KR102666639B1 - 대장균 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

대장균 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장균 리포폴리사카라이드 및 이의 접합체로부터 유래된 변형된 O-폴리사카라이드 분자를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 다가 백신은 상이한 대장균 혈청형에 대해 2개 이상의 1가 면역원성 조성물을 조합하여 제조할 수 있다. 한 양태에서, 변형된 O-폴리사카라이드 분자는 wzz 유전자를 포함하는 재조합 세균에 의해 생성된다.

Description

대장균 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2018년 8월 24일자 출원된 미국 가출원 제62/722,370호, 2018년 12월 26일자 출원된 미국 가출원 제62/784,940호 및 2019년 7월 31일자 출원된 미국 가출원 제62/881,361호(이들의 전문은 각각 참조로 혼입됨)를 우선권 주장한다.
기술분야
본 발명은 대장균(Escherichia coli, E. Coli) 조성물 및 이의 방법에 관한 것이다.
그람-음성균의 세포벽은 외막과 외막 내부에 펩티도글리칸 층을 포함한다. 외막은 인지질, 리포폴리사카라이드(LPS), 지단백질 및 막 단백질을 포함한다. 리포폴리사카라이드는 막의 외층에서 발견되고, 인지질은 내층에서 발견된다.
LPS는 코어 올리고사카라이드를 반복된 사카라이드 단량체 단위를 함유하는 O-폴리사카라이드 중합체에 연결하는 지질 A 막 앵커를 포함하고, 이는 짧거나 길거나 매우 긴 O-쇄를 형성한다. 코어 올리고사카라이드가 대부분 개별 세균 종 내에서 보존되지만, O-폴리사카라이드는 혈청형 중에서 가변적일 수 있다.
대장균은 생명을 위협하는 세균성 패혈증을 유발하는 것으로 공지된 그람-음성균이다. 캡슐(K) 및 리포폴리사카라이드(LPS) O-항원은 둘 다 중요한 독성 인자이다.
대장균에 대한 백신의 기초로 O-폴리사카라이드를 사용하는 데 상당한 관심이 존재한다. 그러나, 통상적인 화학적 접합 또는 생체접합 접근법을 사용하여 대장균 당접합체 백신을 개발하려는 이전의 시도는 모든 혈청형에 대해 강력한 기능적 면역 반응을 생성하는 데 실패한다. 따라서, 강력한 기능적 면역 반응을 생성하는 대장균에 대한 면역원성 조성물에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.
이들 및 다른 요구를 충족시키기 위해, 본 발명은 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 생물공정 개발을 위한 개선된 특성 및 면역원성 에피토프의 보다 높은 밀도를 갖는 더 장쇄 O-항원 리포폴리사카라이드(LPS)를 발현하도록 조작된 대장균 균주로부터 생성되는, 사카라이드, 접합체 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 한 양태에서, 대장균 균주는 고 카피 플라스미드로부터 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) fepE 유전자를 발현하도록 조작되고, 이는 상이한 O-항원 혈청형의 대장균 균주에서 장쇄 LPS의 생산을 초래한다.
초기 균주 개발은 혈청형 O25b의 O-항원에 중점을 두었고, 이는 치료하기 어려운 신종 다중약물 내성 단리물과 관련된다. wzzB 유전자는 임상 대장균 O25b 균주에서 결실된다. 살모넬라 fepE 플라스미드로 형질전환한 후, 현재 조작된 대장균 O25b 균주는 독점적으로 장쇄 LPS를 생산한다. 세균 표면에서 O-항원을 방출하기 위해 아세트산으로 화학 추출한 후, 생성된 장쇄 O25b 폴리사카라이드는 통상적인 정제 및 접합 기술에 적용할 수 있었다. 생체접합을 통해 생성된 O-항원과 달리, 이러한 장쇄 O-항원은 내부 및 외부 코어 올리고사카라이드를 보유하고, 독립적으로 살균성이고 패혈증을 차단할 수 있는 기능성 항체를 유도할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 예시적인 O25b 당접합체는 놀랍게도 비접합된 폴리사카라이드보다 포유동물에서 훨씬 더 면역원성였다.
따라서, 한 양상에서, 본 발명은 대장균의 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 5개 이상의 반복 단위의 증가를 포함하는 사카라이드에 관한 것이다.
한 양태에서, 조성물은 구조식 O1, 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4, 구조식 O5, 구조식 O6, 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18, 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23, 구조식 O24, 구조식 O25, 구조식 O25b, 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45, 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 62D1, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73, 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187(이때, n은 1 내지 1,000의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함한다. 표 1, 도 9a 내지 9c, 도 10a 및 10b를 참고한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명백히 언급되지 않는 한, 용어 "n"은 군으로부터 선택되는 구조식의 "n"을 의미한다. 한 양태에서, 조성물은 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 62D1, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187(이때, n은 1 내지 1,000의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함한다. 표 1, 도 9a 내지 9c, 도 10a 및 10b를 참고한다.
한 양태에서, 조성물은 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O10, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O21, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O28, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O58, 구조식 O64, 구조식 O69, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O75, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O86, 구조식 O88, 구조식 O90, 구조식 O98, 구조식 O104, 구조식 0111, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O119, 구조식 O121, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O136, 구조식 O138, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O147, 구조식 O149, 구조식 O152, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O164, 구조식 O173, 구조식 62D1, 구조식 O22, 구조식 O35, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O83, 구조식 O91, 구조식 O105, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O139, 구조식 O153, 구조식 O167 및 구조식 O172(이때, n은 1 내지 1,000의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함한다. 표 1, 도 9a 내지 9c 및 도 10a를 참고한다.
한 양태에서, 조성물은 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O10, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O21, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O28, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O58, 구조식 O64, 구조식 O69, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O75, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O86, 구조식 O88, 구조식 O90, 구조식 O98, 구조식 O104, 구조식 0111, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O119, 구조식 O121, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O136, 구조식 O138, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O147, 구조식 O149, 구조식 O152, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O164, 구조식 O173 및 구조식 62D1(이때, n은 1 내지 1,000의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함한다. 표 1 및 도 9a 내지 9c를 참고한다.
한 양태에서, 조성물은 구조식 O8, 구조식 O9a, 구조식 O9, 구조식 O20ab, 구조식 O20ac, 구조식 O52, 구조식 O97 및 구조식 O101로부터 선택되는 구조를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 조성물은 구조식 O8, 구조식 O9a, 구조식 O9, 구조식 O20ab, 구조식 O20ac, 구조식 O52, 구조식 O97 및 구조식 O101(이때, n은 1 내지 10의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함한다. 표 1 및 도 10b를 참고한다.
한 양태에서, 대장균 혈청형은 O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O25b, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D1, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 및 O187 중 어느 하나로부터 선택된다.
한 양태에서, 대장균 혈청형은 O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O25b, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D1, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 및 O187로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 사카라이드는 그람-음성균에서 wzz 계열 단백질을 발현하여 사카라이드를 생성함으로써 생산된다. 한 양태에서, 사카라이드는 그람-음성균에서 wzz 계열 단백질을 발현(반드시 과발현되지는 않음)하여 사카라이드를 생성함을 포함하는 배양물에서 그람-음성균에 의해 생산된 O-폴리사카라이드의 반복 단위를 증가시킴으로써 생산된다. 바람직한 양태에서, wzz 계열 단백질은 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2 중 어느 하나로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 발현된(반드시 과발현되지는 않음) wzz 계열 단백질은 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 사카라이드는 합성적으로 합성된다. 한 양태에서, 사카라이드는 담체 단백질에 공유 결합(접합)된다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다.
한 양상에서, 본 발명은 사카라이드 및/또는 이의 접합체 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 효과량의 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 면역 반응은 항-대장균 O-특이적 폴리사카라이드 항체의 유도를 포함한다.
도 1a 및 1b는 pUC 레플리콘, 세포 당 500 내지 700x 카피, 쇄 길이 조절자(도 1a) 및 P15a 레플리콘, 세포 당 10 내지 12x 카피, O-항원 오페론(도 1b) 플라스미드를 도시한다.
도 2는 K12＼W3110＼WzzB(서열번호 23); O25a＼ETEC＼ATCC＼WzzB(서열번호 22); O25a:K5:H1＼WzzB(서열번호 21); O25b＼2401＼WzzB(서열번호 20); 및 O25b＼2401＼WzzB(서열번호 20)를 나타내는 WzzB 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 3a 및 3b는 이종 wzzB 및 fepE 쇄 길이 조절자의 플라스미드-기반 발현에 의한 혈청형 O25a 및 O25b 균주에서 O-항원 쇄 길이의 조절을 도시한다. wzzB 녹아웃 균주 O25K5H1(O25a) 및 GAR2401(O25b)의 플라스미드 형질전환체에서 LPS 발현의 유전적 상보성이 도시된다. 도 3a의 좌측에, O25a O25K5HΔwzzB의 플라스미드 형질전환체의 LPS 프로파일이 도시되고, 우측에 O25b GAR 2401ΔwzzB 형질전환체의 유사한 프로파일이 도시된다. O25-특이적 혈청[스타텐스 세럼 인스티튜트(Statens Serum Institut)]으로 탐지된 복제 겔의 면역블롯이 도 3b에 도시된다. 레인 1 내지 7과 연관된 O25a ΔwxxB(녹아웃) 배경:레인 8 내지 15와 연관된 O25b 2401 ΔwzzB(녹아웃) 배경).
도 4는 숙주 O25K5H1ΔwzzB에서 대장균 및 살모넬라 fepE 플라스미드에 의해 부여된 장쇄 O-항원 발현을 도시한다.
도 5는 FepE 아미노산 서열 정렬을 도시한다. O157 FepE 아미노산 서열은 서열번호 18이고; O25a ETEC ATCC FepE 아미노산 서열은 서열번호 17이고; O25a:K5:H1 FepE 아미노산 서열은 서열번호 16이고; O25b 2401 FepE 아미노산 서열은 서열번호 15이고; 살모넬라 LT2 FepE 아미노산 서열은 서열번호 19이다.
도 6은 살모넬라 fepE 발현이 다양한 임상 단리물에서 장쇄 O-항원 LPS를 생성함을 도시한다.
도 7a 및 7b는 O25b O-항원 녹아웃 숙주 균주에서 O25b 장쇄 O-항원 LPS의 플라스미드-유도 아라비노스-유도성 발현을 도시한다. SPS PAGE의 결과는 도 7a에 도시되고, O25 면역블롯의 결과는 도 7b에 도시되고, 이때 도 7a 및 7a에서, 레인 1은 클론 1, 아라비노스 부재로부터 유래하고; 레인 2는 클론 1, 0.2% 아라비노스로부터 유래하고; 레인 3은 클론 9, 아라비노스 부재로부터 유래하고; 레인 4는 클론 9, 0.2% 아라비노스로부터 유래하고; 레인 5는 O55 대장균 LPS 표준물로부터 유래하고; 레인 6은 O111 대장균 LPS 표준물로부터 유래한다.
도 8은 통상적인 숙주 균주에서 장쇄 O-항원 LPS의 플라스미드-매개 아라비노스-유도성 발현을 도시한다.
도 9a 내지 9c는 골격에 4개 이하의 잔기를 갖는 폴리머라제-의존 경로에 의해 합성된 O-항원의 구조를 도시한다.
도 10a는 골격에 5 또는 6개의 잔기를 갖는 폴리머라제-의존 경로에 의해 합성된 O-항원의 구조를 도시하고; 도 10b는 ABC-수송체-의존 경로에 의해 합성되는 것으로 여겨지는 O-항원의 구조를 도시한다.
도 11은 탐색적 생물공정 균주에서 O25 O-항원 LPS의 발현을 도시한다.
도 12a 및 12b는 균주 GAR2831 및‘2401ΔwzzB/fepE로부터 정제된 단쇄(도 12a, 균주 1 O25b wt 2831) 및 장쇄 O25b O-항원(도 12b, 균주 2 O25b 2401ΔwzzB/LT2 FepE)의 SEC 프로파일 및 특성을 도시한다.
도 13a 및 13b는 토끼 연구 1 VAC-2017-PRL-EC-0723의 백신접종 일정에 관한 정보(도 13a); 토끼 연구 2 VAC-2018-PRL-EC-077에 대한 백신접종 일정(도 13b)을 도시한다.
도 14a 내지 14c는 O25b 당접합체 IgG 반응을 도시하고, 이때 -●-는 채혈 전의 결과; -■-는 채혈 1(6주); -▲-는 채혈 2(8주); -◆-는 채혈 3(12주)을 나타낸다. 도 14a는 토끼 1-3(중간 활성화)의 결과를 도시하고; 도 14b는 토끼 2-3(저 활성화)의 결과를 도시하고; 도 14c는 토끼 3-1(높은 활성화)의 결과를 도시한다.
도 15a 내지 15f는 O25b 장쇄 O-항원 당접합체, 즉 저 활성화 O25b-CRM197 접합체(도 15d 내지 15f, 이때 -●-는 토끼 2-1로부터의 채혈 전의 결과를 나타내고, -■-는 토끼 2-1로부터의 12주 항혈청의 결과를 나타냄) 대 비접합된 폴리사카라이드, 즉 유리 O25b 폴리사카라이드(도 15a 내지 15c, 이때 -●-는 토끼 A-1로부터의 채혈 전 결과를 나타내고, -■-는 토끼 A-1로부터의 6주 항혈청의 결과를 나타내고, -▲-는 토끼 A-1로부터의 8주 항혈청의 결과를 나타냄)에 대한 IgG 반응을 도시한다. MFI가 1,000 MFI 미만의 범위에서 면역 전 항체와 면역 항체 사이의 차이를 강조하기 위해 로그 스케일로 도시됨에 유의한다. 도 15a는 토끼 A-1(비접합된 폴리사카라이드)의 결과를 도시하고, 도 15b는 토끼 A-3(비접합된 폴리사카라이드)의 결과를 도시하고, 도 15c는 토끼 A-4(비접합된 폴리사카라이드)의 결과를 도시하고, 도 15d는 토끼 2-1(저 활성화)의 결과를 도시하고, 도 15e는 토끼 2-2(저 활성화)의 결과를 도시하고, 도 15f는 토끼 2-3(저 활성화)의 결과를 도시한다.
도 16a 내지 16c는 O25b 항혈청으로 검출된 천연 대 장쇄 O25b O-항원의 표면 발현을 도시한다. 도 16a는 -●-가 O25b 2831/fepE 대 PD3 항혈청의 결과를 나타내고; -■-는 O25b 2831 wt 대 채혈 전의 결과를 나타내고; -▲-는 O25b 2831/fepE 대 PD3 항혈청의 결과를 나타내고; -▼-는 O25b 2831/fepE 대 채혈 전의 결과를 나타내는 결과를 도시한다. 도 16b는 -●-가 O25b 2401 대 PD3 항혈청의 결과를 나타내고; -■-가 O25b 2401 대 채혈 전의 결과를 나타내고; -▲-가 O25b 2401/fepE 대 PD3 항혈청의 결과를 나타내고; -▼-가 O25b 2401/fepE 대 채혈 전의 결과를 나타내는 결과를 도시한다. 도 16c는 -●-가 대장균 K12 대 PD3 항혈청의 결과를 나타내고; -■-가 대장균 K12 대 채혈 전의 결과를 나타내는 결과를 도시한다.
도 17은 5개의 공지된 화학형의 외부 코어 올리고사카라이드의 탄수화물 골격의 일반화된 구조를 도시한다. 모든 글리코스는 달리 표시되지 않는 한 α-아노머 배열에 존재한다. 생성물이 각각의 연결기의 형성을 촉매하는 유전자는 점선 화살표로 표시된다. 별표는 O-항원의 부착이 발생하는 코어 올리고사카라이드의 잔기를 나타낸다.
도 18은 비접합된 유리 O25b 폴리사카라이드가 면역원성이 아님(dLIA)을 도시하고, 이때 -●-는 4-1의 18주(1주 = PD4) 항혈청의 결과를 나타내고; -■-는 4-2의 18주(1주 = PD4) 항혈청의 결과를 나타내고; -▲-는 5-1의 18주(1주 = PD4) 항혈청의 결과를 나타내고; -▼-는 5-2의 18주(1주 = PD4) 항혈청의 결과를 나타내고; -*-는 6-1의 18주(1주 = PD4) 항혈청의 결과를 나타내고; --는 6-2의 18주(1주 = PD4) 항혈청의 결과를 나타낸다.
도 19a 내지 19c는 BRC 토끼 O25b RAC 접합체 면역 혈청 OPA 역가의 특이성을 설명하는 그래프를 도시한다. 도 19a는 토끼 2-3 면역 전 혈청 -●- 및 면역 후 혈청 wk 13 -■-의 OPA 역가를 도시한다. 도 19b는 토끼 1-2 면역 전 혈청 -●- 및 면역 후 혈청 wk 19 -■-의 OPA 역가를 도시한다. 도 19c는 토끼 1-2 wk 19 OPA 역가 특이성을 도시하고, 이때 토끼 1-2 면역 혈청의 OPA 활성은 100 μg/mL의 정제된 비접합된 O25b 장쇄 O-항원 폴리사카라이드와의 사전-항온처리에 의해 차단되고, 이때 -■-는 토끼 1-2 면역 혈청 wk 19의 결과를 나타내고; -▼-는 토끼 1-2 wk 19 w/R1 장쇄-OAg의 결과를 나타낸다.
