CN105518122A - 用于博德特氏菌属物种的工业规模培养的化学成分确定的培养基 - Google Patents

Abstract

用于博德特氏菌属物种的工业规模培养的化学成分确定的培养基。

Description

用于博德特氏菌属物种的工业规模培养的化学成分确定的培养基

背景

博德特氏菌属(Bordetella)是许多细菌性疾病的致病因子，例如百日咳博德特氏菌（Bordetellapertussis）（也称为百日咳嗜血杆菌（Haemophiluspertussis））导致百日咳，一种可以在婴幼儿中严重的呼吸系统疾病。该疾病的临床过程的特征在于阵发性快速咳嗽随后是吸气费力，经常伴随特征性“咳咳”的声音。在严重的情况下，缺氧可导致脑损伤；然而最常见的并发症是继发性肺炎。

百日咳通常被认为是由百日咳博德特氏菌引起的，但偶尔从具有典型的百日咳表征和症状的患者中分离出副百日咳博德特氏菌（B.parapertussis）。副百日咳博德特氏菌感染比百日咳博德特氏菌较不常见，其中5-10%的百日咳与副百日咳博德特氏菌相关（Mertsola(1985)EurJClinMicrobiol4;123;Lautrop(1971)Lancet1(7711)1195-1198）。副百日咳博德特氏菌伴随轻微的临床症状，所述临床症状加上副百日咳博德特氏菌与百日咳博德特氏菌的血清学交叉反应性，使得副百日咳博德特氏菌难以诊断。

针对百日咳博德特氏菌的第一代疫苗是全细胞疫苗，由完整的杀死的细菌构成。这些在许多国家中在20世纪50年代和60年代引进并成功减少百日咳的发病率。全细胞百日咳博德特氏菌疫苗的一个问题是与之相关的高水平的反应原性。包含纯化的百日咳博德特氏菌蛋白的无细胞疫苗具有较少的反应原性并已经改造用于很多国家的免疫接种计划。通常包含百日咳毒素（PT）、丝状血细胞凝集素（FHA）以及非常经常的百日咳杆菌粘附素（PRN）的无细胞疫苗，被广泛使用，并提供有效保护免于百日咳的严重程度。

在这些疫苗中使用的博德特氏菌毒素通过发酵博德特氏菌并分离产生的毒力因子而生成，但是博德特氏菌属物种是需复杂营养的(fastidious)生物，其难以在高浓度下生长（DoernClin.infect.dis.2000,30166-173），此外，其难以高水平表达博德特氏菌毒力因子，诸如FHA（丝状血细胞凝集素）、百日咳杆菌粘附素（PRN）和来自百日咳博德特氏菌的百日咳毒素（PT）。

博德特氏菌在化学成分确定的培养基中生长。例如，Stainer和Scholte(JournalofGeneralMicrobiology(1971),63,211-220)公开了用于生产百日咳菌(pertussis)的简单的化学成分确定的培养基。在化学成分确定的培养基中生长提供优势，因为不确定的培养基可以在其营养含量中变化导致生长和表达的不可预测性。

但是化学成分确定的培养基可以是昂贵的并且难以制造大量，此外难以设计支持高水平的毒素生产的平衡的化学确定的培养基。本发明人已惊奇地发现，可以对用于百日咳博德特氏菌物种的化学成分确定的培养基进行很多修饰以形成支持高水平的毒力因子生产的简单的培养基。

发明简述

在本发明的第一方面，提供了用于博德特氏菌属物种的化学成分确定的培养基，其中所述化学成分确定的培养基包含一种或多种下列修饰：

（i）所述化学成分确定的培养基包含少于0.035mM、少于0.030mM、少于0.020mM或少于0.010mM硫酸盐；

（ii）所述化学成分确定的培养基包含选自半胱氨酸和胱氨酸的半胱氨酸来源，其中所述半胱氨酸来源浓度少于0.50mM、少于0.30mM、少于0.25mM、少于0.20mM、少于0.15mM、少于0.10mM、少于0.05mM或少于0.03mM；

（iii）所述化学成分确定的培养基包含选自硫代硫酸盐、连三硫酸盐、连四硫酸盐、过氧二硫酸盐、硫化物和亚硫酸盐的无机硫源；

（iv）所述化学成分确定的培养基不包含有机硫源；

（v）所述化学成分确定的培养基包含选自MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）、MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）、HEPES（4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪乙磺酸）和PIPES（哌嗪-N,N'-双（2-乙磺酸））的缓冲剂；

（vi）所述化学成分确定的培养基包含大于2μM、大于3μM、大于4μM、大于5μM大于6μM铜；

（vii）所述化学成分确定的培养基包含大于2μM、大于5μM、大于10μM、大于50μM、大于100μM或大于400μM的镁；

（viii）所述化学成分确定的培养基包含单一氨基酸来源；

（ix）所述化学成分确定的培养基不包含多种氨基酸来源（asourceofaminoacids）；

（x）所述化学成分确定的培养基包含选自锌、钴、硫胺素、核黄素和泛酸盐的添加剂；

（xi）所述化学成分确定的培养基包含选自大于0.4μM生物素、大于50μM钙、大于15μM烟酸和大于25μM抗坏血酸的添加剂；或

（xii）所述化学成分确定的培养基包含选自浓度大于1000μM的天冬氨酸、浓度大于1000μM的甘氨酸、浓度大于500μM的甲硫氨酸和浓度大于1500μM的亮氨酸的氨基酸。

在本发明的第二方面，提供了用于博德特氏菌属物种的化学成分确定的培养基，其中所述化学成分确定的培养基包含至少两种组分并且其中所述至少两种组分选自：

a）大于100:1、大于125:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1（碳：磷）（mol/mol）的比例的碳和磷；

b）大于20:1、大于22:1、大于24:1或大于25:1（谷氨酸：磷）（mol/mol）的比例的谷氨酸和磷；

c）小于600:1、小于500:1、小于400:1或小于300:1（碳：镁）（mol/mol）的比例的碳和镁；

d）小于115:1、小于110:1、小于105:1或小于100:1（谷氨酸：镁）（mol/mol）的比例的谷氨酸和镁；

e）大于3000:1、大于3500:1或大于4000:1（碳：铜）（mol/mol）的比例的碳和铜；

f）大于170:1、大于180:1、大于200:1或大于250:1（谷氨酸：铜）（mol/mol）的比例的谷氨酸和铜；

g）大于9500:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（碳：铁）（mol/mol）的比例的碳和铁；

h）大于1600:1、大于1800:1、大于2000:1或大于2500:1（谷氨酸：铁）（mol/mol）的比例的谷氨酸和铁；

i）小于500:1、小于400:1、小于300:1或小于250:1（碳：甘氨酸）（mol/mol）的比例的碳和甘氨酸；

j）小于100:1、小于80:1、小于75:1或小于60:1（谷氨酸：甘氨酸）（mol/mol）的比例的谷氨酸和甘氨酸；

k）小于440:1、小于400:1、小于350:1或小于300:1（碳：亮氨酸）（mol/mol）的比例的碳和亮氨酸；

l）小于75:1、小于70:1、小于60:1或小于50:1（谷氨酸：亮氨酸）（mol/mol）的比例的谷氨酸和亮氨酸；

m）小于1200:1、小于1000:1、小于800:1或小于750:1（碳：甲硫氨酸）（mol/mol）的比例的碳和甲硫氨酸；

n）小于200:1、小于175:1、小于150:1或小于120:1（谷氨酸：甲硫氨酸）（mol/mol）的比例的谷氨酸和甲硫氨酸；

o）大于3750:1、大于4000:1、大于4500:1或大于5000:1（碳：钙）（mol/mol）的比例的碳和钙；

p）大于620:1、大于650:1、大于675:1或大于750:1（谷氨酸：钙）（mol/mol）的比例的谷氨酸和钙；

q）大于3000:1、大于3500:1、大于4750:1或大于5000:1（碳：钴）（mol/mol）的比例的碳和钴；

r）大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（谷氨酸：钴）（mol/mol）的比例的谷氨酸和钴；

s）大于3000:1、大于3500:1、大于4000:1或大于5000:1（碳：锌）（mol/mol）的比例的碳和锌；

t）大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（谷氨酸：锌）（mol/mol）的比例的谷氨酸和锌；

u）大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（碳：硫酸盐等价物）（mol/mol）的比例的碳和硫酸盐等价物；和

v）大于130:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1（谷氨酸：硫酸盐等价物）（mol/mol）的比例的谷氨酸和硫酸盐等价物。

在本发明的第三方面，提供了用于在化学成分确定的培养基（CDM）中生长博德特氏菌属物种的发酵方法，所述方法包括：

（a）用博德特氏菌属物种接种本发明的化学成分确定的培养基；

（b）在化学成分确定的培养基中维持博德特氏菌属物种持续足以允许生物质积累的一段时间。

在本发明的第四方面，提供可通过本发明的发酵方法获得的毒力因子。

在本发明的第五方面，提供通过本发明的发酵方法获得的毒力因子。

在本发明的第六方面，提供包含本发明的毒力因子的免疫原性组合物。

在本发明的第七方面，提供包含本发明免疫原性组合物的疫苗。

在本发明的第八方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在预防或治疗疾病中的用途。

在本发明的第九方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制备用于治疗或预防细菌性疾病的药物中的用途。

在本发明的第十方面，提供了预防或治疗疾病的方法，所述方法包括向患者施用疫苗的免疫原性组合物。

发明详述

化学成分确定的培养基

化学成分确定的培养基（CDM）经常被认为是有益的，因为不像化学成分不确定的培养基，化学成分确定的培养基包含精确浓度的每种营养物，因此减少培养基的变化和改善发酵产物的质量。但是产生平衡的最优的化学成分确定的培养基是困难的，因为难以预测不同细菌所需的营养物/培养基组分。理想的是，化学成分确定的培养基应该是基本平衡的，即，在发酵结束时对于细菌代谢不应该有过量的任何特定培养基组分（其由于存在过多的该培养基组分），因为平衡的培养基支持更有效的生长而且更经济。Goldner（J.Gen.Microbiol.(1966),44,439-444）已设计了用于百日咳博德特氏菌的半合成培养基，然而，这太复杂并且在工业规模使用是昂贵的。StainerScholte试图设计将是更适合于工业规模的发酵的更简单的培养基，然而，这对于毒力因子的生产不是最优的（JournalofGeneralMicrobiology(1971),63,211-220）。本发明人已经发现，可以对这些化学成分确定的培养基进行某些修饰以简化培养基或显著增加从在这种培养基中生长的博德特氏菌获得的毒力因子产量。

这些修饰包括：

（i）所述化学成分确定的培养基包含少于0.035mM、少于0.030mM、少于0.020mM或少于0.010mM硫酸盐；

（ii）所述化学成分确定的培养基包含选自半胱氨酸和胱氨酸的半胱氨酸来源，其中所述半胱氨酸来源浓度少于0.50mM、少于0.30mM、少于0.25mM、少于0.20mM、少于0.15mM、少于0.10mM、少于0.05mM或少于0.03mM；

（iii）所述化学成分确定的培养基包含选自硫代硫酸盐、连三硫酸盐、连四硫酸盐、过氧二硫酸盐、硫化物和亚硫酸盐的无机硫源；

（iv）所述化学成分确定的培养基不包含有机硫源；

（v）所述化学成分确定的培养基包含选自MOPS、MES、HEPES和PIPES的缓冲剂；

（vi）所述化学成分确定的培养基包含大于2μM、大于3μM、大于4μM、大于5μM或大于6μM的铜；

（vii）所述化学成分确定的培养基包含大于2μM、大于5μM、大于10μM、大于50μM、大于100μM或大于400μM的镁；

（viii）所述化学成分确定的培养基包含单一氨基酸来源；

（ix）所述化学成分确定的培养基不包含多种氨基酸来源；

（x）所述化学成分确定的培养基包含选自锌、钴、硫胺素、核黄素和泛酸盐的添加剂；

（xi）所述化学成分确定的培养基包含选自大于0.4μM生物素、大于50μM钙、大于15μM烟酸和大于25μM抗坏血酸的添加剂；或

（xii）所述化学成分确定的培养基包含选自浓度大于1000μM的天冬氨酸、浓度大于1000μM的甘氨酸、浓度大于500μM的甲硫氨酸和浓度大于1500μM的亮氨酸的氨基酸。

因此，在本发明的第一方面，提供了用于博德特氏菌属物种的化学成分确定的培养基，其中所述化学成分确定的培养基包含一种或多种上述修饰。

此外，在尝试配制新的化学成分确定的培养基时经常涉及取复合培养基并用等价量的个别化学成分确定的组分替换复合培养基组分（诸如，casmino酪蛋白水解物）。但是，本发明人已经惊奇地发现，培养基组分间的比例可以对于保证化学成分确定的培养基是平衡的并且支持高产量的毒力因子生产而言是非常重要的。

