MXPA06002813A - Procedimiento para producir un polisacarido capsular para ser utilizado en vacunas de conjugado - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para producir un polisacárido y una vacuna de conjugado que comprende al polisacárido que se produce de conformidad con el método de la invención. Un paso característico en el método de conformidad con la invención es que el pH del medio de cultivo se mantiene a un valor constante conácido o base hasta que el ajuste respectivamente con base oácido ya no es posible. Utilizando el método de la invención, se puede obtener polisacárido capsular en un rendimiento alto en un tiempo relativamente corto. El método es sencillo, reproducible y efectivo en cuanto a costos.

Description

PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR UN POLISACARIDO CAPSULAR PARA SER UTILIZADO EN VACUNAS DE CONJUGADO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la producción de polisacáridos capsulares bacterianos y a su uso para la producción de vacunas de conjugado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El primer paso en la elaboración de una vacuna es el de separar la actividad generadora de enfermedad, de la actividad inductora de inmunidad. En la práctica esto significa aislar o crear un organismo, o una parte de un organismo, que no pueda ocasionar la enfermedad completamente desarrollada, pero que aún conserve los antigenos responsables de inducir la respuesta inmune del hospedero. Se distinguen dos grupos importantes de vacunas: vacunas de organismo completo y vacunas de subunidades. Las vacunas de organismo completo se producen aniquilando/inactivando o atenuando/debilitando los organismos. Las vacunas de sub-unidad incluyen vacunas basadas por ejemplo en antigenos proteinicos y antigenos tipo carbohidrato. Las vacunas anti-bacterianas que se producen utilizando antigenos tipo carbohidrato pueden estar constituidas por un polisacárido purificado (capsular) proveniente del organismo causante de la enfermedad. Los ejemplos de dichas vacunas son: vacunas de polisacárido de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) , Neisseria meningitidis (A, C, W e Y) , Salmonella typhi (Vi) , y Streptococcus pneumoniae (23 serotipos diferentes) . Al parecer las vacunas de polisacárido no protegen a los infantes menores de 2 años de edad y no inducen memoria de célula T a largo plazo. Por lo tanto, se introdujo una nueva generación de vacunas de polisacárido conjugado. Parece ser que las vacunas de conjugado son inmunogénicas en niños pequeños e inducen una memoria a largo plazo. Las vacunas de conjugado se producen principalmente uniendo el polisacárido a un portador proteinico. La primera vacuna de conjugado que se introdujo a nivel mundial estaba dirigida contra Haemophilus influenzae tipo b (Hib) . Haemophilus influenzae tipo b causa neumonía y meningitis, principalmente en niños pequeños. Este se disemina a través de las gotitas que se producen al toser, estornudar y en condiciones de vivienda sobre-poblada. Se estima que causa 2 a 3 millones de casos de enfermedad cada año y alrededor de 450,000 decesos, la gran mayoria de estos en países en vias de desarrollo. Varias vacunas contra Hib se encuentran en uso generalizado en paises con ingresos elevados, en donde éstos virtualmente han erradicado la enfermedad. Las vacunas están entre las más seguras actualmente en uso. Los estudios han confirmado la efectividad de estas vacunas en paises con bajos ingresos, pero relativamente pocos de éstos han iniciado su uso rutinario en infantes. La vacuna de Hib es una de las vacunas más sub-utilizadas debido a su costo relativamente elevado en comparación con las vacunas utilizadas de manera rutinaria en el programa regular de inmunización de la niñez. Los procedimientos de producción utilizados hoy en dia son relativamente costosos, e incluyen un paso largo de cultivo de aproximadamente 16-18 horas, véase por ejemplo el documento US 4,644,059 y que el periodo de cultivo típicamente se basa en parámetros arbitrarios, tales como tiempo o densidad óptica, véase por ejemplo el documento US 4,220,717. De esta manera, no es posible compensar respecto a los cambios en las condiciones de cultivo y los rendimientos sub-óptimos de polisacárido son el resultado inevitable. Además, se utilizan químicos agresivos tales como fenol para recuperar el polisacárido, véase por ejemplo los documentos US 4,695624 y EP 0 528 Con el fin de contribuir al objetivo de la OMS (Organización Mundial de la Salud) y de AGVI (Alianza Global para Vacunas e Inmunización) , de elaborar vacunas de conjugado de Hib disponibles para todos los niños en el mundo y para brindar a las personas en paises en vias de desarrollo una oportunidad de tener acceso a tecnología de Hib, se tiene que desarrollar, patentar y concesionar a estos paises, bajo ciertos términos razonables, un procedimiento de producción relativamente sencillo y fácilmente escalable. La vacuna producida debe satisfacer los requerimientos relevantes de la OMS.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: DO590, pH y concentración de fosfato de polirribosil ribitol (PRP) durante un cultivo de prueba a una escala de 40 litros. Figura 2: Procedimiento de purificación sencillo de fosfato de polirribosil ribitol (PRP) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para producir un polisacárido y al uso del polisacárido para producir una composición farmacéutica. El método para producir el polisacárido comprende: - cultivar una bacteria encapsulada en un medio de cultivo apropiado a un pH y temperatura apropiados - ajustar el pH del medio de cultivo a un valor constante con base o ácido hasta que el ajuste con base o ácido respectivamente ya no sea posible retrasar la lisis de las células, de preferencia mediante enfriamiento hasta una temperatura menor a la temperatura utilizada para el cultivo opcionalmente, recuperar el polisacárido a partir del medio de cultivo. Una de las ventajas del método de producción de polisacárido de conformidad con la invención es que se pueden obtener polisacáridos capsulares, es decir antigeno capsular extraído a partir de una bacteria patógena, con un alto rendimiento (aproximadamente 200-400 g/litro) en un tempo muy corto. Desde luego, la optimización adicional del medio y/o método de cultivo (por lote alimentado en lugar de por lotes) da como resultado una concentración mucho más alta de polisacárido. Mientras que los métodos de la técnica más avanzada para producir polisacáridos capsulares requieren entre 16 y 18 horas de fermentación aproximadamente, en el método de conformidad con la presente invención, la fermentación típicamente se puede completar, es decir se alcanza el momento óptimo para su terminación, dentro de un intervalo entre 6 y 14 horas aproximadamente, de preferencia ésta se completa dentro de 7, 8, 9, 10 u 11 horas aproximadamente. Típicamente, ésta no toma más de 12 a 14 horas aproximadamente. Desde luego los tiempos dependen de las bacterias y de las cepas utilizadas y pueden ser ligeramente diferentes dependiendo de la "condición fisica" de las bacterias. En este contexto, la "condición fisica" de las bacterias se refiere entre otras cosas a la calidad del inoculo y se refleja, por ejemplo, en la duración de la fase lag del cultivo. Otras ventajas del método de conformidad con la presente invención son que el método es sencillo, reproducible y efectivo en cuanto a costos y produce rendimientos óptimos, incluso después de un cambio en las condiciones de cultivo. Asimismo, las bacterias se cultivan utilizando un medio simple que no contenga componentes de origen animal, excepto por la hemina. Esto produce un medio limpio lo cual es una gran ventaja, debido a que la tendencia en la actualidad es la de reducir al inimo la transferencia de enfermedades de animales, tales como BSE, utilizando tanto como sea posible medios libres de componentes de origen animal. Incluso otra ventaja es que éste también es muy flexible en el sentido de que tan rápido como se inicia el enfriamiento, se retrasa la lisis celular y la recolección del polisacárido se puede efectuar en cualquier momento conveniente, en tanto que ésta se inicie dentro de 24 horas aproximadamente, de preferencia dentro de 8, 10, 12, 14 ó 16 horas aproximadamente, más preferido dentro de 2, 4 ó 6 horas aproximadamente después de iniciar el enfriamiento. El experto en la técnica entenderá que mientras más alta sea la temperatura después del enfriamiento, más rápido se tendrá que iniciar la recolección, para obtener mejores resultados. En una modalidad, la recolección se inicia aproximadamente 1.5 horas después de reducir la temperatura. El método se escala sustancialmente sin problemas especialmente debido a que la recolección se basa en un parámetro físico (pH) y no en algo arbitrario tal como por ejemplo el tiempo o la densidad óptica (DO) . Asimismo, el método da como resultado un polisacárido a granel muy estable que se puede purificar utilizando un procedimiento relativamente sencillo. El procedimiento de purificación se basa en el sobrenadante concentrado, por lo tanto, la cantidad de materiales auxiliares es mínima. La purificación da como resultado un polisacárido purificado que es estable durante un tiempo prolongado y que pasa todos los requerimientos de la OMS. Los polisacáridos capsulares se pueden extraer a partir de cualquier bacteria encapsulada, ya sea Gram negativa o Gram positiva. Los ejemplos no limitativos de bacterias, que se pueden utilizar, son cepas de Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, histeria, Clostridiu , Haemophilus, Pneumococcus, Neisseria y Escherichia . De interés particular para los seres humanos son los polisacáridos capsulares provenientes de Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Neisseria meningitidis. De manera especial se ha utilizado ampliamente Haemophilus influenzae, véase por ejemplo Rosenberg et al. (1961) J. Biol. Chem. 236:2845 y Zamenhof et al. (1953) J. Biol. Chem. 203:695. Se puede utilizar cualquier cepa de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) . Los ejemplos de cepas apropiadas incluyen la cepa de referencia Hib, Eagan y la cepa A760705. Los métodos para cultivar estas bacterias son bien conocidos en la técnica, por ejemplo a partir de Meritt et al. (2000) J Biotechnology 81:189. En general, un medio de cultivo apropiado se basa en aminoácidos y/o extracto de levadura o peptona, cloruro de sodio (NaCl) y glucosa, complementado con NAD y hemina y se amortigua utilizando una solución reguladora de fosfato. De preferencia, el medio no debe contener componentes de origen animal excepto hemina. Un pH apropiado por lo general es un pH entre 6 y 8 aproximadamente, de preferencia 6.5 y 7.5 aproximadamente o 6.8 y 7.2 aproximadamente . La temperatura de cultivo típicamente es de alrededor de 30-37°C, de preferencia entre 35 y 37°C aproximadamente . De conformidad con el método de la presente invención, el pH se mantiene constante en un valor deseado utilizando ya sea ácido o base. Se puede utilizar cualquier ácido o base que se utilice convencionalmente para ajustar el pH en los cultivos de células. Las bases y ácidos apropiados incluyen NaOH, de preferencia en una concentración de 1-5 moles/1 aproximadamente y HCl, de preferencia en forma concentrada. En algún momento, el pH ya no se puede ajustar más utilizando el ácido o base elegido, debido a que el pH ahora muestra una tendencia a disminuir o aumentar respectivamente. Este momento corresponde aproximadamente a la fase logarítmica tardia (véase también figura 1) . El pH se monitorea sin ajuste adicional. La reducción o aumento del pH se desacelera después de cierto tiempo, por lo general 2-4 horas aproximadamente después que se suspenden los ajustes de pH si se cultiva a 35°C aproximadamente. A temperaturas más bajas, esto toma más tiempo. Justo antes que la reducción o aumento comience a desacelerar, lo cual se puede predecir a partir de las corridas de prueba (a diferencia por ejemplo de la densidad óptica), se termina la fermentación y se recolecta el caldo de cultivo. La fermentación de preferencia se termina mediante enfriamiento, debido a que esto tiene muchas ventajas. En primer lugar, éste no implica el uso de productos químicos agresivos, tales como formaldehido, el cual también se puede utilizar para terminar la fermentación. En segundo lugar, ésta es una manera muy económica de finalizar el crecimiento, debido a que no implica materiales adicionales. En tercer lugar, éste tiene la ventaja concomitante de que se reduce al minimo la probabilidad de lisis durante la recolección. Debido a que la recolección es un procedimiento que típicamente no se completa dentro de unos cuantos minutos, el enfriamiento brinda la flexibilidad y tiempo para recolectar bajo circunstancias óptimas y en el momento óptimo. Una recolección temprana puede llevar por ejemplo a un rendimiento de polisacárido 50% menor, dependiendo del tiempo de recolección (véase por ejemplo figura 1) . El efectuar la recolección a un tiempo posterior puede contaminar la fracción de polisacárido, debido a que las células se han Usado y todo tipo de material celular termina en el medio a partir del cual se va a aislar el polisacárido (véase por ejemplo figura 1) . Estas contaminaciones celulares pueden complicar cualquier procedimiento de aislamiento y purificación posterior del polisacárido.