도 20a는 예시적인 투여 일정의 설명을 도시한다. 도 20b 및 20c는 비접합된 O25b 장쇄 O-항원 폴리사카라이드(도 20b, O25b 유리 폴리사카라이드(2 μg)) 및 유도된 O25b RAC/DMSO 장쇄 O-항원 당접합체(도 20c, O25b-CRM197 RAC 장쇄(2 μg))에 의해 유도된 O-항원 O25b IgG 수준을 나타내는 그래프를 도시하고, 이때 - ...-(점선)는 천연 CD1 O25b IgG 수준을 도시한다.
도 21a 및 21b는 투약 2 후(도 21a) 및 투약 3 후(도 21b) RAC, eTEC O25b 장쇄 당접합체 및 단일-말단 당접합체의 OPA 면역원성을 나타내는 그래프를 도시하고, 이때 -O-는 단일-말단 단쇄 2 μg의 결과를 나타내고; -●-는 단일-말단 장쇄 2 μg의 결과를 나타내고; -▲-는 RAC/DMSO 장쇄 2 μg의 결과를 나타내고; -▼-는 eTEC 장쇄 2 μg의 결과를 나타내고; *는 배경 대조군(n = 20)의 결과를 나타낸다. † 반응자 비는 2x 초과의 백신접종되지 않은 기준선의 역가를 갖는 % 마우스이다.
도 22는 eTEC 화학의 OPA 면역원성 및 변형된 수준의 폴리사카라이드 활성화를 나타내는 그래프를 도시한다. † 반응자 비는 2x 초과의 백신접종되지 않은 기준선의 역가를 갖는 % 마우스이다.
도 23a는 예시적인 투여 일정의 설명을 도시하고, 도 23b는 O25b 단리물에 의한 치명적 챌린지로부터 대장균 eTEC 접합체의 투약으로 면역화된 마우스의 보호를 나타내는 그래프를 도시하고, 이때 -◇-는 eTEC 장쇄 17% 활성화를 나타내고; -△-는 eTEC 장쇄 10% 활성화를 나타내고; -▽-는 eTEC 장쇄 4% 활성화를 나타내고; -□-는 O25b 폴리사카라이드를 나타내고; -○-는 백신접종되지 않은 대조군을 나타낸다.
도 24는 단일-말단 접합체의 예시적인 제조를 설명하는 개략도이고, 이때 접합 공정은 티올 작용기의 마스킹 해제시 다이설파이드 아민 링커를 사용하는 2-케토-3-데옥시옥탄산(KDO)의 선택적인 활성화를 포함한다. 이어서, KDO는 도 24에 도시된 브로모 활성화된 CRM197 단백질에 접합된다(단일-말단 접합체의 제조).
도 25a 및 25b는 CRM197에 대한 대장균 당접합체의 제조에 사용된 활성화(도 25a) 및 접합(도 25b) 공정에 대한 예시적인 공정 흐름도를 보여준다.
서열 식별자
서열번호 1은 표 4에 기술된 LT2wzzB_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 2는 표 4에 기술된 LT2wzzB_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 3은 표 4에 기술된 O25bFepE_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 4는 표 4에 기술된 O25bFepE_A에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 5는 표 4에 기술된 wzzB P1_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 6은 표 4에 기술된 wzzB P2_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 7은 표 4에 기술된 wzzB P3_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 8은 표 4에 기술된 wzzB P4_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 9는 표 4에 기술된 O157 FepE_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 10은 표 4에 기술된 O157 FepE_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 11은 표 4에 기술된 pBAD33_adaptor_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 12는 표 4에 기술된 pBAD33_adaptor_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 13은 표 4에 기술된 JUMPSTART_r에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 14는 표 4에 기술된 gnd_f에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열번호 15는 도 5에 도시된 O25b 2401 FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 16은 도 5에 도시된 O25a:K5:H1 FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 17은 도 5에 도시된 O25a ETEC ATCC FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 18은 도 5에 도시된 O157 FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 19는 도 5에 도시된 살모넬라 LT2 FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 20은 도 2에 도시된 O25b 2401 WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 21은 도 2에 도시된 O25a:K5:H1 WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 22는 도 2에 도시된 O25a ETEC ATCC WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 23은 도 2에 도시된 K12 W3110 WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 24는 도 2에 도시된 살모넬라 LT2 WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 놀랍게도 면역원성 접합체의 놀라운 발견 및 이의 사용 방법을 비롯한, 상이한 Wzz 단백질(예컨대, WzzB)의 조작으로부터 생성된 대장균 항원을 발견한다. 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 사카라이드를 함유하는 당접합체가, 예컨대, 본원에서 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서로 지칭되는 2가 이종 이작용성 링커를 통해 담체 단백질에 공유 접합됨을 발견한다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도, 예를 들어 환원적 아민화(RAC), 특히, 비양성자성 용매, 바람직하게는 DMSO 중에서(RAC/DMSO) 또는 수용액 중에서 RAC를 통해 담체 단백질에 접합된 사카라이드를 함유하는 당접합체를 발견한다. 본 발명은 또한 이러한 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 이러한 당접합체 및 면역원성 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도, 일부 양태에서, 중간쇄 또는 장쇄 O-항원을 갖는 고 분자량 사카라이드를 함유하는 당접합체가 비교적 짧은 O-항원 쇄를 갖는 당접합체에 비해 더 면역원성일 수 있음을 발견한다. 또한, 본 발명자들은, 일부 양태에서, 예를 들어 RAC 또는 단일-말단 접합 또는 eTEC를 포함하는 방법에 의해, 담체 단백질에 접합되기 전에 사카라이드의 다중-말단 활성화에 의해 생산된 당접합체가 담체 단백질에 접합하기 전에 당의 단일-말단 활성화에 의해 생산된 당접합체보다 면역원성일 수 있음을 발견한다.
한 양태에서, 사카라이드는 사카라이드의 크기를 제어하기 위해 상이한 Wzz 단백질(예컨대, WzzB)의 발현(반드시 과발현은 아님)에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "사카라이드"는 단일 당 모이어티 또는 모노사카라이드 단위, 및 다이사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 형성하기 위해 공유적으로 연결된 2개 이상의 단일 당 모이어티 또는 모노사카라이드 단위의 조합을 지칭한다. 사카라이드는 선형 또는 분지형일 수 있다.
한 양태에서, 사카라이드는 재조합 그람-음성균에서 생산된다. 한 양태에서, 사카라이드는 재조합 대장균 세포에서 생산된다. 한 양태에서, 사카라이드는 재조합 살모넬라 세포에서 생산된다. 예시적인 세균는 대장균 O25K5H1, 대장균 BD559, 대장균 GAR2831, 대장균 GAR865, 대장균 GAR868, 대장균 GAR869, 대장균 GAR872, 대장균 GAR878, 대장균 GAR896, 대장균 GAR1902, 대장균 O25a ETC NR-5, 대장균 O157:H7:K-, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움(Typhimurium) 균주 LT2, 대장균 GAR2401, 살모넬라 엔테리카 혈청형 엔테리티디스(Enteritidis) CVD 1943, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 CVD 1925, 살모넬라 엔테리카 혈청형 파라티피(Paratyphi) A CVD 1902 및 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) CVD 1208S에서 생산된다. 한 양태에서, 세균는 대장균 GAR2401이 아니다. 사카라이드 생산에 대한 이러한 유전적 접근은 백신 성분으로서 O-폴리사카라이드와 O-항원 분자의 효율적인 생산을 가능하게 한다.
본원에 사용된 용어 "wzz 단백질"은, 예를 들어 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzzl 및 wzz2와 같은 쇄 길이 결정 폴리펩티드를 지칭한다. 예시적인 wzz 유전자 서열에 대한 젠뱅크(GenBank) 수탁번호는 각각 E4991/76의 경우 AF011910, F186의 경우 AF011911, M70/1-1의 경우 AF011912, 79/311의 경우 AF011913, Bi7509-41의 경우 AF011914, C664-1992의 경우 AF011915, C258-94의 경우 AF011916, C722-89의 경우 AF011917, 및 EDL933의 경우 AF011919이다. G7 및 Bi316-41 wzz 유전자 서열에 대한 젠뱅크 수탁번호는 각각 U39305 및 U39306이다. 예시적인 wzz 유전자 서열에 대한 추가 젠뱅크 수탁번호는 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피무리움 균주 LT2 FepE의 경우 NP_459581; 대장균 O157:H7 균주 EDL933 FepE의 경우 AIG66859; 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피무리움 균주 LT2 WzzB의 경우 NP_461024; 대장균 K-12 아주 MG1655 WzzB의 경우 NP_416531; 대장균 K-12 아주 MG1655 FepE의 경우 NP_415119이다. 바람직한 양태에서, wzz 계열 단백질은 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2 중 어느 하나, 가장 바람직하게는 wzzB, 더욱 바람직하게는 fepE이다.
예시적인 wzzB 서열은 다음을 포함한다:
>O25b 2401 WzzB
MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQEEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQEQVTKPQVQQTEDVTQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSSNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK (서열번호 20)
>O25a:K5:H1 WzzB
MRVENNNVSGQNNDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQDEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK (서열번호 21)
>O25a ETEC ATCC WzzB
MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVVVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSFAFSALAETLDNQKEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEDAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNLALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIENLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNSK (서열번호 22)
>K12 W3110 WzzB
MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQEEREKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPMLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK (서열번호 23)
>살모넬라 LT2 WzzB
MTVDSNTSSGRGNDPEQIDLIELLLQLWRGKMTIIVAVIIAILLAVGYLMIAKEKWTSTAIITQPDAAQVATYTNALNVLYGGNAPKISEVQANFISRFSSAFSALSEVLDNQKEREKLTIEQSVKGQALPLSVSYVSTTAEGAQRRLAEYIQQVDEEVAKELEVDLKDNITLQTKTLQESLETQEVVAQEQKDLRIKQIEEALRYADEAKITQPQIQQTQDVTQDTMFLLGSDALKSMIQNEATRPLVFSPAYYQTKQTLLDIKNLKVTADTVHVYRYVMKPTLPVRRDSPKTAITLVLAVLLGGMIGAGIVLGRNALRSYKPKAL (서열번호 24)
예시적인 FepE 서열은 다음을 포함한다:
>O25b GAR2401 FepE
MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKSFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISTLVVKESLENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKAHVNDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGGVLLRYAMASRKQDAMMADHLV (서열번호 15)
>O25a:K5:H1 FepE
MSSLNIKQGSEAHFPEYPLASPSNNEIDLLNLIEVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKTFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDPLDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDESALYTSWTLSFTAPTSEEAQKVLAGYIDYISALVVKESIENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKTNINDVNFTPFKYQLRPSLPVKKDGQGKAIIVILSALVGGMVACGGVLLRHAMASRKQDAMMADHLV (서열번호 16)
> O25a ETEC ATCC FepE
MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKSFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISTLVVKESLENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKAHVNDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGGVLLRYAMASRKQDAMMADHLV (서열번호 17)
> O157 FepE
MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKTFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISALVVKESIENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKMKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKANINDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGSVLLRYAMASRKQDAMMADHLV (서열번호 18)
>살모넬라 LT2 FepE
MPSLNVKQEKNQSFAGYSLPPANSHEIDLFSLIEVLWQAKRRILATVFAFACVGLLLSFLLPQKWTSQAIVTPAESVQWQGLERTLTALRVLDMEVSVDRGSVFNLFIKKFSSPSLLEEYLRSSPYVMDQLKGAQIDEQDLHRAIVLLSEKMKAVDSNVGKKNETSLFTSWTLSFTAPTREEAQKVLAGYIQYISDIVVKETLENIRNQLEIKTRYEQEKLAMDRVRLKNQLDANIQRLHYSLEIANAAGIKRPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGISRKLEIEKGVTDVAEIDGDLRNRQYHVEQLAAMNVSDVKFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIIILAALIGGMMACGGVLLRHAMVSRKMENALAIDERLV (서열번호 19)
일부 양태에서, 변형된 사카라이드(상응하는 야생형 사카라이드와 비교하여 변형됨)는 그람-음성균에서 그람-음성균으로부터의 wzz 계열 단백질(예컨대, fepE)을 발현(반드시 과발현하는 것은 아님)하고/거나, 중간쇄 또는 장쇄 O-항원을 함유하는 고 분자량 사카라이드, 예컨대 리포폴리사카라이드를 생성하기 위해 제2 wzz 유전자(예컨대, wzzB)를 스위칭 오프(switching off)(즉, 억제, 결실, 제거)함으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, 변형된 사카라이드는 wzz2를 발현(반드시 과발현하는 것은 아님)하고 wzz1을 스위칭 오프함으로써 생산될 수 있다. 또는, 다르게는, 변형된 사카라이드는 wzzfepE를 발현(반드시 과발현하는 것은 아님)하고 wzzB를 스위칭 오프함으로써 생산될 수 있다. 다른 양태에서, 변형된 사카라이드는 wzzB를 발현(반드시 과발현하는 것은 아님)하지만 wzzfepE를 스위칭 오프함으로써 생산될 수 있다. 다른 양태에서, 변형된 사카라이드는 fepE를 발현함으로써 생산될 수 있다. 바람직하게는, wzz 계열 단백질은 숙주 세포에 대해 이종성인 균주로부터 유래된다.
일부 양태에서, 사카라이드는 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19 중 어느 하나와 적어도 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성인 아미노산 서열을 갖는 wzz 계열 단백질을 발현함으로써 생산된다. 한 양태에서, wzz 계열 단백질은 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 포함한다. 바람직하게는, wzz 계열 단백질은 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19에 대해 적어도 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 사카라이드는 fepE 단백질에 대해 적어도 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현시킴으로써 생산된다.
한 양상에서, 본 발명은 그람-음성균에서 wzz 계열 단백질, 바람직하게는 fepE를 발현시켜, 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 반복 단위의 증가를 갖는 중간쇄 또는 장쇄 O-항원을 함유하는 고 분자량 사카라이드를 생성함으로써 생산된 사카라이드에 관한 것이다. 한 양상에서, 본 발명은 그람-음성균으로부터 wzz 계열 단백질(예컨대, wzzB)을 발현(반드시 과발현하는 것은 아님)시켜, 상응하는 야생형 O-항원과 비교하여, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 반복 단위의 증가를 갖는 O-항원 쇄를 갖는, 중간쇄 또는 장쇄 단백질을 함유하는 고 분자량 사카라이드를 생성하는 배양물에서 그람-음성균에 의해 생산된 사카라이드에 관한 것이다. 상응하는 야생형 사카라이드와 비교하여 증가된 반복 단위 수를 갖는 추가 예시적인 사카라이드에 대해서는 하기 O-폴리사카라이드 및 O-항원에 대한 설명을 참고한다. 원하는 쇄 길이는 주어진 백신 구축물의 맥락에서 개선된 또는 최대 면역원성을 생성하는 길이이다.
다른 양태에서, 사카라이드는 표 1에서 선택되는 어느 하나의 구조식을 포함하고, 이때 사카라이드의 반복 단위의 수 n은 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드의 반복 단위의 수보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 반복 단위만큼 크다. 바람직하게는, 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 이상의 반복 단위을 증가를 포함한다. 예를 들어, 표 21을 참고한다. 사카라이드의 길이를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 실시예 5에 기술된 핵 자기 공명, 질량 분광법 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 내인성 wzz O-항원 길이 조절자(예컨대, wzzB)에 대한 유전자가 결실되고, 재조합 대장균 숙주 세포(예컨대, 살모넬라 fepE)에 이종성인 그람-음성균으로부터의 (제2) wzz 유전자로 대체되어, 중간쇄 또는 장쇄 O-항원을 함유하는 고 분자량 사카라이드, 예컨대 리포폴리사카라이드를 생성하는 재조합 대장균 숙주 세포에서 생산된 사카라이드에 관한 것이다. 일부 양태에서, 재조합 대장균 숙주 세포는 살모넬라, 바람직하게는 살모넬라 엔테리카로부터의 wzz 유전자를 포함한다.
한 양태에서, 숙주 세포는 안정하게 유지되는 플라스미드 벡터로서 wzz 계열 단백질에 대한 이종 유전자를 포함한다. 다른 양태에서, 숙주 세포는 숙주 세포의 염색체 DNA에 통합된 유전자로서 wzz 계열 단백질에 대한 이종 유전자를 포함한다. 대장균 숙주 세포에서 플라스미드 벡터를 안정적으로 발현하는 방법 및 이종 유전자를 대장균 숙주 세포의 염색체에 통합하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 양태에서, 숙주 세포는 안정하게 유지되는 플라스미드 벡터로서 O-항원에 대한 이종 유전자를 포함한다. 다른 양태에서, 숙주 세포는 숙주 세포의 염색체 DNA에 통합된 유전자로서 O-항원에 대한 이종 유전자를 포함한다. 대장균 숙주 세포 및 살모넬라 숙주 세포에서 플라스미드 벡터를 안정적으로 발현하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이종 유전자를 대장균 숙주 세포 및 살모넬라 숙주 세포의 염색체로 통합하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
한 양상에서, 재조합 숙주 세포는 탄소 공급원을 포함하는 매질에서 배양된다. 대장균 배양을 위한 탄소 공급원은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 탄소 공급원은 당 알코올, 폴리올, 알돌 당 또는 케토 당, 예컨대, 비제한적으로, 아라비노스, 셀로비오스, 프럭토스, 글루코스, 글리세롤, 이노시톨, 락토스, 말토스, 만니톨, 만노스, 람노스, 라피노스, 소르비톨, 소르보스, 수크로스, 트레할로스, 피루베이트, 석시네이트 및 메틸아민을 포함한다. 바람직한 양태에서, 매질은 글루코스를 포함한다. 일부 양태에서, 매질은 탄소 공급원으로서 폴리올 또는 알돌 당, 예를 들어 만니톨, 이노시톨, 소르보스, 글리세롤, 소르비톨, 락토스 및 아라비노스를 포함한다. 모든 탄소 공급원은 배양 개시 전에 매질에 첨가될 수 있거나, 배양 중에 단계적으로 또는 연속적으로 첨가될 수 있다.