因此，在本发明的第二方面，提供了用于博德特氏菌属物种的化学成分确定的培养基，其中所述化学成分确定的培养基包含至少两种组分并且其中所述至少两种组分选自：

a）大于100:1、大于125:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1（碳：磷）（mol/mol）的比例的碳和磷；

b）大于20:1、大于22:1、大于24:1或大于25:1（谷氨酸：磷）（mol/mol）的比例的谷氨酸和磷；

c）小于600:1、小于500:1、小于400:1或小于300:1（碳：镁）（mol/mol）的比例的碳和镁；

d）小于115:1、小于110:1、小于105:1或小于100:1（谷氨酸：镁）（mol/mol）的比例的谷氨酸和镁；

e）大于3000:1、大于3500:1或大于4000:1（碳：铜）（mol/mol）的比例的碳和铜；

f）大于170:1、大于180:1、大于200:1或大于250:1（谷氨酸：铜）（mol/mol）的比例的谷氨酸和铜；

g）大于9500:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（碳：铁）（mol/mol）的比例的碳和铁；

h）大于1600:1、大于1800:1、大于2000:1或大于2500:1（谷氨酸：铁）（mol/mol）的比例的谷氨酸和铁；

i）小于500:1、小于400:1、小于300:1或小于250:1（碳：甘氨酸）（mol/mol）的比例的碳和甘氨酸；

j）小于100:1、小于80:1、小于75:1或小于60:1（谷氨酸：甘氨酸）（mol/mol）的比例的谷氨酸和甘氨酸；

k）小于440:1、小于400:1、小于350:1或小于300:1（碳：亮氨酸）（mol/mol）的比例的碳和亮氨酸；

l）小于75:1、小于70:1、小于60:1或小于50:1（谷氨酸：亮氨酸）（mol/mol）的比例的谷氨酸和亮氨酸；

m）小于1200:1、小于1000:1、小于800:1或小于750:1（碳：甲硫氨酸）（mol/mol）的比例的碳和甲硫氨酸；

n）小于200:1、小于175:1、小于150:1或小于120:1（谷氨酸：甲硫氨酸）（mol/mol）的比例的谷氨酸和甲硫氨酸；

o）大于3750:1、大于4000:1、大于4500:1或大于5000:1（碳：钙）（mol/mol）的比例的碳和钙；

p）大于620:1、大于650:1、大于675:1或大于750:1（谷氨酸：钙）（mol/mol）的比例的谷氨酸和钙；

q）大于3000:1、大于3500:1、大于4750:1或大于5000:1（碳：钴）（mol/mol）的比例的碳和钴；

r）大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（谷氨酸：钴）（mol/mol）的比例的谷氨酸和钴；

s）大于3000:1、大于3500:1、大于4000:1或大于5000:1（碳：锌）（mol/mol）的比例的碳和锌；

t）大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（谷氨酸：锌）（mol/mol）的比例的谷氨酸和锌；

u）大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（碳：硫酸盐等价物）（mol/mol）的比例的碳和硫酸盐等价物；和

v）大于130:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1（谷氨酸：硫酸盐等价物）（mol/mol）的比例的谷氨酸和硫酸盐等价物。

术语“化学成分确定的培养基”指基本上不含复合材料诸如酵母、酪蛋白氨基酸、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物的培养基。参见，例如Jayme和Smith,Cytotechnology33(1-3):27-36(2000)。特别是，如本文所用，化学成分确定的培养基不包括酪蛋白氨基酸（CAA）作为培养基中氨基酸的来源。如本文所用，酪蛋白氨基酸指通过水解酪蛋白获得的氨基酸的混合物。

本发明的CDM在正项（培养基中包括的成分或组分）和负项（培养基中排除的成分或组分）进行描述。

“来源”是为培养基提供至少一种特定成分的培养基组分。例如，胱氨酸是半胱氨酸的来源，因为其提供半胱氨酸用于被培养基中生长的生物所利用。如本文所用，成分本身被认为是“来源”，例如，硫酸盐是硫酸盐的来源，并且半胱氨酸是半胱氨酸的来源等。“来源”可以提供多于一种成分，例如，氨基酸可以是碳源和氮源，以及氨基酸来源。

术语“培养基”指足以允许博德特氏菌生长成相当高密度（例如达到超过1.0g/L、超过1.5g/L，超过2.0g/L或超过2.5g/L干细胞重量的生物质）的营养物的来源。

本发明的化学成分确定的培养基用于博德特氏菌属物种的工业规模的培养，术语“工业规模培养”指在发酵罐中的培养，在一个实施方案中，工业规模的培养是在具有如下工作体积的发酵罐中的培养：5-10000升、10-5000升、20-2000升、50升-1000升、大于或等于5升、大于或等于10升、大于或等于15升、大于或等于20升、大于或等于25升、大于或等于50升、大于或等于100升、小于或等于10000升、小于或等于5000升或小于或等于2500升。在进一步的实施方案中，“工业规模培养”是适合用于大于10mg/L、大于15mg/L或大于20mg/L百日咳毒素的生产的培养。

在发酵方法过程中，在方法的开始，将本发明的化学成分确定的培养基添加到发酵罐，尽管，任选地培养基的其它部分可以在发酵方法过程中添加（例如在分批补料发酵中）；可选地，具有不同组成的培养基可以在发酵中晚一点添加。这样的培养基也可以连续添加到培养基中，用于在诸如恒化器或retentostats的系统中使用。优选地，发酵是分批补料发酵。

本发明的化学成分确定的培养基优选地支持博德特氏菌属物种的生长产量高于StainerScholte培养基（描述于JournalofGeneralMicrobiology(1971),63:211-220）所支持的生长产量。这可以通过用博德特氏菌菌株的第一样品接种包含StainerScholte培养基的摇瓶或发酵罐并用博德特氏菌菌株的第二样品接种包含要测试的化学成分确定的培养基的摇瓶或发酵罐（使用与选择用于StainerScholte培养基的体积相同的体积），接种博德特氏菌菌株来确定。对于两种样品应在多个两个时间点取OD_650nm，这些时间点必须包括刚好在接种后的时间点（称为时间点A）和在生长结束时的时间点（称为时间点B）。需要注意的是，当两个连续时间点之间（间隔至少24小时）的细胞浓度增加没有超过10%时，则认为生长已停止。如果在时间点B和时间点A之间的OD_650nm差异对于第二样品高于StainerScholte培养基中接种的第一样品，则待测试的化学成分确定的培养基支持博德特氏菌属物种比由StainerScholte培养基所支持的更高的生长产量。

化学成分确定的培养基优选支持少于15h、少于12h、少于10h或少于9h的博德特氏菌属物种的平均世代时间。这可以使用第[028]段中所述的类似方法测试，但是通过用时间点A和时间点B之间的时间除以这些两个时间点之间世代数目来获得平均世代时间。通过计算在第二时间点的OD_650nm与在第一时间点的的OD_650nm比率，转化成Log₂，获得时间点A和时间点B之间的世代数目。

所述化学成分确定的培养基优选地支持比StainerScholte培养基所支持的更高水平的百日咳毒素生产。这可通过如下确定：用百日咳博德特氏菌菌株的第一样品接种含有StainerScholte培养基的摇瓶或发酵罐并用百日咳博德特氏菌菌株的第二样品接种含有待测试的化学成分确定的培养基的摇瓶或发酵罐（与对于StainerScholte培养基所选体积相同的体积），孵育两个样品直到增长已经停止，并计算每个样品中的百日咳毒素产生水平。一种用于确定百日咳毒素产生水平的方法描述于实施例1中。如果对于第二样品的百日咳毒素产生水平高于对于第一样品的水平，则化学成分确定的培养基支持比由StainerScholte培养基支持的更高水平的百日咳毒素的产生。

在一个优选的实施方案中，本发明的化学成分确定培养基支持博德特氏菌属物种产生百日咳毒素，具有大于10mg/L，或大于1510mg/L的产量，更优选产量为大于20mg/L。是否化学成分确定的培养基支持博德特氏菌属物种以产生具有特定产量的百日咳毒素可通过用博德特氏菌属物种的样品接种化学成分确定的培养基并孵育细胞直至生长停止来确定。在生长结束时，可以使用实施例1中描述的方法来计算百日咳毒素的产量。

在一个实施方案中，化学成分确定的培养基是基本上平衡的培养基。基本上平衡的培养基这样的培养基，其中在发酵结束时，没有任何特定营养物的显著过量。是否化学成分确定的培养基是基本平衡的培养基可以通过在培养基中孵育博德特氏菌属物种直至生长停止并在生长停止后检查培养基上清液进行测试。如果代谢源（即氮、磷和硫的来源）以基本上类似的速率（彼此的10％之内）使用，则该化学上确定的培养基是平衡的。在优选实施方案中，所有代谢来源的最终浓度将是在0mM左右。

通常化学成分确定的培养基必须包含至少碳源、磷源、氮源、硫源和缓冲剂。氮源可以是有机的或无机的。氮源可以是氨基酸或肽，或者氮源可以是非氨基酸或肽的氮源，在这样的化学成分确定的培养基中，所述化学成分确定的培养基不包含氨基酸。在一个实施方案中，氮源是无机的。在一个实施方案中，氮源包含选自氨基酸、尿素、多胺、铵（诸如氯化铵、硫酸铵或硝酸铵）、核碱基、核苷和核苷酸的化合物或由其组成。在进一步的实施方案中，氮源包含氯化铵或由其组成。碳源可以包含氨基酸或肽或由其组成，或可以包含非氨基酸或肽的碳源或由其组成；在这样的化学成分确定的培养基中，所述化学成分确定的培养基不包含氨基酸。如本文所用术语“不包含氨基酸”是指培养基也“不包含”肽或蛋白质，因为肽或蛋白质是氨基酸的来源。在一个实施方案中，碳源包含选自单糖、二糖、多糖、多元醇（糖醇）、有机酸和氨基酸的化合物或由其组成。在进一步的实施方案中，碳源包含选自葡萄糖、果糖、山梨糖、半乳糖胺、甘露糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、柠檬酸、乳酸、乙酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、脯氨酸和谷氨酸的化合物或由其组成。在进一步的实施方案中，碳源包含谷氨酸或脯氨酸。在进一步的实施方案中，碳源包含选自柠檬酸、乳酸、乙酸、丙酮酸、富马酸和琥珀酸的有机酸或由其组成。

本发明的化学成分确定的培养基是用于博德特氏菌属物种的工业规模培养。在一个实施方案中，培养基包含博德特氏菌属物种。在一个实施方案中，博德特氏菌属物种是选自Bordetellapetrii、鸟博德特氏菌（Bordetellaavium）、Bordetellahinzii、Bordetellatrematum、霍氏博德特氏菌（Bordetellaholmesii）、副百日咳博德特氏菌（Bordetellaparapertussis）、支气管炎博德特氏菌（Bordetellabronchiseptica）和百日咳博德特氏菌（也称为百日咳嗜血杆菌）的物。优选地，博德特氏菌属物种选自副百日咳博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌和百日咳博德特氏菌。更优选博德特氏菌属物种是百日咳博德特氏菌。

硫源

在第一实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含少于0.035mM、少于0.030mM、少于0.020mM、少于0.010mM硫酸盐，少于0.005mM、少于0.0001mM、少于0.00005mM、少于0.00001mM，0.035mM-0mM、0.005mM-0mM或0.00001mM-0mM。本发明人已经惊奇地发现当在用于博德特氏菌的化学成分确定的培养基中使用时，从化学成分确定的培养基去除硫酸盐显著地增加毒力因子诸如PT的产量。WO0178462和Lacey(1960;J.Hyg.58:57-93)公开了如下想法，硫酸盐可以是毒力因子生产的抑制剂，但是WO0178462中公开的低硫酸盐培养基包含0.001g/L添加的FeSO₄。因此，清楚的是，WO0178462中的发明人认为需要存在至少某些量的FeSO₄，以便产生化学成分确定的培养基以允许百日咳菌生长。值得注意的是，为了获得高水平的毒力因子，培养基必须同时支持毒力因子产生和博德特氏菌生长到合适的生物质，因此尽管已知硫酸盐抑制毒力因子表达，但是不知道博德特氏菌可以在不存在硫酸盐的情况下生长到合理的生物质。还应当注意的是Jebb和Tomlinson(J.Gen.Microbiol.17,59-68)公开了硫酸盐不足以提供硫源，这与其它继续向他们的培养基添加硫酸盐的现有技术和引用Jebb和Tomlinson的后来的文献(诸如Licary,SiberandSwartzJournalofBiotechnologyl20(1991)117-130)矛盾。此结论被其它关于用于博德特氏菌的培养基的公开物所支持，通常这些公开物都似乎需要存在硫酸盐（例如，如上述StainerScholte培养基包含硫酸盐）。但是，本发明人已经惊奇地发现，FeSO₄可以用柠檬酸铁(III)替换以去除硫酸盐（因此减少了毒力因子表达的抑制），并仍然提供支持博德特氏菌生长的有效的培养基，并且降低硫酸盐的浓度甚至低于WO0178462中所公开的浓度提供了毒力因子诸如PT产量的显著增加。在进一步的实施方案中，化学成分确定的培养基不包含硫酸盐。