Con el fin de finalizar la fermentación para poder efectuar la recolección, la temperatura de preferencia se reduce hasta una temperatura menor de 30 °C, más preferido menor de 25 °C, más preferido aún menor de 20 °C. La recolección en si, es decir el vaciado del termentador, puede comenzar dentro de minutos después que se ha finalizado la fermentación, pero el enfriamiento hace que el procedimiento sea muy flexible y permite un retraso de varias horas a conveniencia del recolector. No existe necesidad de esperar, lo cual es casi inevitable si se utiliza formaldehido para aniquilar las células. En una modalidad, la recolección se inicia por lo menos dos horas después que ha finalizado la fermentación. En otra modalidad, la recolección se inicia por lo menos 3, 4, 5 ó 6 horas después que se ha finalizado el crecimiento. La recolección típicamente se efectúa mediante centrifugación, y es seguida opcionalmente por inactivación, concentración y de preferencia diafiltración del sobrenadante. La centrifugación de preferencia se efectúa a una velocidad de 3000-6000 rpm aproximadamente. La centrifugación es seguida opcionalmente por inactivación. La inactivación, la cual se efectúa para aniquilar cualquier vida microbiana, se puede efectuar utilizando formaldehido, de preferencia en una concentración final que no exceda 0.1% (p/v) durante la noche a una temperatura entre 2 y 8°C aproximadamente. En una modalidad se utiliza formaldehido al 0.04% p/p para inactivar del sobrenadante. El sobrenadante concentrado se puede almacenar antes de recuperar el polisacárido, de preferencia mediante congelamiento, más preferido mediante congelamiento a < -20 °C, en la cual éste es estable durante por lo menos dos años si se produce de conformidad con el método de la invención. En una modalidad, éste es estable durante por lo menos tres años. En una modalidad, la producción de polisacárido durante la fermentación se calcula utilizando una prueba ELISA y típicamente está entre 200 y 400 mg/1 aproximadamente en el sobrenadante, y es de masa molecular relativa bastante alta (700-800 kDa) .