재조합 숙주 세포를 위한 예시적인 배양 매질은 KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 나트륨 시트레이트, Na2SO4, 아스파르트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O로부터 선택되는 어느 하나의 요소를 포함한다. 바람직하게는, 매질은 KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 나트륨 시트레이트, Na2SO4, 아스파르트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O를 포함한다.
본원에서 사용된 매질은 고체 또는 액체, 합성(즉, 인공) 또는 천연 매질일 수 있고, 재조합 숙주 세포의 배양에 충분한 영양소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 매질은 액체 매질이다.
일부 양태에서, 매질은 적합한 무기 염을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 매질은 미량 영양소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 매질은 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 매질은 추가 탄소 공급원을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 매질은 적합한 무기 염, 미량 영양소, 성장 인자 및 보충 탄소 공급원을 추가로 포함할 수 있다. 대장균 배양에 적합한 무기 염, 미량 영양소, 성장 인자 및 보충 탄소 공급원은 당업계에 공지되어 있다.
일부 양태에서, 매질은 펩톤, N-Z 아민, 효소적 대두 하이드록실레이트, 추가 효모 추출물, 맥아 추출물, 보충 탄소 공급원 및 다양한 비타민과 같은 적절한 추가 성분을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 매질은 펩톤, N-Z 아민, 효소적 대두 하이드록실레이트, 추가 효모 추출물, 맥아 추출물, 보충 탄소 공급원 및 다양한 비타민과 같은 추가 성분을 포함하지 않는다.
적합한 보충 탄소 공급원의 예시적인 예는 비제한적으로 기타 탄수화물, 예컨대 글루코스, 과당, 만니톨, 전분 또는 전분 가수분해물, 셀룰로스 가수분해물 및 당밀; 유기 산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 젖산, 포름산, 말산, 시트르산 및 푸마르산; 및 알코올, 예컨대 글리세롤, 이노시톨, 만니톨 및 소르비톨을 포함한다.
일부 양태에서, 매질은 질소 공급원을 추가로 포함한다. 대장균 배양에 적합한 질소 공급원은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 질소 공급원의 예시적인 예는 비제한적으로 암모니아, 예컨대 암모니아 가스 및 수성 암모니아; 무기 또는 유기 산의 암모늄 염, 예컨대 암모늄 클로라이드, 암모늄 니트레이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 설페이트 및 암모늄 아세테이트; 우레아; 니트레이트 또는 니트라이트 염, 및 기타 질소-함유 물질, 예컨대 순수한 또는 조질 제제인 아미노산, 육류 추출물, 펩톤, 어분, 생성 가수분해물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두 케이크 가수분해물, 효모 추출물, 건조 효모, 에탄올-효모 증류물, 콩가루, 면실 박 등을 포함한다.
일부 양태에서, 매질은 무기 염을 포함한다. 적합한 무기 염의 예시적인 예는 비제한적으로 칼륨, 칼슘, 나트륨, 마그네슘, 망간, 철, 코발트, 아연, 구리, 몰리브덴, 텅스텐 및 기타 미량 원소 및 인산의 염을 포함한다.
일부 양태에서, 매질은 적절한 성장 인자를 포함한다. 적절한 미량 영양소, 성장 인자 등의 예시적인 예는 비제한적으로 코엔자임 A, 판토텐산, 피리독신-HCl, 비오틴, 티아민, 리보플라빈, 플라빈 모노뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드, DL-6,8-티오크트산, 엽산, 비타민 B12, 기타 비타민, 아미노산, 예컨대 시스테인 및 하이드록시프롤린, 염기, 예컨대 아데닌, 우라실, 구아닌, 티민 및 시토신, 나트륨 티오설페이트, p- 또는 r-아미노벤조산, 니아신아미드, 니트릴로아세테이트 등을 순수하거나 부분적으로 정제된 화합물 또는 천연 물질에 존재하는 화합물로서 포함한다. 양은 당업계에 공지된 방법 및 기술에 따라 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 변형된 사카라이드(상응하는 야생형 사카라이드와 비교하여)는, 예를 들어 시험관 내에서 합성적으로 생산된다. 사카라이드의 합성 생산 또는 합성은 비용 및 시간 집약적인 생산 공정의 회피를 촉진할 수 있다. 한 양태에서, 사카라이드는, 예를 들어, 적절하게 보호된 모노사카라이드 중간체로부터 순차적인 글리코실화 전략 또는 순차 글리코실화 및 [3 + 2] 블록 합성 전략의 조합을 사용함으로써 합성적으로 합성된다. 예를 들어, 티오글리코사이드 및 글리코실 트라이클로로아세트이미데이트 유도체는 글리코실화에서 글리코실 공여체로 사용될 수 있다. 한 양태에서, 시험관 내에서 합성적으로 합성된 사카라이드는 재조합 수단에 의해, 예를 들어 상기 기술된 wzz 계열 단백질의 조작에 의해 생성된 사카라이드와 동일한 구조를 갖는다.
(재조합 또는 합성 수단에 의해) 생산된 사카라이드는, 예를 들어 하기 대장균 혈청형 중 어느 하나를 비롯한 임의의 대장균 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함한다: O1(예컨대, O1A, O1B, 및 O1C), O2, O3, O4(예컨대, O4:K52 및 O4:K6), O5(예컨대, O5ab 및 O5ac(균주 180/C3)), O6(예컨대, O6:K2; K13; K15 및 O6:K54), O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18(예컨대, O18A, O18ac, O18A1, O18B 및 O18B1), O19, O20, O21, O22, O23(예컨대, O23A), O24, O25(예컨대, O25a 및 O25b), O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45(예컨대, O45 및 O45rel), O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D1, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73(예컨대, O73(균주 73-1)), O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 및 O187.
개별 폴리사카라이드는 전형적으로, 예를 들어, 투석, 농축 작업, 투석 여과 작업, 정용여과 작업, 접선 유동 여과, 침전, 용리, 원심분리, 한외여과, 심층 여과 및/또는 컬럼 크로마토그래피(이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 이온 교환 크로마토그래피, DEAE 및 소수성 상호작용 크로마토그래피)와 같은 당업계에 공지된 방법을 통해, 바람직하게는, 폴리사카라이드는 접선 유동 여과를 포함하는 방법을 통해 정제된다.
정제된 폴리사카라이드는 활성화되어(예컨대, 화학적으로 활성화되어) 반응할 수 있도록 되고(예컨대, 담체 단백질에 직접적으로 또는 eTEC 스페이서와 같은 링커를 통해), 본원에 추가로 기술된 바와 같이 본 발명의 당접합체에 혼입될 수 있다.
하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 사카라이드는 대장균 혈청형으로부터 유래되고, 이때 혈청형은 O25a이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O25b이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O1A이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O2이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O6이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O17이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O15이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O18A이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O75이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O4이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O16이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O13이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O7이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O8이다. 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O9이다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 열거된 혈청형 중 임의의 것에 대한 언급은 당업계에 공지된 반복 단위 구조(후술되는 바와 같은 O-단위)를 포함하고, 상응하는 혈청형에 고유한 혈청형을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "O25a" 혈청형(당업계에서 혈청형 "O25"로도 공지됨)은 표 1에 나타낸 구조식 O25를 포함하는 혈청형을 지칭한다. 다른 실시예로서, 용어 "O25b" 혈청형은 표 1에 나타낸 구조식 O25b를 포함하는 혈청형을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 혈청형은 달리 명시되지 않는 한 본원에서 일반적으로 지칭되고, 예를 들어 용어 구조식 "O18"은 일반적으로 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1을 포함하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "O1"은 일반적으로 표 1에 따른 구조식 명칭에 일반적인 용어 "O1"을 포함하는 구조식의 종, 예컨대 각각 표 1에 제시된 구조식 O1A, 구조식 O1A1, 구조식 O1B 및 구조식 O1C 중 어느 하나를 포괄하는 것을 지칭한다. 따라서, "O1 혈청형"은 일반적으로 구조식 O1A, 구조식 O1A1, 구조식 O1B 및 구조식 O1C 중 어느 하나를 포함하는 혈청형을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "O6"은 일반적으로 표 1에 따른 구조식 명칭에 일반적인 용어 "O6"을 포함하는 구조식의 종, 예컨대 각각 표 1에 제시된 구조식 O6:K2; K13; K15; 및 O6:K54 중 어느 하나를 포괄하는 것을 지칭한다. 따라서, "O6 혈청형"은 일반적으로 구조식 O6:K2; K13; K15; 및 O6:K54 중 어느 하나를 포함하는 혈청형을 지칭한다.
표 1에 따른 구조식 명칭에 일반적인 용어를 포함하는 구조식의 종을 일반적으로 지칭하는 용어의 다른 예는 "O4", "O5", "O18" 및 "O45"를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "O2"는 표 1에 제시된 구조식 O2를 지칭한다. 용어 "O2 O-항원"은 표 1에 제시된 구조식 O2를 포함하는 사카라이드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 열거된 혈청형으로부터의 O-항원에 대한 언급은 상응하는 혈청형 명칭으로 표지된 구조식을 포함하는 사카라이드를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "O25B O-항원"은 표 1에 제시된 구조식 O25B를 포함하는 사카라이드를 지칭한다.
다른 예로서, 용어 "O1 O-항원"은 일반적으로 용어 "O1"을 포함하는 구조식, 예컨대 각각 표 1에 제시된 구조식 O1A, 구조식 O1A1, 구조식 O1B 및 구조식 O1C를 포괄하는 사카라이드를 지칭한다.
다른 예로서, 용어 "O6 O-항원"은 일반적으로 용어 "O6"을 포함하는 구조식, 예컨대 각각 표 1에 제시된 구조식 O6:K2; 구조식 O6:K13; 구조식 O6:K15 및 구조식 O6:K54를 포괄하는 사카라이드를 지칭한다.
O-폴리사카라이드
본원에 사용된 용어 "O-폴리사카라이드"는 구조가 전체 세포 또는 지질 A를 포함하지 않는 한 O-항원을 포함하는 임의의 구조를 지칭한다. 예를 들어, 한 양태에서, O-폴리사카라이드는 지질 A가 결합되지 않은 리포폴리사카라이드를 포함한다. 지질 A를 제거하는 단계는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 산을 첨가하여 열처리하는 것을 포함한다. 예시적인 과정은 90분 동안 100℃에서 1% 아세트산으로 처리하는 것을 포함한다. 이러한 과정은 제거된 지질 A를 단리하는 과정과 조합된다. 지질 A를 단리하는 예시적인 과정은 초원심분리를 포함한다.
한 양태에서, O-폴리사카라이드는 O-항원으로 구성된 구조를 지칭하고, 이때 O-폴리사카라이드는 용어 O-항원과 동의어이다. 한 바람직한 양태에서, O-폴리사카라이드는 코어 사카라이드의 부재 하에 O-항원의 반복 단위를 포함하는 구조를 지칭한다. 따라서, 한 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R1 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R2 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R3 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R4 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 K12 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 바람직한 양태에서, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함하는 구조를 지칭한다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 O-항원, 코어 사카라이드 및 KDO 모이어티를 포함하는 구조를 지칭한다.
LPS로부터 코어 올리고사카라이드를 포함하는 O-폴리사카라이드를 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, LPS의 정제 후, 정제된 LPS를 100℃에서 90분 동안 1%(v/v) 아세트산 중에서 가열하고, 이어서 4℃에서 5시간 동안 142,000 x g로 초원심분리함으로써 가수분해할 수 있다. O-폴리사카라이드를 함유하는 상청액을 동결건조하고 4℃에서 저장한다. 특정 양태에서, O-폴리사카라이드의 간단한 정제를 가능하게 하는 캡슐 합성 유전자의 결실이 기술된다.
O-폴리사카라이드를, 비제한적으로 LPS로부터 지질 A를 제거하기 위한 약한 산 가수분해를 비롯한 방법에 의해 단리할 수 있다. 다른 양태는 O-폴리사카라이드 제조를 위한 제제로서 하이드라진의 사용을 포함할 수 있다. LPS의 제조는 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
특정 양태에서, Wzz 단백질(예컨대, wzzB)을 발현하는(반드시 과발현하는 것은 아님) 야생형, 변형 또는 약독화된 그람-음성균 균주로부터 정제된 O-폴리사카라이드는 접합체 백신에 사용하기 위해 제공된다. 바람직한 양태에서, O-폴리사카라이드 쇄는 접합체 또는 복합 백신으로서 백신 항원으로 사용하기 위해 wzz 단백질을 발현하는(반드시 과발현하는 것은 아님) 그람-음성균 균주로부터 정제된다.
한 양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배, 35배, 36배, 37배, 38배, 39배, 40배, 41배, 42배, 43배, 44배, 45배, 46배, 47배, 48배, 49배, 50배, 51배, 52배, 53배, 54배, 55배, 56배, 57배, 58배, 59배, 60배, 61배, 62배, 63배, 64배, 65배, 66배, 67배, 68배, 69배, 70배, 71배, 72배, 73배, 74배, 75배, 76배, 77배, 78배, 79배, 80배, 81배, 82배, 83배, 84배, 85배, 86배, 87배, 88배, 89배, 90배, 91배, 92배, 93배, 94배, 95배, 96배, 97배, 98배, 99배, 100배 이상만큼 증가된 분자량을 갖는다. 바람직한 양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 1배 이상 내지 5배 이하만큼 증가된 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 2배 이상 내지 4배 이하만큼 증가된 분자량을 갖는다. 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교되는 O-폴리사카라이드의 분자량의 증가는, 바람직하게는 O-항원 반복 단위의 수의 증가와 연관된다. 한 양태에서, O-폴리사카라이드의 분자량의 증가는 wzz 계열 단백질에 기인한다.
한 양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 kDa 이상만큼 증가된 분자량을 갖는다. 한 양태에서, 본 발명의 O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 1 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된 분자량을 갖는다. 한 양태에서, 분자량은 5 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 12 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 15 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 18 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 20 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 21 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 22 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 30 kDa 이상 내지 200 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 1 kDa 이상 내지 100 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 5 kDa 이상 내지 100 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 100 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 12 kDa 이상 내지 100 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 15 kDa 이상 내지 100 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 20 kDa 이상 내지 100 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 1 kDa 이상 내지 75 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 5 kDa 이상 내지 75 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 75 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 12 kDa 이상 내지 75 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 15 kDa 이상 내지 75 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 18 kDa 이상 내지 75 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 20 kDa 이상 내지 75 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 30 kDa 이상 내지 75 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 90 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 12 kDa 이상 및 85 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 75 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 70 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 60 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 50 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 49 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 48 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 47 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 10 kDa 이상 내지 46 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 20 kDa 이상 내지 45 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 20 kDa 이상 내지 44 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 20 kDa 이상 내지 43 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 20 kDa 이상 내지 42 kDa 이하만큼 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 20 kDa 이상 내지 41 kDa 이하만큼 증가된다. 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 O-폴리사카라이드의 분자량의 이러한 증가는, 바람직하게는 O-항원 반복 단위의 수의 증가와 연관된다. 한 양태에서, O-폴리사카라이드의 분자량의 증가는 wzz 계열 단백질에 기인한다. 예를 들어, 표 21을 참고한다.
다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 표 1로부터 선택되는 어느 하나의 구조식을 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드 내의 반복 단위의 수 n은 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드 내의 반복 단위의 수보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 반복 단위만큼 크다. 바람직하게는, 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 이상의 반복 단위의 증가를 포함한다. 예를 들어, 표 21을 참고한다.
O-항원
O-항원은 그람-음성균의 외막 내의 리포폴리사카라이드(LPS)의 부분이다. O-항원은 세포 표면 상에 존재하고, 가변성 세포 구성요소이다. O-항원의 가변성은 그람-음성균의 혈청형별의 기준을 제공한다. 현재의 대장균 혈청형별 계획은 O-폴리사카라이드 1 내지 181을 포함한다.
O-항원은 올리고사카라이드 반복 단위(O-단위)를 포함하고, 이의 야생형 구조는 통상적으로 광범위한 당류로부터의 2 내지 8개의 잔기를 함유한다. 예시적인 대장균 O-항원의 O-단위는 표 1에 제시되고, 또한 도 9a 내지 9c 및 도 10a 및 10b를 참고한다.
한 양태에서, 본 발명의 사카라이드는 1개의 올리고사카라이드 단위일 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 사카라이드는 관련 혈청형의 1개의 반복 올리고사카라이드 단위이다. 이러한 양태에서, 사카라이드는 구조식 O8, 구조식 O9a, 구조식 O9, 구조식 O20ab, 구조식 O20ac, 구조식 O52, 구조식 O97 및 구조식 O101로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 사카라이드는 올리고사카라이드일 수 있다. 올리고사카라이드는 작은 수의 반복 단위(전형적으로 5 내지 15개의 반복 단위)를 갖고, 전형적으로 합성적으로 또는 폴리사카라이드의 가수분해에 의해 유도된다. 이러한 양태에서, 사카라이드는 구조식 O8, 구조식 O9a, 구조식 O9, 구조식 O20ab, 구조식 O20ac, 구조식 O52, 구조식 O97 및 구조식 O101로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 모든 사카라이드 및 본 발명의 면역원성 조성물 중 모든 사카라이드는 폴리사카라이드이다. 고 분자량 폴리사카라이드는 항원 표면 상에 존재하는 에피토프에 기인하는 특정 항체 면역 반응을 유도할 수 있다. 고 분자량 폴리사카라이드의 단리 및 정제는 바람직하게는 본 발명의 접합체, 조성물 및 방법에 사용하기 위해 고려된다.
일부 양태에서, 각각의 개별 O-항원 중합체 중 반복 O 단위 수(및 이에 따라 중합체 쇄의 길이 및 분자량)는 wzz 쇄 길이 조절자, 내막 단백질에 의존한다. 상이한 wzz 단백질은 상이한 범위의 모달(modal) 길이(4 내지 100 초과의 반복 단위)를 부여한다. 용어 “모달 길이”는 O-단위를 반복하는 수를 지칭한다. 그람-음성균은 종종 2개의 별개의 OAg 모달 쇄 길이(하나는 더 길고 하나는 더 짧음)를 부여하는 2개의 상이한 Wzz 단백질을 갖는다. 그람-음성균에서 계열 단백질(예컨대, wzzB)의 발현(반드시 과발현하는 것은 아님)은 O-항원 길이의 조작이 특정 길이 범위의 O-항원의 세균 생산의 시프팅 또는 바이어싱, 및 고-수율 큰 분자량 리포폴리사카라이드의 생산의 강화를 가능하게 할 수 있다. 한 양태에서, 본원에 사용된 “짧은” 모달 길이는 작은 수(예컨대, 1 내지 20개)의 반복 O-단위를 지칭한다. 한 양태에서, 본원에 사용된 “긴” 모달 길이는 20개 초과 및 40개 이하의 수의 반복 O-단위를 지칭한다. 한 양태에서, 본원에 사용된 “매우 긴” 모달 길이는 40개 초과의 반복 O-단위를 지칭한다.
한 양태에서, 생산된 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 10개 반복 단위, 15개 반복 단위, 20개 반복 단위, 25개 반복 단위, 30개 반복 단위, 35개 반복 단위, 40개 반복 단위, 45개 반복 단위, 50개 반복 단위, 55개 반복 단위, 60개 반복 단위, 65개 반복 단위, 70개 반복 단위, 75개 반복 단위, 80개 반복 단위, 85개 반복 단위, 90개 반복 단위, 95개 반복 단위 또는 100개 반복 단위의 증가를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명의 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 반복 단위의 증가를 갖는다. 바람직하게는, 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 반복 단위의 증가를 포함한다. 예를 들어, 표 21을 참고한다. 사카라이드의 길이를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 실시예 5에 기술된 핵 자기 공명, 질량 분광법 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다.
사카라이드의 반복 단위의 수를 측정하는 방법은 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 반복 단위의 수(또는 구조식의 “n”)는 폴리사카라이드의 분자량(코어 사카라이드 또는 KDO 잔기의 분자량 없음)을 반복 단위의 분자량(즉, 구조식의 각각의 모노사카라이드의 분자량의 합으로 이론적으로 계산될 수 있는, 예를 들어 표 1에 제시된 상응하는 구조식의 구조의 분자량)으로 나눔으로써 계산될 수 있다. 구조식의 각각의 모노사카라이드의 분자량은 당업계에 공지되어 있다. 구조식 O25b의 반복 단위의 분자량은, 예를 들어, 약 862 Da이다. 구조식 O1a의 반복 단위의 분자량은, 예를 들어, 약 845 Da이다. 구조식 O2의 반복 단위의 분자량은, 예를 들어, 약 829 Da이다. 구조식 O6의 반복 단위의 분자량은, 예를 들어, 약 893 Da이다. 접합체의 반복 단위의 수를 측정할 때, 담체 단백질 분자량 및 단백질:폴리사카라이드 비는 계산에 감안된다. 본원에 정의된 “n”은 폴리사카라이드 분자의 반복 단위의 수(표 1의 괄호에 표시됨)를 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 생물학적 거대분자에서, 반복 구조는 불완전한 반복부, 예컨대, 예를 들어, 누락된 분지의 영역으로 배치된다. 또한, 천연 공급원, 예컨대 세균으로부터 단리되고 정제된 폴리사카라이드는 크기 및 분지가 불균일할 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 경우에, n은 집단 내의 분자에 대한 n에 대한 평균 또는 중간 값을 나타낼 수 있다.
한 양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 O-항원의 하나 이상의 반복 단위의 증가를 갖는다. O-항원의 반복 단위는 표 1에 제시된다. 한 양태에서, O-폴리사카라이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 총 반복 단위를 포함한다. 바람직하게는, 사카라이드는 총 3개 이상 내지 80개 이하의 반복 단위를 갖는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 반복 단위의 증가를 갖는다.
한 양태에서, 사카라이드는 임의의 O-항원 구조식(예를 들어, 표 1에 제시된 구조식(도 9a 내지 9c 및 도 10a 및 10b))의 n이 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 이상, 및 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 50 이하의 정수인 O-항원을 포함한다. 임의의 최소 값 및 임의의 최대 값은 범위를 한정하도록 조합될 수 있다. 예시적인 범위는, 예를 들어, 1 이상 내지 1,000 이하; 10 이상 내지 500 이하; 및 20 이상 내지 80 이하, 바람직하게는 90 이하를 포함한다. 한 바람직한 양태에서, n은 31 이상 내지 90 이하이다. 바람직한 양태에서, n은 40 내지 90, 더욱 바람직하게는 60 내지 85이다.
한 양태에서, 사카라이드는 어느 하나의 O-항원 구조의 n이 1 이상 내지 200 이하인 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 5 이상 내지 200 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 10 이상 내지 200 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 25 이상 내지 200 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 50 이상 내지 200 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 75 이상 내지 200 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 100 이상 내지 200 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 125 이상 내지 200 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 150 이상 내지 200 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 175 이상 내지 200 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 1 이상 내지 100 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 5 이상 내지 100 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 10 이상 내지 100 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 25 이상 내지 100 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 50 이상 내지 100 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 75 이상 내지 100 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 1 이상 내지 75 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 5 이상 내지 75 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 10 이상 내지 75 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 20 이상 내지 75 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 25 이상 내지 75 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 30 이상 내지 75 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 40 이상 내지 75 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 50 이상 내지 75 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 30 이상 내지 90 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 35 이상 내지 85 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 35 이상 내지 75 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 35 이상 내지 70 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 35 이상 내지 60 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 35 이상 내지 50 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 35 이상 내지 49 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 35 이상 내지 48 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 35 이상 내지 47 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 35 이상 내지 46 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 36 이상 내지 45 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 37 이상 내지 44 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 38 이상 내지 43 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 39 이상 내지 42 이하이다. 한 양태에서, 어느 하나의 O-항원 구조의 n은 39 이상 내지 41 이하이다.
예를 들어, 한 양태에서, 사카라이드의 n은 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 또는 90, 가장 바람직하게는 40이다. 다른 양태에서, n은 35 이상 내지 60 이하이다. 예를 들어, 한 양태에서, n은 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60 중 어느 하나, 바람직하게는 50이다. 다른 바람직한 양태에서, n은 55 이상 내지 75 이하이다. 예를 들어, 한 양태에서, n은 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 또는 69, 가장 바람직하게는 60이다.
사카라이드 구조는 당업계에 공지된 방법 및 도구, 예를 들어, NMR, 예컨대 1D, 1H, 및/또는 13C, 2D TOCSY, DQF-COSY, NOESY 및/또는 HMQC에 의해 측정될 수 있다.
일부 양태에서, 접합 전에 정제된 폴리사카라이드는 5 내지 400 kDa의 분자량을 갖는다. 이러한 다른 양태에서, 사카라이드는 10 내지 400 kDa; 5 내지 400 kDa; 5 내지 300 kDa; 5 내지 200 kDa; 5 내지 150 kDa; 10 내지 100 kDa; 10 내지 75 kDa; 10 내지 60 kDa; 10 내지 40 kDa; 10 내지 100 kDa; 10 내지 200 kDa; 15 내지 150 kDa; 12 내지 120 kDa; 12 내지 75 kDa; 12 내지 50 kDa; 12 및 60 kDa; 35 내지 75 kDa; 40 내지 60 kDa; 35 내지 60 kDa; 20 내지 60 kDa; 12 내지 20 kDa; 또는 20 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다. 추가 양태에서, 폴리사카라이드는 7 내지 15 kDa; 8 내지 16 kDa; 9 내지 25 kDa; 10 내지 100 kDa; 10 내지 60 kDa; 10 내지 70 kDa; 10 내지 160 kDa; 15 내지 600 kDa; 20 내지 1,000 kDa; 20 내지 600 kDa; 20 내지 400 kDa; 30 내지 1,000 KDa; 30 내지 60 kDa; 30 내지 50 kDa or 5 내지 60 kDa의 분자량을 갖는다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 범자연수 정수는 본 개시내용의 양태로서 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리사카라이드 또는 담체 단백질-폴리사카라이드 접합체의 "분자량"이란 용어는 다중각도 레이저 광 산란 검출기(MALLS)와 조합된 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 계산된 분자량을 지칭한다.
폴리사카라이드는 통상적인 정제 과정 중에 크기가 약간 감소될 수 있다. 추가적으로, 본원에 기술된 바와 같이, 폴리사카라이드는 접합 전에 사이징 기술을 거칠 수 있다. 기계적 또는 화학적 사이징이 사용될 수 있다. 화학적 가수분해는 아세트산을 사용하여 수행될 수 있다. 기계적 사이징은 고압 균질화 전단을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 언급된 분자량 범위는 접합 전에(예컨대, 활성화 전에) 정제된 폴리사카라이드를 지칭한다.
[표 1]
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Figure 112021033935808-pct00003
Figure 112021033935808-pct00004
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코어 올리고사카라이드
코어 올리고사카라이드는 야생형 대장균 LPS에서 지질 A와 O-항원 외부 영역 사이에 위치한다. 더욱 구체적으로, 코어 올리고사카라이드는 야생형 대장균에서 O-항원과 지질 A 사이의 결합을 포함하는 폴리사카라이드의 일부이다. 이러한 결합은 가장 안쪽에 있는 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산(KDO) 잔기의 헤미케탈 작용기와 지질 A의 GlcNAc-잔기의 하이드록실 기 사이의 케토시드 결합을 포함한다. 코어 올리고사카라이드 영역은 야생형 대장균 균주 사이에서 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 통상적으로, 제한된 수의 당을 포함한다. 코어 올리고사카라이드는 내부 코어 영역과 외부 코어 영역을 포함한다.
더욱 구체적으로, 내부 코어는 주로 L-글리세로-D-만노-헵토스(헵토스) 및 KDO 잔기로 구성된다. 내부 코어는 매우 보존적이다. KDO 잔기는 하기 구조식 KDO를 포함한다:
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코어 올리고사카라이드의 외부 영역은 내부 코어 영역보다 더 많은 변화를 나타내고, 이러한 영역의 차이는 대장균의 5개의 화학형인 R1, R2, R3, R4 및 K-12를 구별한다. 5개의 공지된 화학형의 외부 코어 올리고사카라이드의 탄수화물 골격의 일반화된 구조를 예시하는 도 17을 참고한다. HepII는 내부 코어 올리고사카라이드의 마지막 잔기이다. 모든 외부 코어 올리고사카라이드는 (헥소스)3 탄수화물 골격 및 2개의 측쇄 잔기와 함께 구조적 주제를 공유하지만, 골격의 헥소스의 순서와 측쇄 잔기의 성질, 위치 및 연결기는 모두 다를 수 있다. R1 및 R4 외부 코어 올리고사카라이드의 구조는 매우 유사하고, 단일 β-연결된 잔기만 상이하다.
야생형 대장균의 코어 올리고사카라이드는 당업계에서 원위 올리고사카라이드의 구조에 기초하여 5개의 상이한 화학형으로 분류된다: 대장균 R1, 대장균 R2, 대장균 R3, 대장균 R4, 대장균 K12.
바람직한 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 O-폴리사카라이드가 O-항원에 결합된 코어 올리고사카라이드를 포함하는 당접합체를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 코어 대장균 화학형 대장균 R1, 대장균 R2, 대장균 R3, 대장균 R4 및 대장균 K12 중 하나 이상에 대한 면역 반응을 유도한다. 다른 양태에서, 조성물은 2개 이상의 코어 대장균 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다. 다른 양태에서, 조성물은 3개 이상의 코어 대장균 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다. 다른 양태에서, 조성물은 4개 이상의 코어 대장균 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다. 다른 양태에서, 조성물은 모든 5개의 코어 대장균 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다.
다른 바람직한 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 O-폴리사카라이드가 O-항원에 결합된 코어 올리고사카라이드를 포함하지 않는 당접합체를 포함한다. 한 양태에서, 이러한 조성물은 코어 올리고사카라이드를 포함하지 않는 O-폴리사카라이드를 갖는 당접합체에도 불구하고 코어 대장균 화학형 대장균 R1, 대장균 R2, 대장균 R3, 대장균 R4 및 대장균 K12 중 하나 이상에 대한 면역 반응을 유도한다.
대장균 혈청형은 5개 화학형 중 하나에 따라 특성화될 수 있다. 표 2는 화학형에 따라 특성화된 예시적인 혈청형을 나열한다. 굵게 표시된 혈청형은 표시된 코어 화학형과 가장 통상적으로 연관된 혈청형을 나타낸다. 따라서, 바람직한 양태에서, 조성물은 코어 대장균 화학형 대장균 R1, 대장균 R2, 대장균 R3, 대장균 R4 및 대장균 K12 중 하나 이상에 대한 면역 반응을 유도하고, 이는 각각의 상응하는 대장균 혈청형 중 어느 하나에 대한 면역 반응을 포함한다.
[표 2]
Figure 112021033935808-pct00013
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 구조식 O25a, 구조식 O6, 구조식 O2, 구조식 O1, 구조식 O75, 구조식 O4, 구조식 O16, 구조식 O8, 구조식 O18, 구조식 O9, 구조식 O13, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O91 및 구조식 O163(이때, n은 1 내지 100임)을 갖는 사카라이드로부터 선택되는 R1 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물의 사카라이드는 대장균 R1 코어 모이어티(예컨대, 도 17에 도시됨)를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 구조식 O25a, 구조식 O6, 구조식 O2, 구조식 O1, 구조식 O75, 구조식 O4, 구조식 O16, 구조식 O18, 구조식 O13, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O91 및 구조식 O163(이때, n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 더욱 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65임)을 갖는 사카라이드로부터 선택되는 R1 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물의 사카라이드는 사카라이드에 대장균 R1 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 구조식 O21, 구조식 O44, 구조식 O11, 구조식 O89, 구조식 O162 및 구조식 O9(이때, n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 더욱 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65임)를 갖는 사카라이드로부터 선택되는 R2 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물의 사카라이드는 대장균 R2 코어 모이어티(예컨대, 도 17에 도시됨)를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 구조식 O25b, 구조식 O15, 구조식 O153, 구조식 O21, 구조식 O17, 구조식 O11, 구조식 O159, 구조식 O22, 구조식 O86 및 구조식 O93(이때, n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 더욱 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65임)을 갖는 사카라이드로부터 선택되는 R3 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물의 사카라이드는 대장균 R3 코어 모이어티(예컨대, 도 17에 도시됨)를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 구조식 O2, 구조식 O1, 구조식 O86, 구조식 O7, 구조식 O102, 구조식 O160 및 구조식 O166(이때, n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 더욱 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65임)을 갖는 사카라이드로부터 선택되는 R4 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물의 사카라이드는 대장균 R4 코어 모이어티(예컨대, 도 17에 도시됨)를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 K-12 화학형(예컨대, 구조식 O25b를 갖는 사카라이드 및 구조식 O16을 갖는 사카라이드)(이때, n은 1 내지 1,000, 바람직하게는 31 내지 100, 더욱 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35내지 65임)을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물의 사카라이드는 대장균 K-12 코어 모이어티(예컨대, 도 17에 도시됨)를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 사카라이드는 코어 사카라이드를 포함한다. 따라서, 한 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R1 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R2 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R3 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R4 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 K12 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 사카라이드는 코어 사카라이드를 포함하지 않는다. 따라서, 한 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R1 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R2 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R3 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 R4 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 대장균 K12 코어 모이어티를 포함하지 않는다.
접합된 O-항원
단백질 담체에 대한 O-항원 또는 바람직하게는 O-폴리사카라이드의 화학적 연결기는 O-항원 또는 O-폴리사카라이드의 면역원성을 개선할 수 있다. 그러나, 중합체 크기의 가변성은 생산에 있어 실질적인 도전을 나타낸다. 상업적 사용에서, 사카라이드의 크기는 상이한 접합 합성 전략, 제품 균일성 및 접합 면역원성과의 상용성에 영향을 미칠 수 있다. O-항원 합성 경로의 조작을 통해 Wzz 계열 단백질 쇄 길이 조절자의 발현을 제어하면 대장균를 비롯한 다양한 그람-음성균 균주에서 원하는 길이의 O-항원 쇄를 생산할 수 있다.
한 양태에서, 정제된 사카라이드는 화학적으로 활성화되어 담체 단백질과 반응할 수 있는 활성화된 사카라이드를 생산한다. 일단 활성화되면, 각각의 사카라이드는 담체 단백질에 개별적으로 접합되어 접합체, 즉 당접합체를 형성한다. 본원에 사용된 용어 "당접합체"는 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 지칭한다. 한 양태에서, 사카라이드는 담체 단백질에 직접 연결된다. 다른 양태에서, 사카라이드는 스페이서/링커를 통해 단백질에 연결된다.
접합체는 O-항원을 따라 하나 또는 여러 부위에서 O-항원에 담체를 결합하는 방식에 의해, 또는 코어 올리고사카라이드의 하나 이상의 잔기를 활성화하는 방식에 의해 제조될 수 있다.
