CN105349472A - 一种多组分细菌培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多组分细菌培养基，属于培养基领域。本发明的一种多组分细菌培养基，由3.0%~7%醋酸钠，0.7%~4.7%丙酸钠，0.9%~1.5%硫酸锰，2.2%~2.8%氯化镁，1.3%~2.3%氯化钙，0.4%~1.4%硝酸铵，2.6%~4.6%谷氨酸，14.0%~16.0%缓冲液，15.5%~21.5%蛋白胨，3.4%~9.4%酵母膏，13.0%~14.8%牛肉膏，5.6%~7.4%芒果提取物，1.3%~2.3%芦荟胶，？1.8%~2.8%琼脂，0.5%~1.1%Gemini表面活性剂组成和16.8%~17.4%去离子水组成。本发明的具有促进假单胞杆菌药物在生物防治农作物病害中的应用具有重要的意义，提高假单胞杆菌拮抗能力的特点。

Description

一种多组分细菌培养基
技术领域
本发明涉及一种培养基，特别是一种多组分细菌培养基。
背景技术
假单胞杆菌菌株产生的抗菌蛋白对蔬菜灰霉病由较强的抗性。因此，开展提高假单胞杆菌拮抗物质的分泌产量研究具有重要意义。
因此寻找一种能够提高假单胞杆菌拮抗能力的培养基能够为促进假单胞杆菌药物在生物防治农作物病害中的应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种能够促进假单胞杆菌在生物防治农作物病害中的应用具有重要的意义，提高假单胞杆菌拮抗能力的培养基。
本发明采用的技术方案如下：
本发明的一种多组分细菌培养基，由3.0％～7％醋酸钠，0.7％～4.7％丙酸钠，0.9％～1.5％硫酸锰，2.2％～2.8％氯化镁，1.3％～2.3％氯化钙，0.4％～1.4％硝酸铵，2.6％～4.6％谷氨酸，14.0％～16.0％缓冲液，15.5％～21.5％蛋白胨，3.4％～9.4％酵母膏，13.0％～14.8％牛肉膏，5.6％～7.4％芒果提取物，1.3％～2.3％芦荟胶，1.8％～2.8％琼脂，0.5％～1.1％Gemini表面活性剂组成和16.8％～17.4％去离子水组成。
由于采用了上述技术方案，采用蛋白胨、牛肉膏和芒果提取物作为细菌培养的氮源和碳源，芒果中不仅含有大量的类胡萝卜素、维生素C、果胶和膳食纤维等有益物质，同时还含有特殊的芒果苷，芒果酸和类似维他命P复合物的槲黄素，均能够促进细菌的生长。
缓冲液的存在保证培养基的pH处于一定的恒定范围内，避免细菌在生长过程中，代谢产物的产生改变培养基的pH环境，使得pH变化过大而抑制细菌的生长。
醋酸钠，丙酸钠，硫酸锰，氯化镁，氯化钙和硝酸铵作为细菌生长的必要微量元素提供成分，缺乏微量元素锰、钙、镁等会导致细菌生长缓慢，但如果无机盐的含量过高，会在培养基中形成难溶物，反而会抑制细菌的生长，因此，上述比例为最合理的范围。
本发明的一种多组分细菌培养基，由5.0％醋酸钠，2.7％丙酸钠，1.2％硫酸锰，2.5％氯化镁，1.8％氯化钙，0.9％硝酸铵，3.6％谷氨酸，15.0％缓冲液，18.5％蛋白胨，6.4％酵母膏，13.9％牛肉膏，6.5％芒果提取物，1.8％芦荟胶，2.3％琼脂，0.8％Gemini表面活性剂组成和17.1％去离子水组成。
由于采用了上述技术方案，上述比例为最佳值。
本发明的一种多组分细菌培养基，所述蛋白胨为螺旋藻蛋白胨。