Recuperación del polisacárido El polisacárido se puede recuperar del medio, normalmente a partir de su sobrenadante, utilizando técnicas de vanguardia. La recuperación puede conducir a un polisacárido parcialmente, sustancialmente o completamente purificado. De preferencia, ésta produce un producto que contiene más de 80%, 85%, 90% o 95% del polisacárido de partida. Sin embargo, la fermentación de conformidad con el método de la invención también permite un procedimiento de recuperación bastante sencillo, el cual también se puede utilizar en combinación con procedimientos de la técnica más avanzada para producción de polisacárido. Este procedimiento de recuperación y purificación sencillo se caracteriza por el hecho de que no se utilizan productos químicos agresivos tales como fenol. Asimismo, no se necesita de centrifugación a alta velocidad o ultra-centrifugación, o cromatografía. Esto hace que la purificación sea económicamente atractiva, debido a que no existe la necesidad de invertir en una centrifuga de alta velocidad (adicional) o ultra-centrifuga, o en material para columna costoso. El procedimiento comprende cuatro pasos de precipitación sencillos, los cuales no se tienen que repetir varias veces, como es frecuente en el caso de los esquemas de purificación de la técnica más avanzada y cada uno de los cuales dura como máximo ! 24 horas. En una modalidad, la precipitación se efectúa de manera conveniente, es decir durante 15-18 horas. Este procedimiento de recuperación sencillo comprende : a) utilizar un detergente catiónico para precipitar el polisacárido o parte de los contaminantes a partir del sobrenadante para obtener una primera fracción de polisacárido; b) utilizar alcohol para precipitar el polisacárido a partir de la primera fracción de polisacárido para obtener una segunda fracción de polisacárido; c) someter la segunda fracción de polisacárido a una precipitación con alcohol en presencia de un detergente aniónico en la cual el alcohol está presente en una concentración que está por debajo de la concentración a la cual precipita el polisacárido; d) precipitar el polisacárido a partir de la fracción soluble utilizando alcohol para obtener un precipitado de polisacárido; e) disolver el precipitado de polisacárido y someterlo a concentración y diafiltración.

El detergente catiónico en a) de preferencia es Cetavlon (bromuro de hexadeciltri etilamonio) , de preferencia en una concentración final de aproximadamente 0.01-1% (p/v) . El detergente aniónico en c) de preferencia es desoxicolato de sodio (DOC) , de preferencia en una concentración final de aproximadamente 0.1-1% (p/v). El alcohol que se utiliza en los pasos de precipitación de preferencia es etanol, más preferido en una concentración final de aproximadamente 60-74% (v/v) en b) ; de aproximadamente 10-50% (v/v) en c) ; y de aproximadamente 60-85% (v/v) en e) . En cada paso, los sólidos y fluidos (también conocidos como comprimidos y sobrenadantes) se separan utilizando cualquiera o una combinación de centrifugación, decantación y filtración. Después de la última precipitación con alcohol, el comprimido de preferencia se separa del sobrenadante mediante decantación y no mediante centrifugación. En cualquier paso, el comprimido con polisacárido precipitado se puede disolver en cualquier solvente o liquido conveniente, por ejemplo utilizando agua o NaCl 1 molar. Este procedimiento de recuperación simplificado que se puede utilizar para todos los tipos de polisacáridos también es parte de la invención. De preferencia, la purificación se efectúa utilizando sobrenadante concentrado. La cantidad de detergente y/o etanol necesaria se basa en el volumen de concentrado. El polisacárido purificado después es estable durante por lo menos dos años a < -20°C. En una modalidad, el polisacárido purificado es estable durante por lo menos tres años. En una modalidad, el polisacárido se recupera mediante un procedimiento que comprende una precipitación con Cetavlon al 0.65% (p/v), una precipitación con etanol al 72% (v/v) , una precipitación con etanol al 32% (v/v) en presencia de DOC al 0.5% (p/v) y una precipitación con etanol al 64% (v/v) , de preferencia después de la clarificación.

En otra modalidad, el polisacárido se purifica utilizando una precipitación con Cetavlon al 0.04% (p/v) en a). El polisacárido después permanece en el sobrenadante. La precipitación con alcohol se puede efectuar agregando alcohol directamente al sobrenadante. El resto del procedimiento es como se mencionó anteriormente. Incluso en otra modalidad, el procedimiento de recuperación comprende una precipitación con Cetavlon al 0.65% (p/v) asi como una precipitación con Cetavlon al 0.04% (p/v). La precipitación con Cetavlon al 0.04% (p/v) se puede utilizar por ejemplo para purificar de manera adicional el polisacárido obtenido después del paso con etanol al 64% (v/v) . El alcohol en c) se puede agregar antes o después de la adición del detergente. De manera alternativa, éste se agrega en forma simultánea, es decir por separado al mismo tiempo o como una mezcla. De preferencia, el alcohol se agrega después del detergente. Una combinación de la fermentación y el método de recuperación de la invención permite un polisacárido de pureza elevada. Por ejemplo, el polisacárido capsular proveniente de Haemophilus influenzae tipo b aislado de conformidad con esta combinación de métodos de la invención cumple con todas las especificaciones de la OMS de polisacárido purificado que será utilizado para la producción de vacuna de Hib conjugada. De preferencia, la fracción de polisacárido purificado contiene por lo menos 90% (p/p) de polisacárido, más preferido por lo menos 94, 95 o 96% (p/p) de polisacárido, tomando como base el peso seco. El contenido de endotoxina de preferencia es menor de 10 Ul/ icrogramo, más preferido menor de 8, menor de 5, menor de 2 o menor de 1 Ul/microgramo, más preferido aún, éste es menor de 0.5 o menor de 0.2 Ul/microgramo de fracción de polisacárido. El contenido de ácido nucleico de preferencia es menor de 1% (p/p), más preferido menor de 0.8 (p/p).

Producción de la vacuna Se puede utilizar un polisacárido que se produce utilizando el método de la invención para incrementar la capacidad del sistema inmunológico de humanos o animales para luchar contra infecciones. En particular, éste se puede utilizar para la preparación de una composición farmacéutica para administración a un individuo humano o animal. El polisacárido o un conjugado del mismo de preferencia se administra por via parenteral, por ejemplo mediante inyección o infusión por via intravenosa, infección peritoneal, intramuscular, intra-arterial o intra-lesión. El polisacárido o un conjugado del mismo se puede combinar con un medio o vehículos para suministro farmacéuticamente aceptable utilizando técnicas convencionales conocidas en el campo. Los métodos para preparar composiciones que se puedan administrar por via parenteral son bien conocidos en la técnica y se describen con mayor detalle en diversas fuentes, incluyendo, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20a edición, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA. El polisacárido de preferencia se administra en una dosis terapéuticamente efectiva, es decir una que incremente la capacidad del sistema inmune de humanos o animales para luchar contra infecciones . De preferencia, éste se utiliza para la producción de una vacuna, por ejemplo una vacuna de conjugado de polisacárido. Los métodos para producir vacunas de conjugado son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Ada et al (2003) Clin. Microbiol. Infect. 9(2):79-85, Dick et al (1986) Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10: Conjúgate Vaccines: 48-114, y Jennings et al (1994) Neoglycoconjugates : Preparation and Applications: 325-371. Aunque existen variaciones ligeras en los métodos utilizados para producir vacunas de conjugado, los métodos de producción típicamente comprenden : - activación del polisacárido y/o el portador proteinico conjugación del polisacárido (activado) al portador proteinico (activado) - opcionalmente, purificación del conjugado polisacárido-proteina - opcionalmente, formulación del conjugado polisacárido-proteina .

El polisacárido se puede dimensionar hasta una masa molecular consistente antes de la conjugación, utilizando métodos de des-polimerización controlada conocidos en la técnica. Los métodos de des-polimerización apropiados comprenden oxidación de dioles vecinales, aplicación de energía ultrasónica, e hidrólisis en medio ácido o alcalino. La hidrólisis alcalina se puede efectuar de manera conveniente en una solución reguladora, con el fin de asegurar la estabilidad del pH a través de toda la reacción. Una solución reguladora alcalina apropiada es una solución reguladora de bicarbonato-carbonato, 0.1 a 1 moles/1 a pH mayor de 9, de preferencia mayor de pH 10. Estas reacciones de des-polimerización se pueden efectuar a temperatura ambiente, pero de preferencia en condiciones frias, tales como 2 a 8°C, para reducir al mínimo las reacciones secundarias no deseadas, y de preferencia bajo agitación vigorosa. El polisacárido se puede activar antes de la conjugación o antes del dimensionamiento utilizando métodos de activación conocidos en la técnica, tales como por ejemplo, utilizando un reactivo para cianilación (Kohn et al (1986) Appl. Biochem. Biotechnol. 9:285-305). Los agentes para cianilación apropiados incluyen bromuro de cianógeno (CNBr) , tetra-fluoroborato de l-ciano-4- (dimetilamino) -piridinio (CDAP) , tetra-fluoroborato de N-ciano-N,W,W-trietilamonio (CTEA) , y p-nitrofenilcianato (pNPC) . De manera alternativa, se pueden formar grupos aldehido terminales en el polisacárido mediante corte oxidativo de los dioles vecinales y la conjugación se puede efectuar después mediante aminación reductiva con un reactivo reductor apropiado, tal como ciano-borohidruro de sodio. El portador proteinico también se puede activar antes de la conjugación utilizando métodos de activación conocidos en la técnica, tales como por ejemplo utilizando un reactivo para halogenoalquilación (Bernatowicz et al (1986) Anal. Biochem. 155 (1):95-102). Dicho reactivo apropiado es el éster de ácido bromo-acético de N-hidroxisuccinimida . El polisacárido se puede conjugar al portador proteinico directamente o después de la activación (adicional) mediante moléculas espadadoras o enlazadoras, introducidas ya sea en el polisacárido (activado) y/o el portador proteinico (activado) . Por ejemplo, después de la activación del polisacárido con un agente para cianilación, se pueden introducir en el polisacárido espaciadores de tipo (di) amino o aminoácido, tales como cistamina o glicina. Algunos espaciadores de tipo diamino se pueden reducir adicionalmente para generar grupos tiol libres (de Weers et al (1998) Bioconjugate Chem. 9 (3) -.309-315) . Otro espaciador apropiado es la dihidrazida del ácido adipico (ADH) (Chu et al (1983) Infect . Im un. 40 (1) : 245-256) . De manera alternativa, estos espaciadores se pueden introducir en el portador proteinico mediante una reacción de a idación. La remoción del exceso de espaciadores se puede efectuar utilizando métodos de purificación conocidos en la técnica, tales como cromatografía de permeación en gel, precipitación diferencial, y diafiltración. Un sistema de diafiltración apropiado utiliza el principio de filtración con flujo tangencial en membranas microporosas . Se ha demostrado que las soluciones salinas reguladas facilitan este procedimiento de purificación. Una solución apropiada es una solución reguladora de fosfato, 0.01 a 0.2 moles/1 aproximadamente, con cloruro de sodio o sal equivalente, 0.5 a 3 moles/l aproximadamente. Con dicho método, se puede eliminar un espaciador tal como ADH hasta niveles de contaminación por debajo de 0.05 a 0.5% (p/p) aproximadamente de la ADH unida al polisacárido. Dicha descontaminación se puede monitorear utilizando cromatografía de permeación en gel de alto rendimiento (HP-GPC) , con un detector de UV ajustado a una longitud de onda baja, tal como 210 a 230 nm aproximadamente. Después se efectúa la cuantificación de ADH residual mediante el uso de una calibración patrón. Después de la introducción de los espaciadores en el polisacárido, se puede efectuar la conjugación al portador proteinico utilizando la mediación de un reactivo para amidación a base de carbodi-imida. Un reactivo para amidación apropiado es clorhidrato de N- (3-dimetil-aminopropil) -N' -etilcarbodi-imida (EDC) , el cual se puede complementar con N-hidroxisuccinimida (NHS) para facilitar la reacción. De manera alternativa, se pueden formar enlaces tioéter mediante condensación entre un polisacárido tiolado y un portador proteinico halogenoacetilado, sin ayuda de un reactivo adicional. Una reacción de conjugación mediada por carbodi-i ida puede tomar lugar a valores de pH ligeramente ácidos, típicamente pH 4 a 6, con lo cual se asegura la amidación preferente de los grupos espaciadores de hidrazida con respecto a los grupos amino encontrados en el portador proteinico. En una modalidad, la reacción de conjugación toma lugar en una solución reguladora apropiada, con el fin de asegurar la estabilidad del pH a lo largo de toda la reacción. Esto elimina la necesidad de tener acceso a, o de invertir en un medidor de pH equipado con un titulador automatizado con el fin de efectuar las adiciones de ácido regulares. En una modalidad preferida, se utiliza una solución reguladora carente de grupos carboxilicos que reaccionen con las carbodi-imidas, con lo cual se obstaculiza la reacción de conjugación deseada. Por ejemplo, se puede utilizar una solución reguladora que esté constituida por ácido 2-morfolinoetansulfónico (MES), 0.05 a 0.2 moles/1, y cloruro de sodio, 0.2 a 1 moles/1, a pH 5.5 a 6.1. la reacción de conjugación se puede extinguir mediante la adición de álcali o de una solución reguladora alcalina, la cual lleva el pH de la mezcla de reacción a un pH de aproximadamente 7 o mayor, con lo cual se evita o se desacelera drásticamente la amidación adicional mediada por carbodi-imida. Una solución reguladora alcalina apropiada es una solución reguladora de fosfato, 0.1 a 0.4 moles/1 aproximadamente, a pH 8 a 9, que se agrega en una cantidad suficiente para neutralizar la mezcla de reacción hasta pH 7 aproximadamente. La remoción del polisacárido y proteina sin reaccionar se puede efectuar utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como cromatografía de permeación en gel, cromatografía por interacción hidrofóbica, precipitación diferencial, y diafiltración. Un sistema de cromatografía de permeación en gel utiliza los medios de gel Sefarosa CL-4B, Sefacril S-500 HR (7?mersham) , o medios de gel equivalentes, con una solución salina regulada neutra como eluyente. Un sistema de cromatografía por interacción hidrofóbica apropiado utiliza los medios de gel Butil-, Octil-, o Fenil-Sefarosa 6 Fast Flow (Amersham) , o medios de gel equivalentes, con una solución de sulfato de amonio regulada neutra como el eluyente para unión. Un sistema de precipitación diferencial apropiado utiliza soluciones de sulfato de amonio concentradas. El polisacárido y proteina sin reaccionar residuales se pueden detectar y cuantificar mediante el uso de cromatografía de permeación en gel de alto rendimiento (HP-GPC) , con un detector de UV ajustado a 280 nm, y un detector de Índice de refracción diferencial. El polisacárido sin reaccionar residual también se puede cuantificar mediante una prueba colorimétrica especifica después de precipitar el conj gado . La preparación de conjugados también se describe en los documentos US 4,356,170, US 4,644,059, US 4,673,574, US 4,695,624, US 4,902,506, US 7,667,170, EP 0 161 188, EP 0 477 508 y EP 0 848 011. El polisacárido, el cual de preferencia es un fosfato de polirribosil ribitol (PRP) , se puede copular a cualquier portador proteinico. Los portadores proteinicos apropiados incrementan su carácter de inmunógeno e incluyen proteínas de membrana in unógenas, subunidades de proteina viral, polipéptidos sintéticos y otras proteínas inmunógenas. De manera más preferida, el portador proteinico es un toxoide. Los toxoides bien conocidos utilizados en las vacunas de conjugado son toxoide tetánico y toxoide diftérico. El polisacárido que se produce utilizando el método de la invención se puede utilizar para producir una vacuna monovalente. Un ejemplo apropiado de una vacuna monovalente es una vacuna de polisacárido o una vacuna de conjugado únicamente contra Haemophilus infl uenzae tipo b (Hib) . De manera alternativa, el polisacárido de la invención se puede utilizar para producir una vacuna multi-valente . Este se puede utilizar, por ejemplo, para producir una vacuna tetravalente, tal como una vacuna contra difteria-tétanos-polio-Hib o una vacuna contra difteria-pertussis-tétanos-Hib, o una vacuna pentavalente, tal como difteria-pertussis-tétanos-polio-Hib, o difteria-pertussis-tétanos-hepatitis B-Hib. La vacuna se puede formular en cualquier manera conveniente. Por ejemplo, una vacuna de Hib monovalente puede tener forma de un producto sometido a secado por congelamiento o en forma de liquido, con o sin la adición de un estabilizador, tal como lactosa, o de un coadyuvante, tal como fosfato de aluminio. Será evidente para el experto en la técnica que el método de producción de conformidad con la invención también se puede utilizar para la producción de polisacárido a partir de otros micro-organismos que contengan polisacárido.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Prueba de crecimiento de Hae¡mophllv?.s influenzae tipo b Se cultiva una cepa (A760705) de Haemophilus influenzae tipo b aislada en Amsterdam utilizando un bio-reactor de 50 litros (volumen de trabajo de 40 litros) con un sistema de control NOVO. Se identifica que esta cepa es Haemophil us infl uenzae tipo b utilizando pruebas comúnmente empleadas, tales como evaluación inmunológica y determinación de serotipo, y de morfología. El bio-reactor se llena primero con el medio basal (compuestos 1 a 5 en el cuadro 1 disueltos en 35.5 litros) antes que se esterilice in si tu durante minutos a 110°C. Justo antes de inocular, se agrega la cantidad apropiada de las soluciones de reserva al medio (véase cuadro 2) . El bio-reactor se inocula utilizando un pre-cultivo de 1 litro, cultivado a una escala de 3.5 litros utilizando el mismo medio y un lote de semilla congelado a -70°C de la cepa de Hib. El pH se mantiene constante a 7.0 utilizando NaOH 5 moles/litro. La temperatura se mantiene constante a 35°C. El oxigeno disuelto (DO) se mantiene constante a 30% utilizando aire y oxigeno a través del espacio superior empleando un flujo de gas de 5 1/minuto. La velocidad del agitador se incrementa gradualmente desde 300 hasta 700 rpm. Se toman muestras diferentes utilizando un aparato para muestreo automatizado. El cultivo se monitorea midiendo la densidad óptica a 590 nm (DO5g0) , pH y concentración de PRP (véase figura 1) . Para monitorear la lisis del cultivo se controla una tinción de Gram de un número de muestras. Primero, se incrementa la concentración de PRP hasta alrededor de 320 mg/1, la cual es menos o más paralela al crecimiento. El pH comienza a incrementarse después de 7 horas aproximadamente de cultivo, la DO590 está en su punto óptimo y es igual a 6.88. Después de aproximadamente 12 horas de cultivo el PRP es más o menos constante a 330 mg/1 mientras que el pH se incrementa adicionalmente, la DO590 se reduce adicionalmente y la lisis de las células comienza lentamente. Después de 16 horas de cultivo, las células todavía no están completamente Usadas y el pH es igual a 7.92.

CUADRO 1 Composición del medio No. Compuesto Concentración ^ (g/D 1 Ácido L-glutá ico 1 .3 2 Na2HP04 • 2H20 2 . 5 3 KC1 0 . 09 4 NaCl 6 5 NH4C1 1 . 25 6 Extracto de levadura (solo la fracción de 10 masa molecular baja <30 kDa) 7 Cistina 0 . 015 8 MgS04-7H20 0 . 6 9 Dextrosa 5 10 Hemina 0 . 005 11 NAD 0 . 002 Notas: los compuestos 1 a 5 se pueden disolver en agua, se someten a autoclave después de ajustar el pH a 7.5 y se almacenan (medio basal) . Los compuestos 6 a 11 se almacenan por separado {siguiendo el cuadro 2) .

Después de un par de horas más a temperatura ambiente, se hace evidente la lisis total de las células, el pH es igual a 8.43 y la DO590 es igual a 4.08. La concentración de PRP es igual a 480 mg/1, debido a la lisis total.

CUADRO 2 Soluciones de reserva para medios de producción Solución Compuesto Medio (g/l) Solución de mi de de reserva solución reserva (g/D de reserva/1 1 6: extracto de 10 120 83.33 levadura 2 7: cistina 0.015 0.6 25 8: MgS04 • 7H20 0.6 24 9: dextrosa 5 200 3 10 : Hemina 0.005 1 5 4 11 : NAD 0.002 0.4 5 Este experimento pretende monitorear el cultivo de Hib, el sobrenadante no se purifica de conformidad con el procedimiento descrito anteriormente. El tiempo de recolección óptimo de este cultivo se presenta después de alrededor de 10 horas de cultivo. Para posponer la lisis, el cultivo se puede enfriar hasta una temperatura más baja que la temperatura de cultivo, y algo más de PRP se pudo haber secretado durante el enfriamiento. El recolectar en esta fase exponencial puede significar un bajo rendimiento de PRP.

EJEMPLO 2 Producción de fosfato de polirribosil ribitol (PRP) Se produce PRP bajo las condiciones del ejemplo 1 en una escala de 350 litros. El cultivo no se continúa hasta que todas las células se lisan, pero se detiene después de 8.3 horas a un pH de 7.43 y una DO590 de 4.4 iniciando el enfriamiento utilizando agua de la llave a través de la camisa del bio-reactor. El cultivo se recolecta 1.5 horas después utilizando una centrifuga continua. Al inicio de la recolección, la concentración de PRP en el sobrenadante es igual a 277-377 mg/1, y la temperatura del cultivo es igual a 19 °C. El sobrenadante se inactiva agregando una solución de formaldehido 2.7 moles/1 al sobrenadante hasta una concentración de aproximadamente 0.1% (v/v). El sobrenadante se concentra hasta 9.6 litros aproximadamente y se somete a diafiltración utilizando PBS. El sobrenadante concentrados almacena a <- 20°C.

EJEMPLO 3 Purificación de fosfato de poliorribosil ribitol (PRP) Se purifican 1.5 litros de sobrenadante concentrado proveniente del ejemplo 2 utilizando el procedimiento en la figura 2, cuatro meses después del cultivo. Después de la purificación, se someten a secado por congelamiento 12 matraces que contienen cada uno 30 mi de PRP puro en forma liquida para determinar la pureza tomando como base la masa seca (OMS TRS 814 Anexo 1 1991 y TRS 897 Anexo 1, 2000) . Todas las muestras (liquidas y sometidas a secado por congelamiento, incluyendo muestras de IPC) se analizan respecto a contenido de PRP, ácidos nucleicos y proteina. También se analiza PRP purificado utilizando HP-GPC (Hennessey et al (1993) J. Liq. Chromatogr. 16 (8):1715-1729) , espectroscopia RMN (Lemercinier et al (2000) Biologicals 28 (3) : 175-183) , y espectroscopia UV. La determinación de ribosa (reacción con orcinol: Ashwell et al (1957) Meth. Enzymol. III: 73-105), fósforo (Ames et al (1966) Meth. Enzymol. VIII: 115-118), y proteina residual (Lowry et al (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275), se efectúa mediante pruebas colorimétricas . La endotoxina se mide con la prueba LAL. Véase cuadro 3 para la composición de PRP purificado. El PRP tiene una masa molecular relativa de 765 kDa. El PRP cumple todas las especificaciones de la OMS de polisacárido purificado que será utilizado para la producción de vacunas de Hib conjugado. El rendimiento de la purificación tomando como base la prueba de orcinol es igual a 80%. La concentración de DOC en el producto final es menor de 5 µg/ml (limite de detección) y la de formaldehido es menor de 0.005 nmoles/1.

CUADRO 3 Composición de PRP purificado Componente Composición de Especificaciones de la PRP OMS Masa total (g) ; 100% 7.39 Masa seca (%) 98.62 PRP (%) 96,81 Fósforo (%) 7.84 6.8-9 Pentosa (%) 35.22 32-38 Ácidos nucleicos (%) 0.75 < 1 Proteina (%) 0.33 < 1 Endotoxina (Ul/µg) 0.11 < 10 ÜI = Unidades internacionales EJEMPLO 4 Activación de fosfato de polirribosil ribitol (PRP) Se concentra PRP (1.023 g; endotoxina: 0.02 Ul por µg de PRP) hasta aproximadamente 10 g/l con ayuda de un sistema de filtración de flujo tangencial, equipado con un cartucho de filtro con corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa. Recuperación: 999 mg (98%) . El concentrado de PRP se transfiere después a un recipiente con camisa, y se enfria hasta 4°C aproximadamente. Después se agrega rápidamente un volumen igual de solución reguladora de bicarbonato/carbonato de sodio previamente fria (0.4 moles/1, pH 10.5), y la mezcla de reacción resultante se mantiene a ~4°C bajo agitación vigorosa (~400 rpm) durante 90 minutos. La disminución de la masa molecular relativa promedio (Mr) de PRP se monitorea mediante HP-GPC. Al final de este paso de degradación alcalina, se agrega CNBr (5 moles/1 en acetonitrilo) (2.2 mi por g de PRP) . Las condiciones previas se mantienen durante otros 10 minutos. Después de esto, se agregan rápidamente tres volúmenes de reactivo ADH previamente frios (18 g por g de PRP) , 30 g/l en solución de bicarbonato (1 moles/1) . Las condiciones previas se mantienen aproximadamente durante otras 16 horas (a pH 9 aproximadamente) . El PRP activado (PRP-ADH) se concentra después hasta ~20 g/l, con el sistema TFF, equipado con un cartucho de filtro con MWCO de 10 kDa. La diafiltración exhaustiva toma después lugar para eliminar el exceso de reactivos, principalmente ADH. El primer paso utiliza aproximadamente 20 volúmenes de solución reguladora de fosfato (0.1 moles/1, pH 7.2; con NaCl, 1.5 moles/1). El avance de la remoción del exceso de ADH se sigue mediante HP-GPC a 215 nm, con relación a una curva de calibración estándar. Cuando el exceso de ADH está por debajo de 0.05% (p/p) de ADH total, se continua la diafiltración con aproximadamente 5 volúmenes de solución reguladora de MES (0.1 moles/1, pH 6.1; con NaCl, 0.5 moles/1). Después se concentra PRP-ADH hasta una concentración calculada de aproximadamente 25 g/l. El PRP-ADH concentrado se analiza respecto a los grupos ribosa y amino (reacción con TNBS: Habeeb et al (1966) Anal. Biochem. 14:328-336), y se almacena a una temperatura entre 2 y 8°C. Recuperación: 764 mg (75%) .

Relación de activación: 25 unidades repetitivas (UR) de PRP por grupo de ADH, o 1.9% (p/p) de ADH.

EJEMPLO 5 Conjugación de fosfato de polirribosil ribitol activado (PRP- ADH) a toxoide tetánico (TTd) Se concentra toxoide tetánico (TTd; 1.327 g; 1,623 Lf/mg de PN; 1,900 Lf/ml) hasta aproximadamente 20 g/l, con el sistema TFF (cartucho de filtro con MWCO de 10 kDa) . Después se efectúa la diafiltración, en parte para eliminar el exceso de los componentes del medio, con aproximadamente 5 volúmenes de solución reguladora de MES (pH 6.1). Después se concentra el TTd hasta una concentración calculada de aproximadamente 30 g/l. El TTd concentrado se analiza respecto al contenido de proteina (reacción de Lowry) , y se almacena a una temperatura entre 2 y 8°C. Recuperación: 1.186 g (89%). Después se transfiere el concentrado de PRP-ADH (707 mg) a un reactor con camisa, y se enfria hasta 4°C aproximadamente. Después se agrega el concentrado de TTd (786 mg) , y la mezcla resultante se lleva hasta aproximadamente 4°C, bajo agitación suave (200 rpm aproximadamente), para evitar la formación de espuma. Después se agrega el reactivo EDC previamente frió, 100 g/l en solución reguladora de MES (pH 6.1), (1 g por g de TTd). Finalmente, se agrega solución reguladora de MES (pH 6.1) para completar hasta el volumen total. Esta mezcla de reacción (relación PRP/TTd de 0.93 p/p) se mantiene aproximadamente a 4°C, bajo agitación suave. La reacción se detiene a las 3 h 30, cuando el nivel residual de TTd llega a 4.4%, según se mide mediante HP-GPC a 280 nm. La reacción se extingue mediante adición de un volumen igual de solución reguladora de fosfato de sodio (0.1 moles/1, pH 8.0; con EDTA, 0.005 moles/1), y después se almacena a una temperatura entre 2 y 8°C.

EJEMPLO 6 Purificación del conjugado polisacárido-proteina La mezcla de conjugación se clarifica en una unidad de filtro en linea de 0.45 µm. Esta después se purifica en cinco porciones iguales en una columna de GPC (4.4 cm de diámetro, altura del lecho empacado 45 cm) , empacada con Sefarosa CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech) , y se eluye con solución reguladora de fosfato de sodio (0.1 moles/1, pH 7.0; con EDTA, 0.005 moles/1) a una velocidad de flujo de 6 ml/min. La elución se monitorea con detectores de Índice de refracción diferencial, de UV (226 nm) , y de conductividad. Las fracciones se recolectan cada 2 minutos durante aproximadamente 0.9 VC . Las fracciones de la primera corrida se analizan después respecto a contenido de ribosa, y proteina (reacción de BCA: Smith et al (1985) Anal. Biochem. 150 (1): 76-85), y se almacenan a una temperatura entre 2 y 8°C. Se mezclan las fracciones de todas las corridas correspondientes al primer pico que contiene ribosa (187 mg de PRP) y proteina (440 mg de TTd) , y que tiene una relación de PRP/TTd homogénea (0.43 p/p), (mezcla 1): esta es la mezcla de conjugado con Mr alta utilizada posteriormente para la preparación de la vacuna. Las fracciones remanentes que comprenden principalmente PRP sin conjugar, también se mezclan (mezcla 2) para calcular el balance de masas: esta mezcla contiene conjugado con Mr media y baja, PRP-ADH libre (es decir, sin conjugar), y TTd libre. El balance de masas es: 78% de PRP, y 76% de TTd, tomando como base las cantidades de los materiales de partida para conjugación (véase cuadro 4) . La mezcla de conjugado con Mr alta (mezcla 1) se concentra después hasta aproximadamente 4 g/l, con el sistema TFF (cartucho de filtro con MWCO de 10 kDa) . Después se efectúa la diafiltración, con aproximadamente 10 volúmenes de solución reguladora de Tris (0.02 moles/1; pH 7.0). El conjugado con solución reguladora intercambiada (PRPTTd) se concentra después hasta aproximadamente 1 g/l, y se esteriliza mediante filtración en una unidad de filtro en linea de 0.22 µm. La masa de PRPTTd concentrado, estéril se analiza después mediante HP-GPC, y también respecto al contenido de ribosa, y proteina (reacción de BCA) , y después se almacena a una temperatura entre 2 y 8°C. Recuperación: 170 mg de PRP (22%), y 372 mg de TTd (45%). La relación PRP/TTd final es de 0.46 (v/p) (especificación de la OMS: 0.3-0.6) y el contenido de endotoxina es de 6.58 Ul por µg de PRP. El análisis de PRP libre (Guo et al (1998) Biologicals 26 (l):33-38) da 12.7% (especificación de la OMS: <20%). Después se estudia la estabilidad de la masa de PRPTTd estéril, concentrado durante un total de seis meses mientras se mantiene almacenada a una temperatura entre 2 y 8°C.

CUADRO 4 Recuperaciones y balance de masas de PRPTTd PRP TTd PRP/TTd Especificación de la OMS (mg) (% ) (mg) (% ) (P/P) (P/p) Mezcla 768 100 829 100 0.93 inicial GPC mezcla 1 187 24 440 53 0.43 CUADRO 4 Recuperaciones y balance de masas de PRPTTd PRP TTd PRP/TTd Especificación de la OMS (mg) (% ) (mg) (% ) (P/P) (P/P) GPC mezcla 2 415 54 188 23 Balances de 602 78 628 76 - masas Masa final 170 22 372 45 0.46 0.3-0.6 estéril Notas: las masas moleculares relativas (Mr) se determinan contra patrones de referencia de pululano puro en columnas de HP-GPC OHpak (Shodex) SB-805 y SB-804. Detección: Índice de refracción diferencial y ÜV (215, y 280 nm) . Cálculos de Mr basados en la señal de ÜV a 280 nm.

