CN105624065A - 一种百日咳杆菌培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细菌培养基技术领域，涉及一种百日咳杆菌培养基，由以下原料组成：1000ml水、5-8g谷氨酸钠、4-8g植物蛋白胨、1-2g氯化钠、0.1-0.2g硫酸镁、2-3g？L-胱氨酸、0.2-0.3g烟酸、0.5-1g抗坏血酸、5-10g还原型谷胱甘肽、0.5-1.0gFeSO4·7H2O、20-40g芦荟胶、25-35g琼脂、4-5g橄榄油、5-10g青稞提取物。本发明是用芦荟胶，采用植物氮源，在培养基中添加使用橄榄油和抗坏血酸是培养基稳定性提高，并增加青稞提取物作为百日咳杆菌繁殖的养分，提高培养效率。

Description

一种百日咳杆菌培养基
技术领域
本发明属于细菌培养基技术领域，涉及一种百日咳杆菌培养基。
背景技术
百日咳是引起全球婴幼儿死亡的一个重要原因。据WHO报道，2008年全球百日咳发病约1600万例，其中95％发生在发展中国家，约19.5万儿童因此死亡。在我国，从近几年的全国法定传染病疫情通报中可看出每年都有2000人左右发病。
百日咳是由百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis)通过飞沫从感染者传播给易感个体引起的。数十年来，通过使用质量可靠的百日咳疫苗对婴幼儿开展免疫接种，在全球范围内成功预防了婴幼儿中出现严重的百日咳病例。2008年，全球约82％的婴幼儿接种了3针次百日咳疫苗。WHO报道，2008年全球通过接种百日咳疫苗，避免了约68.7万例死亡。
我国的国家免疫规划中已将无细胞百白破联合疫苗代替了全细胞的百白破疫苗。传统的全细胞疫苗由于其较严重的副作用和无细胞百白破疫苗快速发展后展现出的巨大优势而逐渐被停用。无细胞百日咳疫苗(APV)自身具有免疫效果好且副反应小的优点。WHO推荐的无细胞疫苗包括PT、FHA(丝状血凝素)、PRN、FIM2和FIM3五种抗原，其中，百日咳毒素(PT)为APV的主要成分。理想的百日咳疫苗应是由抗原成分明确、具有良好的免疫原性及保护效果而无毒性作用的百日咳抗原组成。
而百日咳疫苗生产厂家一般均采用将百日咳菌种开启到包姜氏培养基(含羊血成分)，再传活性炭培养基(含牛源的酸水解酪蛋白)，最后接种SS培养基(或改良的SS培养基)，改良SS培养基可能会含有牛源的酸水解酪蛋白。这些在培养基中加入的动物血液成分和动物来源的氮源成分均存在潜在的感染动物携带病毒的风险，而且成分复杂，给疫苗带来不安全的风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种百日咳杆菌培养基，该培养基为无动物源成分、完全避免了因动物携带病原体给疫苗安全带来的风险，提高了疫苗的安全性，减少疫苗接种的副反应。
本发明通过下述技术方案来实现。一种百日咳杆菌培养基，由以下原料组成：1000ml水、5-8g谷氨酸钠、4-8g植物蛋白胨、1-2g氯化钠、0.1-0.2g硫酸镁、2-3gL-胱氨酸、0.2-0.3g烟酸、0.5-1g抗坏血酸、5-10g还原型谷胱甘肽、0.5-1.0gFeSO4·7H2O、20-40g芦荟胶、25-35g琼脂、4-5g橄榄油、5-10g青稞提取物。
百日咳杆菌培养基的最佳配比为：由以下原料组成：1000ml水、6g谷氨酸钠、6g植物蛋白胨、1g氯化钠、0.2g硫酸镁、2gL-胱氨酸、0.3g烟酸、1g抗坏血酸、8g还原型谷胱甘肽、1.0gFeSO4·7H2O、30g芦荟胶、30g琼脂、4g橄榄油、10g青稞提取物。
应用上述培养基培养百日咳杆菌的方法，它包括以下步骤：
S1.菌种开启：启开百日咳工作种子批菌种，接种于固体培养基，35℃培养60小时；
S2.传二代培养：将步骤S1开启的百日咳菌种接种于二代摇瓶液体培养基中，起始OD600值为0.2，35℃培养25小时，为二代菌种菌液；
S3.传三代培养：将二代菌种菌液接种于三代摇瓶液体培养基中，起始OD600值为0.2，35℃培养25小时，为三代菌种菌液；
S4.发酵罐培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，通气搅拌培养，培养温度为35℃，培养时间为50小时，培养至发酵液pH值为7.0～7.5，OD600值为5.0～10，将发酵液下罐，通过分离纯化制备百日咳抗原。
本发明具有以下优点：本发明的百日咳杆菌培养基作为无动物源成分，是用芦荟胶，采用植物氮源，在培养基中添加使用橄榄油和抗坏血酸是培养基稳定性提高，并增加青稞提取物作为百日咳杆菌繁殖的养分，提高培养效率，能在菌种传代时进行良好的菌种复苏和扩增培养，产毒亦可达到行业标准，因此本发明培养基完全避免了因动物携带病原体给疫苗安全带来的风险，提高了疫苗的安全性，可以减少疫苗接种的副反应。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种百日咳杆菌培养基，由以下原料组成：1000ml水、5g谷氨酸钠、4g植物蛋白胨、1g氯化钠、0.1g硫酸镁、2gL-胱氨酸、0.2g烟酸、0.5g抗坏血酸、5g还原型谷胱甘肽、0.5gFeSO4·7H2O、20g芦荟胶、25g琼脂、4g橄榄油、5g青稞提取物。
实施例2
一种百日咳杆菌培养基，由以下原料组成：1000ml水、8g谷氨酸钠、8g植物蛋白胨、2g氯化钠、0.2g硫酸镁、3gL-胱氨酸、00.3g烟酸、1g抗坏血酸、10g还原型谷胱甘肽、1.0gFeSO4·7H2O、40g芦荟胶、35g琼脂、5g橄榄油、10g青稞提取物。
实施例3
一种百日咳杆菌培养基，由以下原料组成：1000ml水、6g谷氨酸钠、6g植物蛋白胨、1g氯化钠、0.2g硫酸镁、2gL-胱氨酸、0.3g烟酸、1g抗坏血酸、8g还原型谷胱甘肽、1.0gFeSO4·7H2O、30g芦荟胶、30g琼脂、4g橄榄油、10g青稞提取物。
实施例4
一种百日咳杆菌培养基，由以下原料组成：1000ml水、5g谷氨酸钠、8g植物蛋白胨、2g氯化钠、0.1g硫酸镁、2gL-胱氨酸、0.3g烟酸、0.5g抗坏血酸、10g还原型谷胱甘肽、0.5gFeSO4·7H2O、25g芦荟胶、35g琼脂、5g橄榄油、6g青稞提取物。
实施例5
一种百日咳杆菌培养基，由以下原料组成：1000ml水、8g谷氨酸钠、4g植物蛋白胨、1g氯化钠、0.1g硫酸镁、3gL-胱氨酸、0.2g烟酸、0.5g抗坏血酸、8g还原型谷胱甘肽、1.0gFeSO4·7H2O、35g芦荟胶、25g琼脂、5g橄榄油、5g青稞提取物。
实施例6
应用实施例3所述培养基培养百日咳杆菌的方法，它包括以下步骤：
S1.菌种开启：启开百日咳工作种子批菌种，接种于固体培养基，35℃培养60小时；
S2.传二代培养：将步骤S1开启的百日咳菌种接种于二代摇瓶液体培养基中，起始OD600值为0.2，35℃培养25小时，为二代菌种菌液；
S3.传三代培养：将二代菌种菌液接种于三代摇瓶液体培养基中，起始OD600值为0.2，35℃培养25小时，为三代菌种菌液；
S4.发酵罐培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，通气搅拌培养，培养温度为35℃，培养时间为50小时，培养至发酵液pH值为7.0～7.5，OD600值为5.0～10，将发酵液下罐，通过分离纯化制备百日咳抗原。
采用本发明培养基与传统培养基培养比较实验，本发明的培养基菌落增长更快，更均匀，培养基保存时间也更长，本发明的培养基进行培养发酵液中PT含量、FHA含量显著高于采用传统培养基进行培养的PT含量、FHA含量。

