CN104707134A - 一种无细胞百日破联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无细胞百日破联合疫苗及其制备方法，属于疫苗生产制备技术领域，无细胞百日破联合疫苗由下述组分的原料组成：百日咳毒素：5～40μg；丝状血凝素：5～40μg；百日咳黏附素：2～10μg；白喉类毒素：10～25lf；破伤风类毒素：4～10lf；氢氧化铝：1.0～2.0mg/ml；氯化钠：7.5～9.5g/L。制备方法包括制备各单价疫苗原液、合并和稀释。本发明的疫苗成分明确，容易进行质量控制，副作用更小，安全性更好；制备方法具有操作简单、制备方便、成本低、适宜于工业化大规模生产。

Description

一种无细胞百日破联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗生产制备技术领域，具体涉及一种无细胞百日破联合疫苗及其制备方法。

背景技术

百日咳、白喉、破伤风等疾病在我国流行范围广、危害严重，及时进行疫苗接种是有效的预防保护性措施。我国目前应用于计划免疫预防百日咳、白喉和破伤风疾病的疫苗包括全细胞百白破联合疫苗(DTwP)和无细胞百白破联合疫苗(DTaP)。两者区别在于联合疫苗中的百日咳不同，即全细胞百日咳和无细胞百日咳。

顾名思义，全细胞百日咳是将百日咳全菌体用适当灭活剂灭活后，与佐剂配合，直接用作免疫用疫苗。作为最早纳入WHO扩大免疫计划(EPI)的疫苗，全细胞百白破疫苗已经在预防和控制这三种传染病方面发挥了重要作用。我国也在1985年将其纳入第一批国家计划免疫的疫苗。然而，由于全细胞百白破疫苗中白喉类毒素、破伤风类毒素均为提纯精制过的有效蛋白抗原，而百日咳则为全细胞菌体，所以注射全细胞百白破联合疫苗后容易发生因百日咳所含毒性组份引起的严重不良反应。20世纪70年代，由于百日咳发病率的下降以及接种全细胞百白破疫苗(DTwP)后出现的严重的不良反应，英国、荷兰及日本等国家一度出现了抵制疫苗接种及停用的现象，导致接种率下降，致使这些国家百日咳的发病率又出现大幅反弹。我国也因其容易产生副反应，严重影响了计划免疫的实施，使全国免疫覆盖率未真正达到85％，造成过百日咳局部爆发流行的情况，如贵州1997年曾爆发流行。

目前，绝大多数发达国家均已经采用副反应较小的无细胞百白破联合疫苗，作为常规免疫用疫苗，取代传统的全细胞百日咳疫苗。无细胞百白破联合疫苗中的无细胞百日咳主要是通过提取纯化，去掉百日咳菌体中一些易引起副反应的毒性物质，而保留具有保护性免疫作用的抗原成分。

无细胞百日咳疫苗从生产工艺来讲可分为共纯化疫苗和组份纯化疫苗。日本是最早研制出无细胞百白破疫苗的国家。1981年日本率先采用共纯化工艺研制成功含有百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)的无细胞百白破疫苗。其工艺包括发酵罐培养细菌后，盐析沉淀，然后用蔗糖密度梯度离心去除杂质，收集富含PT和FHA的有效成分。我国的无细胞百白破联合疫苗于80年代中期开始研制，90年代中期获得生产文号，生产工艺是沿用日本的共纯化工艺。2011年，我国将共纯化的无细胞百白破纳入免疫接种计划。

然而，由于共纯化无细胞百日咳是在同一反应体系中同时纯化提取抗原，因此不同厂家的工艺不同，同一厂家相同工艺下，纯化的细微差异均会导致抗原含量比例的不同。实际上，中国食品药品检定院在疫苗批签发审核检测时，也发现共纯化百日咳疫苗PT和FHA的比例变化极大(骆鹏等，建立我国百日咳组份纯化疫苗质量标准的探讨。中国生物制品学杂志，2013年9月第26卷第9期，1351～1354)，类似情况在日本也有报道(李忠云等，百白破联合疫苗：问题与对策。上海预防医学，2006，18(1)：3～5)，因此共纯化工艺不利于产品的质量稳定。

随着纯化技术的发展，使分别分离出百日咳有效抗原并配制成组份疫苗成为可能。这种工艺被称为组份纯化工艺，即采用柱层析法，将不同的保护性抗原分别纯化，然后再将各抗原定量配比成疫苗。组份纯化工艺的优点在于，疫苗抗原成分明确，含量可控，纯度更高，使得疫苗副作用更小，安全性更好；另一方面，组分纯化疫苗的柱层析工艺相对简单，耗时短。自90年代中期以来，欧美发达国家均采用柱层析分离纯化百日咳各抗原组份来生产无细胞百日咳疫苗。中国目前仍然停留在共纯化工艺生产无细胞百日咳疫苗的水平上，与欧美发达国家存在近20年的差距(潘殊男等，中国百日咳疫苗的现状及研发趋势初探。微生物学免疫学进展，2012年第49卷第5期，72～77)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种无细胞百日破联合疫苗及其制备方法，该疫苗成分明确，容易进行质量控制，副作用更小，安全性更好；制备方法具有操作简单、制备方便、成本低、适宜于工业化大规模生产。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种无细胞百日破联合疫苗，它由下述组分的原料组成：