EJEMPLO 7 Formulación de conjugado de polisacárido-proteina como una vacuna de Hib monovalente En otro experimento, se formula la masa de PRPTTd estéril, concentrada (121 mg de PRP; 348 mg de TTd; relación PRP/TTd de 0.35 p/p; 1.9% de PRP libre, 7.27 Ul de endotoxina por µg de PRP) con solución reguladora de Tris y sacarosa, durante la preparación para liofilización. La vacuna a granel se diluye primero con solución reguladora de Tris (0.1 moles/1; pH 7.0), después se agrega sacarosa (0.5 moles/1), y se agrega agua para inyección para completar hasta el volumen final. Se transfieren porciones de 1.4 mi a frascos para vacuna de dosis múltiples, y después se efectúa la liofilización. Debido a las pérdidas inherentes al procedimiento de llenado automático, finalmente se obtienen aproximadamente 1,500 frascos de dosis múltiples, para un total de 7,500 dosis inyectables (es decir, 5 por frasco) . Cada frasco contiene 8-12 µg de PRP por mi de dosis de humano, que serán reconstituidos con solución de NaCl. Después se estudia la estabilidad de la vacuna de PRPTTd liofilizada durante 18 meses (planeado para un total de 36 meses), a temperatura ambiente normal, y bajo condiciones de estrés a 37 °C (véase cuadro 5) . La temperatura de transición de vidrio (medida utilizando DSC) permanece alta aproximadamente a 63 °C, y permanece constante, lo que demuestra que la vacuna liofilizada está en un estado físico estable. Para la determinación de PRP libre, primero se tiene que eliminar la sacarosa mediante intercambio de solución reguladora, utilizando dispositivos para ultra-filtración centrifuga (MWCO de 10 kDa) . También se estudia la estabilidad de la masa concentrada, estéril de PRPTTd durante un total de seis meses (véase cuadro 5) . Durante estos estudios, la Mr permanece constante, y no se observa un incremento significativo de PRP libre.

CUADRO 5 Estabilidad de PRPTTd Mr PRP libre Transición de pH ( kDa) ( % ) vidrio ( °C) Masa final estéril t = 0 1,463 1.9 7.00 t = 4 semanas n.a. 1.8 7.00 t = 24 semanas 1,439 2.7 6.90 Vacuna liofilizada t = 0 1,381 10.1 64 6.56 t = 3 meses 1,325 n.a. t = 6 meses 1,396 5.5 t = 12 meses 1,306 6.3 t = 18 meses 1,334 5.7 Estudio bajo estrés (37°C) vacuna liofilizada) t = 1 semana 1,337 6.9 63 t = 4 semanas 1,337 4.1 63 Especificación de la OMS < 20 Notas : la determinación de PRP libre en la vacuna liofilizada sólo es posible después de la remoción del exceso de sacarosa mediante intercambio de solución reguladora. Los valores elevados (> 10%) se deben, en parte, a la sacarosa residual, la cual interfiere con la prueba de orcinol para ribosa. Cálculos de Mr: véase cuadro 4. La transición dividido se mide utilizando calorimetría de barrido diferencial (DSC) .

Claims (17)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir un polisacárido capsular a partir de una bacteria encapsulada que comprende : - cultivar la bacteria encapsulada en un medio de cultivo apropiado a un pH y temperatura apropiadas, mientras se ajusta el pH del medio de cultivo a un valor constante con una base o ácido hasta que el ajuste con base o ácido respectivamente ya no sea posible terminar el cultivo justo antes de que el incremento o decremento del pH comience a desacelerar, de preferencia enfriando a una temperatura menor a la temperatura utilizada para el cultivo - recolectar el caldo de fermentación opcionalmente, recuperar el polisacárido a partir del medio de cultivo.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fermentación se termina dentro de 6-14 horas aproximadamente después de que inicia la fermentación.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la lisis se retrasa enfriando a una temperatura menor de 30°C, de preferencia menor de 25 ó 20°C.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el pH del medio de cultivo se ajusta con base hasta un valor constante entre 6.5 y 7.

5. 5. - El método de conformidad con las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el medio de cultivo se utiliza para cultivar una cepa de Haemophilus influenzae tipo b.

6. - Un método para recuperar un polisacárido a partir de un caldo de fermentación que comprende: - omitir el uso de fenol, centrifugación de alta velocidad, ultra-centrifugación y cromatografía; - utilizar un máximo de 4 pasos de precipitación.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la recuperación incluye: - mezclar la fracción de polisacárido con un detergente catiónico - agregar alcohol hasta una concentración que esté por debajo de la concentración necesaria para precipitar el polisacárido.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7 que comprende: - utilizar un detergente catiónico para precipitar el polisacárido o parte de los contaminantes a partir del sobrenadante para obtener una primera fracción de polisacárido; utilizar alcohol para precipitar el polisacárido a partir de la primera fracción de polisacárido para obtener una segunda fracción de polisacárido; - someter la segunda fracción de polisacárido a una precipitación con alcohol en presencia de un detergente aniónico, con lo cual el alcohol está presente en una concentración que es menor de la concentración a la cual precipita el polisacárido; precipitar el polisacárido a partir de la fracción insoluble utilizando alcohol para obtener un precipitado de polisacárido; disolver el precipitado de polisacárido y someterlo a concentración y diafiltración.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polisacárido es un polisacárido capsular que se produce de conformidad con el método de conformidad con la reivindicación 1-5.

10.- Un método para producir una vacuna de conjugado de polisacárido, cuyo método comprende: - producir un polisacárido de conformidad con el método de las reivindicaciones 1-5 - recuperar el polisacárido a partir del medio de cultivo - opcionalmente, activar el polisacárido recuperado para conjugación - conjugar el polisacárido recuperado a un portador proteinico, de preferencia un toxoide opcionalmente, purificar el conjugado de polisacárido-proteina .

11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polisacárido se recupera a partir del medio de cultivo utilizando un procedimiento de conformidad con la reivindicación 6 ó 7.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el polisacárido se somete a degradación alcalina controlada en presencia de una solución reguladora de bicarbonato/carbonato bajo agitación vigorosa antes de la activación o conjugación.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque el polisacárido se activa y después se purificar utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial.

14.- El método de conformidad con las reivindicaciones 10-13, caracterizado porque el polisacárido activado se conjuga a la proteina a un pH en el intervalo de pH 4.0 a 6.5, en el cual el pH se regula mediante una solución reguladora carente de grupos de ácido carboxilico.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el pH se regula utilizando solución reguladora de ácido 2-morfolinoetansulfónico (MES) a pH 5.5 a 6.1.

16.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque el polisacárido es fosfato de polirribosil ribitol.

17.- Una composición farmacéutica que comprende un polisacárido o conjugado de polisacárido que se produce de conformidad con el método de las reivindicaciones 1-16.