短语“不包含”特定物质诸如硫酸盐指其中培养基的制造者未添加显著量的该物质的培养基。因此，如果培养基包含小量的特定物质，则可以认为培养基“不包含”该物质，所述物质是例如污染物。或者，如果培养基的制造者已添加了非常小量的不足以改变毒力因子诸如百日咳毒素的产量的特定物质，则该培养基可以被认为“不包含”该物质。这可以通过在小量该物质的存在下和不存在小量该物质的情况下培养博德特氏菌属物种并使用ELISA测量该毒力因子在这两种培养物中的产量来确定。合适的ELISA描述于第[122]段。

在一个实施方案中，本发明提供了包含选自半胱氨酸和胱氨酸的半胱氨酸来源的化学成分确定的培养基，其中半胱氨酸的来源以下列浓度：少于0.50mM、少于0.30mM、少于0.25mM、少于0.20mM、少于0.15mM、少于0.10mM、少于0.05mM、少于0.03mM、少于0.01mM、少于0.005mM、少于0.001mM、少于0.0005mM、少于0.0001mM、少于0.00005mM或少于0.00001mM。

半胱氨酸通常用于通过博德特氏菌的生物质合成，但是，当半胱氨酸以更高浓度存在时，它将被代谢为硫酸盐（Bogdan等((2001);Infect.Immun.69:6823-6830)）。此硫酸盐不能被同化，因为硫酸盐同化途径无功能（Parkhill等((2003);Nat.Genet.35:32-40)）。因此，在培养基中使用高浓度的半胱氨酸可以提供硫酸盐离子，其如上述抑制毒力因子表达。但是，Bogdan等认为生长需要半胱氨酸，因此，Bogdan等公开的培养基（甚至包含假设减少的量的半胱氨酸的那些）包含相对高浓度的半胱氨酸。类似地，Jebb和Tomlinson（J.Gen.Microbiol.17,59-68）描述了半胱氨酸的存在对于生长是必需的。但是本发明人已经首次证明，博德特氏菌可以在不存在半胱氨酸的情况下生长并因此可以使用比Bogdan等公开的那些甚至更低浓度的半胱氨酸。

胱氨酸是半胱氨酸的二聚体，其可以被博德特氏菌以与半胱氨酸类似的方式代谢，但是对博德特氏菌提供两倍量的半胱氨酸。

在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基不包含半胱氨酸或胱氨酸。在优选的实施方案中，所述化学成分确定的培养基不包含硫酸盐、半胱氨酸或胱氨酸。

在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含选自硫代硫酸盐、连三硫酸盐、连四硫酸盐、过氧二硫酸盐、硫化物和亚硫酸盐的无机硫源。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基不包含有机硫源。

本发明人已经首次证明，可以使用无机硫作为硫源（而非半胱氨酸）用于生长博德特氏菌。

从现有技术，例如Jebb和Tomlinson(J.Gen.Microbiol.17,59-68)，表现出，对于博德特氏菌的生长需要有机硫源。这是因为，已知用于从硫酸盐和硫代硫酸盐合成半胱氨酸的途径在博德特氏菌属的成员中不发挥功能（Parkhill等((2003);Nat.Genet.35:32-40)）。但是，发明人已经首次证明博德特氏菌可以在不存在有机硫源的情况下生长（只要存在无机硫源诸如硫代硫酸盐）。

在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含硫代硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.005mM、大于0.006mM、大于0.007mM、大于0.008mM、大于0.010mM、大于0.050mM、大于0.100mM、0.005mM-0.100mM、0.005mM-0.050mM、0.005mM-0.025mM、约0.120mM或约0.011mM硫代硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含连三硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.003mM、大于0.004mM、大于0.005mM、大于0.008mM、大于0.010mM、大于0.020mM、大于0.050mM、0.003mM-0.500mM、0.003mM-0.100mM、0.005mM-0.010mM、约0.007mM或约0.080mM连三硫酸盐。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含连四硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.002mM、大于0.003mM、大于0.004mM、大于0.005mM、大于0.025mM、大于0.050mM、0.002mM-1.000mM、0.002mM-1.000mM、0.010mM-0.100mM、约0.060mM或约0.0006mM连四硫酸盐。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含过氧二硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.005mM、大于0.006mM、大于0.007mM、大于0.008mM、大于0.010mM、大于0.050mM、大于0.100mM、0.005mM-1.000mM、0.005mM-0.200mM、0.005mM-0.015mM、约0.120mM或约0.011mM过氧二硫酸盐。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含硫化物。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.010mM、大于0.012mM、大于0.014mM、大于0.016mM、大于0.020mM、大于0.100mM、大于0.200mM、0.010mM-1.000mM、0.010mM-0.300mM、0.010mM-0.100mM、约0.240mM或约0.022mM硫化物。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含亚硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.010mM、大于0.012mM、大于0.014mM、大于0.016mM、大于0.020mM、大于0.100mM、大于0.200mM、约0.240mM或约0.022mM亚硫酸盐。

在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含硫代硫酸盐和连三硫酸盐、硫代硫酸盐和连四硫酸盐、硫代硫酸盐和过氧二硫酸盐、硫代硫酸盐和硫化物、硫代硫酸盐和亚硫酸盐、连三硫酸盐和连四硫酸盐、连三硫酸盐和过氧二硫酸盐、连三硫酸盐和硫化物、连三硫酸盐和亚硫酸盐、连四硫酸盐和过氧二硫酸盐、连四硫酸盐和硫化物、连四硫酸盐和亚硫酸盐、过氧二硫酸盐和硫化物、过氧二硫酸盐和亚硫酸盐或硫化物和亚硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含选自硫代硫酸盐、连三硫酸盐、连四硫酸盐、过氧二硫酸盐、硫化物和亚硫酸盐的2、3、4、5、6或更多种无机硫源。

在优选的实施方案中，所述化学成分确定的培养基不包含硫酸盐、半胱氨酸或胱氨酸，并且不包含大于0.005mM、大于0.006mM、大于0.007mM、大于0.008mM、大于0.010mM、大于0.050mM、大于0.100mM、0.005mM-0.100mM、0.005mM-0.050mM、0.005mM-0.025mM、约0.120mM或约0.011mM硫代硫酸盐。

缓冲剂

在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含选自MOPS、MES、HEPES和PIPES的缓冲剂。

本发明人已经惊奇地发现包含除Tris和β-甘油磷酸盐之外的缓冲剂，特别是MOPS缓冲剂的化学成分确定的培养基展示相比其它培养基改善的百日咳博德特氏菌的生长速率。在用于百日咳博德特氏菌的化学成分确定的培养基中使用的可替换的缓冲剂由Lothe等(JournalofBiologicalStandardisation(1985)13,129-134)探索，但是，他们的结论是β-甘油磷酸盐是优异的缓冲剂。但是，本发明人已经发现不仅其它缓冲剂可以是有效的，而且MOPS也展示相对于β-甘油磷酸盐的改进。由于此原因，本发明提供了包含MOPS缓冲剂的化学成分确定的培养基。在一个实施方案中，所述缓冲剂是以下列浓度的MOPS：大于2mM、大于5mM、大于7mM、大于9mM、大于10mM、大于11mM、2mM-100mM、2mM-50mM、5mM-20mM或约12mM。

高浓度的铜

据证实，在用于博德特氏菌的培养基中不需要铜（Stainer和ScholteJournalofGeneralMicrobiology(1971),63:211-220），但本发明人惊奇地发现，向用于博德特氏菌的化学成分确定的培养基中添加相对高浓度的铜导致由博德特氏菌产生的毒素的量显著增加（例如从百日咳博德特氏菌表达百日咳毒素）。

因此，在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于2μM、大于3μM、大于4μM、大于5μm、大于6μM、大于7μM、大于8μM、小于200μM、小于150μM、小于100μM、4μM-10μM、2μM-200μM、3μM-150μM或5μM-100μM铜。在一个实施方案中，铜源选自氯化铜、硫酸铜、乙酸铜、氯酸铜和碳酸铜。在进一步的实施方案中，铜是以氯化铜的形式。

高浓度的镁

已知高浓度的镁调节博德特氏菌，并且诱导博德特氏菌转化为它们不大可能表达毒力因子诸如百日咳毒素和FHA的状态（Idigbe等J.MED.MICROBIOL(1981)409-418)andLacey等((1960)J.Hyg.58:57-93)）。如上文所解释的，在诱导高的毒素表达水平的环境中生长博德特氏菌是有利的，已知添加镁减少毒力因子表达并因此为了博德特氏菌疫苗生产，从培养基中去除镁。但是，本发明人已经惊奇地发现，添加高浓度镁可以在化学成分确定的培养基中使用，并具有高水平的毒力因子诸如PT的表达。

由于这些原因，在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含大于2μM、大于5μM、大于10μM、大于25μM、大于50μM、大于75μM、大于100μM、大于200μM、大于300μM、大于400μM、2μM-6000μM、1000μM-6000μM或约5000μM镁。

氨基酸来源

通常已知培养基必须包括氮源和碳源；在很多情况下，对于生长需要特定氨基酸（必需氨基酸）。Stainer和Scholte(Stainer和ScholteJournalofGeneralMicrobiology(1971),63:211-220)尝试创造简化的化学成分确定的培养基，但是，他们的结论是需要至少两种氨基酸，即谷氨酸、脯氨酸和胱氨酸。

但是，本发明人已经惊奇地发现博德特氏菌可以在仅包含一种类型氨基酸的培养基中生长。特别是，发明人已经证明，博德特氏菌可以在包含仅单一氨基酸并且不包含半胱氨酸的培养基上生长，这特别令人惊奇，因为，如上述，先前认为需要半胱氨酸作为硫源。这是有利的，因为如上述，用于商业用途的培养基应当尽可能简单以便减少制造培养基的困难、降低培养基成本和减少潜在的批次到批次的变异的来源。

由于此原因，在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含单一氨基酸来源。术语“单一氨基酸来源”指为培养基提供一种类型氨基酸来源（诸如谷氨酰胺或天冬酰胺或另一种氨基酸来源）的化合物，化合物诸如胱氨酸可以被认为是单一氨基酸来源，因为尽管这是二肽，但这仅包含半胱氨酸并因此仅提供单一的氨基酸。值得注意的是，如果存在半胱氨酸和胱氨酸两者，则培养基会被认为包含单一氨基酸来源，因为这两种化合物向培养基提供仅半胱氨酸（单一氨基酸）。此术语包括氨基酸的D-和L-对映异构体。在一个实施方案中，所述氨基酸来源是D-对映异构体，在进一步的实施方案中，所述氨基酸来源是L-对映异构体，在进一步的实施方案中，所述氨基酸来源可以L-对映异构体或D-对映异构体。具有“单一氨基酸来源”的培养基不包含其它氨基酸，例如具有半胱氨酸作为单一氨基酸来源的培养基不包含谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸或任何其它氨基酸。如上文所解释的，术语“不包含”特定物质诸如特定氨基酸指其中培养基的制造者未添加显著量的该物质的培养基。因此，如果培养基包含小量的特定物质，则可以认为培养基“不包含”该物质，所述物质是例如污染物。或者，如果培养基的制造者已添加了非常小量的不足以改变毒力因子诸如百日咳毒素的产量的特定物质，则该培养基可以被认为“不包含”该物质。这可以通过在小量该物质的存在下和不存在小量该物质的情况下培养博德特氏菌属物种并使用ELISA测量毒力因子在这两种培养物中的产量来确定(如上述)。在进一步的实施方案中，单一氨基酸来源是单一氮源。

在一个实施方案中，所述单一氨基酸来源选自半胱氨酸、胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和甲硫氨酸。在一个实施方案中，所述单一氨基酸来源是以下列浓度的半胱氨酸：大于75mM、大于100mM、大于125mM、75mM-250mM、100mM-150mM或约125mM。在一个实施方案中，所述单一氨基酸来源是以下列浓度的脯氨酸：大于75mM、大于100mM、大于125mM、75mM-250mM、100mM-150mM或约125mM。在一个实施方案中，所述单一氨基酸来源是以下列浓度的谷氨酸：大于75mM、大于100mM、大于125mM、75mM-250mM、100mM-150mM或约125mM。在一个实施方案中，所述单一氨基酸来源是以下列浓度的谷氨酰胺：大于75mM、大于100mM、大于125mM、75mM-250mM、100mM-150mM或约125mM。在一个实施方案中，所述单一氨基酸来源是以下列浓度的天冬氨酸：大于10mM、大于20mM、大于30mM、10mM-100mM、20mM-50mM或约30mM。在一个实施方案中，所述单一氨基酸来源是以下列浓度的天冬酰胺：大于75mM、大于100mM、大于125mM、75mM-250mM、100mM-150mM或约125mM。在一个实施方案中，所述单一氨基酸来源是以下列浓度的丝氨酸：大于75mM、大于100mM、大于125mM、75mM-250mM、100mM-150mM或约125mM。在一个实施方案中，所述单一氨基酸来源是以下列浓度的丙氨酸：大于75mM、大于100mM、大于125mM、75mM-250mM、100mM-150mM或约125mM。