作为优选方案，它由下述组分的原料组成：

一种无细胞百日破联合疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

S1.制备各单价疫苗原液

S11.制备白喉类毒素原液：开启白喉杆菌PW8株，先在产毒培养基种子管中传1～3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用改良林氏培养基，34～36℃培养约48小时，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白，离心收集上清，超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀，加生理盐水溶解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置35～37℃，脱毒30天，除菌过滤即为白喉类毒素原液；

S12.制备破伤风类毒素原液：开启破伤风梭状芽孢杆菌，先在产毒培养基种子管中传1～3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养基，34～36℃培养62～72小时，培养结束后加入甲醛杀菌，培养液经过滤去除菌体，加入硫酸铵沉淀毒素蛋白，离心收集沉淀，超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛，置35～37℃，脱毒30天，即为破伤风类毒素原液；

S13.制备无细胞百日咳疫苗原液：开启百日咳杆菌，接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，生产用培养基选用CPB培养基，采用培养罐液体培养，于细菌对数生长期后期或静止期前期收获，收获的培养物采用离心法进行固液分离，然后分别进行分离纯化得百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素，将百日咳毒素采用戊二醛进行脱毒、百日咳黏附素和丝状血凝素采用甲醛进行脱毒，除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；

S2.合并和稀释：将无细胞百日咳原液、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入已经稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至5.8～7.2，即为无细胞百日咳疫苗。

进一步地，步骤S13中所述百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素的纯化方法分别为：

所述百日咳黏附素的纯化为：将离心后收集的菌体采用60℃热释放，超滤浓缩后，上样于Capto adhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组份，再上样于Capto SP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰；

所述丝状血凝素和百日咳毒素的纯化为：离心后的上清液超滤浓缩后上样于Capto SP层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含丝状血凝素和百日咳毒素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱，缓冲液采用Tris-HCl缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰。

本发明具有以下优点：本发明提供了一种由分离纯化的百日咳制备的无细胞百白破联合疫苗，其特点是采用柱层析技术，分别纯化百日咳保护性抗原百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)和黏附素(PRN)，定量配比后与精制纯化的破伤风类毒素、白喉类毒素配制成疫苗，其优点是疫苗成分明确，容易进行质量控制，副作用更小，安全性更好，该联合疫苗上市后可为我国儿童传染病预防工作提供安全性更好的优质疫苗，同时减少接种次数，降低接种成本，创造良好的社会和经济效益。该疫苗的制备方法具有操作简单、制备方便、成本低、适宜于工业化大规模生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：一种无细胞百日破联合疫苗，它由下述组分的原料组成：

实施例2：一种无细胞百日破联合疫苗，它由下述组分的原料组成：

实施例3：一种无细胞百日破联合疫苗，它由下述组分的原料组成：

实施例4：一种无细胞百日破联合疫苗，它由下述组分的原料组成：

实施例5：一种无细胞百日破联合疫苗，其特征在于：它由下述组分的原料组成：

实施例6：一种无细胞百日破联合疫苗，其特征在于：它由下述组分的原料组成：

实施例7：一种无细胞百日破联合疫苗，其特征在于：它由下述组分的原料组成：

实施例8：一种无细胞百日破联合疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

S1.制备各单价疫苗原液

S11.制备白喉类毒素原液：开启白喉杆菌PW8株，先在产毒培养基种子管中传1代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用改良林氏培养基，34℃培养约48小时，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白，离心收集上清，超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀，加生理盐水溶解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置35℃，脱毒30天，除菌过滤即为白喉类毒素原液；

S12.制备破伤风类毒素原液：开启破伤风梭状芽孢杆菌，先在产毒培养基种子管中传1代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养基，34℃培养62小时，培养结束后加入甲醛杀菌，培养液经过滤去除菌体，加入硫酸铵沉淀毒素蛋白，离心收集沉淀，超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛，置35℃，脱毒30天，即为破伤风类毒素原液；

S13.制备无细胞百日咳疫苗原液：开启百日咳杆菌，接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，生产用培养基选用CPB培养基，采用培养罐液体培养，于细菌对数生长期后期或静止期前期收获，收获的培养物采用离心法进行固液分离，然后分别进行分离纯化得百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素，将百日咳毒素采用戊二醛进行脱毒、百日咳黏附素和丝状血凝素采用甲醛进行脱毒，除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；

