CN107586744B

CN107586744B - 一种肺炎链球菌培养的培养基

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Publication number: CN107586744B
Application number: CN201710990658.5A
Authority: CN
Inventors: 吕新; 陈丽华; 李玥仁; 黄薇; 刘兰英
Original assignee: Institute Of Quality Standard And Testing Technology For Agro-Products Fujian Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Quality Standard And Testing Technology For Agro-Products Fujian Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2037-10-23
Also published as: CN107586744A

Abstract

本发明提供了一种肺炎链球菌培养基，包括基础培养基和培养基添加剂，其中所述基础培养基包括蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、无水磷酸氢二钠、氯化钙，所述培养基添加剂含有至少一种血清蛋白。本发明的培养基的制备方法简单、成本低廉、摆脱了对CO₂培养环境的依赖，因而不需要CO₂培养箱。与传统胰蛋白胨大豆培养基相比，本发明的培养基保存使用更方便。

Description

一种肺炎链球菌培养的培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肺炎链球菌培养的培养基。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是威胁人类健康的主要病原菌之一。可引起大叶性肺炎、婴幼儿脑膜炎、中耳炎和心内膜炎等疾病。诱发较高的发病率和死亡率，在婴幼儿、老年人以及免疫缺陷病人中多发。

肺炎链球菌属革兰染色阳性菌，兼性厌氧菌，其生长对培养条件和培养基营养物质均要求严苛。美国模式培养物保藏中心(ATCC)作为全球知名的微生物保藏机构，推荐了两种肺炎链球菌培养基：脑心浸液培养基和胰蛋白胨大豆培养基。脑心浸液培养基，其配方如下：牛脑浸粉7.7g、牛心浸粉9.8g、蛋白胨10g、葡萄糖2g、氯化钠5g、磷酸氢二钠2.5g、水1000ml。胰蛋白胨大豆培养基，其配方如下：胰蛋白胨15g、大豆胨5g、氯化钠5g、水1000ml，灭菌后加入终浓度5％脱纤维羊血。

但上述两种培养基在肺炎链球菌培养时均存在问题，使用脑心浸液培养基培养肺炎链球菌，必须在5-10％CO₂浓度下才能良好生长，而提供CO₂的培养环境需要CO₂培养箱，但一般微生物实验室不一定具备这样的实验设备，从而限制了肺炎链球菌试验的开展。而且脑心浸液培养基因含有牛脑浸粉和牛心浸粉两种特殊营养物质，使其相较普通微生物培养基价格高出许多。使用胰蛋白胨大豆培养基，因加入终浓度5％脱纤维羊血，虽然不需要在5-10％CO₂浓度下肺炎链球菌也能良好生长，但脱纤维羊血一来价格昂贵、二来保存时间很短(4度冰箱保存二周)，若不能及时使用完，将带来浪费而增加实验成本，也给肺炎链球菌培养工作造成诸多不便和麻烦。因此，寻找一种适合于肺炎链球菌生长的成本低廉、保存使用方便，可以完全摆脱肺炎链球菌培养对CO₂培养环境和脱纤维羊血严苛要求的液体培养基，将对肺炎链球菌研究开展起到积极的促进作用，也是本发明重点解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肺炎链球菌培养基，包括基础培养基和培养基添加剂，其中所述基础培养基包括蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、无水磷酸氢二钠、氯化钙，所述培养基添加剂含有至少一种血清蛋白。

优选地，本发明所述的肺炎链球菌培养基中，所述基础培养基包括以下成分：蛋白胨15-25g、牛肉粉3-5g、酵母粉3-6g、葡萄糖1-3g、氯化钠1-3g、氢氧化钠0.5-1.5g、碳酸氢钠1-3g、无水磷酸氢二钠0.2-0.5g、氯化钙0.1-0.2g、蒸馏水加至1000ml。

优选地，本发明所述的肺炎链球菌培养基中，所述基础培养基包括以下成分：蛋白胨20g、牛肉粉5g、酵母粉5g、葡萄糖2g、氯化钠2g、氢氧化钠1g、碳酸氢钠2g、无水磷酸氢二钠0.4g、氯化钙0.1g、蒸馏水加至1000ml。

优选地，本发明所述的肺炎链球菌培养基中，所述血清蛋白为牛血清蛋白；更优选地，所述血清蛋白为5％-10％牛血清蛋白；更优选地，所述血清蛋白为终浓度0.1％-0.5％牛血清蛋白；最优选地，所述血清蛋白为终浓度0.2％牛血清蛋白。