本发明人已经进一步证明，尽管在用于博德特氏菌的化学成分确定的培养基中使用单一氨基酸来源是有利的，因为这可以支持毒素的高生产，但是也可以开发完全不包含氨基酸来源的培养基。这提供了其中通过单独组分提供碳源和氮源的培养基，这允许人们分别操纵碳和氮源。的确，Thalen等（JournalofBiotechnology(1999)75:147-159）报道1:5的氮碳比（如在Stainer和Scholte培养基中所发现的（JournalofGeneralMicrobiology(1971),63:211-220））对于博德特氏菌的生长不是最优的，并且导致铵的积累。Thalen等证明铵积累可以通过使用1:10的氮比碳比例显著减少。但是，用天然存在的氨基酸不能获得这样的比例，对于天然存在的氨基酸，该比例通过分子组成确定，并且范围从1:1.5（精氨酸）到1:9（酪氨酸和苯丙氨酸）。为了绕过这个限制，Thalen等通过添加不包含氮的第二碳源（乳酸（有机酸））来操纵碳氮比。但是，此溶液在代谢流方面是复杂的，这从而使得过程监测和理解，以及平衡的培养基的获得变得复杂（Neeleman等(AppliedMicrobiologyandBiotechnology(2001),57:489-493)）。完全消除氨基酸提供了精确操作碳氮比的替代方案，通过小心地调节一方面不包含氮的碳源和另一方面不包含碳的氮源的相对浓度。为此原因，在一个进一步的实施方案中，化学成分确定的培养基不包含氨基酸来源。

培养基应当包含碳源，如果培养基不包含氨基酸来源，则碳源优选是有机酸。在一个实施方案中，有机酸选自柠檬酸、乳酸、乙酸、丙酮酸、富马酸和琥珀酸。本发明人已经证明有机酸是作为碳源用于博德特氏菌支持合理的生长水平的谷氨酸的合适的替代。

在一个实施方案中，如果化学成分确定的培养基包含单个氨基酸来源，或不包含多种氨基酸来源，则化学成分确定的培养基还包含至少一种化学上确定的培养基组分，所述化学上确定的培养基组分包括磷酸氢钾、氯化钾、镁、钙、柠檬酸铁（Ⅲ）、MOPS缓冲剂、烟酸、二甲基-β-环糊精、铜或钴，优选所述培养基包含2、3、4、5、6、7、8或9种这些组分。在优选的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含所有这些组分。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基还可以包含钠、锌、生物素、核黄素、泛酸钙。优选地，所述培养基包含钠、锌、生物素、核黄素和泛酸钙。

在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含单一氨基酸来源或不包含多种氨基酸来源，并且所述化学确定的培养基的确包含250mg/L-750mg/LKH₂PO₄、100-300mg/LKCl、500-1500mg/LMgCl₂.6H₂O、50mg/L-150mg/LCaCl₂.2H₂O、10mg/L-30mg/L柠檬酸铁(III).3H₂O、1000mg/L-5000mg/LMOPS、4mg/L-8mg/L烟酸、500mg/L-2000mg/L二甲基-β-环糊精、0.5mg/L-2mg/LCuCl₂.2H₂O和0.1mg/L-1mg/LCoCl₂.H₂O。在进一步的实施方案中，所述培养基进一步包含1mg/L-25mg/LZnCl₂、0.01-1.00mg/L生物素、0.01-1.00mg/L核黄素、1mg/L-10mg/L泛酸钙和5000mg/L-1500mg/LNaCl。

其它有益的添加剂

如上述，认为化学成分确定的培养基必须包含至少碳源、氮源、磷源、硫源和缓冲剂。通常，有利的是将化学成分确定的培养基设计为简单的（不包含太多组分）因为这减少成本和制造复杂性。但是，本发明人已经证明添加选自下列的添加剂可以显著改善毒力因子诸如百日咳毒素的产量：锌、钴、硫胺素、核黄素、泛酸盐、大于0.4μM生物素、大于50μM钙、大于15μM烟酸和大于25μM抗坏血酸。

因为此原因，在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含选自锌、钴、硫胺素、核黄素和泛酸盐的添加剂。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含选自大于0.4μM生物素、大于50μM钙、大于15μM烟酸和大于25μM抗坏血酸的添加剂。

在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含至少2、3、4、5、6、7、8或9种这些添加剂。在优选的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含锌、钴、核黄素、硫胺素、泛酸盐、大于0.4μM生物素、大于0.05mM钙、大于15μM烟酸和大于25μM抗坏血酸的所有。在一个实施方案中，化学成分确定的培养基中添加剂的浓度对于添加剂足以增加博德特氏菌的毒力因子生产水平（这可以使用第[036]段中的测定进行检查以测量添加剂的添加是否改变百日咳毒素的产量）。

在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.1μM、大于1μM、大于5μM、大于10μM、大于20μM、大于30μM、大于40μM、大于50μM、大于60μM、大于70μM、大于100μM、大于200μM、大于400μM、大于400μM、大于600μM、大于700μM、10μM-2000μM、20μM-1000μM、30μM-100μM或约75μM锌。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.05μM、大于0.10μM、大于0.15μM、0.10μM-0.30μM、0.10μM-0.20μM或约0.18μM钴。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.05μM、大于0.10μM、大于0.15μM、0.05μM-5.00μM、0.10μM-1.00μM、或0.15μM-0.50μM硫胺素。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于大于0.1μM、大于0.2μM、大于0.3μM、大于0.4μM大于0.5μM、大于0.6μM、大于0.8μM、0.1μM-10μM、0.5μM-1.0μM或约0.8μM核黄素。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.10μM、大于0.5μM、大于1.0μM、大于1.5μM、大于2.0μM、大于5.0μM、大于8.0μM、0.5μM-100μM、0.5μM-25.0μM、5.0μM-10.0μM、或约8.0μM泛酸盐。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.4μM、大于0.5μM、大于0.6μM、大于0.8μM、0.5μM-100μM、0.5μM-25.0μM、5.0μM-10.0μM、或约8.0μM生物素。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于100μM、大于120μM、大于140μM、50μM-1000μM、50μM-500μM、100μM-200μM或约140μM钙。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于20μM、大于30μM、大于35μM、15μM-500μM、15μM-100μM、25μM-75μM或约50μM烟酸。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于50μM、大于75μM、大于100μM、大于1000μM、大于2000μM、大于3000μM、25μM-10000μM、10000μM-5000μM、或约3500μM抗坏血酸。

在优选实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0.01mM锌、大于0.0005mM钴、大于0.005mM硫胺素、大于0.0001mM核黄素、大于0.005泛酸盐、大于0.4μM生物素、大于0.05mM钙、大于15μM烟酸和大于25μM抗坏血酸。

在进一步优选的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于700μM锌、大于0.15μM钴、大于29μM硫胺素、大于0.8μM核黄素、大于8.0μM泛酸盐、大于0.8μM生物素、大于140μM钙、大于35μM烟酸和大于3000μM抗坏血酸。

在进一步优选的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含10μM-150μM锌、0.10μM-0.30μM钴、25μM-200μM硫胺素、0.1μM-10μM核黄素、0.5μM-100μM泛酸盐、0.5μM-100μM生物素、50μM-1000μM钙、1μM-500μM烟酸和25μM-10000μM抗坏血酸。

在进一步优选的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含30μM-80μM锌、0.10μM-0.20μM钴、25μM-50μM硫胺素、0.5μM-1.0μM核黄素、5.0μM-10.0μM泛酸盐、5.0μM-10.0μM生物素、100μM-200μM钙、25μM-75μM烟酸和10000μM-5000μM抗坏血酸。

氨基酸浓度

本发明人已经进一步的证明，现有技术培养基诸如StainerScholte培养基可以通过添加高水平的天冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸而改善。因此，在进一步的实施方案中，提供了化学成分确定的培养基，其包含来自由浓度大于1000μM的天冬氨酸、浓度大于1000μM的甘氨酸、浓度大于500μM的甲硫氨酸和浓度大于1500μM的亮氨酸组成的组的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的天冬氨酸：大于1000μM、大于2000μM、大于2450μM、大于3000μM、大于3500μM、1000μM-10000μM、1000μM-5000μM或约4000μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的甘氨酸：大于500μM、大于1000μM、大于1500μM、大于1750μM、500μM-5000μM、500μM-2500μM或约2000μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的甲硫氨酸：大于100μM、大于300μM、大于500μM、大于600μM、大于700μM、100μM-2000μM、100μM-1000μM或约775μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的亮氨酸：大于500μM、大于1000μM、大于1500μM、大于2000μM、大于2500μM、大于3000μM、500μM-10000μM、500μM-5000μM、3000μM-4000μM或约3300μM。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下的至少2、3或4种：浓度大于100μM的天冬氨酸、浓度大于1000μM的甘氨酸、浓度大于500μM的甲硫氨酸和浓度大于1500μM的亮氨酸。在优选的实施方案中，本发明的化学成分确定的培养基包含浓度大于1000μM的天冬氨酸、浓度大于1000μM的甘氨酸、浓度大于500μM的甲硫氨酸和浓度大于1500μM的亮氨酸。

在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的谷氨酸：大于50mM、大于75mM、大于90mM、大于100mM、大于110mM、50mM-500mM、50mM-250m、100mM-150mM或约120mM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的丙氨酸：大于1000μM、大于1500μM、大于2000μM、大于2500μM、大于3000μM、1000μM-10000μM、1000μM-5000μM、3000μM-4000μM或约3400μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的苯丙氨酸：大于500μM、大于750μM、大于1000μM、大于1250μM、大于1400μM、500μM-10000μM、500μM-5000μM、1000μM-2000μM或约1400μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的组氨酸：大于50μM、大于100μM、大于150μM、大于200μM、50μM-1000μM、50μM-500μM、150μM-250μM或约200μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的异亮氨酸：大于500μM、大于1000μM、大于1500μM、大于1750μM、500μM-5000μM、500μM-2500μM、1000μM-2000μM或约1800μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的赖氨酸：大于500μM、大于1000μM、大于1500μM、大于2000μM、500μM-10000μM、500μM-5000μM、1500μM-2500μM或约2100μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的脯氨酸：大于1000μM、大于3000μM、大于4000μM、大于5000μM、大于6000μM、大于7000μM、1000μM-50000μM、1000μM-10000μM、7000μM-8000μM或约7600μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的丝氨酸：大于500μM、大于1000μM、大于1500μM、大于1700μM、500μM-10000μM、500μM-5000μM、1000μM-2000μM或约1700μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的缬氨酸：大于1000μM、大于2000μM、大于2500μM、大于3000μM、1000μM-10000μM、1000μM-5000μM、3000μM-4000μM或约3400μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的酪氨酸：大于25μM、大于50μM、大于75μM、大于100μM、大于150μM、大于175μM、25μM-1000μM、25μM-500μM、100μM-200μM或约180μM。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的谷胱甘肽：大于100μM、大于200μM、大于400μM、大于500μM、大于600μM、大于700μM、100μM-5000μM、100μM-2500μM、100μM-1000μM或约750μM。在一个优选的实施方案中，化学成分确定的培养基包含浓度大于50mM的谷氨酸，浓度大于1000μM的丙氨酸，浓度大于1000μM的天冬氨酸，浓度大于500μM的苯丙氨酸，浓度大于500μM的甘氨酸，浓度大于50μM的组氨酸，浓度大于500μM的异亮氨酸，浓度大于500μM的赖氨酸，浓度大于500μM的亮氨酸，浓度大于100μM的甲硫氨酸，浓度大于1000μM的脯氨酸，浓度大于500μM的丝氨酸，浓度大于1000μM的缬氨酸，浓度大于25μM的酪氨酸和浓度大于700μM的谷胱甘肽。在进一步优选的实施方案中，化学成分确定的培养基包含浓度大于110mM的谷氨酸，浓度大于3000μM的丙氨酸，浓度大于3500μM的天冬氨酸，浓度大于1400μM的苯丙氨酸，浓度大于1750μM的甘氨酸，浓度大于200μM的组氨酸，浓度大于1750μM的异亮氨酸，浓度大于2000μM的赖氨酸，浓度大于3000μM的亮氨酸，浓度大于700μM的甲硫氨酸，浓度大于7000μM的脯氨酸，浓度大于1700μM的丝氨酸，浓度大于3000μM的缬氨酸，浓度大于175μM的酪氨酸和浓度大于700μM的谷胱甘肽。

在一个优选的实施方案中，化学成分确定的培养基包含浓度为1000μM-10000μM的天冬氨酸、浓度为500μM-5000μM的甘氨酸、浓度为100μM-2000μM的甲硫氨酸、浓度为500μM-10000μM的亮氨酸、浓度为50mM-500mM的谷氨酸、浓度为1000μM-10000μM的丙氨酸、浓度为500μM-10000μM的苯丙氨酸、浓度为50μM-1000μM的组氨酸、浓度为500μM-5000μM的异亮氨酸、浓度为500μM-10000μM的赖氨酸、浓度为1000μM-50000μM的脯氨酸、浓度为500μM-10000μM的丝氨酸、浓度为1000μM-10000μM的缬氨酸、浓度为25μM-1000μM的酪氨酸和浓度为100μM-5000μM的谷胱甘肽。

在一个优选的实施方案中，化学成分确定的培养基包含浓度为1000μM-5000μM的天冬氨酸、浓度为500μM-2500μM的甘氨酸、浓度为100μM-1000μM的甲硫氨酸、浓度为3000μM-4000μM的亮氨酸、浓度为100mM-150mM的谷氨酸、浓度为3000μM-4000μM的丙氨酸、浓度为1000μM-2000μM的苯丙氨酸、浓度为150μM-250μM的组氨酸、浓度为1000μM-2000μM的异亮氨酸、浓度为1500μM-2500μM的赖氨酸、浓度为7000μM-8000μM的脯氨酸、浓度为1000μM-2000μM的丝氨酸、浓度为3000μM-4000μM的缬氨酸、浓度为100μM-200μM的酪氨酸和浓度为100μM-1000μM的谷胱甘肽。

组分的比例

本发明人已经惊奇地发现，如果使用特定比例的化合物，则所述化学成分确定的培养基将提供改善的毒力因子诸如百日咳毒素和FHA的产量。为此原因，提供了包含至少两种组分的化学成分确定的培养基，并且其中所述至少两种组分选自：

a）大于100:1、大于125:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1（碳：磷）（mol/mol）的比例的碳和磷；

b）大于20:1、大于22:1、大于24:1或大于25:1（谷氨酸：磷）（mol/mol）的比例的谷氨酸和磷；

c）小于600:1、小于500:1、小于400:1或小于300:1（碳：镁）（mol/mol）的比例的碳和镁；

d）小于115:1、小于110:1、小于105:1或小于100:1（谷氨酸：镁）（mol/mol）的比例的谷氨酸和镁；

e）大于3000:1、大于3500:1或大于4000:1（碳：铜）（mol/mol）的比例的碳和铜；

f）大于170:1、大于180:1、大于200:1或大于250:1（谷氨酸：铜）（mol/mol）的比例的谷氨酸和铜；

g）大于9500:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（碳：铁）（mol/mol）的比例的碳和铁；

h）大于1600:1、大于1800:1、大于2000:1或大于2500:1（谷氨酸：铁）（mol/mol）的比例的谷氨酸和铁；

i）小于500:1、小于400:1、小于300:1或小于250:1（碳：甘氨酸）（mol/mol）的比例的碳和甘氨酸；

j）小于100:1、小于80:1、小于75:1或小于60:1（谷氨酸：甘氨酸）（mol/mol）的比例的谷氨酸和甘氨酸；

k）小于440:1、小于400:1、小于350:1或小于300:1（碳：亮氨酸）（mol/mol）的比例的碳和亮氨酸；

l）小于75:1、小于70:1、小于60:1或小于50:1（谷氨酸：亮氨酸）（mol/mol）的比例的谷氨酸和亮氨酸；

m）小于1200:1、小于1000:1、小于800:1或小于750:1（碳：甲硫氨酸）（mol/mol）的比例的碳和甲硫氨酸；

n）小于200:1、小于175:1、小于150:1或小于120:1（谷氨酸：甲硫氨酸）（mol/mol）的比例的谷氨酸和甲硫氨酸；

o）大于3750:1、大于4000:1、大于4500:1或大于5000:1（碳：钙）（mol/mol）的比例的碳和钙；

p）大于620:1、大于650:1、大于675:1或大于750:1（谷氨酸：钙）（mol/mol）的比例的谷氨酸和钙；

q）大于3000:1、大于3500:1、大于4750:1或大于5000:1（碳：钴）（mol/mol）的比例的碳和钴；

r）大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（谷氨酸：钴）（mol/mol）的比例的谷氨酸和钴；

s）大于3000:1、大于3500:1、大于4000:1或大于5000:1（碳：锌）（mol/mol）的比例的碳和锌；

t）大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（谷氨酸：锌）（mol/mol）的比例的谷氨酸和锌；

u）大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1（碳：硫酸盐等价物）（mol/mol）的比例的碳和硫酸盐等价物；和

v）大于130:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1（谷氨酸：硫酸盐等价物）（mol/mol）的比例的谷氨酸和硫酸盐等价物。

在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种或所有22种的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)和(v)。在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含比例大于200:1的碳和磷(碳:磷)(mol/mol)、比例大于25:1的谷氨酸和磷(谷氨酸:磷)(mol/mol)、比例小于300:1的碳和镁(碳:镁)(mol/mol)、比例小于100:1的谷氨酸和镁(谷氨酸:镁)(mol/mol)、比例大于4000:1的碳和铜(碳:铜)(mol/mol)、比例大于250:1的谷氨酸和铜(谷氨酸:铜)(mol/mol)、比例大于1500:1的碳和铁(碳:铁)(mol/mol)、比例大于2500:1的谷氨酸和铁(谷氨酸:铁)(mol/mol)、比例小于250:1的碳和甘氨酸(碳:甘氨酸)(mol/mol)、比例小于250:1的谷氨酸和甘氨酸(碳;甘氨酸)(mol/mol)、比例小于300:1的碳和亮氨酸(碳:亮氨酸)(mol/mol)、比例小于50:1的谷氨酸和亮氨酸(谷氨酸:亮氨酸)(mol/mol)、比例小于750:1的碳和甲硫氨酸(碳:甲硫氨酸)(mol/mol)、比例小于120:1的谷氨酸和甲硫氨酸(谷氨酸:甲硫氨酸)(mol/mol)、比例大于5000:1的碳和钙(碳:钙)(mol/mol);比例大于750:1的谷氨酸和钙(谷氨酸:钙)(mol/mol)、比例大于5000:1的碳和钴(碳:钴)(mol/mol)、比例大于1500:1的谷氨酸和钴(谷氨酸:钴)(mol/mol)、比例大于5000:1的碳和锌(碳:锌)、比例大于1500:1的谷氨酸和锌(谷氨酸:锌)(mol/mol)、比例大于1500:1的碳和硫酸盐等价物(碳:硫酸盐等价物)和比例大于200:1的谷氨酸和硫酸盐等价物(谷氨酸:硫酸盐等价物)。

术语“硫酸盐等价物”指无机硫酸盐或其代谢导致产生硫酸盐的有机化合物（包括但不限于半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽）。

培养基包含Fe(III)

博德特氏菌培养基倾向于包括以Fe(II)离子形式的铁，诸如StainerScholte培养基，其包括FeSO₄(Stainer和ScholteJournalofGeneralMicrobiology(1971),63:211-220)，但是本发明人已证实，Fe(III)离子也可以在博德特氏菌的培养基中使用，并且进一步，包含Fe(III)离子（诸如柠檬酸铁(III)）的培养基提供了比包含Fe(II)离子（诸如FeSO₄）的培养基更高水平的毒力因子诸如百日咳毒素的生产。

因此，在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含Fe(III)离子。类似地，在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含络合至有机化合物的Fe(II)或Fe(III)，优选地化学成分确定的培养基包含络合至有机化合物的Fe(III)。在一个实施方案中，有机化合物是选自血红素、血红蛋白、肌红蛋白、转铁蛋白、铁蛋白、乳铁蛋白、肠菌素、产气菌素（aerobactin）、产碱杆菌素（alcaligin）、粪生素（coprogen）、铁色素、去铁胺、ferroxamine、异羟肟酸、柠檬酸和二羟基苯甲酰基丝氨酸的有机化合物。在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含络合柠檬酸的Fe(III)。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于10μM、大于20μM、大于30μM、大于40μM、大于50μM、10μM-500μM、10μM-100μM、25μM-75μM或约60μM的柠檬酸铁(III)。

其它培养基组分

本发明的培养基可以包括其它组分，除了上述的那些。例如，化学成分确定的培养基可包括氯化物。在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含浓度小于45mM，小于40mM，小于35mM，小于30mM，小于25mM，小于20mM或小于15mM，0.1mM-500mM，10mM-20mM或约16mM的氯化物的氯化物。化学成分确定的培养基可包括乙酸，在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含浓度大于1mM、大于2mM、大于3mM、大于4mM、1mM-100mM、4mM-6mM或约5mM的乙酸的乙酸。化学成分确定的培养基可包括钾。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的钾：大于1mM、大于2mM、大于3mM、大于4mM、大于5mM、大于6mM、1mM-100mM、5.5mM-7mM或约6.5mM。化学成分确定的培养基可以包含磷源，在一个实施方案中，磷源包含以下列浓度的磷酸盐：大于0.5mM、大于1mM、大于1.5mM、大于2mM、大于2.5mM、0.5mM-100mM、3mM-4mM或约3.6mM。化学成分确定的培养基可包括二甲基-β环糊精。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含以下列浓度的二甲基-β环糊精：大于0.1mM、大于0.2mM、大于0.3mM、大于0.4mM、大于0.5mM、大于0.6mM、0.01mM-10mM、0.7mM-0.8mM或约0.75mM。

在一个实施方案中，化学成分确定的培养基不包含硫酸盐、半胱氨酸或胱氨酸并且的确包含大于0.008mM硫代硫酸盐、大于11mMMOPS、大于6μM铜、大于400μM镁、大于700μM锌、大于0.15μM钴、大于0.15μM钴、大于29μM硫胺素、大于0.8μM核黄素、大于8.0μM泛酸盐、大于0.8μM生物素、大于140μM钙、大于35μM烟酸、大于3000μM抗坏血酸、大于110mM浓度的谷氨酸、大于3000μM浓度的丙氨酸、大于3500μM浓度的天冬氨酸、大于1400μM浓度的苯丙氨酸、大于1750μM浓度的甘氨酸、大于200μM浓度的组氨酸、大于1750μM浓度的异亮氨酸、大于2000μM浓度的赖氨酸、大于3000μM浓度的亮氨酸、大于700μM浓度的甲硫氨酸、大于7000μM浓度的脯氨酸、大于1700μM浓度的丝氨酸、大于3000μM浓度的缬氨酸、大于175μM浓度的酪氨酸、大于700μM浓度的谷胱甘肽、小于15mM的氯化物、大于4mM的乙酸、大于6mM的钾、大于0.6mM的二甲基-β环糊精和大于2.5mM的磷酸盐；任选地，所述化学成分确定的培养基进一步包含钠和大于50μM柠檬酸铁(III)。

在一个实施方案中，化学成分确定的培养基不包含硫酸盐、半胱氨酸或胱氨酸并且的确包含0.005mM-0.100mM的硫代硫酸盐、2mM-100mM的MOPS、2μM-200μM铜、2μM-6000μM镁、10μM-150μM锌、0.10μM-0.30μM钴、25μM-200μM硫胺素、0.1μM-10μM核黄素、0.5μM-100μM泛酸盐、0.5μM-100μM生物素、50μM-1000μM钙、1μM-500μM烟酸、25μM-10000μM抗坏血酸、1000μM-10000μM浓度的天冬氨酸、500μM-5000μM浓度的甘氨酸、100μM-2000μM浓度的甲硫氨酸、500μM-10000μM浓度的亮氨酸、50mM-500mM浓度的谷氨酸、1000μM-10000μM浓度的丙氨酸、500μM-10000μM浓度的苯丙氨酸、50μM-1000μM浓度的组氨酸、500μM-5000μM浓度的异亮氨酸、500μM-10000μM浓度的赖氨酸、1000μM-50000μM浓度的脯氨酸、500μM-10000μM浓度的丝氨酸、1000μM-10000μM浓度的缬氨酸、25μM-1000μM浓度的酪氨酸、100μM-5000μM浓度的谷胱甘肽、0.1mM-500mM的氯化物、1mM-100mM的乙酸、1mM-100mM的钾、0.01mM-10mM的二甲基-β环糊精和0.5mM-100mM的磷酸盐；任选地，所述化学成分确定的培养基进一步包含钠和10μM-500μM柠檬酸铁(III)。

在一个实施方案中，化学成分确定的培养基不包含硫酸盐、半胱氨酸或胱氨酸并且的确包含0.005mM-0.025mM的硫代硫酸盐、5mM-20mM的MOPS、4μM-10μM铜、1000μM-6000μM、30μM-80μM锌、0.10μM-0.20μM钴、25μM-50μM硫胺素、0.5μM-1.0μM核黄素、5.0μM-10.0μM泛酸盐、5.0μM-10.0μM生物素、100μM-200μM钙、25μM-75μM烟酸、10000μM-5000μM抗坏血酸、1000μM-5000μM浓度的天冬氨酸、500μM-2500μM浓度的甘氨酸、100μM-1000μM浓度的甲硫氨酸、3000μM-4000μM浓度的亮氨酸、100mM-150mM浓度的谷氨酸、3000μM-4000μM浓度的丙氨酸、1000μM-2000μM浓度的苯丙氨酸、150μM-250μM浓度的组氨酸、1000μM-2000μM浓度的异亮氨酸、1500μM-2500μM浓度的赖氨酸、7000μM-8000μM浓度的脯氨酸、1000μM-2000μM浓度的丝氨酸、3000μM-4000μM浓度的缬氨酸、100μM-200μM浓度的酪氨酸和100μM-1000μM浓度的谷胱甘肽、10mM-20mM的氯化物、4mM-6mM的乙酸、5.5mM-7mM的钾、0.7mM-0.8mM的二甲基-β环糊精和3mM-4mM的磷酸盐；所述化学成分确定的培养基任选地进一步包含钠和25μM-75μM柠檬酸铁(III)。

发酵方法

本发明进一步提供了用于在化学成分确定的培养基（CDM）中生长博德特氏菌属物种的发酵方法，所述方法包括：

（a）用博德特氏菌属物种接种本发明的化学成分确定的培养基；

（b）在化学成分确定的培养基中维持博德特氏菌属物种持续足以允许生物质积累的一段时间。

术语“发酵方法”指生长细胞和/或从那些细胞表达毒力因子的工业规模的方法。术语“工业规模”指在发酵罐中的方法，在一个实施方案中，工业规模的方法是在具有如下工作体积的发酵罐中的方法：5-10000升、10-5000升、20-2000升、50升-1000升、大于或等于5升、大于或等于10升、大于或等于15升、大于或等于20升、大于或等于25升、大于或等于50升、大于或等于100升、小于或等于10000升、小于或等于5000升或小于或等于2500升。在进一步的实施方案中，“工业规模方法”是适合用于大于10mg/L、大于15mg/L或大于20mg/L百日咳毒素的生产的方法。

在一个实施方案中，发酵方法具有少于15h、少于12h、少于10h或少于9h的平均世代时间。段落[029]描述了用于确定平均世代时间的方法。

在进一步的实施方案中，发酵方法产生超过10mg/L、15mg/L或20mg/L百日咳毒素。第[031]描述了用于确定百日咳毒素产量的方法。

在一个实施方案中，发酵方法在下列温度下进行：大于或等于32℃、大于或等于33℃、大于或等于34℃、小于或等于45℃、小于或等于42℃、小于或等于40℃、小于或等于38℃、32℃-45℃、33℃-42℃、33℃-40℃或33℃-38℃。

在一个实施方案中，在发酵方法期间使用消泡剂。在进一步的实施方案中，所述消泡剂是聚二甲基硅氧烷。

在一个实施方案中，溶氧的水平是1μM-160μM、15μM-140μM、30μM-120μM，、45μM-110μM、60μM-100μM或约80μM。

在一个实施方案中，发酵方法的pH为pH6.0-pH7.5、pH6.5-pH7.0或约pH7.2。

毒力因子表达和纯化

在一个实施方案中，博德特氏菌属物种表达至少一种毒力因子，包括百日咳毒素（PT）、丝状血细胞凝集素（FHA）、百日咳杆菌粘附素（PRN）、凝集原2或凝集原3。在一个实施方案中，博德特氏菌属物种表达PT，在一个实施方案中，博德特氏菌属物种表达FHA，在一个实施方案中，博德特氏菌属物种表达PRN，在一个实施方案中，博德特氏菌属物种表达PT和FHA，在一个实施方案中，博德特氏菌属物种表达PT和PRN，在一个实施方案中博德特氏菌属物种表达PRN和FHA，在一个实施方案中，博德特氏菌属物种表达PT、PRN和FHA。PT、FHA和PRN是本领域熟知的。

在一个实施方案中，发酵方法进一步包括纯化所述毒力因子以产生纯化的毒力因子的步骤c）。纯化的毒力因子可以是纯化的百日咳毒素（PT）、丝状血细胞凝集素（FHA）、百日咳杆菌粘附素（PRN）、凝集原2或凝集原3。纯化的毒力因子可以纯化后改变，例如百日咳毒素可以在纯化后进行化学脱毒。对于百日咳抗原的制备，还参见EP427462和WO91/12020。在一个实施方案中，步骤c）涉及使用层析的细胞纯化。在一个实施方案中，所述层析技术是亲和层析、凝胶过滤、高压液相层析（HPLC）或离子交换层析。任选地，亲和层析使用亲和标签纯化柱、抗体纯化柱、凝集素亲和柱、前列腺素纯化柱或链霉亲和素柱。任选地，HPLC使用离子交换柱、反相柱或大小排阻柱。任选地，离子交换柱是阴离子交换柱或阳离子交换柱。

该方法可以进一步包括配制含有纯化的毒力因子的免疫原性组合物的步骤d）。

该方法可以进一步包括向免疫原性组合物加入至少一种另外的抗原的步骤e）。在一个实施方案中，所述至少一个进一步的抗原选自百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、百日咳杆菌粘附素、菌毛凝集原、白喉类毒素、破伤风类毒素、来自脑膜炎奈瑟球菌的至少一种缀合的糖抗原、乙型肝炎表面抗原、灭活脊髓灰质炎病毒（IPV）和来自乙型流感嗜血杆菌的缀合的糖抗原。所述来自脑膜炎奈瑟球菌的至少一种缀合的糖抗原可以是MenC、MenY、MenA和MenW（例如A+C、A+Y、A+W、C+Y、C+W、Y+W、A+C+Y、A+C+W、A+Y+W、C+Y+W、A+C+Y+W）；任选包含MenC和/或MenY，任选包含所有四个。

可选地或除了上述脑膜炎球菌抗原之外，该免疫原性组合物还可包含一种或多种肺炎球菌荚膜寡糖或多糖-载体蛋白缀合物。

在本发明的组合物中所表示的典型的肺炎球菌荚膜寡糖或多糖（优选后者）包括源自肺炎球菌的至少四种血清型的抗原。优选地，四种血清型包括6B、14、19F和23F。更优选地，至少7种血清型包括在组合物中，例如，源自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的那些。仍然更优选地，至少11种血清型被包括在组合物（11价），例如，源自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的那些。在本发明的优选实施方案中，包含至少13种此类缀合的肺炎球菌抗原，虽然本发明也考虑进一步的抗原，例如23价（诸如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F）。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，发酵方法包括将药学上可接受的赋形剂加入免疫原性组合物的步骤f）。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含佐剂，诸如磷酸铝或氢氧化铝。在一个实施方案中，发酵方法包括将佐剂加入免疫原性组合物的步骤g）。将DTPa和DTPw抗原吸附到铝佐剂上的方法是本领域已知的。参见，例如WO93/24148和WO97/00697。在将抗原在本发明的组合免疫原性组合物中混合在一起之前，通常吸附到佐剂上的组分在适当的pH下在室温下放置至少10分钟的时间，用于吸附最多的和优选所有抗原。

其它组分优选未吸附（诸如IPV）或特异性吸附到其它佐剂上-与其它组分混合之前，乙肝表面抗原（HBsAg）优选吸附在磷酸铝上（如WO93/24148中所述）。

在进一步的实施方案中，提供了通过所述方法可获得的毒力因子。在进一步的实施方案中，提供了通过所述方法获得的毒力因子。

在进一步的实施方案中，提供了包含毒力因子和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种进一步的抗原。在一个实施方案中，所述至少一种进一步的抗原选自百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、百日咳杆菌粘附素、菌毛凝集原、白喉类毒素、破伤风类毒素、来自脑膜炎奈瑟球菌的至少一种缀合的糖抗原、B型肝炎表面抗原、灭活脊髓灰质炎病毒（IPV）和来自乙型流感嗜血杆菌的缀合的糖抗原（任选地缀合到破伤风类毒素）。所述来自脑膜炎奈瑟球菌的至少一种缀合的糖抗原可以是MenC、MenY、MenA和MenW（例如A+C、A+Y、A+W、C+Y、C+W、Y+W、A+C+Y、A+C+W、A+Y+W、C+Y+W、A+C+Y+W）；任选包含MenC和/或MenY，任选包含所有四个。在一个实施方案中，疫苗包含白喉类毒素、破伤风类毒素和PT，FHA和PRN（一种DTPa疫苗）中的至少一个。

在一个实施方案中，提供了包含免疫原性组合物的疫苗。

疫苗制备一般性描述于VaccineDesign-TheSubunitandadjuvantapproachEdPowellandNewman;PellumPress。有利地，根据本发明的组合疫苗是儿童疫苗。

每疫苗剂量中的多糖或寡糖缀合物抗原的量选择为如下的量，其在典型的接种者（vaccinees）中诱导免疫保护性应答而无显著的不利的副作用。该量将取决于所利用的特定的免疫原而不同。通常预期每个剂量会包含1-1000μg缀合的多糖或寡糖（表示为糖的量），优选2-100μg，更优选4-40、2-15或3-10μg，最优选约或正好5μg。

疫苗中蛋白抗原的含量将通常在1-100μg的范围内，优选5-50μg，最通常在5-25μg的范围内。

特定疫苗的合适的抗原量可以通过涉及在主体中抗体滴度和其它应答的观测的标准研究来确定。在最初的疫苗接种后，主体可以在约4周的时间间隔或更长的时间接收一个或两个加强注射。

本发明的疫苗制剂可以用于保护或治疗易于感染的哺乳动物（优选人），通过将所述疫苗经由全身或粘膜途径施用的方法。这些施用可包括经由肌内，、腹膜内、皮内或皮下途径注射。

在进一步的方面，提供了用于疾病预防或治疗的如前述的免疫原性组合物或疫苗。

在进一步的方面，提供了用于百日咳博德特氏菌病预防或治疗的如前述的免疫原性组合物或疫苗。

在进一步的方面，提供了如前述的免疫原性组合物或疫苗在预防或治疗疾病中的用途。

在进一步的方面，提供了如前述的免疫原性组合物或疫苗在制备用于细菌性疾病的治疗或预防的药物中的用途。

在进一步的方面，提供了预防或治疗疾病的方法，包括向患者施用如前述的免疫原性组合物或疫苗。

在一个实施方案中，所述疾病是百日咳博德特氏菌病。

术语“百日咳毒素”是指百日咳毒素或可选地百日咳毒素的基因类毒素形式。在一个实施方案中，百日咳毒素不是百日咳毒素的基因类毒素。

术语“包含(comprising、comprise和comprises)”可以在所有情况下被替换为术语“由……组成(consisting、consist和consists)”。术语“包含”是指“包括”。因此，除非上下文另有要求，单词“包含(comprises)”和其变体如“包含(comprise)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所述化合物或组合物（例如，核酸，多肽，抗原）或步骤，或者化合物或步骤的组，但不排除任何其它化合物、组合物、步骤，或其组。术语“由……组成”意指包含排除其它化合物，组合物，步骤或组诸如此类。

单数术语“一种”、“一个”和“该”包括复数指示对象，除非上下文清楚地另外指示。类似地，词语“或”意图包括“和”，除非上下文清楚地另外指示。术语“多个”指两个或更多。进一步要理解的是，所有对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，并且提供用于说明。另外，关于物质例如抗原的浓度或水平给定的数字限制意图是近似的。因此，当浓度指示为至少（例如）200pg时，意图是浓度理解为至少近似（或“约”或“~”）200pg。

实施例1-基本化学成分确定的培养基中百日咳博德特氏菌的20L规模发酵

设计化学成分确定的培养基（B-CDM），其基于Stainer&Scholte培养基的组合物（SS；StainerandScholte,J.Gen.Microbiol.63:211-220(1971)），并且含有氨基酸补充剂以及二甲基-β环糊精。表1比较了Stainer&Scholte的原始培养基(SS)、SS培养基的修饰版本（其包含二甲基-β环糊精-——文献记载的百日咳博德特氏菌的生长刺激剂（Imaizumi等,J.Clin.Microbiol.17:781-786(1983)）——和其它小的改动）（SS-环(cyclo)）、以及基本化学成分确定的培养基（B-CDM）的组成。

SS-环和B-CDM培养基在发酵COQ467和COQ365中分别进行评估。对于这两种发酵，含有7.5ml的新鲜培养基（B-CDM）的第一摇瓶预培养物用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种并在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h）。第一预培养物用于接种含有100ml新鲜培养基（B-CDM）的第二摇瓶预培养物。第二预培养物在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h），并用于接种两个摇瓶，摇瓶中各含1升新鲜培养基（对于COQ467是SS-环和对于COQ365是B-CDM；参见表1中的组成）。在35℃（+/-1℃）和150rpm下生长40h（+/-4h）后，合并来自第三预培养物的两个摇瓶。只要第三预培养物停止，就将合并的预培养物用于接种发酵罐。

使用20L发酵罐（Biolafitte）。将10L培养基（对于COQ467是“SS环”和对于COQ365是“B-CDM”）无菌转移到发酵罐。使用下列条件以设置100%-溶氧（DO）水平：温度（35℃）和排出压力(headpressure)（0.4巴）。通过加入1.5L合并的预培养物实现接种。

在发酵过程中，温度（35℃），排出压力（0.4巴）和空气流速（20Lmin^-1）保持恒定。通过经由泡沫控制器自动加入聚二甲基硅氧烷乳液控制发泡。溶氧水平设置在25%，并当DO落到25%以下时通过增加搅拌来调节。最小搅拌速率设置在50rpm；最大搅拌速率设置在1,000rpm。在COQ467（SS-环）中通过加入磷酸50％（w/v），并在COQ365（B-CDM）中通过加入乙酸50％（w/v）来调节pH。

在发酵期间，生长监测为在650nm的光密度（OD_650nm）。在发酵结束时（定义为氧消耗减少时-作为谷氨酸耗尽的结果-，导致搅拌速率降低），通过ELISA确定在培养上清液中的百日咳毒素（PT）的产生。

表2比较了发酵COQ365（B-CDM）和发酵COQ467（SS-环）的生物质产量、PT产量和平均世代时间。

PT浓度的确定。培养基上清液中PT浓度通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）确定。聚苯乙烯微稀释板(4-39454;Nunc)的孔用100μl纯化的多克隆豚鼠抗PT抗血清（在pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液中1:16,000稀释）在4℃下包被过夜。将板用DPBST洗涤三次（Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，不含Ca和Mg，含有0.1％（v/v）吐温20）。然后将纯化的PT标准品和培养物上清液（在DPBST中）的连续稀释液加入到各孔（每孔100μl）。在室温下孵育30分钟后，将板用DPBST洗涤三次。山羊抗PT抗血清（在DPBST中1：500稀释）和不含抗PT的豚鼠血清（在DPBST中1：1000稀释）然后加入到各孔（每孔100μl）。在室温下孵育30分钟后，将板用DPBST洗涤三次。缀合碱性磷酸酶的兔抗山羊免疫球蛋白G（Zymed；在DPBST中1：1000稀释）随后被加入到各孔（每孔100μl）。在室温下孵育30分钟后，将板用DPBST洗涤三次。板通过向每孔中（每孔100μl）加入在二乙醇胺缓冲液（二乙醇胺9.7％（v/v），叠氮化钠0.2g/L，MgCl₂.6H₂O0.214g/L，pH9.8）中的对硝基苯基磷酸盐（Calbiochem）的10g/L的溶液进行显色。显色在室温下进行，并通过向每个孔加入50μl的3MNaOH停止。在NaOH添加后一小时内在405nm读取孔的吸光度，使用VersaMax酶标仪（MolecularDevices）。

B-CDM条件导致比SS-环高的生长产量和速率。PT生产也显著增加。（参见表2）。

*基于测量的预培养物的OD_650nm，即1.5*OD_预培养物/11.5，计算的初始生物质浓度。

**产量计算为发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时OD_650nm之间的差异。

***总发酵时间定义为氧消耗减少（作为谷氨酸耗尽的结果）导致搅拌速率的降低时的时间。

****如下计算平均世代时间。首先，世代数目计算为转化为log₂的在发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时的OD_650nm之间的比例。然后通过将总发酵时间除以世代数目计算平均世代时间。

实施例2——铁源对在化学成分确定的培养基中的20L规模百日咳博德特氏菌发酵的影响

在发酵COQ348中评价柠檬酸铁作为硫酸亚铁替代物。

含有7.5ml的新鲜培养基（B-CDM；参见表1的组成）的第一摇瓶预培养物用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种并在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h）。第一预培养物用于接种含有100ml新鲜培养基（B-CDM）的第二摇瓶预培养物。第二预培养物在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h），并用于接种两个摇瓶，摇瓶中各含1升新鲜培养基（B-CDM，其经修饰以包含10mg/L三水合柠檬酸铁(III)并且不含FeSO₄）。在35℃（+/-1℃）和150rpm下生长40h（+/-4h）后，合并来自第三预培养物的两个摇瓶。只要第三预培养物停止，就将合并的预培养物用于接种发酵罐。

使用20L发酵罐（Biolafitte）。将10L培养基（B-CDM，其经修饰以包含10mg/L三水合柠檬酸铁(III)并且不含FeSO₄）无菌转移到发酵罐中。使用下列条件以设置100%-溶氧（DO）水平：温度（35℃）和排出压力（0.4巴）。通过加入1.5L合并的预培养物实现接种。

在发酵过程中，温度（35℃），排出压力（0.4巴）和空气流速（20Lmin^-1）保持恒定。通过经由泡沫控制器自动加入聚二甲基硅氧烷乳液控制发泡。溶氧水平设置在25%，并当DO落到25%以下时通过增加搅拌来调节。最小搅拌速率设置在50rpm；最大搅拌速率设置在1,000rpm。通过添加乙酸50%(w/v)调节pH在7.2。

在发酵期间，生长监测为在650nm的光密度（OD_650nm）。在发酵结束时（定义为氧消耗减少时-作为谷氨酸耗尽的结果-，导致搅拌速率降低），通过ELISA确定在培养上清液中的百日咳毒素（PT）的产生。

表3比较了发酵COQ352（B-CDM，其经修饰以包含10mg/L三水合柠檬酸铁(III)并且无FeSO₄）和发酵COQ365（B-CDM，具有FeSO₄，参见实施例1）的生物质产量、PT产量和平均世代时间。

生长产量和速率就最大生物质浓度而言在两个条件之间是类似的，表明无机硫酸盐可以从培养基组合物省略，并且可以作为Fe(II)或Fe（Ⅲ）补充铁，而不会影响百日咳博德特氏菌的生长。当使用柠檬酸铁，而不是硫酸亚铁作为铁源时，PT生产也显著增加。

*基于测量的预培养物的OD_650nm，即1.5*OD_预培养物/11.5，计算的初始生物质浓度。

**产量计算为发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时OD_650nm之间的差异。

***总发酵时间定义为氧消耗减少（作为谷氨酸耗尽的结果）导致搅拌速率的降低时的时间。

****如下计算平均世代时间。首先，世代数目计算为转化为log₂的在发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时的OD_650nm之间的比例。然后通过将总发酵时间除以世代数目计算平均世代时间。

实施例3——硫代硫酸盐作为硫源用于百日咳博德特氏菌的生长

基于文献，百日咳博德特氏菌的生长只有在有机硫源的存在下才有可能，所述硫源可以提供为胱氨酸、半胱氨酸和/或谷胱甘肽（Jebb和Tomlinson(1957)J.Gen.Microbiol.17:59）。

进行测定以确定无机硫源是否能够支持百日咳博德特氏菌的生长。含有7.5ml的新鲜培养基（B-CDM；修饰以含有0.604g/L的烟酸）摇瓶用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种并在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-5h）。通过离心收获细胞，用NaCl0.9%(w/v)洗涤两次，并重悬于不含有S源的新鲜培养基中（见表4中组成），以0.5的理论OD_650nm，如从收获前培养的OD_650nm所计算的。使用20μl该细胞悬浮液接种装有180μl不含有S源的新鲜培养基的96孔微量滴定板的每个孔中（参见表4组成）。向每个孔中，加入20μl的补充溶液，其中含有表5中列出的化合物中的一种。仅使用板的内孔用于培养，以使蒸发最小化，并且包括一个对照，其中，所述补充溶液用水代替。然后将板在BiotekSynergyH1读取仪中在35℃恒定振荡孵育53小时，并且每10分钟自动监测生长为OD_650nm。生长测定的结果示于表5中。

无机硫酸盐和亚硫酸盐不能够支持百日咳博德特氏菌的生长。然而，在存在硫代硫酸盐作为培养基中硫的唯一来源的情况下，观察到生长。这些结果证明i）硫酸盐可以从培养基中省略，并且ii）只要存在支持生长的化合物诸如硫代硫酸盐，则不需要存在有机硫源诸如胱氨酸、半胱氨酸、或谷胱甘肽。

*计算为53小时后的OD_650nm和初始OD_650nm之间的差异。

**+，生物质产量高于阴性对照；-，生物质产量低于或等于阴性对照。

实施例4——筛选化学成分确定的培养基中的替代缓冲剂

对于B-CDM培养基中Tris缓冲剂的替代物进行筛选。含有7.5ml的新鲜培养基（B-CDM）的第一摇瓶预培养物用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种并在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h）。第一预培养物用于接种含有100ml新鲜培养基（B-CDM）的第二摇瓶预培养物。第二预培养物在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h）。然后通过离心收获细胞，在NaCl0.9%中洗涤，并在NaCl0.9%中重悬。此细胞悬浮物用于接种一组9个摇瓶，每个含有50ml新鲜培养基（B-CDM）或具有其中CDM的Tris缓冲剂用如表6中所列的另一种缓冲剂替换的培养基。摇瓶在35℃和150rpm下孵育48小时。在24h和48h后生长监测为OD_650nm。结果示于表6中。

β-甘油磷酸盐和MOPS能够支持B-CDM中的百日咳博德特氏菌的生长。总体来看，MOPS在生长速率（24小时后的生物质产量）和产量（48小时后的生物质产量）方面优于β-甘油磷酸盐。用这两种缓冲剂，较低浓度导致更快的生长和更高的最终生物质产量。在测试的最低浓度（2.5g/L），MOPS显示对生长速率（24小时后的生物质产量）有利的影响，相比于使用Tris作为缓冲剂的对照条件。

*相对于相同孵育时间时的对照条件（Tris缓冲剂）表示生物质产量。

实施例5——Cu ²⁺ 添加对在化学成分确定的培养基上的20L规模百日咳博德特氏菌发酵的影响

在发酵COQ348中评价Cu²⁺补充的影响。

含有7.5ml的新鲜培养基（B-CDM；参见表1的组成）的第一摇瓶预培养物用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种并在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h）。第一预培养物用于接种含有100ml新鲜培养基（B-CDM）的第二摇瓶预培养物。第二预培养物在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h），并用于接种两个摇瓶，摇瓶中各含1升新鲜培养基（B-CDM，其补充有1.28mg/L(7.5μM)CuCl₂.2H₂O）。在35℃（+/-1℃）和150rpm下生长40h（+/-4h后，合并来自第三预培养物的两个摇瓶。只要第三预培养物停止，就将合并的预培养物用于接种发酵罐。

使用20L发酵罐（Biolafitte）。将10L培养基（B-CDM，其补充有1.28mg/L(7.5μM)CuCl₂.2H₂O）无菌转移到发酵罐中。使用下列条件以设置100%-溶氧（DO）水平：温度（35℃）和排出压力（0.4巴）。通过加入1.5L合并的预培养物实现接种。

在发酵过程中，温度（35℃），排出压力（0.4巴）和空气流速（20Lmin^-1）保持恒定。通过经由泡沫控制器自动加入聚二甲基硅氧烷乳液控制发泡。溶氧水平设置在25%，并当DO落到25%以下时通过增加搅拌来调节。最小搅拌速率设置在50rpm；最大搅拌速率设置在1,000rpm。通过添加乙酸50%(w/v)调节pH在7.2。

在发酵期间，生长监测为在650nm的光密度（OD_650nm）。在发酵结束时（定义为氧消耗减少时-作为谷氨酸耗尽的结果-，导致搅拌速率降低），通过ELISA确定在培养上清液中的百日咳毒素（PT）的产生。

表7比较了发酵COQ348（B-CDM补充有Cu）和发酵COQ365（B-CDM不补充Cu，参见实施例1）的生物质产量、PT产量和平均世代时间。

向化学成分确定的培养基中加入CuCl₂导致生物质产量的显著增加。生长速率和PT产量也受到积极影响。

*基于测量的预培养物的OD_650nm，即1.5*OD_预培养物/11.5，计算的初始生物质浓度。

**产量计算为发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时OD_650nm之间的差异。

***总发酵时间定义为氧消耗减少（作为谷氨酸耗尽的结果）导致搅拌速率的降低时的时间。

****如下计算平均世代时间。首先，世代数目计算为转化为log₂的在发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时的OD_650nm之间的比例。然后通过将总发酵时间除以世代数目计算平均世代时间。

实施例6——改进的化学成分确定的培养基中百日咳博德特氏菌的20L规模发酵

在发酵COQ426中评价基本CDM（B-CDM）的改进的制剂。

含有7.5ml的新鲜培养基（B-CDM；参见表1的组成）的第一摇瓶预培养物用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种并在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h）。第一预培养物用于接种含有100ml新鲜培养基（B-CDM）的第二摇瓶预培养物。第二预培养物在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h），并用于接种两个摇瓶，摇瓶中各含1升新鲜培养基（改进的CDM；参见表8中的组成）。在35℃（+/-1℃）和150rpm下生长40h（+/-4h）后，合并来自第三预培养物的两个摇瓶。只要第三预培养物停止，就将合并的预培养物用于接种发酵罐。

使用20L发酵罐（Biolafitte）。将10L培养基无菌转移至发酵罐中。使用下列条件以设置100%-溶氧（DO）水平：温度（35℃）和排出压力（0.4巴）。通过加入1.5L合并的预培养物实现接种。

在发酵过程中，温度（35℃），排出压力（0.4巴）和空气流速（20Lmin^-1）保持恒定。通过经由泡沫控制器自动加入聚二甲基硅氧烷乳液控制发泡。溶氧水平设置在25%，并当DO落到25%以下时通过增加搅拌来调节。最小搅拌速率设置在50rpm；最大搅拌速率设置在1,000rpm。通过添加磷酸50%(w/v)调节pH在7.2。

在发酵期间，生长监测为在650nm的光密度（OD_650nm）。在发酵结束时（定义为氧消耗减少时-作为谷氨酸耗尽的结果-，导致搅拌速率降低），通过ELISA确定在培养上清液中的百日咳毒素（PT）的产生。

表9比较了发酵COQ426（改进的CDM）和发酵COQ365（B-CDM，参见实施例1）的生物质产量、PT产量和平均世代时间。

改进的CDM条件导致相比基本CDM略更低的生长产量。生长速率也略更低。但是PT生产显著增加（+170%）。

*基于测量的预培养物的OD_650nm，即1.5*OD_预培养物/11.5，计算的初始生物质浓度。

**产量计算为发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时OD_650nm之间的差异。

***总发酵时间定义为氧消耗减少（作为谷氨酸耗尽的结果）导致搅拌速率的降低时的时间。

****如下计算平均世代时间。首先，世代数目计算为转化为log₂的在发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时的OD_650nm之间的比例。然后通过将总发酵时间除以世代数目计算平均世代时间。

实施例7——在包含硫代硫酸盐作为硫源的改进的化学成分确定的培养基中百日咳博德特氏菌的20规模的发酵

在发酵COQ454中评价改进的CDM（实施例6）的修饰的制剂。在此培养基中，半胱氨酸用硫代硫酸盐替代作为硫源。

含有7.5ml的新鲜培养基（B-CDM；参见表1的组成）的第一摇瓶预培养物用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种并在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h）。第一预培养物用于接种含有100ml新鲜培养基（B-CDM）的第二摇瓶预培养物。第二预培养物在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-1h），并用于接种两个摇瓶，摇瓶中各含1升新鲜培养基（改进的CDM，具有硫代硫酸盐；参见表10中的组成）。在35℃（+/-1℃）和150rpm下生长40h（+/-4h）后，合并来自第三预培养物的两个摇瓶。只要第三预培养物停止，就将合并的预培养物用于接种发酵罐。

使用20L发酵罐（Biolafitte）。将10L培养基无菌转移至发酵罐中。使用下列条件以设置100%-溶氧（DO）水平：温度（35℃）和排出压力（0.4巴）。通过加入1.5L合并的预培养物实现接种。

在发酵过程中，温度（35℃），排出压力（0.4巴）和空气流速（20Lmin^-1）保持恒定。通过经由泡沫控制器自动加入聚二甲基硅氧烷乳液控制发泡。溶氧水平设置在25%，并当DO落到25%以下时通过增加搅拌来调节。最小搅拌速率设置在50rpm；最大搅拌速率设置在1,000rpm。通过添加磷酸50%(w/v)调节pH在7.2。

在发酵期间，生长监测为在650nm的光密度（OD_650nm）。在发酵结束时（定义为氧消耗减少时-作为谷氨酸耗尽的结果-，导致搅拌速率降低），通过ELISA确定在培养上清液中的百日咳毒素（PT）的产生。

表11比较了发酵COQ454（改进的CDM，具有硫代硫酸盐）、发酵COQ426（改进的CDM，参见实施例6）和发酵COQ365（B-CDM，参见实施例1）的生物质产量、PT产量和平均世代时间。

在“改进的具有硫代硫酸盐的CDM”中生物质产量相比基本CDM略低，但是导致更高的生长速率和更高的PT生产（+310%）。相比“改进的CDM”，“改进的具有硫代硫酸盐的CDM”培养基导致类似的生物质产量、更高的生长速率、和更高的PT生产（+52%）。

*基于测量的预培养物的OD_650nm，即1.5*OD_预培养物/11.5，计算的初始生物质浓度。

**产量计算为发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时OD_650nm之间的差异。

***总发酵时间定义为氧消耗减少（作为谷氨酸耗尽的结果）导致搅拌速率的降低时的时间。

****如下计算平均世代时间。首先，世代数目计算为转化为log2的在发酵结束时的OD_650nm和发酵开始时的OD_650nm之间的比例。然后通过将总发酵时间除以世代数目计算平均世代时间。

实施例8——在仅包含一种氨基酸的最低限度培养基中百日咳博德特氏菌的生长

进行测定以确定百日咳博德特氏菌是否有可能在包含单一氨基酸作为唯一碳和氮源的最低限度培养基中生长。含有7.5ml的新鲜培养基（含有0.604g/L的烟酸的B-CDM）摇瓶用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种并在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-5h）。通过离心收获细胞，用NaCl0.9%(w/v)洗涤两次，并重悬于新鲜培养基中（见表12中组成），以0.5的理论OD_650nm，如从收获前培养物的OD_650nm所计算的。使用1ml此细胞悬浮液接种含有30ml表12中的培养基的摇瓶，所述培养基补充有单一氨基酸(L-半胱氨酸125mM、L-脯氨酸125mM、L-谷氨酸125mM、L-谷氨酰胺125mM、L-天冬酰胺30mM、L-天冬酰胺125mM、L-丝氨酸125mM、或L-丙氨酸125mM)作为C和N源，以及硫代硫酸盐0.25mM作为S源（除了l-Cys补充，其中没有加入硫代硫酸盐）。具有氯化铵（25mM）和硫代硫酸盐（0.25mM）但是没有氨基酸的相同培养基用作阴性对照。然后将摇瓶在35℃在恒定摇动（150rpm）下孵育约10天。生长监测为OD_650nm。生长测定的结果示于图1。

所有测试的氨基酸都能够作为C和N的唯一来源支持百日咳博德特氏菌的生长，只要存在S源（硫代硫酸盐）。当L-Cys用作氨基酸时，不需要任何其它的硫源。

实施例9——在不包含氨基酸的最低限度培养基中百日咳博德特氏菌的生长

进行测定以确定百日咳博德特氏菌是否可能在其中仅提供氮作为无机铵、提供硫作为硫代硫酸盐、和提供碳作为有机酸的最低限度培养基中生长。含有7.5ml的新鲜培养基（含有0.604g/L的烟酸的B-CDM）摇瓶用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种并在35℃（+/-1℃）和150rpm下孵育24h（+/-5h）。通过离心收获细胞，用NaCl0.9%(w/v)洗涤两次，并重悬于新鲜培养基中（见表13中组成），以0.5的理论OD_650nm，如从收获前培养物的OD_650nm所计算的。使用1ml此细胞悬浮液接种含有30ml表13中的培养基的摇瓶，所述培养基补充有单一有机酸(柠檬酸100mM，L-乳酸100mM，乙酸100mM，丙酮酸100mM，富马酸100mM，或琥珀酸100mM)。不具有有机酸补充物的相同培养基用作阴性对照。然后将摇瓶在35℃在恒定摇动（150rpm）下孵育约10天。生长监测为OD_650nm。生长测定的结果示于图2中。

所有测试的有机酸都能够作为C的唯一来源支持百日咳博德特氏菌的生长。

Claims (18)

1.用于博德特氏菌属(Bordetella)物种的工业规模培养的化学成分确定的培养基，其包含：

（i）选自络合至有机化合物的Fe(II)和络合至有机化合物的Fe(III)的铁组分，其中所述有机化合物选自血红素、血红蛋白、肌红蛋白、转铁蛋白、铁蛋白、乳铁蛋白、肠菌素、产气菌素、产碱杆菌素、粪生素、铁色素、去铁胺、ferroxamine、异羟肟酸、柠檬酸和二羟基苯甲酰基丝氨酸；

（ⅱ）3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）；

（ⅲ）二甲基-β-环糊精；和

（ii）选自浓度1000μM或更高的天冬氨酸、浓度1000μM或更高的甘氨酸、浓度500μM或更高的甲硫氨酸和浓度1500μM或更高的亮氨酸的氨基酸，

其中所述化学成分确定的培养基不包含FeSO4或三（羟甲基）氨基甲烷。

2.根据权利要求1的化学成分确定的培养基，其进一步包含：

（vi）2μM或更高、3μM或更高、4μM或更高、5μM或更高、或6μM或更高的铜；

（vii）2μM或更高、5μM或更高、10μM或更高、50μM或更高、100μM或更高、或400μM或更高的镁；

（x）选自锌、钴、硫胺素、核黄素和泛酸盐的添加剂；

（xi）选自0.4μM或更高的生物素、50μM或更高的钙、15μM或更高的烟酸和25μM或更高的抗坏血酸的添加剂。

3.根据权利要求1或2的化学成分确定的培养基，其包含选自硫代硫酸盐、连三硫酸盐、连四硫酸盐、过氧二硫酸盐、硫化物和亚硫酸盐的无机硫源，并且其中所述培养基不包含有机硫源。

4.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其包含大于0.005mM、大于0.006mM、大于0.007mM、大于0.008mM、大于0.010mM、大于0.050mM、大于0.100mM，约0.120mM或约0.011mM硫代硫酸盐。

5.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其包含大于0.003mM、大于0.004mM、大于0.005mM、大于0.008mM、大于0.010mM、大于0.020mM、大于0.050mM、约0.007mM或约0.080mM连三硫酸盐。

6.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其包含大于0.002mM、大于0.003mM、大于0.004mM、大于0.005mM、大于0.025mM、大于0.050mM、约0.060mM或约0.0006mM连四硫酸盐。

7.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其包含大于0.005mM、大于0.006mM、大于0.007mM、大于0.008mM、大于0.010mM、大于0.050mM、大于0.100mM、约0.120mM或约0.011mM过氧二硫酸盐。

8.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其包含大于0.010mM、大于0.012mM、大于0.014mM、大于0.016mM、大于0.020mM、大于0.100mM、大于0.200mM、约0.240mM或约0.022mM硫化物。

9.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其包含大于0.010mM、大于0.012mM、大于0.014mM、大于0.016mM、大于0.020mM、大于0.100mM、大于0.200mM、约0.240mM或约0.022mM亚硫酸盐。

10.权利要求1的化学成分确定的培养基，其包含浓度大于2mM、大于5mM、大于7mM、大于9mM、大于10mM或大于11mM的MOPS。

11.权利要求2的化学成分确定的培养基，其包含以氯化铜形式的铜。

12.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其包含选自铵盐和氯化铵的无机氮源。

13.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其包含选自谷氨酸、脯氨酸、柠檬酸、乳酸、乙酸、丙酮酸、富马酸和琥珀酸的碳源。

14.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其进一步包含选自下列的组分：

(i)大于0.1μM、大于1μM、大于50μM、大于100μM、大于200μM、大于300μM、大于400μM、大于500μM、大于600μM或大于700μM的锌；

(ii)大于0.05μM、大于0.10μM或大于0.15μM钴；

(iii)大于100μM、大于120μM或大于140μM钙；

(iv)大于20μM、大于30μM或大于35μM烟酸；

(v)大于50μM、大于75μM、大于100μM、大于1000μM、大于2000μM或大于3000μM抗坏血酸；

(vi)大于0.1μM、大于1μM、大于5μM、大于10μM或大于25μM硫胺素；

(vii)大于0.4μM、大于0.5μM、大于0.6μM或大于0.8μM生物素；

(viii)大于0.1μM、大于0.2μM、大于0.3μM、大于0.4μM、大于0.5μM、大于0.6μM或大于0.8μM核黄素；和

(ix)大于0.1μM、大于0.5μM、大于1.0μM、大于2.0μM、大于5.0μM或大于7.0μM泛酸盐。

15.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其进一步包含选自下列的氨基酸：

(i)以如下浓度的谷氨酸：大于50mM、大于75mM、大于90mM、大于100mM或大于110mM；

(ii)以如下浓度的丙氨酸：大于1000μM、大于1500μM、大于2000μM、大于2500μM或大于3000μM；

(iii)以如下浓度的苯丙氨酸：大于500μM、大于750μM、大于1000μM、大于1250μM或大于1400μM；

(iv)以如下浓度的组氨酸：大于50μM、大于100μM、大于150μM或大于200μM；

(v)以如下浓度的异亮氨酸：大于500μM、大于1000μM、大于1500μM或大于1750μM；

(vi)以如下浓度的赖氨酸：大于500μM、大于1000μM、大于1500μM或大于2000μM；

(vii)以如下浓度的脯氨酸：大于1000μM、大于3000μM、大于4000μM、大于5000μM、大于6000μM或大于7000μM；

(viii)以如下浓度的丝氨酸：大于500μmM、大于1000μM、大于1500μM或大于1700μM；

(ix)以如下浓度的缬氨酸：大于1000μM、大于2000μM、大于2500μM或大于3000μM；和

(x)以如下浓度的酪氨酸：大于25μM、大于50μM、大于75μM、大于100μM、大于150μM或大于175μM。

16.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其进一步包含以如下浓度的谷胱甘肽：大于100μM、大于200μM、大于400μM、大于500μM、大于600μM或大于700μmM。

17.前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基，其进一步包含选自下列的组分：

(i)以如下浓度的氯化物：小于45mM、小于40mM、小于35mM、小于30mM、小于25mM、小于20mM、10mM-20mM或约16mM；

(ii)以如下浓度的乙酸：大于1mM、大于2mM、大于3mM、大于4mM、4mM-6mM或约5mM；和

（iii）以如下浓度的钾：大于1mM、大于2mM、大于3mM、大于4mM、大于5mM、大于6mM、5.5mM-7mM或约6.5mM。

18.用于在化学成分确定的培养基（CDM）中生长博德特氏菌属物种的发酵方法，所述方法包括：

（a）用博德特氏菌属物种接种前述权利要求任一项的化学成分确定的培养基；和

（b）在所述化学成分确定的培养基中维持所述博德特氏菌属物种持续足以允许生物质积累的一段时间。