S2.合并和稀释：将无细胞百日咳原液、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入已经稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至5.8，即为无细胞百日咳疫苗。

步骤S13中所述百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素的纯化方法分别为：

所述百日咳黏附素的纯化为：将离心后收集的菌体采用60℃热释放，超滤浓缩后，上样于Capto adhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组份，再上样于Capto SP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰；

所述丝状血凝素和百日咳毒素的纯化为：离心后的上清液超滤浓缩后上样于Capto SP层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含丝状血凝素和百日咳毒素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱，缓冲液采用Tris-HCl缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰。

实施例9：一种无细胞百日破联合疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

S1.制备各单价疫苗原液

S11.制备白喉类毒素原液：开启白喉杆菌PW8株，先在产毒培养基种子管中传3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用改良林氏培养基，36℃培养约48小时，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白，离心收集上清，超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀，加生理盐水溶解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置35℃，脱毒30天，除菌过滤即为白喉类毒素原液；

S12.制备破伤风类毒素原液：开启破伤风梭状芽孢杆菌，先在产毒培养基种子管中传3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养基，36℃培养72小时，培养结束后加入甲醛杀菌，培养液经过滤去除菌体，加入硫酸铵沉淀毒素蛋白，离心收集沉淀，超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛，置37℃，脱毒30天，即为破伤风类毒素原液；

S13.制备无细胞百日咳疫苗原液：开启百日咳杆菌，接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，生产用培养基选用CPB培养基，采用培养罐液体培养，于细菌对数生长期后期或静止期前期收获，收获的培养物采用离心法进行固液分离，然后分别进行分离纯化得百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素，将百日咳毒素采用戊二醛进行脱毒、百日咳黏附素和丝状血凝素采用甲醛进行脱毒，除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；

S2.合并和稀释：将无细胞百日咳原液、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入已经稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至7.2，即为无细胞百日咳疫苗。

步骤S13中所述百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素的纯化方法分别为：

所述百日咳黏附素的纯化为：将离心后收集的菌体采用60℃热释放，超滤浓缩后，上样于Capto adhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组份，再上样于Capto SP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰；

所述丝状血凝素和百日咳毒素的纯化为：离心后的上清液超滤浓缩后上样于Capto SP层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含丝状血凝素和百日咳毒素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱，缓冲液采用Tris-HCl缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰。

实施例10：一种无细胞百日破联合疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

S1.制备各单价疫苗原液

S11.制备白喉类毒素原液：开启白喉杆菌PW8株，先在产毒培养基种子管中传2代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用改良林氏培养基，35℃培养约48小时，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白，离心收集上清，超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀，加生理盐水溶解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置36℃，脱毒30天，除菌过滤即为白喉类毒素原液；

S12.制备破伤风类毒素原液：开启破伤风梭状芽孢杆菌，先在产毒培养基种子管中传2代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养基，34～36℃培养62～72小时，培养结束后加入甲醛杀菌，培养液经过滤去除菌体，加入硫酸铵沉淀毒素蛋白，离心收集沉淀，超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛，置35～37℃，脱毒30天，即为破伤风类毒素原液；

S13.制备无细胞百日咳疫苗原液：开启百日咳杆菌，接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，生产用培养基选用CPB培养基，采用培养罐液体培养，于细菌对数生长期后期或静止期前期收获，收获的培养物采用离心法进行固液分离，然后分别进行分离纯化得百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素，将百日咳毒素采用戊二醛进行脱毒、百日咳黏附素和丝状血凝素采用甲醛进行脱毒，除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；

S2.合并和稀释：将无细胞百日咳原液、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入已经稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至5.8～7.2，即为无细胞百日咳疫苗。

进一步地，步骤S13中所述百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素的纯化方法分别为：

所述百日咳黏附素的纯化为：将离心后收集的菌体采用60℃热释放，超滤浓缩后，上样于Capto adhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组份，再上样于Capto SP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰；

所述丝状血凝素和百日咳毒素的纯化为：离心后的上清液超滤浓缩后上样于Capto SP层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含丝状血凝素和百日咳毒素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱，缓冲液采用Tris-HCl缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰。

将上述制备的无细胞百白破联合疫苗按照每人份剂量分别分装在预灌装注射瓶和西林瓶中，再包装至每人份市售独立包装。

以下通过实验说明本发明的有益效果：

成品检定：

1 鉴别试验

采用酶联免疫法检测PT、FHA、PRN抗原，应含有相应抗原(《中国药典》2010版三部“吸附百白破联合疫苗”中附录IX S)。采用絮状试验(《中国药典》2010版三部“吸附百白破联合疫苗”中附录XI D)，本品应与白喉抗毒素、破伤风抗毒素出现絮状反应。