Claims (3)

1.一种百日咳杆菌培养基，其特征在于：由以下原料组成：1000ml水、5-8g谷氨酸钠、4-8g植物蛋白胨、1-2g氯化钠、0.1-0.2g硫酸镁、2-3gL-胱氨酸、0.2-0.3g烟酸、0.5-1g抗坏血酸、5-10g还原型谷胱甘肽、0.5-1.0gFeSO4·7H2O、20-40g芦荟胶、25-35g琼脂、4-5g橄榄油、5-10g青稞提取物。
2.根据权利要求1所述的一种百日咳杆菌培养基，其特征在于：由以下原料组成：1000ml水、6g谷氨酸钠、6g植物蛋白胨、1g氯化钠、0.2g硫酸镁、2gL-胱氨酸、0.3g烟酸、1g抗坏血酸、8g还原型谷胱甘肽、1.0gFeSO4·7H2O、30g芦荟胶、30g琼脂、4g橄榄油、10g青稞提取物。
3.一种培养百日咳杆菌的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的百日咳杆菌培养基，包括以下步骤：
S1.菌种开启：启开百日咳工作种子批菌种，接种于固体培养基，35℃培养60小时；
S2.传二代培养：将步骤S1开启的百日咳菌种接种于二代摇瓶液体培养基中，起始OD600值为0.2，35℃培养25小时，为二代菌种菌液；
S3.传三代培养：将二代菌种菌液接种于三代摇瓶液体培养基中，起始OD600值为0.2，35℃培养25小时，为三代菌种菌液；
S4.发酵罐培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，通气搅拌培养，培养温度为35℃，培养时间为50小时，培养至发酵液pH值为7.0～7.5，OD600值为5.0～10，将发酵液下罐，通过分离纯化制备百日咳抗原。
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