由于采用了上述技术方案，现有技术通常采用日本蛋白胨来培养细菌，价格较为昂贵，成本较高，螺旋藻的组物中其中60％以上的是蛋白质，主要包括异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸和缬氨酸，此外，还含脂肪，碳水化合物，叶绿素，类胡萝卜素，藻青素，维生素A、B1、B2、B6、B12、E，烟酸，肌酸，γ-亚麻酸，泛酸钙，叶酸(folicacid)及钙，铁，锌，镁等。可以从螺旋藻中分离提取出新的廉价的优质蛋白胨，由螺旋藻制成的螺旋藻蛋白胨能够为细菌生长提供所需的氮源和碳源。
本发明的一种多组分细菌培养基，所述Gemini表面活性剂的结构式如下，
由于采用了上述技术方案，该表面活性剂可以刺激细菌拮抗物质的产生，并提高拮抗物质的产量。
本发明的一种多组分细菌培养基，所述芒果提取物通过以下步骤制备，
步骤一：取用新鲜芒果，按芒果：淀粉的质量比12:1，将淀粉溶解在温度为25～38℃的水中清洗芒果；
步骤二：将步骤一中清洗好的芒果浸泡在浓度为4.82mol/L的盐水中，在微波功率为550W，温度为27℃的条件下预处理20min；
步骤三：将步骤二中经过处理的芒果取出，用常温清水清洗；
步骤四：将步骤三中晾干的芒果浸泡在无水乙醇中，芒果：无水乙醇的质量比为1:1.5，在微波功率为400W，温度为30℃的条件下预处理20min；
步骤五：对经过步骤四处理的芒果在无水乙醇中进行破碎，加水将无水乙醇稀释为73％的乙醇溶液，在压力0.62kPa，温度78℃的条件下回流5h；
步骤六：将步骤五中的反应体系趁热过滤，得滤液一与滤渣一，取滤渣一溶于乙酸乙酯中，滤渣：乙酸乙酯的质量比为1:1.5，在温度78℃的条件下回流5h；
步骤七：将步骤六中的反应体系趁热过滤，得滤液二与滤渣二；
步骤八：取步骤六中制得的滤液一，将体系中的乙醇除去，冷却至常温，置于360nm，2kW的高压汞灯下，在光强为96mW/cm2，辐照距离为8cm的条件下辐照2h，体系表面形成一层膜状物，弃去膜状物，得悬浊液；
步骤九：将步骤八中的悬浊液与步骤七中滤液二混合，去除溶剂水和乙酸乙酯，得到芒果提取物。
由于采用了上述技术方案，在微波的作用，能够迅速破坏植物细胞中的细胞壁提高分子运动速率，使得芒果中含有的天然产物更够更好更快地从植物细胞中渗透出，提高提取的效率和提取物的产量。芒果中含有一种特殊的物质——芒果漆酚，该物质不利于细菌的生长，漆酚不溶于水，且为油状物，漆酚的密度小于水的密度；漆酚具有成膜的物理性质，高压泵灯能够发出强的紫外光，在强的紫外光照射下，漆酚能够迅速成膜，利用该特性既能够高效地去除掉提取物中的漆酚。
的一种多组分细菌培养基，其特征在于：所述缓冲液为磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液，所述缓冲液由9mL的Na2HPO4溶液和1mL的KH2PO4溶液组成，所述Na2HPO4溶液的浓度为0.067mol/L，所述KH2PO4溶液的浓度为0.66mol/L。
本发明的一种多组分细菌培养基，所述培养基的pH为7.73。
由于采用了上述技术方案，该pH值为最适宜细菌生长的pH值。
本发明的一种多组分细菌培养基，所述培养基在提高假单胞杆菌拮抗能力的应用。
由于采用了上述技术方案，使用该培养基培养的假单胞杆菌拮抗能力较普通培养基的能力有所提高，且经过该培养基培养的假单胞杆菌产生的拮抗物质产量也有所提高。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、为细菌生长提供所需的氮源，碳源和微量元素，为细菌提供稳定的生长环境，且较廉价。
2、使用该培养基培养的假单胞杆菌拮抗能力较普通培养基的能力有所提高，且经过该培养基培养的假单胞杆菌产生的拮抗物质产量也有所提高。
附图说明
图1为本发明培养基和普通培养基的拮抗能力对比曲线图。
图2为本发明培养基和普通培养基的生长情况对比曲线图。
具体实施方式
下面对本发明作详细的说明。
为了使发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种多组分细菌培养基，由3.0％醋酸钠，4.7％丙酸钠，0.9％硫酸锰，2.8％氯化镁，1.3％氯化钙，1.4％硝酸铵，2.6％谷氨酸，16.0％缓冲液，15.5％蛋白胨，9.4％酵母膏，13.0％牛肉膏，7.4％芒果提取物，1.3％芦荟胶，2.8％琼脂，0.5％Gemini表面活性剂组成和17.4％去离子水组成。
其中，蛋白胨为螺旋藻蛋白胨，Gemini表面活性剂的结构式如下，
芒果提取物通过以下步骤制备，
步骤一：取用新鲜芒果，按芒果：淀粉的质量比12:1，将淀粉溶解在温度为25～38℃的水中清洗芒果；
步骤二：将步骤一中清洗好的芒果浸泡在浓度为4.82mol/L的盐水中，在微波功率为550W，温度为27℃的条件下预处理20min；
步骤三：将步骤二中经过处理的芒果取出，用常温清水清洗；
步骤四：将步骤三中晾干的芒果浸泡在无水乙醇中，芒果：无水乙醇的质量比为1:1.5，在微波功率为400W，温度为30℃的条件下预处理20min；
步骤五：对经过步骤四处理的芒果在无水乙醇中进行破碎，加水将无水乙醇稀释为73％的乙醇溶液，在压力0.62kPa，温度78℃的条件下回流5h；
步骤六：将步骤五中的反应体系趁热过滤，得滤液一与滤渣一，取滤渣一溶于乙酸乙酯中，滤渣：乙酸乙酯的质量比为1:1.5，在温度78℃的条件下回流5h；
步骤七：将步骤六中的反应体系趁热过滤，得滤液二与滤渣二；
步骤八：取步骤六中制得的滤液一，将体系中的乙醇除去，冷却至常温，置于360nm，2kW的高压汞灯下，在光强为96mW/cm2，辐照距离为8cm的条件下辐照2h，体系表面形成一层膜状物，弃去膜状物，得悬浊液；
步骤九：将步骤八中的悬浊液与步骤七中滤液二混合，去除溶剂水和乙酸乙酯，得到芒果提取物。
缓冲液为磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液，缓冲液由9mL的Na2HPO4溶液和1mL的KH2PO4溶液组成，所述Na2HPO4溶液的浓度为0.067mol/L，所述KH2PO4溶液的浓度为0.66mol/L，培养基的pH为7.73。
实施例2
一种多组分细菌培养基，由7％醋酸钠，0.7％丙酸钠，1.5％硫酸锰，2.2％氯化镁，2.3％氯化钙，0.4％硝酸铵，4.6％谷氨酸，14.0％缓冲液，21.5％蛋白胨，3.4％酵母膏，14.8％牛肉膏，5.6％芒果提取物，2.3％芦荟胶，1.8％琼脂，1.1％Gemini表面活性剂组成和16.8％去离子水组成。
其中，蛋白胨为螺旋藻蛋白胨，Gemini表面活性剂的结构式如下，
芒果提取物通过以下步骤制备，
步骤一：取用新鲜芒果，按芒果：淀粉的质量比12:1，将淀粉溶解在温度为25～38℃的水中清洗芒果；
步骤二：将步骤一中清洗好的芒果浸泡在浓度为4.82mol/L的盐水中，在微波功率为550W，温度为27℃的条件下预处理20min；
步骤三：将步骤二中经过处理的芒果取出，用常温清水清洗；
步骤四：将步骤三中晾干的芒果浸泡在无水乙醇中，芒果：无水乙醇的质量比为1:1.5，在微波功率为400W，温度为30℃的条件下预处理20min；