2 物理检查

2.1 外观：振摇后应呈均匀乳白色混悬液，无摇不散的凝块或异物。

2.2 装量：依法检查(《中国药典》2010版三部，附录IA)，应不低于标示量。

3 化学检查

3.1 pH值：应为5.8～7.2

3.2 氯化钠含量：应为7.5～9.5g/L(《中国药典》2010版三部，附录VII G)。

3.3 氢氧化铝含量：应为1.0～1.5mg/ml(《中国药典》2010版三部，附录VII F)。

3.4 游离甲醛含量：应不高于0.2g/L(《中国药典》2010版三部，附录VI F)

3.5 戊二醛含量：应小于0.01g/L(《中国药典》2010版三部，附录VI D)。

4.效价测定

4.1 无细胞百日咳疫苗

每1次人用剂量中的免疫效价应不低于4.0IU(按《中国药典》2010版三部“吸附百白破联合疫苗”中附录2进行)。

4.2 白喉疫苗

每1次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于30IU(《中国药典》2010版三部，附录XI C)。

4.3 破伤风疫苗

每1次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU(《中国药典》2010版三部，附录XI B)。

5.无菌检查:依法检查(《中国药典》2010版三部，附录XII A),应符合规定。

6 特异性毒性检查

6.1 无细胞百日咳疫苗

按《中国药典》2010版三部“吸附无细胞百白破联合疫苗”附录2.5项进行。

6.2 白喉、破伤风疫苗

用体重250～350豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2.5ml，分两侧注射，每侧1.25ml，观察30天。注射部位可有浸润，经5～10天变成硬结，可能30天不完全吸收。在第10、第20、第30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏死、无破伤风及晚期麻痹症者为合格。

7.毒性逆转试验：供试品置37℃四周，按《中国药典》2010版三部“吸附无细胞百白破联合疫苗”附录2.6项进行。

采用上述方法对实施例1-7制备的无细胞百日破联合疫苗进行检测，实验结果如表1所示：

表1：无细胞百日破联合疫苗的实验检测结果

Claims (4)

1.一种无细胞百日破联合疫苗，其特征在于，它由下述组分的原料组成：

      百日咳毒素：    5～40μg；            丝状血凝素：  5～40μg；

      百日咳黏附素：  2～10μg；            白喉类毒素：  10～25lf；

      破伤风类毒素：  4～10lf；             氢氧化铝：    1.0～2.0mg/ml；

      氯化钠：        7.5～9.5g/L。

2.根据权利要求1所述的一种无细胞百日破联合疫苗，其特征在于：它由下述组分的原料组成：

      百日咳毒素：    25μg；           丝状血凝素：      25μg；

      百日咳黏附素：   8μg；           白喉类毒素：      12.5lf；

      破伤风类毒素：  5lf；               氢氧化铝：      1.0～1.5mg/ml；

      氯化钠：        7.5～9.5g/L。

3.根据权利要求1或2所述的一种无细胞百日破联合疫苗的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. 制备各单价疫苗原液

S11. 制备白喉类毒素原液：开启白喉杆菌PW8株，先在产毒培养基种子管中传1～3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用改良林氏培养基，34～36℃培养约48小时，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白，离心收集上清，超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀，加生理盐水溶解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置35～37℃，脱毒30天，除菌过滤即为白喉类毒素原液；

S12. 制备破伤风类毒素原液：开启破伤风梭状芽孢杆菌，先在产毒培养基种子管中传1～3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养基，34～36℃培养62～72小时，培养结束后加入甲醛杀菌，培养液经过滤去除菌体，加入硫酸铵沉淀毒素蛋白，离心收集沉淀，超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛，置35～37℃，脱毒30天，即为破伤风类毒素原液；

S13. 制备无细胞百日咳疫苗原液：开启百日咳杆菌，接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，生产用培养基选用CPB培养基，采用培养罐液体培养，于细菌对数生长期后期或静止期前期收获，收获的培养物采用离心法进行固液分离，然后分别进行分离纯化得百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素，将百日咳毒素采用戊二醛进行脱毒、百日咳黏附素和丝状血凝素采用甲醛进行脱毒，除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；

S2. 合并和稀释：将无细胞百日咳原液、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入已经稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至5.8～7.2，即为无细胞百日咳疫苗。

4.根据权利要求3所述的一种无细胞百日破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S13中所述百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素的纯化方法分别为：

所述百日咳黏附素的纯化为：将离心后收集的菌体采用60℃热释放，超滤浓缩后，上样于Capto adhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组份，再上样于Capto SP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰；

所述丝状血凝素和百日咳毒素的纯化为：离心后的上清液超滤浓缩后上样于Capto SP层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含丝状血凝素和百日咳毒素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱，缓冲液采用Tris-HCl缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰。