MX2015006455A - Produccion de altos rendimientos de polisacaridos bacteriales. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona cultivo, fermentación y condiciones de purificación mejorados para preparar polisacáridos de Neisseria meningitis. La invención en particular se relaciona a un medio de fermentación novedoso, estrategias de adición de solución de alimentación óptica y un proceso de purificación mejorado que carece de cualesquiera métodos cromatográficos para obtener alto rendimiento de polisacárido X de Neisseria meningitidis.

Description

PRODUCCIÓN DE ALTOS RENDIMIENTOS DE POLISACÁRIDOS BACTERIALES Campo de la Invención La invención se relaciona a vacunas contra Neissería meningitidis .

Antecedentes de la Invención La Neisseria meningitidis es la causa de meningitis bacteriana epidémica. El polisacárido capsular es un determinante de virulencia principal de N. meningitidis . Entre los 13 grupos meningococos clasificados en base a la estructura de polisacárido capsular, se asocian serogrupos A, B, C, Y y W135 con la mayoría de casos de enfermedad de meningococos. En la cinta de meningitis africana la más grande epidemia ha sido provocada por el meningococo serogrupo A, mientras que la enfermedad esporádica y brotes en países desarrollados son usualmente provocados por el meningococo serogrupo B y C. El meningococo serogrupo Y surge como una causa importante de enfermedad esporádica y brotes en los Estados Unidos de Norteamérica a finales de los años noventa y en 2000 el meningococo serogrupo W136 provoca enfermedad mundial en asociación con el peregrinaje a la Meca y brotes grandes en África sub-Sahara.

Neisseria meningitidis serogrupo X (MenX), previamente una causa rara de casos esporádicos de meningitis, ha sido recientemente asociada con incidencia Ref .: 256976 incrementada de enfermedad de meningococos y ha surgido como una causa de grandes brotes en la "cinta de meningitis" de África. Los brotes han sido documentados en Nigeria, Burkina Faso, Togo y Ghana y han variado en tamaño. En la estación de meningitis de 2010 más de 6500 casos de meningitis son reportados en Burkina Faso, y es razonable asumir que por lo menos 1000 de estos casos son debido a MenX con una incidencia reportada localmente de 120 casos por 100,000. Previamente, se confirman varios pacientes con enfermedad MenX en un brote de por lo menos 82 casos de meningitis bacteriana en la frontera de Kenia y Uganda en 2007.

Los polisacáridos capsulares de meningococo serogrupo B, C, Y y W135 están compuestos de derivados de ácido siálico. Los meningococos serogrupo B y C expresan ácido polisiálico (alfa 2-8) y (alfa2-9)-enlazado, respectivamente, mientras que secuencias alternantes de D-glucosa o D-galactosa y ácido siálico son expresados por N. meningitidis serogrupo Y y W135. En contraste, la cápsula de meningococos del serogrupo A está compuesta de N-acetilmanosamina 6-fosfato (alfal-6)-enlazado, mientras que N. meningitidis serogrupo X sintetiza polímeros capsulares de N-acetilglucosamina 1-fosfato (alfal-4)-enlazado.

El incremento en incidencia de enfermedad MenX en cinta de meningitis africana en los últimos 5 años garantiza desarrollo e introducción de una vacuna MenX en áreas seleccionadas de la región para evitar y controlar futuras epidemias. La conjugación de polisacáridos capsulares de meningococo a una proteína portadora ha llevado al desarrollo de vacunas conjugadas de polisacárido monovalente (A o C) con alta efectividad, y datos de inmunogenicidad a partir de pruebas clínicas indican que uso amplio de vacunas de conjugado tetravalente que cubren serogrupos A, C, Y y W-135 puede ser similarmente efectivo. Un procedimiento similar puede también ser fructífero para MenX. Se hace referencia a Ouli Xiea et al "Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide and development of an assay for quantification of human antibodies", Vaccine 30, 2012.

Gunnstein Norheim discute que no está disponible una vacuna actual contra serogrupos X y que la siguiente generación de vacunas razonables deben ser objetivadas a los grupos más prevalecientes: A, W-135, X. Se hace referencia a "Preventing the emerging serogroup X meningococcal disease in the African Meningitidis Belt" Oxford Baccine Group, 2011.

La carencia de una vacuna contra el grupo X de meningococos es una causa para preocupación dados los brotes provocados por meningococos de este serogrupo en unos cuantos años pasados. Se hace referencia a "Meningococcal vaccine: WHO position paper", Noviembre 2011.

Con el fin de facilitar desarrollo de vacunas conjugadas a base de polisacárido de Men X, es necesario obtener polisacáridos Men X estructuralmente intactos con mayores rendimientos.

Se descubren varios medios sintéticos para producción a gran escala de polisacárido de meningococo (Frantz, I. D. Jr. Growth Requirements of the Meningococcus, J. Bact ., 43: 757-761, 1942; Catlin, B.W. Nutritional profiles of Neisseria lactamica, gonorrhoeae and meningitidis, en medios definidos químicamente, J. Inf. Dis., 128(2): 178-194, 1973; Watson-Scherp Médium: Watson R. G. Et al. The specific hapten of group C (group lia) meningococcus, It. Chemical nature. J. Immunol 1958; 81:337-44; Marcelo Fossa da Paz; Julia Baruque-Ramos; Haroldo Hiss; Márcio Alberto Vicentin; María Betania Batista Leal; Isaías raw. Polysaccharide production in batch process of Neisseria meningitides serogroup C comparing Frantz, modified Frantz and Catlin 6 cultivation media, Braz. J. Microbiol. Vol.34. no. 1, Sao Paulo Enero/Abril 2003).

Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,494,808 reporta una densidad de gran escala, alta densidad (5 g/L peso de célula seca, y una densidad óptica de entre aproximadamente 10-13 en 600 nm) proceso de fermentación para el cultivo de N. meningitidis (serogrupo B 11). Esta patente describe el siguiente medio (llamado "MC.6") para cultivo de Neisseria meningitidis para aislamiento de OMPC ("Complejo de proteína de membrana externa").

Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 7399615 describe una composición de fermentación en donde la composición omite NH4CI, y un método mejorado para fermentar Neisseria (serogrupos A, C, Y y W135) en una composición de fermentación reemplaza cloruro de amonio (fuente de nitrógeno) con una peptona de soja (HSP-A; Nutricepts, Minneapolis, Minn.) La fermentación de lote de alimentación (2L), en donde el medio de fermentación así como también solución de alimentación contiene resultados de HSP-A en rendimiento de polisacárido Men A de aproximadamente 1300-1400 mg/1 en una OD máxima promedio de entre 14-20.

Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 7491517 describe un medio de cultivo fastidioso de Neisseria meningitidis (NMFM por sus siglas en inglés) para producir polisacáridos capsular a partir de Neisseria meningitidis (serogrupos A, C, Y y W135) que comprende: agua DI (deionizada), NaCl, K2SO4, KCl, citrato trisódico. 2H2O, MgSO4.7H20, MnS04.H20, MnCl2.6H20, vitamina B12, NAD (Nicotinamida Adenindinucléotido) tiamina HCl, peptona de soja, D-glucosa, ácido L-glutá ico, L-arginina, L-serina, 1-cisteína, glicina, ácido morfolinpropansulfónico (MOPS), CaC03 para mantener pH en 6.5 a 7.0 y Fe2(SC>4)3 para serogrupo A y NH4CI para serogrupo W-135. La fermentación resulta en rendimiento de polisacárido de aproximadamente 30-40 mg/1 en una OD máxima promedio de 10.

David Bundle et al. discuten preparación y aislamiento de polisacárido de Men X de cepa 247X de N. meningitidis (Laboratory Center for Disease Control) en donde la cepa se hace crecer en un medio químicamente definido (NCDM) por 18 horas. La fermentación resulta en rendimiento de polisácarido Men X de aproximadamente 20 mg/1. Se hace referencia a "Studies on the Group-specific Polysaccharide of Neisseria meningitidis Serogroup X and an improved Procedure for its isolation" JBC, 1974.

Ouli Xiea et al describe preparación de MenX PS de cepas BF7/07 y BF12/03. Brevemente, las cepas MenX son crecidas en placas de agar de infusión de corazón-cerebro con complemento de Levinthal y después de una etapa de precultivo en medio 0.2 L de Franz, la cepa es cultivada en cuatro matraces de agitación deflectados de 2.8 1 separados que contienen 1.0 ó 1.51 de medio líquido Franz modificado cada uno. Los cultivos líquidos son inactivados después de 16 horas de crecimiento por agregar formaldehído a una concentración final de 1% (v/v). Rendimiento MenX PS por litro de medio de crecimiento parece ser ligeramente superior para BF aislado 7/07 (4.5 mg/1) que para BF12/03 aislado (3.8 mg/1) . Se hace referencia a "Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitides polysaccharide, and development of an assay for quantification of human antibodies", Vaccine 30, 2012.

La téenica anterior discute estudios de mejora de rendimiento y estructurales con respecto a polisacáridos de serogrupos Men A, C, Y y W135. Sin embargo ninguna de la técnica anterior maneja la necesidad bastante sentida para preparación de polisácarido Men X con rendimiento superior el cual es un prerrequisito para desarrollo de polisacárido plano Men X y vacunas conjugadas de proteína de polisacárido de Men X.

En la presente invención se ha encontrado que estrategias de alimentación de la técnica anterior en base al pH-stat, repunte y proporción constante los cuales son adecuados para fermentación Men A C Y W135, sin embargo sufren de siguientes retrocesos para Men X: i) crecimiento satisfactorio pero menos rendimiento de polisacárido ii)crecimiento limitado, menos rendimiento de polisacárido y iii) crecimiento satisfactorio pero fase de declinación temprana. Métodos de la técnica anterior adicionales emplean peptona de soja y extracto de levadura como componentes de medio de alimentación que resultan en menor rendimiento de polisacárido asociado con carga incrementada de contaminantes de proteína.

Es un objeto de la presente invención proporcionar cultivo mejorado, condiciones de fermentación y purificación para preparar polisacáridos X de Neisseria meningitidis con alto rendimiento e impurezas mínimas. Con las mejoras, producción de vacuna de conjugado de proteína de polisacárido de Men X puede ser económico y pueden ser hechas disponibles subsecuentes vacunas a niños de países en desarrollados en una proporción razonable.

Sumario de la Invención La presente invención se origina del descubrimiento sorpresivo que es posible preparar polisacárido de Men X con rendimientos altos y alta pureza por utilizar a) un medio de fermentación que contiene ácido casamino junto con otros componentes, b) estrategia de alimentación exponencial continua novedosa y composición de medio de alimentación que puede resultar en retrasar la fase de declinación, c) condiciones de fermentador óptimo y d) proceso de purificación mejorada que carece de métodos cromatográficos.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Perfil de crecimiento de "X8210 de N. meningitidis" en medio que contiene ácido casamino en comparación con medio que contiene peptona de soja.

Figura 2. Espectro RMN 13C de Men X Figura 3. Espectro RMN 31P de Men X Figura 4: Espectro RMN 3H de Men X Descripción Detallada de la Invención Por consiguiente en una primera modalidad, la presente invención utiliza preferentemente medio de fermentación que contiene ácido casamino como fuente de nitrógeno en lugar de peptona de soja o extracto de levadura por lo mismo proporcionando las siguientes ventajas i) incremento significativo en rendimiento de polisacárido debido al retraso en fase de declinación como un resultado de utilización de una estrategia de alimentación exponencial continua novedosa, ii) 50% de disminución en concentración de contaminantes de proteína y ácido nucleico en etapa misma de cosecha de termentador 100 Kda, por lo mismo asegurando que proceso de purificación subsecuente pueda remover fácilmente impurezas restantes iii) escalación de medio de fermentación que contiene ácido casamino puede ser simple y económica.

Una segunda modalidad de la presente invención es que el medio de fermentación de Neisseria meningitidis para producir polisacáridos capsulares a partir de Neisseria meningitidis X puede comprender dextrosa de 9 y 10 g/1, cloruro de sodio entre 5.5 y 6 g/1, sulfato de potasio entre 0.8 y 1 g/1, fosfato de potasio dibásico entre 3.5 y 4 g/1, cloruro de amonio entre 0.14 y 0.19 g/1, ácido glutámico entre 4.5 y 5.5 g/1, L-arginina entre 0.2 y 0.4 g/1, L-serina entre 0.4 y 0.6 g/1, L-cisteína entre 0.24 y 0.26 g/1, cloruro de magnesio entre 0.18 y 0.20, cloruro de calcio 0.02 g/1, sulfato ferroso 0.002 g/1 y ácido casamino entre 5 y 20 g/1.

Una modalidad preferida de la presente invención es que el medio de fermentación de Neisseria meningitidis para producir polisacáridos capsulares a partir de Neisseria meningitidis X puede comprender dextrosa 10 g/1, cloruro de sodio entre 5.8 y 6 g/1, sulfato de potasio entre 0.9 y 1 g/1, fosfato de potasio dibásico entre 3.8 y 4 g/1, cloruro de amonio entre 0.14 y 0.17 g/1, ácido glutámico entre 4.8 y 5 g/1, L-arginina entre 0.2 y 0.3 g/1, L-serina entre 0.4 y 0.5 g/1, L-cisteína entre 0.24 y 0.25 g/1, cloruro de magnesio entre 0.18 y 0.19, cloruro de calcio 0.02 g/1, sulfato ferroso 0.002 g/1 y ácido casamino entre 5 y 10 g/1.

Un aspecto importante de la presente invención es que en la presente invención se ha encontrado sorpresivamente una estrategia de alimentación exponencial continua ventajosa que puede mantener células en fase estacionaria para una mayor duración, por lo mismo incrementando rendimiento de polisacárido X de N. meningitidis, de tal forma que la adición de alimentación inicial puede ser iniciada cuando OD en 590 nm está entre 3 a 4 en una proporción de 10 ml/h/1.51 lo cual incrementa gradualmente a 30 ml/h/1.51 hasta que la OD del cultivo es más alta y entonces mantenida en 60 ml/h/1.5 1 todavía la OD del cultivo alcanza 50% de OD más alta y entonces puede ser cosechado el cultivo.

Además en la presente invención se ha encontrado que durante fermentación para evitar caída de pH que resulta de acumulación de metabolitos celulares liberados, NaOH en una concentración entre 0.25 N y 0.5N y ácido ortofosfórico en una concentración entre 5 y 10% puede ser proporcionada continuamente por las bombas de dosificación en cascada con el pH mantenido en punto de fijación, en donde proporción de carbonato de sodio (20%) a NaOH (0.5N) es mantenida en 1:3.

Un aspecto importante de la presente invención es que la cepa 8210 de N. meningitidis X es encontrada para tener una fase log entre 5a y 9a h, fase estacionaria entre 9a y 12a y fase de declinación entre 12a y 19a h.

La fermentación en la presente invención puede ser realizada en forma de lote o lote alimentado, preferentemente en un modo de lote alimentado continuo.

En aún otro aspecto de la presente invención, la solución de alimentación puede comprender dextrosa entre 72 y 76 g/1, glutamato de sodio entre 38 y 42 g/1, L-arginina entre 2.8 y 3.2 g/1, L-serina entre 2.8 y 3.2 g/1, 1-cisteína entre 1.9 y 2.1 g/1, cloruro de magnesio entre 1.0 y 2.1, cloruro de calcio entre 0.13 y 0.15 g/1 y sulfato ferroso 0.02 g/1.

En una tercera modalidad, la presente invención proporciona un polisacárido capsular Men X que tiene rendimiento entre 600 mg/1 a 800 mg/1 en etapa de cosecha de termentador de 100 Kda en donde densidad óptica medida en 590 nm puede ser entre 8 y 15, preferentemente entre 8 y 11.

Una tercera modalidad de la presente invención es que fermentación de Neisseria meningitidis X puede ser realizada en valores de punto de fijación de i) pH de 7 a aproximadamente 7.2, ii) temperatura entre 36 y 37°C y en valores de cascada para i) oxígeno disuelto de 15 a 25%, ii) agitación de 350-500 rpm, iii) flujo de gas de 1 a 1.5, iv) aire de 0 a 100% y v) oxígeno de 0 a 100%.

Una cuarta modalidad de la presente invención es que la cosecha de diafiltración de 100 Kda puede ser además sometida a etapas de purificación que comprenden: (a) remoción de impurezas de proteína y endotoxina por utilizar deoxicolato en una concentración de 1% en combinación con ácido etilendiamintetraacético en una concentración de 2 mM y etanol en una concentración de 40%; (b) adición de 4 a 6% de acetato de sodio para remoción de ácidos nucleicos; (c) adición de bromuro de cetiltrimetilamonio en una concentración de 3 a 4% para enlazar polisacárido e impurezas; (d) precipitación de polisacárido a partir del complejo de bromuro de cetiltrimetilamonio- polisacárido por utilizar cloruro de sodio en una concentración de 0.05 M en presencia de 96% de etanol absoluto; (e) remoción de impurezas de proteína y ácido nucleico por lavar gránulo con etanol en una concentración de 45% en presencia de cloruro de sodio en una concentración de 0.4 M; (f) precipitación selectiva de polisacárido por utilizar 96% de etanol absoluto; (g) disolver polisacárido en WFI y someter a filtración de flujo tangencial: y en donde el proceso de purificación no utiliza ninguna cromatografía y el polisacárido purificado tiene rendimiento de 300 a 500 mg/1, peso molecular promedio de 400 a 550 Kda, contiene menos de 0.5% de proteínas/péptidos, menos de 0.5% de ácidos nucleicos, menos de 5 EU^g de endotoxinas con etapa de purificación recuperación de 60% a 65%.

Otro aspecto de la cuarta modalidad es que el proceso de purificación de polisacárido de N. meningitidis X es robusta y eficiente en costo ya que proporciona aproximadamente 60 a 70% de recuperación de polisacárido y no requiere ninguna etapa cromatográfica adicional.

Un quinto aspecto de la presente invención es que el proceso puede ser aplicable a N. meningitidis serotipo X, A, B, C, D, Y, Z, 29E y W-135, preferentemente cepas de N. meningitidis serotipo X seleccionadas de M9601, M9592, M9591, 247X, M9554, M8210 y M2526, 5967 (ST 750), más preferentemente a "M8210".

Una sexta modalidad de la presente invención es que el polisacárido de N. meningitidis X de la presente invención puede ser utilizado para preparar composición de conjugado de proteína de polisacárido por métodos descritos en la solicitud internacional WO 201314268 en donde i) polisacárido X puede ser dimensionado mecánicamente para obtener fragmentos que tiene tamaño entre 150 y 200 Kda, ii) sacárido dimensionado puede ser conjugado a proteína portadora por medio de un enlazador con una química de conjugación de cianilación iii) proporción sacárido a proteína en conjugado final puede ser entre 0.2-0.6.

En un aspecto de la sexta modalidad el polisacárido de N. meningitidis X de la presente invención puede también ser utilizado para preparar una composición de conjugado de proteína de polisacárido de meningococo multivalente que comprende sacárido capsular de serogrupos X y por lo menos un polisacárido capsular adicional de A, C, W135 y Y por métodos descritos previamente en la solicitud internacional WO 201314268 .

La séptima modalidad de la presente invención es que la proteína portadora puede ser seleccionada de un grupo de pero no limitado a CRM 197, toxoide de difteria, toxoide tetánico, toxoide pertussis, E. coli Lt, E. coli ST, y exotoxina a de Pseudomonas aeruginosa, complejo de membrana externa c (OMPC por sus siglas en inglés), porinas, proteínas de enlace de transíerrina , pneumolisina, proteína A de superficie pneumococo (PspA por sus siglas en inglés), proteína adhesina de neumococo (PsaA por sus siglas en inglés), proteínas de superficie de pneumococo BVH-3 y BVH-11, antígeno protector (PA por sus siglas en inglés) de Bacillus anthracis y factor de edema detoxificada (EF por sus siglas en inglés) y factor letal (LF por sus siglas en inglés) de Bacillus anthracis , ovalbúmina, hemocianina de lapa (KLH por sus siglas en inglés), albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina (BSA por sus siglas en inglés) y derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD por sus siglas en inglés) . Preferentemente, proteínas portadoras pueden ser seleccionadas de toxoide tetánico, toxoide de difteria y CRM197.

Composiciones inmunogénicas monovalentes o multivalentes que contienen polisacárido de N. meningitidis X pueden estar en una forma líquida amortiguada o en una forma liofilizada. Preferentemente, el conjugado de proteína polisacárido puede ser liofilizado como se describe previamente en la solicitud de los Estados Unidos de Norteamérica US2013/0209503, en donde la formulación puede tener por lo menos 6 meses de estabilidad en 40°C y contenido libre de polisacárido puede ser menor a 11% p/p.

La composición de vacuna liofilizada de la presente invención puede ser reconstituida con un vehículo de suministro que tiene pH de aproximadamente 6 a 7.5, particularmente con solución salina o PBS.

Composiciones pueden comprender adyuvante de sal de aluminio agregado en una cantidad de 25-125 mg de Al+++ por 0.5 mi.

También la composición puede comprender de un conservador seleccionado de tiomersal y 2-fenoxietanol.

La composición de vacuna liofilizada de la presente invención puede ser dada como una formulación de dosis 1.5 ó 10.

El polisacárido o un conjugado del mismo es administrado preferentemente en forma parental, por ejemplo por inyección o infusión por ruta intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial o intralesión.

Ejemplos: 1)- Procedimiento de Fermentación Vial de semilla que contiene 3 mi de cultivo de N. meningitidis X M8210 (CBER por sus siglas en inglés) que tiene OD 1/ml es congelado en -70°C. Se descongela entonces el vial y se siembra en 30 mi de medio de siembra lo cual se incuba en 37°C y se agita en 150 a 180 rpm. Se duplica el volumen a 60 mi cuando la OD está arriba de 0.7 y entonces 120 mi, 210 mi respectivamente.

Cultivo que tiene OD 10 +_ 0.2 con volumen de 70 ÷_ 10 mi es sembrado en el reactor, en donde el volumen del medio en el reactor es 1500 mi. Después de inoculación de reactor 0 h se mantiene la OD en 0.04 a 0.05.

Se realiza el proceso de fermentación total en bioreactor de vidrio bio flujo Celligen 115 NBS (2.2 1), en donde el ciclo de fermentación es corrido en un modo de lote de alimentación continuo y duración total de ciclo de fermentación es 19 horas. 11) Composición de Medio de Fermentación Tabla 1: Composición de medio novedoso que contiene ácido casamino para N. meningitidis serogrupo X (NMXM-CA-1) Tabla 2: Composición de medio novedoso que contiene ácido casamino para N. meningitidis serogrupo X (NMXM-Ca-II) Tabla 3: Composición de medio novedoso que contiene ácido casamino para N. meningitidis serogrupo X (NMXM-CA-III) Tabla 4: Composición de un medio que contiene peptona de soja para N. meningitidis serogrupo X (NMXM-SP) Tabla 5: Composición de un medio que contiene peptona de soja para N. meningitidis serogrupo X (NMXM-S III Cinéticas de crecimiento, Estrategia de Alimentación Novedosa Y Soluciones de Alimentación.

Tabla 6: Perfil de Crecimiento de cepa 8210 de N. meningitidis Se identifica la fase log entre 5a y 9a hora, fase estacionaria entre 9a y 12a y fase de declinación entre 12a y 19a hora.

Estrategia de Alimentación Novedosa: Se diseña la estrategia de alimentación de tal forma que la adición de alimentación inicial puede ser iniciada cuando OD en 590 nm está entre 3 a 4 en una proporción de 10 ml/h/1.51 lo cual incrementa gradualmente a 30 ml/h/1.5 1 hasta que la OD del cultivo es la más alta y entonces se mantiene en 60 ml/h/1.5 1 hasta que la OD del cultivo alcanza 50% de OD más alta y entonces puede ser cosechado el cultivo.

Soluciones de alimentación Tabla 7: Composición de "Solución 1 alimenticia" novedosa (FS-1) para N. meningitidis serogrupo X.

Tabla 8: Composición de "solución 2 de alimentación" novedosa (FS-2) para N. meningitidis serogrupo X Resultados La estrategia de alimentación exponencial continua resulta en mantener células en fase estacionaria para una duración mayor, por lo mismo incrementando rendimiento de polisacárido de N. meningitidis X. Uso de ácido casamino como una fuente de nitrógeno es encontrado para proporcionar polisacárido de Men X de rendimiento alto y peso molecular alto con impurezas mínimas en etapa 100 Kda como se compara con peptona de soja como fuente de nitrógeno.

Cuando se usan solamente dextrosa y glutamato de sodio como solución de alimentación (FS-2), se afecta morfología celular resultando por último en características de polisacárido desfavorables. Mientras que cuando se usa FS-1 (que contiene aminoácidos, sales además de dextrosa y glutamato de sodio) se encuentra que la morfología de células es mejorada, por lo mismo incrementando rendimiento de polisacárido y proporcionando polisacárido con características favorables.

Estudio de perfil de crecimiento de N. meningitidis X 8210 revela que durante fermentación una caída de pH que resulta de acumulación de metabolitos celulares liberados es observada y que afecta adversamente la proporción de producción de polisacárido capsular. Para evitar la caída de pH, se proporciona continuamente NaOH en una concentración entre 0.25N y 0.5N y ácido ortofosfórico en una concentración entre 5 y 10% continuamente por las bombas de dosificación en cascada con el pH mantenido en punto de fijación, en donde se mantiene la proporción de carbonato de sodio (20%) a NaOH (0.5 N) en 1:3.

IV) Condiciones de Fermentador Tabla 9 : Variables del Fermentador Tabla 10 : Concentración de polisacárido y perfil de pureza en 100 KDa Fuentes de nitrógeno Concentración de Concentraciones utilizadas polisacáridos (gm/1) relativas de - Resultados Para medio NMXM-CA que contiene ácidos casamino, en etapa 100 KDa, el rendimiento de polisacárido está entre 500 y 650 mg/1 con carga mínima, en donde se realiza la cosecha cuando OD alcanza 50% de OD de cultivo más alta. Mientras que para medio NMXM-SP que contiene peptona de soja, en etapa 100 KDa, rendimiento de polisacárido es comparativamente más bajo es decir entre 450 y 500 mg/1 con mayor carga de impurezas.

V) Cosecha e Inactivación Se termina la fermentación una vez que se observa una caída en densidad óptica seguido por inactivación usando 1% de formaldehído por 2 horas en 37°C. Además se reduce la temperatura en 10°C y se incuba por 30 minutos. Se descarga la cosecha y se centrífuga en 14,500 g por 45 minutos.

Se somete entonces el sobrenadante a filtración de 0.2 mg seguido por diafiltración de 100 KD (10-15 veces) y es además concentrada con WFI. Se realiza la última filtración estéril con filtro de 0.2 m.

VI) Purificación de Polisacárido de Men X Protocolo Adición de 0.5% de deoxicolato, 6% de acetato de sodio, EDTA 2 mM y 40% de etanol a la cosecha diafiltrada 100 PCD. Entonces se mantiene la mezcla en 2-8°C por 3-4 horas con agitación. Se somete la última mezcla a centrifugación en 10000 rpm por 20 minutos y se diafiltra el sobrenadante contra Tris 25 mM con membrana de casete 100 KD. Además se realiza precipitación CTAB 10% p/v durante la noche en 2-8°C con agitación y se recolecta el gránulo. Se disuelve el gránulo en 96% de etanol con NaCl 0.05 M en 2-8°C por 2 horas en agitación. Entonces se realiza la precipitación de polisacárido por 30 minutos y se recolecta el gránulo. Se disuelve el gránulo en 45% de etanol con NaCl 0.4 M por 1 hora. Se recolecta el sobrenadante y se filtra a través del filtro de carbono CUNO R32SP. Se precipita entonces el polisacárido en 96% de etanol por 1-2 horas y se recolecta el gránulo. Se disuelve entonces el gránulo en WFI seguido por TFF. Se almacena polisacárido de N. meningitidis X purificado final en -20°C.

Protocolo 2 Adición de 1.5% deoxicolato, 6% de acetato de sodio, EDTA 2 mm y 40% de etanol a la cosecha diafiltrada 100 KD. Entonces se mantiene la mezcla en 2-8°C por 3-4 horas con agitación. Se somete la última mezcla a centrifugación en 10000 rpm por 20 minutos y se diafiltra el sobrenadante contra 25 mM de Tris con membrana de casete 100KD. Además se realiza 6% p/v de CTAB durante la noche en 2-8°C con agitación y se recolecta gránulo. Se disuelve el gránulo en 96% de etanol con 0.05 m de NaCl en 2-8°C por 2horas en agitación. Entonces se realiza la precipitación de polisacárido por 30 minutos y se recolecta el gránulo. Se disuelve el gránulo en 45% de etanol con NaCl 0.4 M por 1 hora. Se recolecta el sobrenadante y se filtra a través de filtro de carbono CUNO R32SP. Entonces se precipita el polisacárido en 96% de etanol por 1-2 horas y se recolecta el gránulo. Se disuelve entonces el gránulo en WFI seguido por TFF. Se almacena polisacárido de N. meningitidis X purificado final en -20°C.