步骤五：对经过步骤四处理的芒果在无水乙醇中进行破碎，加水将无水乙醇稀释为73％的乙醇溶液，在压力0.62kPa，温度78℃的条件下回流5h；
步骤六：将步骤五中的反应体系趁热过滤，得滤液一与滤渣一，取滤渣一溶于乙酸乙酯中，滤渣：乙酸乙酯的质量比为1:1.5，在温度78℃的条件下回流5h；
步骤七：将步骤六中的反应体系趁热过滤，得滤液二与滤渣二；
步骤八：取步骤六中制得的滤液一，将体系中的乙醇除去，冷却至常温，置于360nm，2kW的高压汞灯下，在光强为96mW/cm2，辐照距离为8cm的条件下辐照2h，体系表面形成一层膜状物，弃去膜状物，得悬浊液；
步骤九：将步骤八中的悬浊液与步骤七中滤液二混合，去除溶剂水和乙酸乙酯，得到芒果提取物。
缓冲液为磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液，缓冲液由9mL的Na2HPO4溶液和1mL的KH2PO4溶液组成，所述Na2HPO4溶液的浓度为0.067mol/L，所述KH2PO4溶液的浓度为0.66mol/L，培养基的pH为7.73。
实施例3
一种多组分细菌培养基，由5.0％醋酸钠，2.7％丙酸钠，1.2％硫酸锰，2.5％氯化镁，1.8％氯化钙，0.9％硝酸铵，3.6％谷氨酸，15.0％缓冲液，18.5％蛋白胨，6.4％酵母膏，13.9％牛肉膏，6.5％芒果提取物，1.8％芦荟胶，2.3％琼脂，0.8％Gemini表面活性剂组成和17.1％去离子水组成。
其中，蛋白胨为螺旋藻蛋白胨，Gemini表面活性剂的结构式如下，
芒果提取物通过以下步骤制备，
步骤一：取用新鲜芒果，按芒果：淀粉的质量比12:1，将淀粉溶解在温度为25～38℃的水中清洗芒果；
步骤二：将步骤一中清洗好的芒果浸泡在浓度为4.82mol/L的盐水中，在微波功率为550W，温度为27℃的条件下预处理20min；
步骤三：将步骤二中经过处理的芒果取出，用常温清水清洗；
步骤四：将步骤三中晾干的芒果浸泡在无水乙醇中，芒果：无水乙醇的质量比为1:1.5，在微波功率为400W，温度为30℃的条件下预处理20min；
步骤五：对经过步骤四处理的芒果在无水乙醇中进行破碎，加水将无水乙醇稀释为73％的乙醇溶液，在压力0.62kPa，温度78℃的条件下回流5h；
步骤六：将步骤五中的反应体系趁热过滤，得滤液一与滤渣一，取滤渣一溶于乙酸乙酯中，滤渣：乙酸乙酯的质量比为1:1.5，在温度78℃的条件下回流5h；
步骤七：将步骤六中的反应体系趁热过滤，得滤液二与滤渣二；
步骤八：取步骤六中制得的滤液一，将体系中的乙醇除去，冷却至常温，置于360nm，2kW的高压汞灯下，在光强为96mW/cm2，辐照距离为8cm的条件下辐照2h，体系表面形成一层膜状物，弃去膜状物，得悬浊液；
步骤九：将步骤八中的悬浊液与步骤七中滤液二混合，去除溶剂水和乙酸乙酯，得到芒果提取物。
缓冲液为磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液，缓冲液由9mL的Na2HPO4溶液和1mL的KH2PO4溶液组成，所述Na2HPO4溶液的浓度为0.067mol/L，所述KH2PO4溶液的浓度为0.66mol/L，培养基的pH为7.73。
实施例4
上述培养基在提高假单胞杆菌拮抗能力的应用。
拮抗能力的测定：
取适量的上述培养基，将假单胞杆菌接种于培养基中，在30℃，光照强度815～840lx下培养7d，将病原菌培养至对数生长期，制成菌体浓度为1.5×108～2.5×108CFU·mL-1的菌悬液，涂布，置30℃恒温箱中平衡干燥30min，后立即将无菌滤纸片(96mm)贴于平板上，滴加10μL假单胞杆菌CFS原液，置于30℃下培养24h后，用千分尺测量抑菌圈直径。最低抑菌浓度测定：将假单胞杆菌CFS按2倍稀释法稀释成一定倍数，以琼脂纸片扩散法测定其对病原菌的抑菌活性，以肉眼观察到有抑菌圈的最高稀释度的倒数为最低抑菌浓度(MIC，AU·mL-1)。分别测得实施例1，实施例2，实施例3和普通培养基的拮抗能力曲线，如图1所示。
假单胞杆菌生长情况的测定：
采用浊度法：取适量的上述培养基，将假单胞杆菌接种于培养基中，在30℃，光照强度815～840lx下培养7d，配制成细菌悬液，在660nm波长处测定的吸光度(OD660)作为检测菌体生长的标。分别测得实施例1，实施例2，实施例3和普通培养基的生长情况曲线，如图2所示。
实施例5
Gemini表面活性剂的合成方法：
反应路线如下所示，
合成步骤：
步骤一，称取1份间二苯酚乙烷，加入适量DMF作为溶剂，搅拌溶解后按照间二苯酚乙烷：氯化苄：无水碳酸钾摩尔比1:2.1：4，向溶液中加入氯化苄和无水碳酸钾，升温至80℃，恒温反应3～4h；
步骤二，减压蒸馏将DMF蒸干，加入适量无水二硫化碳作为溶剂，按照间二苯酚乙烷：三氧化铝摩尔比1:3向溶液中加入无水三氧化铝，升温至45℃，保持恒温，向溶液中按照间二苯酚乙烷：辛酰氯摩尔比1:2.1向溶液中缓慢滴加辛酰氯，反应6～8h；
步骤三，自然冷却至常温，通过旋转蒸发仪去除溶剂，用浓度为15％的盐酸处理反应体系，生成白色沉淀；
步骤四，过滤，将固体置于40℃烘箱中真空干燥，制得中间I；
步骤五，称取1份中间体I，加入适量的一缩二乙二醇作为溶剂搅拌溶解，按照中间体I：水合肼：氢氧化钾摩尔比1:2:2向溶液中加入水合肼和氢氧化钾，升温至130℃，反应3h后，升温至210℃，回流反应8h，自然冷却至常温，用石油醚萃取产物，无水氯化钙，制得中间体II；
步骤六，称取一份中间体II，加入适量氯仿作为溶剂，搅拌溶解，将体系置于冰浴的条件下搅拌10min，按照中间体II：发烟硫酸摩尔比1:10，向体系中加入50％发烟硫酸(含50％SO3)，搅拌30min后，自然恢复至常温继续搅拌5h，通过旋转蒸发仪去除掉溶剂，用乙醚萃取产物，无水硫酸钠干燥，得到中间体IV；
步骤七，称取一份中间体IV，加入适量甲醇作为溶剂，搅拌溶解，按照中间体IV：钯碳：氢气摩尔比1:1.5:10向体系中加入钯碳和氢气，室温下搅拌12h，过滤后，通过旋转蒸发仪去掉溶剂，得到中间体V；
步骤八，称取一份中体V，用10％的氢氧化钠水溶液中和磺化产物至pH＝7，石油醚萃取去除未被磺化的有机物，95％的乙醇重结晶，得到产物VI。
实施例6
螺旋藻蛋白胨的制备方法：
步骤一，称取一份螺旋藻干粉，加入适量去离子水调成糊状，研磨至细度为100目；
步骤二，再加入适量去离子水搅拌均匀后，将溶液置于离心机中，在300r/min的条件下离心30min后再搅拌均匀；
步骤三，将离心后的溶液置于-35℃条件下冷冻4h，取出后自然恢复至室温，在将溶液置于离心机中，在300r/min的条件下离心30min后再搅拌均匀；
步骤四，重复步骤二至步骤三4次，取上层清液，调节pH至5.0，置于50℃的水浴箱中，加入按照质量比螺旋藻干粉：木瓜蛋白酶质量比20:1向溶液中加入木瓜蛋白酶液，水解40h；
步骤五，取水解液，调节pH至4.0，加热煮沸10min，过滤，得到螺旋藻蛋白胨。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种多组分细菌培养基，其特征在于：由3.0%~7%醋酸钠，0.7%~4.7%丙酸钠，0.9%~1.5%硫酸锰，2.2%~2.8%氯化镁，1.3%~2.3%氯化钙，0.4%~1.4%硝酸铵，2.6%~4.6%谷氨酸，14.0%~16.0%缓冲液，15.5%~21.5%蛋白胨，3.4%~9.4%酵母膏，13.0%~14.8%牛肉膏，5.6%~7.4%芒果提取物，1.3%~2.3%芦荟胶，1.8%~2.8%琼脂，0.5%~1.1%Gemini表面活性剂组成和16.8%~17.4%去离子水组成。
2.如权利要求1所述的一种多组分细菌培养基，其特征在于：由5.0%醋酸钠，2.7%丙酸钠，1.2%硫酸锰，2.5%氯化镁，1.8%氯化钙，0.9%硝酸铵，3.6%谷氨酸，15.0%缓冲液，18.5%蛋白胨，6.4%酵母膏，13.9%牛肉膏，6.5%芒果提取物，1.8%芦荟胶，2.3%琼脂，0.8%Gemini表面活性剂组成和17.1%去离子水组成。
3.如权利要求1或2所述的一种多组分细菌培养基，其特征在于：所述蛋白胨为螺旋藻蛋白胨。
4.如权利要求3所述的一种多组分细菌培养基，其特征在于：所述Gemini表面活性剂的结构式如下，
。
5.如权利要求4所述的一种多组分细菌培养基，其特征在于：所述芒果提取物通过以下步骤制备，
步骤一：取用新鲜芒果，按芒果：淀粉的质量比12:1，将淀粉溶解在温度为25~38℃的水中清洗芒果；
步骤二：将步骤一中清洗好的芒果浸泡在浓度为4.82mol/L的盐水中，在微波功率为550W，温度为27℃的条件下预处理20min；
步骤三：将步骤二中经过处理的芒果取出，用常温清水清洗；
步骤四：将步骤三中晾干的芒果浸泡在无水乙醇中，芒果：无水乙醇的质量比为1:1.5，在微波功率为400W，温度为30℃的条件下预处理20min；
步骤五：对经过步骤四处理的芒果在无水乙醇中进行破碎，加水将无水乙醇稀释为73%的乙醇溶液，在压力0.62kPa，温度78℃的条件下回流5h；
步骤六：将步骤五中的反应体系趁热过滤，得滤液一与滤渣一，取滤渣一溶于乙酸乙酯中，滤渣：乙酸乙酯的质量比为1:1.5，在温度78℃的条件下回流5h；
步骤七：将步骤六中的反应体系趁热过滤，得滤液二与滤渣二；
步骤八：取步骤六中制得的滤液一，将体系中的乙醇除去，冷却至常温，置于360nm，2kW的高压汞灯下，在光强为96mW/cm2，辐照距离为8cm的条件下辐照2h，体系表面形成一层膜状物，弃去膜状物，得悬浊液；
步骤九：将步骤八中的悬浊液与步骤七中滤液二混合，去除溶剂水和乙酸乙酯，得到芒果提取物。
6.如权利要求4或5所述的一种多组分细菌培养基，其特征在于：所述缓冲液为磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液，所述缓冲液由9mL的Na2HPO4溶液和1mL的KH2PO4溶液组成，所述Na2HPO4溶液的浓度为0.067mol/L，所述KH2PO4溶液的浓度为0.66mol/L。
7.如权利要求6所述的一种多组分细菌培养基，其特征在于：所述培养基的pH为7.73。
8.如权利要求7所述的一种多组分细菌培养基，其特征在于：所述培养基在提高假单胞杆菌拮抗能力的应用。
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