한 양태에서, 각각의 사카라이드는 동일한 담체 단백질에 접합된다.
단백질 담체가 조성물 내의 2개 이상의 사카라이드에 대해 동일한 경우, 사카라이드는 담체 단백질의 동일한 분자(예컨대, 이에 결합된 2개 이상의 상이한 사카라이드를 갖는 담체 분자)에 접합될 수 있다.
바람직한 양태에서, 사카라이드는 각각 단백질 담체의 상이한 분자에 개별적으로 접합된다(단백질 담체의 각각의 분자는 분자에 접합된 하나의 유형의 사카라이드를 가짐). 상기 양태에서, 사카라이드는 담체 단백질에 개별적으로 접합된다고 한다.
사카라이드의 화학적 활성화 및 담체 단백질에 대한 후속 접합은 본원에 개시된 활성화 및 접합 방법에 의해 달성될 수 있다. 폴리사카라이드를 담체 단백질에 접합시킨 후, 당접합체는 다양한 기술에 의해 정제된다(폴리사카라이드-단백질 접합체의 양이 풍부함). 이러한 기술은 농축/정용여과 작업, 침전/용리, 컬럼 크로마토그래피 및 심층 여과를 포함한다. 개별 당접합체가 정제된 후, 이들은 화합되어 본 발명의 면역원성 조성물을 제형시킨다.
활성화. 본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 양태로부터 생성된 활성화된 폴리사카라이드에 관한 것으로서, 폴리사카라이드는 링커 또는 담체 단백질에 대한 접합을 위한 반응성 기를 생성하기 위해 화학 시약으로 활성화된다. 일부 양태에서, 본 발명의 사카라이드는 담체 단백질에 접합되기 전에 활성화된다. 일부 양태에서, 활성화도는 폴리사카라이드의 분자량을 유의하게 감소시키지 않는다. 예를 들어, 일부 양태에서, 활성화도는 폴리사카라이드 골격을 절단하지 않는다. 일부 양태에서, 활성화도는 CRM197(아미노산 분석에 의해 측정됨)과 같은 담체 단백질에서 변형된 리신 잔기의 수에 의해 측정된 바와 같이 접합도에 유의하게 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 일부 양태에서, 활성화도는, 동일한 활성화도의 기준 폴리사카라이드를 갖는 접합체의 담체 단백질에서 변형된 리신 잔기의 수와 비교하여, 담체 단백질에서 변형된(아미노산 분석에 의해 결정됨) 리신 잔기의 수를 3배만큼 유의하게 증가시키지 않는다. 일부 양태에서, 활성화도는 비접합된 유리 사카라이드의 수준을 증가시키지 않는다. 일부 양태에서, 활성화도는 최적 사카라이드/단백질 비를 감소시키지 않는다.
일부 양태에서, 활성화된 사카라이드는 활성화 %를 갖고, 이때 활성화된 사카라이드의 사카라이드 반복 단위 당 티올의 몰은 1 내지 100%, 예를 들어, 2 내지 80%, 2 내지 50%, 3 내지 30% 및 4 내지 25%이다. 활성화도는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ≥ 20%, ≥ 30%, ≥ 40%, ≥ 50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80% 또는 ≥ 90%, 또는 약 100%이다. 바람직하게는, 활성화도는 50% 이하, 더욱 바람직하게는 25% 이하이다. 한 양태에서, 활성화도는 20% 이하이다. 임의의 최소 값과 임의의 최대 값을 조합하여 범위를 한정할 수 있다.
한 양태에서, 폴리사카라이드는 1-시아노-4-다이메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로 활성화되어 시아네이트 에스터를 형성한다. 활성화된 폴리사카라이드는 직접 또는 스페이서(링커) 기를 통해 담체 단백질(바람직하게는 CRM197 또는 파상풍 톡소이드) 상의 아미노 기에 커플링된다.
예를 들어, 스페이서는 말레이미드 활성화 담체 단백질(예를 들어, N-[Y-말레이미도부티를록시]석신이미드 에스터 GMBS)) 또는 할로아세틸화된 담체 단백질(예컨대, 요오도아세트이미드, N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA; SIB), N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB), 설포석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포-SIAB), N-석신이미딜 요오도아세테이트(SIA), 또는 석신이미딜 3-[브로모아세트아미도]프로피오네이트(SBAP)를 사용함)과의 반응 후에 수득된 티오에터 연결기 통해 담체에 커플링될 수 있는 티올화된 폴리사카라이드를 제공하는 시스타민 또는 시스테아민일 수 있다. 한 양태에서, 시아네이트 에스터(임의적으로 CDAP 화학에 의해 제조됨)는 헥산 다이아민 또는 아디프산 다이하이드라자이드(ADH)와 커플링되고, 아미노-유도된 사카라이드는 단백질 담체 상의 카복실 기를 통한 카보다이이미드(예컨대, EDAC 또는 EDC) 화학을 사용하여 담체 단백질(예컨대, CRM197)에 접합된다.
접합을 위한 다른 적합한 기술은 카보다이이미드, 하이드라자이드, 활성 에스터, 노르보란, p-니트로벤조산, N-하이드록시석신이미드, S-NHS, EDC, TSTU를 사용한다. 접합은 사카라이드의 유리 하이드록실 기와 CDI의 반응, 및 이어서 카바메이트 연결기를 형성하기 위한 단백질과의 반응에 의해 형성될 수 있는 카보닐 링커를 포함할 수 있다. 이는 1차 하이드록실 기로의 아노머 말단의 환원, 1차 하이드록실 기의 임의적인 보호/탈보호, CDI 카바메이트 중간체를 형성하기 위한 1차 하이드록실 기와 CDI의 반응, 및 CDI 카바메이트 중간체와 단백질 상의 아미노 기의 커플링(CDI 화학)을 포함할 수 있다.
분자량. 일부 양태에서, 당접합체는 10 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 사카라이드는 50 내지 1,000 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, 사카라이드는 70 내지 900 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, 사카라이드는 100 내지 800 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, 사카라이드는 200 내지 600 kDa의 분자량을 갖는다. 추가 양태에서, 사카라이드는 100 내지 1,000 kDa; 100 내지 900 kDa; 100 내지 800 kDa; 100 내지 700 kDa; 100 내지 600 kDa; 100 내지 500 kDa; 100 내지 400 kDa; 100 내지 300 kDa; 150 내지 1,000 kDa; 150 내지 900 kDa; 150 내지 800 kDa; 150 내지 700 kDa; 150 내지 600 kDa; 150 내지 500 kDa; 150 내지 400 kDa; 150 내지 300 kDa; 200 내지 1,000 kDa; 200 내지 900 kDa; 200 내지 800 kDa; 200 내지 700 kDa; 200 내지 600 kDa; 200 내지 500 kDa; 200 내지 400 kDa; 200 내지 300 kDa; 250 내지 1,000 kDa; 250 내지 900 kDa; 250 내지 800 kDa; 250 내지 700 kDa; 250 내지 600 kDa; 250 내지 500 kDa; 250 내지 400 kDa; 250 내지 350 kDa; 300 내지 1,000 kDa; 300 내지 900 kDa; 300 내지 800 kDa; 300 내지 700 kDa; 300 내지 600 kDa; 300 내지 500 kDa; 300 내지 400 kDa; 400 내지 1,000 kDa; 400 내지 900 kDa; 400 내지 800 kDa; 400 내지 700 kDa; 400 내지 600 kDa; 500 내지 600 kDa의 분자량을 갖는다. 한 양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 단일-말단 접합에 의해 생산된다. 다른 양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 수성 완충액 중에서 제조되는 환원적 아민화 화학(RAC)에 의해 생산된다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 범자연수 정수가 본 개시내용의 양태로서 고려된다.
일부 양태에서, 본 발명의 당접합체는 400 내지 15,000 kDa; 500 내지 10,000 kDa; 2,000 내지 10,000 kDa; 3,000 내지 8,000 kDa; 또는 3,000 내지 5,000 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, 당접합체는 500 내지 10,000 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, 당접합체는 1,000 내지 8,000 kDa의 분자량을 갖는다. 또 다른 양태에서, 당접합체는 2,000 내지 8,000 kDa 또는 3,000 내지 7,000 kDa의 분자량을 갖는다. 추가 양태에서, 본 발명의 당접합체는 200 내지 20,000 kDa; 200 내지 15,000 kDa; 200 내지 10,000 kDa; 200 내지 7,500 kDa; 200 내지 5,000 kDa; 200 내지 3,000 kDa; 200 내지 1,000 kDa; 500 내지 20,000 kDa; 500 내지 15,000 kDa; 500 내지 12,500 kDa; 500 내지 10,000 kDa; 500 내지 7,500 kDa; 500 내지 6,000 kDa; 500 내지 5,000 kDa; 500 내지 4,000 kDa; 500 내지 3,000 kDa; 500 내지 2,000 kDa; 500 내지 1,500 kDa; 500 내지 1,000 kDa; 750 내지 20,000 kDa; 750 내지 15,000 kDa; 750 내지 12,500 kDa; 750내지 10,000 kDa; 750내지 7,500 kDa; 750 내지 6,000 kDa; 750 내지 5,000 kDa; 750 내지 4,000 kDa; 750 내지 3,000 kDa; 750 내지 2,000 kDa; 750 내지 1,500 kDa; 1,000 내지 15,000 kDa; 1,000 내지 12,500 kDa; 1,000 내지 10,000 kDa; 1,000 내지 7,500 kDa; 1,000 내지 6,000 kDa; 1,000 내지 5,000 kDa; 1,000 내지 4,000 kDa; 1,000 내지 2,500 kDa; 2,000 내지 15,000 kDa; 2,000 내지 12,500 kDa; 2,000 내지 10,000 kDa; 2,000 내지 7,500 kDa; 2,000 내지 6,000 kDa; 2,000 내지 5,000 kDa; 2,000 내지 4,000 kDa; 또는 2,000 내지 3,000 kDa의 분자량을 갖는다. 한 양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 본원에 기술된 eTEC 접합에 의해 생산된다. 다른 양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 환원적 아민화 화학(RAC)에 의해 생산된다. 다른 양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 DMSO에서 준비되는 환원적 아민화 화학(RAC)에 의해 생산된다.
추가 양태에서, 본 발명의 당접합체는 1,000 내지 20,000 kDa; 1,000 내지 15,000 kDa; 2,000 내지 10,000 kDa; 2,000 내지 7,500 kDa; 2,000 내지 5,000 kDa; 3,000 내지 20,000 kDa; 3,000 내지 15,000 kDa; 3,000 내지 12,500 kDa; 4,000 내지 10,000 kDa; 4,000 내지 7,500 kDa; 4,000 내지 6,000 kDa; 또는 5,000 내지 7,000 kDa의 분자량을 갖는다. 한 양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 환원적 아민화 화학(RAC)에 의해 생산된다. 다른 양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 DMSO에서 준비되는 환원적 아민화 화학(RAC)에 의해 생산된다. 다른 양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 본원에 기술된 eTEC 접합에 의해 생산된다.
추가 양태에서, 본 발명의 당접합체는 5,000 내지 20,000 kDa; 5,000 내지 15,000 kDa; 5,000 내지 10,000 kDa; 5,000 내지 7,500 kDa; 6,000 내지 20,000 kDa; 6,000 내지 15,000 kDa; 6,000 내지 12,500 kDa; 6,000 내지 10,000 kDa 또는 6,000 내지 7,500 kDa의 분자량을 갖는다.
당접합체의 분자량은 SEC-MALLS에 의해 측정될 수 있다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 범자연수 정수가 본 개시내용의 양태로서 고려된다. 본 발명의 당접합체는 또한 사카라이드 대 담체 단백질의 비(중량/중량)에 의해 특성화될 수 있다. 일부 양태에서, 당접합체에서 폴리사카라이드 대 담체 단백질의 비(w/w)는 0.5 내지 3(예컨대, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9 또는 약 3.0)이다. 다른 양태에서, 사카라이드 대 담체 단백질 비(w/w)는 0.5 및 2.0, 0.5 내지 1.5, 0.8 내지 1.2, 0.5 내지 1.0, 1.0 내지 1.5 또는 1.0 내지 2.0이다. 추가 양태에서, 사카라이드 대 담체 단백질 비(w/w)는 0.8 내지 1.2이다. 바람직한 양태에서, 접합체에서 폴리사카라이드 대 담체 단백질의 비는 0.9 내지 1.1이다. 이러한 일부 양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
당접합체는 또한 분자 크기 분포(Kd)에 의해 특성화될 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 매질(CL-4B)은 접합체의 상대적인 분자 크기 분포를 결정하는 데 사용될 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 중력 공급 컬럼에서 접합체의 분자 크기 분포를 프로파일링하는 데 사용된다. 매질의 공극에서 제외된 큰 분자는 작은 분자보다 더 빨리 용리된다. 분획 수집기는 컬럼 용리액을 수집하는 데 사용된다. 분획은 사카라이드 검정에 의해 비색적으로 시험된다. Kd 측정을 위해 컬럼을 보정하여 분자가 완전히 배제되는 분획(V0)(Kd = 0) 및 최대 체류를 나타내는 분획(Vi)(Kd = 1)을 설정한다. 특정된 샘플 속성에 도달하는 분획(Ve)은 Kd = (Ve - Vo)/(Vi - V0) 표현식에 의해 Kd와 관련된다.
유리 사카라이드. 본 발명의 당접합체 및 면역원성 조성물은 담체 단백질에 공유 접합되지 않지만, 그럼에도 불구하고 당접합체 조성물에 존재하는 유리 사카라이드를 포함할 수 있다. 유리 사카라이드는 당접합체와 비공유 연관(즉, 비공유 결합, 흡착 또는 포획)될 수 있다. 바람직한 양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% 또는 15% 이하의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 25% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 20% 이하의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 15% 이하의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 8% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 6% 이하의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 5% 이하의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 표 12, 표 13, 표 14, 표 15, 표 16, 표 17 및 표 18을 참고한다.
공유 연결기. 다른 양태에서, 접합체는 5 내지 10개의 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 7개의 사카라이드 반복 단위마다; 3 내지 8개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 9개의 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 11개의 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 12개의 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 13개의 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 14개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 15개의 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 6개의 사카라이드 반복 단위마다; 3 내지 7개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 8개의 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 10개의 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 11개의 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 12개의 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 13개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 14개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 20개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 25개의 사카라이드 반복 단위마다 또는 2 내지 25개의 사카라이드 반복 단위마다 담체 단백질과 사카라이드 사이에 하나 이상의 공유 연결기를 포함한다. 빈번한 양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다. 다른 양태에서, 담체 단백질과 사카라이드 사이의 하나 이상의 연결기는 폴리사카라이드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 사카라이드 반복 단위마다 발생한다. 한 양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수가 본 개시내용의 실시예로서 고려된다.
리신 잔기. 본 발명의 당접합체를 특성화하는 또 다른 방식은 다양한 접합된 리신으로 특성화될 수 있는 사카라이드에 접합되는 담체 단백질(예컨대, CRM197)의 리신 잔기의 수(접합도)에 의한 것이다. 폴리사카라이드에 대한 공유 연결기에 의한 담체 단백질의 리신 변형에 대한 증거는 당업자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하는 아미노산 분석에 의해 수득될 수 있다. 접합은 접합체 물질을 생성하는 데 사용된 담체 단백질 출발 물질과 비교하여 회수된 리신 잔기의 수를 감소시킨다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 당접합체의 접합도는 2 내지 15, 2 내지 13, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 3 내지 15, 3 내지 13, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 5 내지 15, 5 내지 10, 8 내지 15, 8 내지 12, 10 내지 15 또는 10 내지 12이다. 한 양태에서, 본 발명의 당접합체의 접합도는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 당접합체의 접합도는 4 내지 7이다. 이러한 일부 양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
담체 단백질 상의 리신에 대한 사카라이드 쇄의 부착 빈도는 본 발명의 당접합체를 특성화하기 위한 다른 파라미터이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리사카라이드의 4개의 사카라이드 반복 단위마다 담체 단백질과 폴리사카라이드 사이의 하나 이상의 공유 연결기가 존재한다. 다른 양태에서, 담체 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유 연결기는 폴리사카라이드의 10개의 사카라이드 반복 단위마다 1회 이상 발생한다. 다른 양태에서, 담체 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유 결합은 폴리사카라이드의 15개의 사카라이드 반복 단위마다 1회 이상 발생한다. 추가 양태에서, 담체 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유 연결기는 폴리사카라이드의 25개의 사카라이드 반복 단위마다 1회 이상 발생한다.
O-아세틸화. 일부 양태에서, 본 발명의 사카라이드는 O-아세틸화된다. 일부 양태에서, 당접합체는 10 내지 100%, 20 내지 100%, 30 내지 100%, 40 내지 100%, 50 내지 100%, 60 내지 100%, 70 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 90 내지 100%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 70 내지 90% 또는 80 내지 90%의 O-아세틸화도를 갖는 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, O 아세틸화도는 ≥ 10%, ≥ 20%, ≥ 30%, ≥ 40%, ≥ 50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80%, ≥ 90% 또는 약 100%이다. O-아세틸화의 %는 100%를 기준으로 제공된 사카라이드의 백분율을 의미한다(이때, 각각의 반복 단위는 이의 아세틸화된 구조에 비해 완전히 아세틸화됨).
일부 양태에서, 당접합체는 환원적 아민화에 의해 제조된다. 일부 양태에서, 당접합체는 단일-말단 연결된 접합된 사카라이드이고, 이때 사카라이드는 담체 단백질에 직접 공유 결합된다. 일부 양태에서, 당접합체는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 공유 결합된다.
환원적 아민화. 한 양태에서, 사카라이드는 환원적 아민화에 의해 담체 단백질에 접합된다(예컨대, 미국 특허출원공보 제2006/0228380호, 제2007/0231340호, 제2007/0184071호 및 제2007/0184072호, 제WO 2006/110381호, 제WO 2008/079653호 및 제WO 2008/143709호).
환원적 아민화는 (1) 사카라이드의 산화, (2) 접합체를 형성하기 위한 활성화된 사카라이드 및 담체 단백질의 환원을 포함한다. 산화 전에, 사카라이드는 임의적으로 가수분해된다. 기계적 또는 화학적 가수분해가 사용될 수 있다. 화학적 가수분해는 아세트산을 사용하여 수행될 수 있다.
산화 단계는 퍼요오데이트와의 반응을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "퍼요오데이트"는 퍼요오데이트 및 퍼요오드산을 둘 다 지칭한다. 이러한 용어는 또한 퍼요오데이트(IO4 -) 및 오르토퍼요오데이트(IO6 5-) 및 퍼요오데이트의 다양한 염(예컨대, 나트륨 퍼요오데이트 및 칼륨 퍼요오데이트)을 둘 다 포함한다. 한 양태에서, 폴리사카라이드는 퍼요오데이트 메타퍼요오데이트의 존재 하에, 바람직하게는 나트륨 퍼요오데이트(NaIO4)의 존재 하에 산화된다. 다른 양태에서, 폴리사카라이드는 오르토퍼요오데이트의 존재 하에, 바람직하게는 퍼요오드산의 존재 하에 산화된다.
한 양태에서, 산화제는 1차 하이드록실을 선택적으로 산화하기 위한 산화제의 존재 하에 안정한 니트록실 또는 니트록사이드 라디칼 화합물, 예컨대 피페리딘-N-옥시 또는 피롤리딘-N-옥시 화합물이다. 상기 반응에서, 실제 산화제는 촉매 순환에서 N-옥소암모늄 염이다. 한 양상에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트록사이드 라디칼 화합물은 피페리딘-N-옥시 또는 피롤리딘-N-옥시 화합물이다. 한 양상에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트록사이드 라디칼 화합물은 TEMPO(2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시) 또는 PR옥실(2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시) 모이어티를 보유한다. 한 양상에서, 상기 안정한 니트록실 라디칼 화합물은 TEMPO 또는 이의 유도체이다. 한 양상에서, 상기 산화제는 N-할로 모이어티를 갖는 분자이다. 한 양상에서, 상기 산화제는 N-클로로석신이미드, N-브로모석신이미드, N-요오도석신이미드, 다이클로로이소시아누르산, 1,3,5-트라이클로로-1,3,5-트라이아지난-2,4,6-트라이온, 다이브로모이소시아누르산, 1,3,5-트라이브로모-1,3,5-트라이아지난-2,4,6-트라이온, 다이요오도이소시아누르산 및 1,3,5-트라이요오도-1,3,5-트라이아지난-2,4,6-트라이온 중 어느 하나로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 산화제는 N-클로로석신이미드이다.
사카라이드의 산화 단계 후에, 사카라이드는 활성화되는 것으로 언급되고, 이하 "활성화된" 것으로 지칭된다. 활성화된 사카라이드 및 담체 단백질은 독립적으로(이산 동결건조) 또는 함께(공동-동결건조) 동결건조될 수 있다. 한 양태에서, 활성화된 사카라이드 및 담체 단백질은 공동 동결건조된다. 다른 양태에서, 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질은 독립적으로 동결건조된다.
한 양태에서, 동결건조는 비환원 당의 존재 하에 일어나고, 가능한 비환원 당은 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨 및 팔라티닛을 포함한다.
접합 과정의 다음 단계는 환원제를 사용하여 활성화된 사카라이드와 담체 단백질을 환원시켜 접합체를 형성하는 것(소위 환원적 아민화)이다. 적합한 환원제는 시아노보로하이드라이드, 예컨대 브뢴스테드 또는 루이스산의 존재 하의 나트륨 시아노보로하이드라이드, 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드 또는 나트륨 또는 아연 보로하이드라이드), 아민 보란, 예를 들어 피리딘 보란, 2-피콜린 보란, 2,6-다이보란-메탄올, 다이메틸아민-보란, t-BuMe'PrN-BH3, 벤질아민-BH3 또는 5-에틸-2-메틸피리딘 보란(PEMB), 보란-피리딘 또는 보로하이드라이드 교환 수지를 포함한다. 한 양태에서, 환원제는 나트륨 시아노보로하이드라이드이다.
한 양태에서, 환원 반응은 수성 용매(예컨대, PBS, MES, HEPES, 비스-트리스, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, 비신 또는 HEPB, pH 6.0 내지 8.5, 7.0 내지 8.0, 또는 7.0 내지 7.5)에서 수행되고, 다른 양태에서 반응은 비양성자성 용매에서 수행된다. 한 양태에서, 환원 반응은 DMSO(다이메틸 설폭사이드) 또는 DMF(다이메틸 포름아미드) 용매에서 수행된다. DMSO 또는 DMF 용매는 동결건조된 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 재구성하는 데 사용될 수 있다.
환원 반응이 끝나면, 접합체에 미반응 알데하이드 기가 잔류할 수 있고, 적절한 캡핑제를 사용하여 캡핑할 수 있다. 한 양태에서, 이러한 캡핑제는 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4)이다. 접합(환원 반응 및 임의적인 캡핑) 후, 당접합체는 당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 정제될 수 있다(폴리사카라이드-단백질 접합체의 양이 풍부할 수 있음). 이러한 기술은 투석, 농축/정용여과 작업, 접선 유동 여과 침전/용리, 컬럼 크로마토그래피(DEAE 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피) 및 심층 여과를 포함한다. 당접합체는 정용여과 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 한 양태에서, 당접합체는 정용여과 또는 이온 교환 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된다. 한 양태에서, 당접합체는 멸균 여과된다.
바람직한 양태에서, 대장균 혈청형으로부터의 당접합체는 O25B, O1, O2 및 O6 중 어느 하나로부터 선택되고, 환원적 아민화에 의해 제조된다. 바람직한 양태에서, 대장균 혈청형 O25B, O1, O2 및 O6으로부터의 당접합체는 환원적 아민화에 의해 제조된다.
한 양상에서, 본 발명은 하기 구조식 O25B의 사카라이드에 연결된 담체 단백질, 예컨대 CRM197을 포함하는 접합체에 관한 것이다:
이때, n은 1 이상의 임의의 정수이다. 바람직한 양태에서, n은 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 이상 및 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 50 이하의 정수이다. 임의의 최소 값 및 임의의 최대 값이 조합되어 범위를 한정할 수 있다. 예시적인 범위는, 예를 들어 1 이상 내지 1,000 이하; 10 이상 내지 500 이하; 및 20 이상 내지 80 이하를 포함한다. 한 바람직한 양태에서, n은 31 이상 내지 90 이하, 더욱 바람직하게는 40 내지 90, 가장 바람직하게는 60 내지 85이다.
다른 양상에서, 본 발명은 표 1(또한 도 9a 내지 9c 및 도 10a 및 10b 참조)에 제시된 하기 구조 중 어느 하나를 갖는 사카라이드에 연결된 담체 단백질, 예컨대 CRM197을 포함하는 접합체에 관한 것이고, 이때 n은 1 이상의 정수이다.
이론 또는 기전에 얽매이려는 것은 아니지만, 일부 양태에서, 안정한 접합체는 항원의 중요한 면역원성 에피토프의 구조적 완전성을 보존하는 것에 대해 균형을 이루는 수준의 사카라이드 항원 변형을 필요로 하는 것으로 여겨진다.
알데하이드의 활성화 및 형성. 일부 양태에서, 본 발명의 사카라이드는 활성화되어 알데하이드를 형성한다. 사카라이드가 활성화되는 이러한 양태에서, 활성화의 백분율(%)(또는 산화도 (DO))은 활성화된 폴리사카라이드의 알데하이드 1몰 당 사카라이드 반복 단위의 몰을 지칭한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 사카라이드는 폴리사카라이드의 반복 단위 상에서 인접 다이올의 퍼요오데이트 산화에 의해 활성화되어 알데하이드를 형성한다. 사카라이드 반복 단위를 기준으로 하는 나트륨 퍼요오데이트의 몰 당량(meq) 및 산화 중의 온도의 변화는 산화도(DO)의 수준을 변화시킨다.
사카라이드 및 알데하이드 농도는 전형적으로 비색 검정에 의해 측정된다. 대체 시약은 TEMPO(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 1-옥실 라디칼)-N-클로로석신이미드(NCS) 조합이고, 1차 알코올 기로부터 알데하이드를 형성한다.
일부 양태에서, 활성화된 사카라이드는, 활성화된 사카라이드의 알데하이드 1몰 당 사카라이드 반복 단위의 몰이 1 내지 100, 예를 들어 2 내지 80, 2 내지 50, 3 내지 30, 4 내지 25인 산화도를 갖는다. 활성화도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ≥ 20, ≥ 30, ≥ 40, ≥ 50, ≥ 60, ≥ 70, ≥ 80, ≥ 90 또는 약 100이다. 바람직하게는, 산화도(DO)는 5 이상 내지 50 이하, 더욱 바람직하게는 10 이상 내지 25 이하이다. 한 양태에서, 활성화도는 10 이상 내지 25 이하이다. 임의의 최소 값 및 임의의 최대 값이 조합되어 범위를 한정할 수 있다. 산화도 값은 활성화의 백분율(%)로 표시될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 10의 DO 값은 활성화된 사카라이드의 총 10개의 사카라이드 반복 단위 중 하나의 활성화된 사카라이드 반복 단위를 지칭하고, 이러한 경우에 10의 DO 값은 10% 활성화로서 표시될 수 있다.
일부 양태에서, 환원적 아민화 화학에 의해 제조된 접합체는 담체 단백질 및 사카라이드를 포함하고, 이때 사카라이드는 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 62D1, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 포함한다. 일부 양태에서, 접합체의 사카라이드는 n이 1 내지 1,000, 5 내지 1,000, 바람직하게는 31 내지 100, 더욱 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65의 정수인 구조식을 포함한다.
단일-말단 연결된 접합체. 일부 양태에서, 접합체는 단일-말단 연결된 접합된 사카라이드이고, 이때 사카라이드는 사카라이드의 한 말단에서 담체 단백질에 공유 결합된다. 일부 양태에서, 단일-말단 연결된 접합된 폴리사카라이드는 말단 사카라이드를 갖는다. 예를 들어, 폴리사카라이드의 말단(말단 사카라이드 잔기) 중 하나가 담체 단백질에 공유 결합된 경우, 접합체는 단일-말단 연결된다. 일부 양태에서, 폴리사카라이드의 말단 사카라이드 잔기가 링커를 통해 담체 단백질에 공유 결합되는 경우 접합체는 단일-말단 연결된다. 이러한 링커는, 예를 들어 시스타민 링커(A1), 3,3'-다이티오 비스(프로판산 다이하이드라자이드) 링커(A4) 및 2,2'-다이티오-N,N'-비스(에탄-2,1-다이일)비스(2-(아미노옥시)아세트아미드) 링커(A6)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 사카라이드는 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산(KDO) 잔기를 통해 담체 단백질에 접합되어 단일-말단 연결된 접합체를 형성한다. 예를 들어, 실시예 18, 실시예 19, 실시예 20 및 도 24를 참고한다.
일부 양태에서, 접합체는 바람직하게는 생체접합체가 아니다. 용어 "생체접합체"는 단백질(예컨대, 담체 단백질)과 항원, 예를 들어 숙주 세포 배경에서 제조된 O-항원(예컨대, O25B) 사이의 접합체를 의미하고, 이때 숙주 세포 기구는 항원을 단백질에 연결한다(예컨대, N-링크). 당접합체는 숙주 세포에서 접합체를 제조 할 필요가 없는 수단, 예를 들어 단백질 및 사카라이드의 화학적 결합에 의한 접합을 필요로 하지 않는 수단에 의해 제조된 당 항원(예컨대, 올리고- 및 폴리사카라이드)-단백질 접합체뿐만 아니라 생체접합체를 포함한다.
티올 활성화된 사카라이드. 일부 양태에서, 본 발명의 사카라이드는 티올 활성화된다. 사카라이드가 티올 활성화된 이러한 양태에서, 활성화의 백분율(%)은 활성화된 폴리사카라이드의 사카라이드 반복 단위 당 티올의 몰을 지칭한다. 사카라이드와 티올 농도는 전형적으로 설프하이드릴의 정량에 대한 엘만(Ellman)의 검정에 의해 결정된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 사카라이드는 다이설파이드 아민 링커에 의한 2-케토-3-데옥시옥탄산(KDO)의 활성화를 포함한다. 예를 들어, 실시예 18 및 도 24를 참고한다. 일부 양태에서, 사카라이드는 2가의 이종 이작용성 링커(본원에서 "스페이서"로도 지칭됨)를 통해 담체 단백질에 공유 결합된다. 링커는 바람직하게는 사카라이드와 담체 단백질 사이에 티오에터 결합을 제공하여 본원에서 "티오에터 당접합체"로 지칭되는 당접합체를 생성한다. 일부 양태에서, 링커는, 예를 들어 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC)와 같은 카바메이트 및 아미드 결합을 추가로 제공한다. 예를 들어, 실시예 13을 참고한다.
일부 양태에서, 단일-말단 연결된 접합체는 담체 단백질 및 사카라이드를 포함하고, 이때 사카라이드는 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 62D1, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 포함한다. 일부 양태에서, 접합체의 사카라이드는 n이 1 내지 1,000, 5 내지 1,000, 바람직하게는 31 내지 100, 더욱 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65의 정수인 구조식을 포함한다.
예를 들어, 한 양태에서, 단일-말단 연결된 접합체는 담체 단백질, 및 구조식 O8, 구조식 O9a, 구조식 O9, 구조식 O20ab, 구조식 O20ac, 구조식 O52, 구조식 O97 및 구조식 O101(이때, n은 1 내지 10의 정수임)로부터 선택되는 구조를 갖는 사카라이드를 포함한다.
eTEC 접합체
한 양상에서, 본 발명은 일반적으로 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 공유 접합된 상기 기술된 대장균 유래의 사카라이드를 포함하는 당접합체[예를 들어, 미국 특허공보 제9,517,274호 및 국제 특허출원공보 제WO 2014/027302호(이들의 전문은 본원에 참조로 혼입됨)에 기술됨], 이러한 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물 및 이러한 당접합체 및 면역원성 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 상기 당접합체는 하나 이상의 eTEC 스페이서를 통해 담체 단백질에 공유 접합된 사카라이드를 포함하고, 이때 사카라이드는 카바메이트 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 접합되고, 이때 담체 단백질은 아미드 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 접합된다. eTEC 스페이서는 7개의 선형 원자(즉, -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-)를 포함하고, 사카라이드와 담체 단백질 사이에 안정적인 티오에터 및 아미드 결합을 제공한다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체는 화학식 I로 표시될 수 있다:
[화학식 I]
상기 식에서,
eTEC 스페이서를 구성하는 원자는 중앙 상자에 함유된다.
본 발명의 상기 당접합체에서, 사카라이드는 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드일 수 있다.
본 발명의 당접합체에 통합된 담체 단백질은 본원에 추가로 기술되거나 당업자에게 공지된 일반적으로 이러한 목적에 적합한 담체 단백질의 군으로부터 선택된다. 특정 양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
다른 양상에서, 본 발명은 a) 유기 용매에서 사카라이드를 탄산 유도체와 반응시켜 활성화된 사카라이드를 생성하는 단계; b) 활성화된 사카라이드를 시스타민 또는 시스테아민 또는 이의 염과 반응시켜 티올화된 사카라이드를 생성하는 단계; c) 티올화된 사카라이드를 환원제와 반응시켜 하나 이상의 유리 설프하이드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화된 사카라이드를 생성하는 단계; d) 활성화된 티올화된 사카라이드를 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화된 담체 단백질과 반응시켜 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 생성하는 단계; 및 e) 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 (i) 활성화된 담체 단백질의 비접합된 α-할로아세트아미드 기를 캡핑할 수 있는 제1 캡핑 시약, 및/또는 (ii) 활성화된 티올화된 사카라이드의 비접합된 유리 설프하이드릴 잔기를 캡핑할 수 있는 제2 캡핑 시약과 반응시켜 eTEC 연결된 당접합체가 생성하는 단계를 포함하는, eTEC 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 본원에 기술된 사카라이드를 포함하는 당접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
빈번한 양태에서, 탄산 유도체는 1,1'-카보닐-다이-(1,2,4-트라이아졸)(CDT) 또는 1,1'-카보닐다이이미다졸(CDI)이다. 바람직하게는, 탄산 유도체는 CDT이고, 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 극성 비양성자성 용매이다. 바람직한 양태에서, 티올화된 사카라이드는 활성화된 사카라이드와 이작용성 대칭 티오알킬아민 시약, 시스타민 또는 이의 염의 반응에 의해 생성된다. 다르게는, 티올화된 사카라이드는 활성화된 사카라이드와 시스테아민 또는 이의 염의 반응에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 eTEC 연결된 당접합체는 화학식 I로 표시될 수 있다.
빈번한 양태에서, 제1 캡핑 시약은 N-아세틸-L-시스테인이고, 이는 담체 단백질의 리신 잔기 상의 비접합된 α- 할로아세트아미드 기와 반응하여, 티오에터 연결기를 통해 활성화된 리신 잔기에 공유 연결된 S-카복시메틸시스테인(CMC) 잔기를 형성한다.
다른 양태에서, 제2 캡핑 시약은 요오도아세트아미드(IAA)이고, 이는 활성화된 티올화된 사카라이드의 비접합된 유리 설프하이드릴 기와 반응하여 캡핑된 티오아세트아미드를 제공한다. 빈번하게, 단계 e)는 제1 캡핑 시약 및 제2 캡핑 시약 둘 다로 캡핑하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 단계 e)는 제1 캡핑 시약으로서 N-아세틸-L-시스테인 및 제2 캡핑 시약으로서 IAA로 캡핑하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 캡핑 단계 e)는 제1 및/또는 제2 캡핑 시약과의 반응 후에 환원제, 예를 들어 DTT, TCEP 또는 머캅토에탄올과의 반응을 추가로 포함한다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체 및 면역원성 조성물은 유리 설프하이드릴 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법에 의해 형성된 활성화된 티올화된 사카라이드는 다수의 유리 설프하이드릴 잔기를 포함할 것이고, 이들 중 일부는 접합 단계 동안 담체 단백질로의 공유 접합을 겪지 않을 수 있다. 이러한 잔류하는 유리 설프하이드릴 잔기는 아티올-반응성 캡핑 시약, 예를 들어 요오도아세트아미드(IAA)와의 반응에 의해 캡핑되어 잠재적으로 반응성인 작용기를 캡핑한다. 다른 티올-반응성 캡핑 시약, 예를 들어 말레이미드 함유 시약 등도 고려된다.
또한, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체 및 면역원성 조성물은 잔류 비접합된 담체 단백질을 포함할 수 있고, 이는 캡핑 공정 단계 동안 변형된 활성화된 담체 단백질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 단계 d)는 활성화된 티올화된 사카라이드를 활성화된 담체 단백질과 반응시키기 전에 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화된 담체 단백질을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 빈번한 양태에서, 활성화된 담체 단백질은 하나 이상의 α-브로모아세트아미드 기를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 생성된 eTEC 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 본원에 기술된 사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 제공한다.
일부 양태에서, 담체 단백질은 CRM197이고, CRM197과 폴리사카라이드 사이의 eTEC 스페이서를 통한 공유 연결기는 폴리사카라이드의 4, 10, 15 또는 25개의 사카라이드 반복 단위마다 1회 이상 발생한다.
본 발명의 각각의 양상에 대해, 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 본원에 기술된 사카라이드, 예컨대 대장균으로부터 유래된 사카라이드를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 면역학적 효과량의 본 발명의 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상의 세균 감염, 질병 또는 병태를 예방하거나, 치료하거나 개선하는 방법을 제공하고, 이때 상기 면역원성 조성물은 본원에 기술된 사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다. 일부 양태에서, 사카라이드는 대장균으로부터 유래된다.
일부 양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 담체 단백질 및 사카라이드를 포함하고, 이때 상기 사카라이드는 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 62D1, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187로부터 선택되는 하나 이상의 구조를 포함한다. 일부 양태에서, 접합체의 사카라이드는 n이 1 내지 1,000, 5 내지 1,000, 바람직하게는 31 내지 100, 더욱 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65인 구조식을 포함한다.
사카라이드에 접합되는 담체 단백질의 리신 잔기의 수는 접합된 리신의 범위로 특성화될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물의 일부 양태에서, CRM197은 사카라이드에 공유 연결된 39개 중 4 내지 16개의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 파라미터를 표현하는 다른 방식은 CRM197 리신의 약 10 내지 약 41%가 사카라이드에 공유 연결된다는 것이다. 다른 양태에서, CRM197은 사카라이드에 공유 연결된 39개 중 2 내지 20개의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 파라미터를 표현하는 다른 방식은 CRM197 리신의 약 5 내지 약 50%가 사카라이드에 공유 결합되는 것이다.
빈번한 양태에서, 담체 단백질은 CRM197이고, CRM197과 폴리사카라이드 사이의 eTEC 스페이서를 통한 공유 연결기는 폴리사카라이드의 4, 10, 15 또는 25개의 사카라이드 반복 단위마다 1회 이상 발생한다.
다른 양태에서, 접합체는 5 내지 10개의 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 7개의 사카라이드 반복 단위마다; 3 내지 8개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 9개의 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 11개의 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 12개의 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 13개의 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 14개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 15개의 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 6개의 사카라이드 반복 단위마다; 3 내지 7개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 8개의 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 10개의 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 11개의 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 12개의 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 13개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 14개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 20개의 사카라이드 반복 단위마다; 또는 4 내지 25개의 사카라이드 반복 단위마다 담체 단백질과 사카라이드 사이에 하나 이상의 공유 연결기를 포함한다.
다른 양태에서, 담체 단백질과 사카라이드 사이의 하나 이상의 연결기는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 폴리사카라이드 반복 단위마다 발생한다.
담체 단백질
본 발명의 당접합체의 성분은 사카라이드가 접합된 담체 단백질이다. 용어 "단백질 담체" 또는 "담체 단백질" 또는 "담체"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 담체 단백질은 표준 접합 과정으로 수정가능하여야 한다.
접합체의 한 성분은 O-폴리사카라이드가 접합된 담체 단백질이다. 한 양태에서, 접합체는 O-폴리사카라이드의 코어 올리고사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함한다(도 17 참조). 한 양태에서, 접합체는 O-폴리사카라이드의 O-항원에 접합된 담체 단백질을 포함한다.
용어 "단백질 담체" 또는 "담체 단백질" 또는 "담체"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 담체 단백질은 표준 접합 과정으로 수정가능하여야 한다.
바람직한 양태에서, 접합체의 담체 단백질은 TT, DT, DT 돌연변이체(예컨대, CRM197), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 단백질 D, PhtX, PhtD, PhtDE 융합(특히, 국제 특허출원공보 제WO 01/98334호 및 제WO 03/54007호에 기술된 것), 해독된 뉴모리신, PorB, N19 단백질, PspA, OMPC, 클로스트리티움 디피실레(Clostridium Difficile) 및 PsaA의 독소 A 또는 B 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된다. 한 양태에서, 본 발명의 접합체의 담체 단백질은 DT(디프테리아 톡소이드)이다. 다른 양태에서, 본 발명의 접합체의 담체 단백질은 TT(파상풍 톡소이드)이다. 다른 양태에서, 본 발명의 접합체의 담체 단백질은 PD(헤모필루스 인플루엔자 단백질 D, 예컨대 제EP 0 594 610 B호 참조)이다.
바람직한 양태에서, 사카라이드는 CRM197 단백질에 접합된다. CRM197 단백질은 디프테리아 독소의 비독성 형태이지만, 면역학적으로 디프테리아 독소와 구별할 수 없다. CRM197은 독소생성 코리네파지 베타의 니트로소구아니딘 돌연변이유발에 의해 생성된 비-독소생성 파지 β197tox-에 감염된 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae)에 의해 생성된다. CRM197 단백질은 디프테리아 독소와 동일한 분자량을 갖지만, 구조 유전자에서 단일 염기 변화(구아닌에서 아데닌으로)가 다르다. 이러한 단일 염기 변화는 성숙한 단백질에서 아미노산 치환(글리신 대신 글루탐산)을 유발하고 디프테리아 독소의 독성 특성을 제거한다. CRM197 단백질은 사카라이드에 대한 안전하고 효과적인 T 세포 의존성 담체이다.
따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 접합체는 담체 단백질로서 CRM197을 포함하고, 이때 사카라이드는 CRM197에 공유 연결된다.
바람직한 양태에서, 당접합체의 담체 단백질은 DT(디프테리아 독소), TT(파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편 C, CRM197(디프테리아 독소의 비독성이지만 항원적으로 동일한 변이체), 기타 DT 돌연변이체(예컨대, CRM176, CRM228, CRM45(문헌[Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973]), CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 또는 CRM107; 및 문헌[Nicholls and Youle, Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기술된 기타 돌연변이; Glu-148의 Asp, Gln 또는 Ser에 대한 결실 또는 돌연변이 및/또는 Ala 158에서 Gly에 대한 결실 또는 돌연변이로의 결실 또는 돌연변이 및 제US 4,709,017호 또는 제US 4,950,740호에 개시된 기타 돌연변이; 하나 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 제US 5,917,017호 또는 제US 6,455,673호에 개시된 기타 돌연변이; 또는 제US 5,843,711호에 개시된 단편), 폐렴쌍구균 뉴모리신(문헌[Kuo et al (1995) Infect lmmun 63; 2706-13]), 일부 양식으로 해독된 ply, 예를 들어 dPLY-GMBS(제WO 04/081515호, PCT/EP2005/010258) 또는 dPLY-포르몰, PhtX, 예컨대 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE(PhtA, PhtB, PhtD 또는 PhtE의 서열은 제WO 00/37105호 또는 제WO 00/39299호에 개시됨) 및 Pht 단백질의 융합, 예를 들어 PhtDE 융합, PhtBE 융합, Pht A-E(제WO 01/98334호, 제WO 03/54007호, 제WO 2009/000826호), OMPC(수막염균(Neisseria meningitidis) 외막 단백질, 통상적으로 수막염균 혈청군 B에서 추출됨, 제EP 0 372 501), PorB(수막염균에서 수출됨), PD (해모필루스 인플루엔자 단백질 D, 예컨대 제EP 0 594 610 B호 참조), 또는 이의 면역학적 기능적 등가물, 합성 펩티드(제EP 0 378 881호, 제EP 0 427 347호), 열 충격 단백질(제WO 93/17712호, 제WO 94/03208호), 백일해 단백질(제WO 98/58668호, 제EP 0 471 177호), 사이토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬(제WO 91/01146호), 다양한 병원체 유래 항원으로부터의 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질(문헌[Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824]), 예컨대 N19 단백질(문헌[Baraldoi et al (2004) Infect lmmun 72; 4884-7]), 폐렴쌍구균 표면 단백질 PspA(제WO 02/091998호), 철 흡수 단백질(제WO 01/72337호), 클로스트리티움 디피실레의 독소 A 또는 B(제WO 00/6176호), 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴쌍구균 부착 단백질(PsaA), 재조합 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A(특히 이의 비독성 돌연변이체(예컨대, 글루탐산 553에서 치환을 갖는 외독소 A)(문헌[Uchida Cameron DM, RJ Collier. 1987. J. Bacteriol. 169:4967-4971])로 이루어진 군으로부터 선택된다. 오발부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 투버쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD)도 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 다른 적합한 담체 단백질은 불활성화된 세균 독소, 예컨대 콜레라 톡소이드(예컨대, 국제 특허출원공보 제WO 2004/083251호에 기술됨), 대장균 LT, 대장균 ST 및 녹농균로부터의 외독소 A를 포함한다.
일부 양태에서, 담체 단백질은, 예를 들어 CRM197, 디프테리아 독소 단편 B(DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드(DT), 파상풍 톡소이드(TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 또는 녹농균의 외독소 A; 녹농균의 해독된 외독소 A(EPA), 말토스 결합 단백질(MBP), 플라겔린, 황색 포도상구균의 해독된 헤모리신 A, 응집 인자 A, 응집 인자 B, 콜레라 독소 B 아단위(CTB), 폐렴쌍구균 뉴모리신 및 이의 해독된 변이체, 캄필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) AcrA 및 캄필로박터 제주니 천연 당단백질 중 어느 하나로부터 선택된다. 한 양태에서, 담체 단백질은 해독된 슈도모나스 외독소(EPA)이다. 다른 양태에서, 담체 단백질은 해독된 슈도모나스 외독소(EPA)가 아니다. 한 양태에서, 담체 단백질은 플라겔린이다. 다른 양태에서, 담체 단백질은 플라겔린이 아니다.
바람직한 양태에서, 당접합체의 담체 단백질은 TT, DT, DT 돌연변이체(예컨대, CRM197), 해모필루스 인플루엔자 단백질 D, PhtX, PhtD, PhtDE 융합체(특히, 제WO 01/98334호 및 제WO 03/54007호에 기술된 것), 해독된 뉴모리신, PorB, N19 단백질, PspA, OMPC, 클로스트리티움 디피실레 및 PsaA의 독소 A 또는 B로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 한 양태에서, 본 발명의 당접합체의 담체 단백질은 DT(디프테리아 톡소이드)이다. 다른 양태에서, 본 발명의 당접합체의 담체 단백질은 TT(파상풍 톡소이드)이다. 다른 양태에서, 본 발명의 당접합체의 담체 단백질은 PD(헤모필루스 인플루엔자 단백질 D, 예컨대 제EP 0 594 610 B호 참조)이다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 캡슐 사카라이드는 CRM197 단백질에 접합된다. CRM197 단백질은 비독성 형태의 디프테리아 독소이지만, 면역학적으로 디프테리아 독소와 구별할 수 없다. CRM197은 독소생성 코리네파지 베타의 니트로소구아니딘 돌연변이유발에 의해 생성된 비독소생성 파지 β197tox-에 의해 감염된 코리네박테리움 디프테리아에에 의해 생성된다(문헌[Uchida, T. et al. 1971, Nature New Biology 233:8-11]). CRM197 단백질은 디프테리아 독소와 동일한 분자량을 갖지만 구조 유전자에서 단일 염기 변화(구아닌에서 아데닌으로)가 다르다. 이러한 단일 염기 변화는 성숙한 단백질에서 아미노산 치환(글리신 대신 글루탐산)을 유발하고, 디프테리아 독소의 독성 특성을 제거한다. CRM197 단백질은 사카라이드에 대한 안전하고 효과적인 T 세포 의존성 담체이다. CRM197 및 이의 생산에 대한 자세한 내용은, 예를 들어 제US 5,614,382호에서 찾을 수 있다.
따라서, 빈번한 양태에서, 본 발명의 당접합체는 담체 단백질로서 CRM197을 포함하고, 이때 캡슐 폴리사카라이드는 CRM197에 공유 연결된다.
조성물 및 백신
본 발명자들은 추가로 상기 기술된 하나 이상의 사카라이드를 포함하는 조성물 및 상기 기술된 하나 이상의 접합체를 포함하는 조성물을 발견한다. 바람직한 양태에서, 조성물은 면역원성 조성물이다. 다른 양태에서, 조성물은 백신이다.
한 양상에서, 면역원성 조성물은 본원에 개시된 임의의 사카라이드를 포함한다. 바람직한 양상에서, 면역원성 조성물은 본원에 개시된 접합체 중 어느 하나를 포함한다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 대장균 혈청형 O25, 바람직하게는 혈청형 O25b로부터의 하나 이상의 당접합체를 포함한다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 대장균 혈청형 O1, 바람직하게는 혈청형 O1a로부터의 하나 이상의 당접합체를 포함한다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 대장균 혈청형 O2로부터의 하나 이상의 당접합체를 포함한다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 대장균 혈청형 O6으로부터의 하나 이상의 당접합체를 포함한다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 하기 대장균 혈청형 O25, O1, O2 및 O6, 바람직하게는 O25b, O1a, O2 및 O6 중 어느 하나로부터 선택되는 하나 이상의 당접합체를 포함한다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 하기 대장균 혈청형 O25, O1, O2 및 O6, 바람직하게는 O25b, O1a, O2 및 O6 중 어느 하나로부터 선택되는 2개 이상의 당접합체를 포함한다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 하기 대장균 혈청형 O25, O1, O2 및 O6, 바람직하게는 O25b, O1a, O2 및 O6 중 어느 하나로부터 선택되는 3개 이상의 당접합체를 포함한다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 하기 대장균 혈청형 O25, O1, O2 및 O6, 바람직하게는 O25b, O1a, O2 및 O6 각각으로부터의 당접합체를 포함한다.
바람직한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 당접합체는 CRM197에 개별적으로 접합된다.
따라서, 조성물은 하나 이상의 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 바람직한 양태에서, 조성물은 1개 초과의 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 2개의 상이한 대장균 혈청형(또는 "v", 원자가)에서 12개의 상이한 혈청형(12v)까지의 O-항원을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 3개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 4개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 5개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 6개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 7개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 8개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 9개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 10개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 11개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다.
바람직하게는, 대장균 사카라이드의 수는 1개의 혈청형(또는 "v", 원자가)에서 26개의 상이한 혈청형(26v)까지의 범위일 수 있다. 한 양태에서, 하나의 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 2개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 3개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 4개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 5개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 6개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 7개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 8개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 9개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 10개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 11개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 12개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 13개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 14개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 15개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 16개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 17개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 18개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 19개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 20개의 다른 혈청이 존재한다. 한 양태에서, 21개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 22개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 23개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 24개의 상이한 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 25개의 다른 혈청형이 존재한다. 한 양태에서, 26개의 상이한 혈청형이 존재한다. 사카라이드는 담체 단백질에 접합되어 본원에 기술된 당접합체를 형성한다.
한 양상에서, 조성물은 하나 이상의 대장균 혈청군으로부터의 O-항원을 포함하는 당접합체를 포함하고, 이때 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 1개 초과의 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 3개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 4개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 5개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 6개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 7개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 8개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 9개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 10개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 11개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 이때 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다.
다른 양상에서, 조성물은 하나 이상의 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 조성물은 1개 초과의 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 2개의 상이한 대장균 혈청형으로부터 12개의 상이한 대장균 혈청형까지의 O-폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 3개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 4개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 5개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 6개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 7개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 8개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 9개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 10개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 11개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 19개의 상이한 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다.
바람직한 양태에서, 조성물은 하나 이상의 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 바람직한 양태에서, 조성물은 1개 초과의 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 예를 들어, 조성물은 2개의 상이한 대장균 혈청형으로부터 12개의 상이한 대장균 혈청형까지의 O-폴리사카라이드를 포함할 수 있고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 3개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 4개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 5개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 6개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 7개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 8개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 9개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 10개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 11개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 양태에서, 조성물은 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다.