本发明的另一方面为提供一种肺炎链球菌培养基的配制方法，包括以下步骤：将上述肺炎链球菌培养基中基础培养基中各个组分按比例混合，完全溶解、高压灭菌后，加入培养基添加剂，即得肺炎链球菌培养基。

优选地，在本发明肺炎链球菌培养基的配制方法中，所述基础培养基包括以下成分：蛋白胨15-25g、牛肉粉3-5g、酵母粉3-6g、葡萄糖1-3g、氯化钠1-3g、氢氧化钠0.5-1.5g、碳酸氢钠1-3g、无水磷酸氢二钠0.2-0.5g、氯化钙0.1-0.2g、蒸馏水加至1000ml；更优选地，所述基础培养基包括以下成分：蛋白胨20g、牛肉粉5g、酵母粉5g、葡萄糖2g、氯化钠2g、氢氧化钠1g、碳酸氢钠2g、无水磷酸氢二钠0.4g、氯化钙0.1g、蒸馏水加至1000ml。

优选地，在本发明肺炎链球菌培养基的配制方法中，所述血清蛋白为牛血清蛋白；更优选地，所述血清蛋白为5％-10％牛血清蛋白；更优选地，所述血清蛋白为终浓度0.1％-0.5％牛血清蛋白；最优选地，所述血清蛋白为终浓度0.2％牛血清蛋白。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明选择牛血清蛋白作为脱纤维羊血的替代物，为肺炎链球菌的生长提供所需的生长促进因子。牛血清蛋白与脱纤维羊血相比价格便宜，且保存时间长，在-20度冰箱可以保存2年，配制时只需将牛血清蛋白加入到高压灭菌后的基础培养基中即可，将极大方便肺炎链球菌培养基的保存使用。

2)培养基的制备方法简单：将各组分混合，使其完全溶解，高压灭菌后加入牛血清蛋白，即可获得用于肺炎链球菌液体培养基。

3)本发明基础培养基中碳源、氮源、微量元素和缓冲液体系的组分均是常规微生物培养基营养组分和常用化学试剂，培养基添加剂牛血清蛋白与脱纤维羊血相比价格便宜。因此，本发明的培养基与脑心浸液培养基和胰蛋白胨大豆培养基相比成本低廉。

4)使用本发明培养基由于摆脱了对CO₂培养环境的依赖，因而不需要CO₂培养箱。因此，本发明的培养基与脑心浸液培养基相比，将有效降低肺炎链球菌的研究门槛，有利于肺炎链球菌研究的开展。

5)本发明培养基使用牛血清蛋白替代脱纤维羊血，不但价格便宜，而且保存时间长，配制时只需将牛血清蛋白加入到高压灭菌后的基础培养基中即可。因此，本发明的培养基与胰蛋白胨大豆培养基相比保存使用方便。

附图说明

图1为本发明一个实施例中的肺炎链球菌在本发明培养基(实施例1)、脑心浸液培养基(BHI)和胰蛋白胨大豆培养基(TSB)中生长曲线对比图；

图2为本发明一个实施例中的肺炎链球菌在本发明培养基(实施例2)、脑心浸液培养基(BHI)和胰蛋白胨大豆培养基(TSB)中生长曲线对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

1.本发明肺炎链球菌培养基的配制

肺炎链球菌基础培养基，由蛋白胨20g、牛肉粉5g、酵母粉5g、葡萄糖2g、氯化钠2g、氢氧化钠1g、碳酸氢钠2g、无水磷酸氢二钠0.4g、氯化钙0.1g、水1000ml组成。

肺炎链球菌培养基添加剂，提供浓度为20％牛血清蛋白，使用终浓度为0.2％牛血清蛋白。

肺炎链球菌培养基配制时，先将基础培养基各组分混合，加入1000ml蒸馏水使其完全溶解，按每瓶100ml的量分装在250ml三角瓶中，121℃高压灭菌15分钟，冷却后每瓶加入20％牛血清蛋白1ml，用于肺炎链球菌液体培养。

2.肺炎链球菌对照培养基的配制

以脑心浸液培养基和胰蛋白胨大豆培养基为肺炎链球菌对照培养基，购自北京陆桥技术股份有限公司。

脑心浸液培养基，由蛋白胨10g、牛脑浸粉12.5g、葡萄糖2g、牛心浸粉5g、氯化钠5g、磷酸氢二钠2.5g、水1000ml组成。

胰蛋白胨大豆培养基，由胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、水1000ml组成。

具体配制方法如下：

脑心浸液培养基配制：称取脑心浸液培养基37g，加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中，按每瓶100ml的量分装在250ml三角瓶中，121℃高压灭菌20min分钟备用。

胰蛋白胨大豆培养基配制：称取胰蛋白胨大豆培养基30g，加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中，按每瓶100ml的量分装在250ml三角瓶中，121℃高压灭菌15min分钟，冷却后临用前每瓶加入5ml脱纤维羊血混匀。

3.肺炎链球菌对比培养试验

肺炎链球菌标准菌株活化：将-70℃保存的肺炎链球菌标准菌株(ATCC49619)，用无菌接种环在血平板上划线，置37℃普通培养箱培养过夜。用无菌牙签挑取1-2个肺炎链球菌菌落于5ml脑心浸液培养基中，置5％CO₂培养箱中静置培养过夜，用于下一步肺炎链球菌对比培养试验。

肺炎链球菌对比培养试验：将过夜培养的肺炎链球菌菌液，以1:100的接种量(1ml菌液)，分别接种于100ml本发明肺炎链球菌培养基、100ml脑心浸液培养基和100ml胰蛋白胨大豆培养基中，置37℃普通培养箱中静置培养，分析不同培养基对肺炎链球菌生长的影响。

4.肺炎链球菌生长曲线比较

由于肺炎链球菌的浓度与混浊度成正比，因此，采用比浊法测定肺炎链球菌光密度值(OD₆₀₀)来推知菌液的浓度，将所测得的光密度值(OD₆₀₀)与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。具体操作如下：将接种后的上述三种培养基，置37℃普通培养箱中静置培养，每隔2小时取样1次，使用分光光度计测定肺炎链球菌光密度值(OD₆₀₀)，连续测定24小时，绘制肺炎链球菌在三种培养基中生长曲线变化。

肺炎链球菌在三种培养基中生长曲线如图1所示，肺炎链球菌在三种培养基中生长曲线如图2所示，结果显示在无5％CO₂培养环境下，脑心浸液培养基(BHI)中肺炎链球菌基本无生长，而本发明培养基和胰蛋白胨大豆培养基(TSB)中肺炎链球菌则可以良好生长，具有明显的延滞期、对数期、平衡期和衰亡期。因此，本发明培养基可以摆脱对CO₂培养环境的依赖，不需要昂贵的CO₂培养箱，将有效降低肺炎链球菌的研究门槛，有利于肺炎链球菌研究的开展。

实施例2：

1.本发明肺炎链球菌培养基的配制

肺炎链球菌基础培养基，由蛋白胨25g、牛肉粉4g、酵母粉6g、葡萄糖3g、氯化钠1.5g、氢氧化钠1.2g、碳酸氢钠1.5g、无水磷酸氢二钠0.5g、氯化钙0.15g、水1000ml组成。

肺炎链球菌培养基添加剂，提供浓度为10％牛血清蛋白，使用终浓度为0.2％牛血清蛋白。

肺炎链球菌培养基的配制时，先将基础培养基各组分混合，加入1000ml蒸馏水使其完全溶解，按每瓶100ml的量分装在250ml三角瓶中，121℃高压灭菌15min，冷却后每瓶加入10％牛血清蛋白2ml，用于肺炎链球菌液体培养。

2.肺炎链球菌对照培养基的配制

脑心浸液培养基和胰蛋白胨大豆培养基的配制，参照实施例1中的方法进行。

3.肺炎链球菌对比培养试验

肺炎链球菌标准菌株活化，参照实施例1中的方法进行。

肺炎链球菌对比培养试验，参照实施例1中的方法进行。

4.肺炎链球菌生长曲线比较

肺炎链球菌生长曲线的绘制，参照实施例1中的方法进行。

肺炎链球菌在三种培养基中生长曲线如图2所示，肺炎链球菌在三种培养基中生长曲线如图2所示，结果显示在无5％CO₂培养环境下，脑心浸液培养基(BHI)中肺炎链球菌基本无生长，而本发明培养基和胰蛋白胨大豆培养基(TSB)中肺炎链球菌则可以良好生长，具有明显的延滞期、对数期、平衡期和衰亡期。因此，本发明培养基可以摆脱对CO₂培养环境的依赖，不需要昂贵的CO₂培养箱，将有效降低肺炎链球菌的研究门槛，有利于肺炎链球菌研究的开展。

实施例3：

1.本发明肺炎链球菌培养基成本分析

分别以实施例1和实施例2中本发明肺炎链球菌培养基组分，计算配制1000ml肺炎链球菌培养基的成本。

实施例1中本发明肺炎链球菌培养基，由蛋白胨20g、牛肉粉5g、酵母粉5g、葡萄糖2g、氯化钠2g、氢氧化钠1g、碳酸氢钠2g、无水磷酸氢二钠0.4g、氯化钙0.1g、牛血清蛋白2g和水1000ml组成。

实施例2中本发明肺炎链球菌培养基，由蛋白胨25g、牛肉粉4g、酵母粉6g、葡萄糖3g、氯化钠1.5g、氢氧化钠1.2g、碳酸氢钠1.5g、无水磷酸氢二钠0.5g、氯化钙0.15g、牛血清蛋白2g和水1000ml组成。

表1本发明肺炎链球菌培养基成本分析

2.肺炎链球菌对照培养基成本分析

肺炎链球菌对照培养基：脑心浸液培养基和胰蛋白胨大豆培养基为商品化培养基，购自北京陆桥技术股份有限公司。对照培养基以配制1000ml培养基的成本进行计算。其中1000ml脑心浸液培养基成本见表2，1000ml胰蛋白胨大豆培养基成本见表3。

表2脑心浸液培养基成本分析

表3胰蛋白胨大豆培养基成本分析

3.本发明肺炎链球菌培养基与对照培养基成本对比

从表1、表2和表3三种培养基成本对比结果可以看出，本发明肺炎链球菌培养基每1000ml的成本在实施例1中为28.85元，在实施例2中为29.77元，平均成本为29.31元。脑心浸液培养基和胰蛋白胨大豆培养基每1000ml的成本分别为47.36元和114.4元。脑心浸液培养基由于含有价格昂贵的牛脑浸粉和牛心浸粉，胰蛋白胨大豆培养基则需要添加脱纤维羊血，总体成本明显比本发明培养基高出许多。而本发明肺炎链球菌培养基所采用的组成成分，均为常规微生物培养基营养组分和常用化学试剂，培养基添加剂牛血清蛋白与脱纤维羊血相比也价格便宜，且保存时间长，配制时只需将牛血清蛋白加入到高压灭菌后的基础培养基中即可。本发明肺炎链球菌培养基成本仅为脑心浸液培养基成本的62％，胰蛋白胨大豆培养基成本的26％。因此，本发明的培养基与脑心浸液培养基和胰蛋白胨大豆培养基相比成本低廉，且保存及使用方便。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种肺炎链球菌培养基，包括基础培养基和培养基添加剂，其中所述基础培养基包括蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、无水磷酸氢二钠、氯化钙；所述培养基添加剂为牛血清蛋白；所述牛血清蛋白终浓度为0.2％牛血清蛋白。

2.根据权利要求1所述的肺炎链球菌培养基，其特征在于，所述基础培养基包括以下成分：蛋白胨15-25g、牛肉粉3-5g、酵母粉3-6g、葡萄糖1-3g、氯化钠1-3g、氢氧化钠0.5-1.5g、碳酸氢钠1-3g、无水磷酸氢二钠0.2-0.5g、氯化钙0.1-0.2g、蒸馏水加至1000ml。

3.根据权利要求2所述的肺炎链球菌培养基，其特征在于，所述基础培养基包括以下成分：蛋白胨20g、牛肉粉5g、酵母粉5g、葡萄糖2g、氯化钠2g、氢氧化钠1g、碳酸氢钠2g、无水磷酸氢二钠0.4g、氯化钙0.1g、蒸馏水加至1000ml。

4.一种肺炎链球菌培养基的配制方法，包括以下步骤：将权利要求1～3任意一项所述的肺炎链球菌培养基中基础培养基中各个组分按比例混合，完全溶解、高压灭菌后，加入培养基添加剂，即得肺炎链球菌培养基。

5.根据权利要求4所述的肺炎链球菌培养基的配制方法，其特征在于，所述基础培养基包括以下成分：蛋白胨20g、牛肉粉5g、酵母粉5g、葡萄糖2g、氯化钠2g、氢氧化钠1g、碳酸氢钠2g、无水磷酸氢二钠0.4g、氯化钙0.1g、蒸馏水加至1000ml。