Protocolo 3 Adición de 1% de deoxicolato, 6% de acetato de sodio, 2mM de EDTA y 40% de etanol a la cosecha diafiltrada 100 KD. Entonces se mantiene la mezcla en 2-8°C por 3-4 horas con agitación. Se somete la última mezcla a centrifugación en 10000 rpm por 20 minutos y se diafiltra el sobrenadante contra 25 mM de Tris con membrana de casete 100 KD. Además se realiza precipitación CTAB 3% p/v durante la noche en 2-8°C con agitación y se recolecta gránulo. Se disuelve el gránulo en 96% de etanol con NaCl 0.05 M en 2-8°C por 2 horas en agitación. Entonces se realiza precipitación de polisacárido por 30 minutos y se recolecta el gránulo. Se disuelve el gránulo en 45% de etanol con NaCl 0.4 m por 1 hora. Se recolecta el sobrenadante y se filtra a través de un filtro de carbono CUNO R32SP. Entonces se precipita el polisacárido en 96% de etanol por 1-2 horas y se recolecta el gránulo. Se disuelve entonces el gránulo en WFI seguido por TFF. Se almacena polisacárido de N. meningitidis X purificado final en -20°C.

El protocolo 1 que tiene bajo DOC provoca remoción ineficiente de contaminantes (proteína/ácidos nucleicos) mientras que altas concentraciones de CTAB resulta en un complejo de CTAB-polisacárido que no es fácilmente separable.

El protocolo 2 que tiene DOC alto resultó en soluciones de polisacáridos más viscosas, lo que hizo más fácil el procesamiento de TFF. Además, una concentración intermedia de CTAB resultó en un complejo de CTAB- polisacárido que no era fácil de separar.

El protocolo 3 que tiene DOC intermediario y menos concentración de CTAB es encontrado para ser más eficiente que el protocolo ½ y por lo tanto es finalizado para purificación de polisacárido de N. meningitidis X.

El polisacárido de N. meningitidis X preparado por protocolo 3 es probado para impurezas como Proteína, ácido nucleico, Endotoxina y tamaño molecular. Aunque especificación/pautas de WHO para polisacárido de Men X no son disponibles, se encuentra que el polisacárido de N. meningitidis X purificado cumple con especificaciones WHO ya fijas para un fosfodiéster similar que contiene polisacárido es decir N. meningitidis A.

Además, comparación de asignaciones de RMN 1H, 13C, 31P de polisacárido de Men X de SIL con datos NMR relacionados a X recientemente publicados (Vaccine 30, 2012, 5812-5823 y Vaccine 30, 2012, 6409-6415) confirman identidad estructural de polisacárido de Men X de SIL.

Tabla 11. Características de Polisacárido de Men X purificado Resultados Tanto, lotes a base de NMXM-SP NMXM-CA de polisacárido de Men X son encontrados para cumplir con especificaciones de WHO fijos para polisacárido de . meningitidis .

Para medio NMXM-CA que contiene ácidos casamino, en etapa purificada final, recuperación de etapa de purificación es entre 60 y 65%, rendimiento de polisacárido está entre 350 y 500 mg/ml con carga mínima de impurezas cuando se realiza cosecha cuando OD de cultivo alcanza 50% de OD de cultivo más alto. Mientras que para medio NMXM-SP que contiene peptona de soja, en etapa purificada final, recuperación de etapa de purificación para polisacárido así como también rendimiento de polisacárido es comparativamente bajo junto con mayor carga de impurezas.

Se logra rendimiento de polisacárido de Men X alto anterior sin utilizar cualesquiera métodos cromatográficos adicionales, demostrando por lo mismo que el protocolo de purificación anterior es robusto y eficiente en costo.

VII) Preparación de conjugados de proteína- polisacárido de Men X inmunogénicos, liofilizados Composiciones inmunogénicas monovalentes o multivalentes que contienen toxoide tetánico- polisacárido de N. meningitidis pueden estar en una forma líquida amortiguada o en una forma liofilizada.

Preferentemente, el conjugado de proteína polisacárido puede ser liofilizado como se describe previamente en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 2013/0209503, en donde la formulación puede tener por lo menos 5 meses de estabilidad en 40°C y contenido libre de polisacárido puede ser menor a 11% p/p.

Puede ser utilizado polisacárido de Men X de la presente invención para preparar composiciones de conjugado de proteína de polisacárido de meningococo multivalente, inmunogénico que comprenden sacárido conjugado a partir de serogrupos X y por lo menos un sacárido capsular de A, C, W135 y Y como se discute previamente en la solicitud internacional WO 201314268.

En vista de las muchas posibles modalidades a las cuales los principios de la invención descrita pueden ser aplicados, debe ser reconocido que las modalidades ilustradas son solamente ejemplos preferidos de la invención y no debe ser tomado como limitante del alcance de la invención. Más aún, el alcance de la invención es definida por las siguientes reivindicaciones. Por lo tanto reclamamos como nuestra invención todo lo que está dentro del alcance y espíritu de estas reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método novedoso para preparar un polisacárido capsular de Neisseria meningitidis con alto rendimiento y alta pureza, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) preparar un medio nutriente termentador acuoso que comprende ácido casamino; (b) incubar el medio nutriente termentador con una bacteria de Neisseria meningitidis X que tiene densidad óptica de 0.8 a 1.2 (c) alimentación exponencial continua con una solución de alimentación con una proporción de adición de alimentación que varía entre 10 ml/h/1.5 1 y 60 ml/h/1.51 que inicia en OD entre 3 y 4; (d) incubar el medio nutriente termentador inoculado bajo condiciones controladas de pH, temperatura y porcentaje de oxígeno disuelto; (e) cosechar el sacárido capsular producido en etapa (d) cuando densidad óptica (OD por sus siglas en inglés) en 590 nm es menor a 60% de OD de cultivo más alto, (f) purificar el sacárido capsular obtenido en la etapa (e); (g) concentrar opcionalmente el polisacárido capsular purificado obtenido en la etapa (f); y en donde el polisacárido purificado tiene rendimiento de 300 a 550 mg/1, peso molecular promedio de 400 a 550 kDa, recuperación de etapa de purificación de 60% a 65% y contiene menos de 0.5% de proteínas/péptidos, menos de 0.5% de ácidos nucleicos y menos de 5 EU/^g de endotoxinas.

2. Un método para la producción de polisacárido capsular de Neisseria meningitidis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: (a) el sacárido capsular que produce bacterias pertenece al grupo sero X; (b) el polisacárido capsular que produce bacterias es seleccionado de N. Meningitidis cepas M8210, M9601, M9591, M9592, M9554, M2526, 247X y 5967 (ST 750); (c) el medio nutriente del termentador comprende: (i) ácidos casamino en una cantidad de 5 g/1 a 20 g/1, 0.14 g/1 a 0.19 g/1 de cloruro de amonio, 10 g/1 a 11 g/1 de dextrosa, 5.8 g/ a 6 g/1 de cloruro de sodio, 0.9 g/1 a 1 g/1 de sulfato de potasio, 3.8 g/1 a 4 g/1 de fosfato de potasio dibásico, 4.8 g/1 a 5 g/ de ácido glutámico, 0.2 g/1 a 0.3 g/1 de L-arginina, 0.4 g/L a 0.5 g/L de 1-serina, 0.24 g/L a 0.25 g/L. L-cisteína, 0.18 g/L a 0.19 g/L de cloruro de magnesio, 0.02 g/1 de cloruro de calcio y 0.002 g/1 de sulfato ferroso de tal forma que la concentración de componentes del medio pueden variar por + 10% ó (ii) ácidos casamino en una cantidad de 5 g/1 a 10 g/1, 0.14 g/1 a 0.17 g/1 de cloruro de amonio, 10 g/1 a 11 g/1 de dextrosa, 5.8 g/1 a 6 g/1 de cloruro de sodio, 0.9 g/1 a 1 g/1 de sulfato de potasio, 3.8 g/1 a 4 g/1 de fosfato de potasio dibásico, 4.8 g/1 a 5 g/1 de ácido glutámico, 0.2 g/1 a 0.3 g/1 de L-arginina, 0.4 g/1 a 0.5 g/1 de L-serina, 0.24 g/L a 0.25 g/1 de L-cisteína, 0.18 g/1 a 0.19 g/1 de cloruro de magnesio, 0.02 g/1 de cloruro de calcio y 0.002 g/1 de sulfato ferroso de tal forma que la concentración de componentes del medio puede variar por + 10%. (d) la inoculación de medio de nutriente termentador es por inoculo de siembra que tiene una densidad óptica de 0.8 a 1; (e) la alimentación exponencial continua inicia con adición de alimentación inicial en una proporción de 10 ml/h/1.5 1 cuando OD en 590 nm está entre 3 a 4 lo cual incrementa gradualmente a 30 ml/h/1.5 1 hasta que la OD de cultivo es más alta y entonces mantenida en 60 ml/h/1.5 1 hasta que la OD del cultivo alcance 50% de la OD más alta cuando puede ser cosechado cultivo; (f) la solución de alimentación comprende de 72 a 76 g/1 de dextrosa, 38 g/1 a 42 g/1 de glutamato de sodio, 2.8 g/1 a 3.2 g/1 de L-arginina, 2.8 g/1 a 3.2 g/1 de L-serina, 1.9 g/1 a 2.1 g/1 de L-cisteína, 1.9 g/L a 2 g/1 de cloruro de magnesio, 0.13 g/1 a 0.15 g/1 de cloruro de calcio y 0.02 g/1 de sulfato ferroso de tal forma que la concentración de componentes de la solución de alimentación puede variar por + 10%. (g) La incubación es realizada (i) en una temperatura de 36°C a 37°C; en un pH de 7-7.2 en 350 a 500 rpm, porcentaje de oxígeno disuelto de 15% a 25%, flujo de gas en 1 a 1.5, aire en 0 a 100% y oxígeno en 0 a 100% por 7 a 10 horas ó (ii) en una temperatura de 36°C, en un pH de 7.2, en aproximadamente 400 rpm, porcentaje de oxígeno de 25%, flujo de gas en 1 a 1.5, iv) aire en 0 a 100% y oxígeno en 0 a 100% por 8 a 9 horas; (h) la inactivación es realizada usando 1% de formaldehído por 1 a 2 horas en 37°C seguido por incubación en 10°C por 30 minutos. (i)la cosecha es realizada por (i) centrifugación en 14500 por 45 minutos remueve todos los residuos celulares; (ii) someter el sobrenadante a filtración 0.2 m seguido por diafiltración de 100 KD y concentración con WFI; y (j) el proceso es realizado en sistema de cultivo de lote de alimentación continua

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (f) comprende: (a) remoción de impurezas de proteína y endotoxina por utilizar detergente aniónico en una concentración de 1 a 1.2% en combinación con agente de quelación en una concentración de 1.5 a 3 mM y alcohol en una concentración de 40% a 50%; (b) adición de acetato de sodio en una concentración de 4 a 6% para remoción de ácidos nucleicos; (c) adición de un detergente catiónico en 3 a 4% para enlazar polisacárido e impurezas; (d) precipitación de polisacárido a partir del complejo de detergente-polisacárido catiónico por utilizar cloruro de sodio en 0.05 M en presencia de 96% de alcohol; (e) remoción de proteína e impurezas de ácido nucleico por gránulo de lavado con 45% de alcohol en presencia de cloruro de sodio en una concentración de 0.4 M; (f) precipitación selectiva de polisacárido por utilizar 96% de alcohol; (g) disolver polisacárido en WFI y someter a filtración de flujo tangencial; y en donde el proceso de purificación no utiliza ninguna cromatografía.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la purificación comprende las siguientes etapas: (a) remoción de impurezas de proteína y endotoxina por utilizar deoxicolato en una concentración de 1% en combinación con ácido etilendiamintetraacético en una concentración de 2 mM y etanol en una concentración de 40%; (b) adición de 4 a 6% de acetato de sodio para remoción de ácidos nucleicos; (c) adición de bromuro de cetiltrimetilamonio en una concentración de 3 a 4% para enlace de polisacárido e impurezas; (d) precipitación de polisacárido a partir de complejo de bromuro de cetiltrimetilamonio-polisacárido por utilizar cloruro de sodio en una concentración de 0.05 M en presencia de 96% de etanol; (e) remoción de proteína e impurezas de ácido nucleico por lavar gránulo con etanol en una concentración de 45% en presencia de cloruro de sodio en una concentración de 0.4 M; (f) precipitación selectiva de polisacárido utilizando 96% de etanol; (g) disolver el polisacárido en WFI y someter a filtración de flujo tangencial y en donde el proceso de purificación no utiliza ninguna cromatografía.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa (h) en donde polisacárido de N. meningitidis X purificado es dimensionado a un tamaño promedio de entre 100 y 150 Kda por usar sistema de alteración de célula de alta presión.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende etapa (i) en donde el polisacárido reducido en tamaño es conjugado a una proteína portadora, para dar un conjugado de proteína-sacárido.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el sacárido de N. meningitidis X es conjugado a una proteína portadora seleccionada del grupo que consiste de TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, proteína D, OMPC y neumolisina.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el sacárido de N. meningitidis X es conjugado a la proteína portadora por medio de un enlazador hetero u homobifuncional con química de conjugación de cianilación.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el reactivo de cianilación es seleccionado de un grupo de tetrafluoroborato de l-ciano-4-pirrolidinpiridinio (CPPT por sus siglas en inglés), 1-ciano-imidazol (1-C1), 1-cianobenzotriazol (1-CBT), o 2-cianopiridazina-3 (2H) uno (2-CPO) o un derivado funcional o modificación del mismo.

10. Una composición inmunogénica preparada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los conjugados de sacárido están en una forma liofilizada.

11. Una composición inmunogénica preparada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los conjugados de sacárido están en una forma líquida amortiguada.

12. Una composición inmunogénica preparada de conformidad con las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque uno o más conjugados de sacárido de N. meningitidis son adsorbidos opcionalmente en hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o una mezcla de ambos o no adsorbido en adyuvante.

13. Una composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende una etapa para agregar adyuvante de sal de aluminio en una cantidad de 25-125 mg de Al+++ por 0.5 mi.

14. Una composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende además un conservador seleccionado de tiomersal y 2-fenoxietanol.

15. Composiciones de vacuna de conjugado de N. meningitidis monovalentes o multivalentes liofilizadas inmunogénicas caracterizadas porque contienen conjugado de proteína- polisacárido de N. meningitidis X preparado de conformidad con cualesquiera reivindicaciones precedentes en donde la vacuna es dada como formulación de dosis 1.5 ó 10.

16. Un método novedoso para preparar un polisacárido capsular de Neisseria meningitidis X con altos rendimientos y alta pureza caracterizado porque se usa: i) una composición de medio de fermentación que contiene ácidos casamino y cloruro de amonio junto con otros componentes, ii) una estrategia de alimentación exponencial continua y composición de medio de alimentación que puede retrasar la fase de declinación, iii) condiciones de termentador óptimas, iv) proceso de purificación mejorado que carece de métodos cromatográficos; y en donde el polisacárido purificado por purificación tienen un rendimiento de 300 a 550 mg/1 , peso molecular promedio de 400 a 550 KDa, contiene menos de 0.5 % de proteínas/péptidos, menos de 0.5% de ácido nucleico, menos de 5 EU/g de endotoxinas y la recuperación de etapa de purificación es de 60 a 65%.

17. Un método novedoso para preparar un polisacárido capsular de Neisseria meningitidis X con altos rendimientos y alta pureza caracterizado porque se usa: i) una composición de medio de fermentación que comprende una combinación de ácido casamino y por lo menos una fuente de nitrógeno adicional seleccionada de peptona de soja y extracto de levadura, ii) una estrategia de alimentación exponencial continua y composición de medio de alimentación que puede retrasar la fase de declinación, iii) condiciones de termentador óptimas, iv) proceso de purificación mejorada que carece de métodos cromatográficos; y en donde el polisácarido purificado por purificación tiene un rendimiento de 300 a 550 rag/1, peso molecular promedio de 400 a 550 KDa, contiene menos de 0.5% de proteínas/péptidos, menos de 0.5% de ácidos nucleicos, menos de 5 EU^g de endotoxinas y la recuperación de etapa de purificación es de 60% a 65%.

18. Un método novedoso para preparar polisacárido capsular de Neisseria meningitidis X con altos rendimientos y alta pureza caracterizado porque se usa i) una composición de medio de fermentación que comprende una combinación de ácido casamino, cloruro de amonio, y por lo menos una fuente de nitrógeno adicional seleccionada de peptona de soja y extracto de levadura, ii) una estrategia de alimentación exponencial continua y composición de medio de alimentación que puede retrasar la fase de declinación, iii) condiciones de termentador óptimas, iv) proceso de purificación mejorado que carece de métodos cromatográficos y en donde el polisacárido purificado por purificación tiene rendimiento de 300 a 550 mg/1, peso molecular promedio de 400 a 550 KDa, contiene menos de 0.5% de proteínas/péptidos, menos de 0.5% de ácidos nucleicos, menos de 5 EU/pg de endotoxinas y la recuperación de etapa de purificación es de 60% a 65%.