가장 바람직한 양태에서, 조성물은 하나 이상의 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 조성물은 1개 초과의 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 2개의 상이한 대장균 혈청형에서 12개의 상이한 대장균 혈청형까지의 O-폴리사카라이드를 포함할 수 있고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 핵심 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 3개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 4개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 5개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 6개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 7개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 8개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 9개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 10개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 11개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 이때 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
다른 바람직한 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O25a(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O25b(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O1a(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O2(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O6(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다.
다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O17(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O15(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O18A(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O75(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O4(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O16(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O13(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O7(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다.
다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 구조식 O8(이때, n은 40 이상임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 구조식 O8을 포함하고, 이때 n은 1 내지 20, 바람직하게는 2 내지 5, 더욱 바람직하게는 3이다. 구조식 O8은, 예를 들어 도 10b에 도시된다. 다른 양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 이때 O-폴리사카라이드는 n이 40 이상인 구조식 O9 및 코어 사카라이드를 포함한다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 구조식 O9를 포함하고, 이때 n은 1 내지 20, 바람직하게는 4 내지 8, 더욱 바람직하게는 5이다. 구조식 O9는, 예컨대 도 10b에 도시된다. 다른 양태에서, O-폴리사카라이드는 구조식 O9a를 포함하고, 이때 n은 1 내지 20, 바람직하게는 4 내지 8, 더욱 바람직하게는 5이다. 구조식 O9a는, 예컨대 도 10b에 도시된다.
일부 양태에서, O-폴리사카라이드는 구조식 O20ab, 구조식 O20ac, 구조식 O52, 구조식 O97 및 구조식 O101 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 포함하고, 이때 n은 1 내지 20, 바람직하게는 4 내지 8, 더욱 바람직하게는 5이다. 예컨대, 도 10b를 참고한다.
전술한 바와 같이, 조성물은 접합된 O-폴리사카라이드(항원)의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 양태에서, 조성물은 구조식 O25b를 포함하는 폴리사카라이드, 구조식 O1A를 포함하는 폴리사카라이드, 구조식 O2를 포함하는 폴리사카라이드, 및 구조식 O6을 포함하는 폴리사카라이드를 포함한다. 더욱 구체적으로, 이러한 조성물은 (i) CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드[이때, O-폴리사카라이드는 구조식 O25b(이때, n은 40 이상임), 및 코어 사카라이드를 포함함]; (ii) CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드[이때, O-폴리사카라이드는 구조식 O1a(이때, n은 40 이상임), 및 코어 사카라이드를 포함함]; (iii) CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드[이때, O-폴리사카라이드는 구조식 O2(이때, n은 40 이상임), 및 코어 사카라이드를 포함함]; 및 (iv) CCRM197에 접합된 O-폴리사카라이드[이때, O-폴리사카라이드는 구조식 O6(이때, n은 40 이상임), 및 코어 사카라이드를 포함함]를 포함한다.
한 양태에서, 조성물은 임의의 대장균 혈청형으로부터 유래된 하나 이상의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 혈청형은 O25a가 아니다. 예를 들어, 한 양태에서, 조성물은 구조식 O25a를 포함하는 사카라이드를 포함하지 않는다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 구조식 O25b를 포함하는 O-폴리사카라이드, 구조식 O1A를 포함하는 O-폴리사카라이드, 구조식 O2를 포함하는 O-폴리사카라이드 및 구조식 O6을 포함하는 O-폴리사카라이드를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 조성물은 2개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 3개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 4개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 5개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 6개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 7개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 8개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 9개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 10개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 11개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 이때 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 구조식 O25b를 포함하고, 이때 n은 15 ± 2이다. 한 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 구조식 O25b를 포함하고, n은 17 ± 2이다. 한 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 구조식 O25b를 포함하고, n은 55 ± 2이다. 다른 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 구조식 O25b를 포함하고, n은 51 ± 2이다. 한 양태에서, 사카라이드는 대장균 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 사카라이드는 대장균 K12 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 양태에서, 접합체는 단일-말단 연결된 접합에 의해 제조된다. 한 양태에서, 접합체는 바람직하게는 DMSO 완충액에서 환원적 아민화 화학에 의해 제조된다. 한 양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 약학적으로 허용되는 희석제를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 ELISA 검정에 의해 측정된 0.2 pg/mL, 0.3 pg/mL, 0.35 pg/mL, 0.4 pg/mL 또는 0.5 pg/mL 이상의 농도에서 대장균 혈청형 O25B 폴리사카라이드에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물과 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성의 비교를 수행하고, 반응자의 잠재적 증가를 평가하기 위해 혈청형 O25B에 대한 반응에 대해 비교할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성(opsonophagocytic) 검정에 의해 측정된 바와 같이 대장균 혈청형 O25B를 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 기능성 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성 검정에 의해 측정된 바와 같이 대장균 혈청형 O25B를 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O25B에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 50% 이상에서 대장균 혈청형 O25B에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상에서 대장균 혈청형 O25B에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O25B에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O25B에 대한 인간 대상의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
한 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 n이 39 ± 2인 구조식 O1a를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 n이 13 ± 2인 구조식 O1a를 포함한다. 한 양태에서, 사카라이드는 대장균 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 양태에서, 접합체는 단일-말단 연결된 접합에 의해 제조된다. 한 양태에서, 접합체는 바람직하게는 DMSO 완충액에서 환원적 아민화 화학에 의해 제조된다. 한 양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 약학적으로 허용되는 희석제를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 ELISA 검정에 의해 측정된 0.2 pg/mL, 0.3 pg/mL, 0.35 pg/mL, 0.4 pg/mL 또는 0.5 pg/mL 이상의 농도에서 대장균 혈청형 O1A 폴리사카라이드에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물과 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성의 비교를 수행하고, 반응자의 잠재적 증가를 평가하기 위해 혈청형 O1A에 대한 반응에 대해 비교할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성 검정에 의해 측정된 바와 같이 대장균 혈청형 O1A를 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 기능성 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성 검정에 의해 측정된 바와 같이 대장균 혈청형 O1A를 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O1A에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 50% 이상에서 대장균 혈청형 O1A에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상에서 대장균 혈청형 O1A에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O1A에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 유의하게 증가시킨다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O1A에 대한 인간 대상의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
한 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 n이 43 ± 2인 구조식 O2를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 n이 47 ± 2인 구조식 O2를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 n이 17 ± 2인 구조식 O2를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 구조식 O2를 포함하고, n은 18 ± 2이다. 한 양태에서, 사카라이드는 대장균 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 사카라이드는 대장균 R4 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 양태에서, 접합체는 단일-말단 연결된 접합에 의해 제조된다. 한 양태에서, 접합체는 바람직하게는 DMSO 완충액에서 환원적 아민화 화학에 의해 제조된다. 한 양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 약학적으로 허용되는 희석제를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 ELISA 검정에 의해 측정된 0.2 pg/mL, 0.3 pg/mL, 0.35 pg/mL, 0.4 pg/mL 또는 0.5 pg/mL 이상의 농도에서 대장균 혈청형 O2 폴리사카라이드에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물과 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성의 비교를 수행하고, 반응자의 잠재적 증가를 평가하기 위해 혈청형 O2에 대한 반응에 대해 비교할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성 검정에 의해 측정된 바와 같이 대장균 혈청형 O2를 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 기능성 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성 검정에 의해 측정된 바와 같이 대장균 혈청형 O2를 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O2에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 50% 이상에서 대장균 혈청형 O2에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상에서 대장균 혈청형 O2에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O2에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 유의하게 증가시킨다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O2에 대한 인간 대상의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
한 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 n이 42 ± 2인 구조식 O6을 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 n이 50 ± 2인 구조식 O6을 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 n이 17 ± 2인 구조식 O6을 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 사카라이드는 n이 18 ± 2인 구조식 O6을 포함한다. 한 양태에서, 사카라이드는 대장균 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 양태에서, 접합체는 단일-말단 연결된 접합에 의해 제조된다. 한 양태에서, 접합체는 바람직하게는 DMSO 완충액에서 환원적 아민화 화학에 의해 제조된다. 한 양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 약학적으로 허용되는 희석제를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 ELISA 검정에 의해 측정된 0.2 pg/mL, 0.3 pg/mL, 0.35 pg/mL, 0.4 pg/mL 또는 0.5 pg/mL 이상의 농도에서 대장균 혈청형 O6 폴리사카라이드에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물과 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성의 비교를 수행하고, 반응자의 잠재적 증가를 평가하기 위해 혈청형 O6에 대한 반응에 대해 비교할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성 검정에 의해 측정된 바와 같이 대장균 혈청형 O6을 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 기능성 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성 검정에 의해 측정된 바와 같이 대장균 혈청형 O6을 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O6에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 50% 이상에서 대장균 혈청형 O6에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상에서 대장균 혈청형 O6에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O6에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 유의하게 증가시킨다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O6에 대한 인간 대상의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
한 양상에서, 조성물은 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하고, 이때 사카라이드는 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 62D1, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187(이때, n은 1 내지 10의 정수임)로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 포함한다. 한 양태에서, 사카라이드는 대장균 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 사카라이드는 대장균 R2 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 사카라이드는 대장균 R3 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 사카라이드는 대장균 R4 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 사카라이드는 대장균 K12 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 양태에서, 접합체는 단일-말단 연결된 접합에 의해 제조된다. 한 양태에서, 접합체는 환원적 아민화 화학에 의해, 바람직하게는 DMSO 완충액에서 제조된다. 한 양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 약학적으로 허용되는 희석제를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29개 이상의 추가적인 접합체 내지 30개 이하의 추가적인 접합체를 추가로 포함하고, 각각의 접합체는 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하고, 상기 사카라이드는 상기 구조식들로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 포함한다.
조성물의 용량
각각의 투약량에서 당접합체의 양은 전형적인 백신에서 중대한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로 선택된다. 이러한 양은 사용되는 특정 면역원과 이것이 제시되는 방법에 따라 달라질 것이다.
면역원성 조성물에서 특정 당접합체의 양은 이러한 접합체(접합된 및 비접합된)에 대한 총 폴리사카라이드를 기준으로 계산될 수 있다. 예를 들어, 20% 유리 폴리사카라이드를 갖는 당접합체는 100 g 폴리사카라이드 투약량에서 약 80 g의 접합된 폴리사카라이드 및 약 20 g의 비접합된 폴리사카라이드를 가질 것이다. 당접합체의 양은 대장균 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 사카라이드 농도는 우론산 검정으로 측정될 수 있다.
면역원성 조성물에서 상이한 폴리사카라이드 성분의 "면역원성 양"은 다양할 수 있고, 각각은 약 1.0 g, 약 2.0 g, 약 3.0 g, 약 4.0 g, 약 5.0 g, 약 6.0 g, 약 7.0 g, 약 8.0 g, 약 9.0 g, 약 10.0 g, 약 15.0 g, 약 20.0 g, 약 30.0 g, 약 40.0 pg, 약 50.0 pg, 약 60.0 pg, 약 70.0 pg, 약 80.0 pg, 약 90.0 pg 또는 약 100.0 g의 임의의 특정 폴리사카라이드 항원을 포함할 수 있다. 일반적으로, 각각의 투약량은 소정 혈청형에 대해 0.1 내지 100 g, 구체적으로 0.5 내지 20 g, 더욱 구체적으로 1 내지 10 g, 더욱 더 구체적으로 2 내지 5 g의 폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 범자연수 정수가 본 개시내용의 양태로서 고려된다. 한 양태에서, 각각의 투약량은 소정 혈청형에 대해 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 6 g, 7 g, 8 g, 9 g, 10 g, 15 g 또는 20 g의 폴리사카라이드를 포함할 것이다.
담체 단백질 양. 일반적으로, 각각의 투약량은 5 내지 150 g의 담체 단백질, 구체적으로 10 내지 100 g의 담체 단백질, 더욱 구체적으로 15 내지 100 g의 담체 단백질, 더욱 구체적으로 25 내지 75 g의 담체 단백질, 더욱 구체적으로 30 내지 70 g의 담체 단백질, 더욱 구체적으로 30 내지 60 g의 담체 단백질, 더욱 구체적으로 30 내지 50 g의 담체 단백질, 더욱 더 구체적으로 40 내지 60 g의 담체 단백질을 포함할 것이다. 한 양태에서, 상기 담체 단백질은 CRM197이다. 한 양태에서, 각각의 투약량은 약 25 g, 약 26 g, 약 27 g, 약 28 g, 약 29 g, 약 30 g, 약 31 g, 약 32 g, 약 33 g, 약 34 g, 약 35 g, 약 36 g, 약 37 g, 약 38 g, 약 39 g, 약 40 g, 약 41 g, 약 42 g, 약 43 g, 약 44 g, 약 45 g, 약 46 g, 약 47 g, 약 48 g, 약 49 g, 약 50 g, 약 51 g, 약 52 g, 약 53 g, 약 54 g, 약 55 g, 약 56 g, 약 57 g, 약 58 g, 약 59 g, 약 60 g, 약 61 g, 약 62 g, 약 63 g, 약 64 g, 약 65 g, 약 66 g, 약 67 g, 68 g, 약 69 g, 약 70 g, 약 71 g, 약 72 g, 약 73 g, 약 74 g 또는 약 75 g의 담체 단백질을 포함할 것이다. 한 양태에서, 상기 담체 단백질은 CRM197이다.
보조제
일부 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 1, 2 또는 3개 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "보조제"는 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 화합물 또는 혼합물을 지칭한다. 항원은 주로 전달 시스템으로서, 주로 면역 조절자로서 역할을 하거나 둘 다의 강력한 특징을 가질 수 있다. 적합한 보조제는 인간을 비롯한 포유동물에 사용하기에 적합한 것들을 포함한다.
인간에게 사용될 수 있는 공지된 적합한 전달 시스템 유형 보조제의 예는 비제한적으로 명반(예컨대, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드), 칼슘 포스페이트, 리포좀, 수중유 유화액, 예컨대 MF59(4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 0.5% w/v 소르비탄 트라이올레에이트(스판(SPAN) 85)), 유중수 유화액, 예컨대 몬타나이드, 및 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)(PLG) 마이크로입자 또는 나노입자를 포함한다.
한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 보조제로서 알루미늄 염(명반)(예컨대, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드). 바람직한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 보조제로서 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드를 포함한다. 한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 0.1 내지 1 mg/mL 또는 0.2 내지 0.3 mg/mL의 원소 알루미늄을 알루미늄 포스페이트의 형태로 포함한다. 한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 약 0.25 mg/mL의 원소 알루미늄을 알루미늄 포스페이트의 형태로 포함한다. 인간에 사용될 수 있는 공지된 적합한 면역 조절 유형 보조제의 예는, 비제한적으로, 아퀼라 나무(QS21, Quil A)의 껍질로부터의 사포닌 추출물, TLR4 작용제, MPL(모노포스포릴 지질 A), 3DMPL(3-O-탈아실화된 MPL) 또는 GLA-AQ, LT/CT 돌연변이체, 사이토카인, 예컨대 다양한 인터류킨(예컨대, IL-2, IL-12) 또는 GM-CSF, AS01 등을 포함한다.
인간에 사용될 수 있는 전달 및 면역 조절 특징 둘 다를 갖는 공지된 적합한 면역 조절 유형 보조제의 예는 비제한적으로 ISCOMS(예컨대, 문헌[Sjoelander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713]; 제WO 90/03184호, 제WO 96/11711호, 제WO 00/48630호, 제WO 98/36772호, 제WO 00/41720호, 제WO 2006/134423호 및 제WO 2007/026190호 참조) 또는 TLR4 작용제와 수중유 유화액의 조합인 GLA-EM을 포함한다.
비제한적으로 동물 실험을 포함하는 수의학 적용례에 대하여, 당업자는 완전 프로인트 보조제(Complete Freund 's Adjuvant, CFA), 프로인트 불완전 보조제(IFA), 에멀지겐(Emulsigen), N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP로 지칭됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 지칭됨) 및 RIBI(세균으로부터 추출된 3개의 성분을 함유함), 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 다이마이콜레이트 및 2% 스쿠알렌/트윈 80 유화액 중 세포벽 골격(MPL + TDM + CWS)을 사용할 수 있다.
본원에 개시된 면역원성 조성물의 효과를 향상시키기 위한 추가의 예시적인 보조제는 비제한적으로 (1) 수중유 유화액 제형(무라밀 펩티드(하기 참조) 또는 세균 세포벽 성분과 같은 다른 특정 면역자극제를 포함하거나 포함하지 않음), 예를 들어 (a) SAF(10% 스쿠알란, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단 중합체 L121, 및 서브마이크론 유화액으로 미세유동화되거나 더 큰 입자 크기 유화액을 생성하기 위해 와류 처리된 thr-MDP를 함유함), 및 (b) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80 및 하나 이상의 세균 세포벽 성분, 예를 들어 모노인지질 A(MPL), 트레할로스 다이마이콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS), 바람직하게는 MPL + CWS[데톡스(DETOX, 상표)]를 함유하는 리비(RIBI, 상표) 보조제 시스템(RAS)[리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem), 미국 몬타나주 해밀턴 소재]; (2) 사포닌 보조제, 예컨대 QS21, 스티물론(STIMULON, 상표)[캠브리지 바이오사이언스(Cambridge Bioscience), 미국 매사추세츠주 워세세스터 소재), 아비스코(ABISCO, 등록상표)[이스코노바(Isconova), 스웨덴 소재] 또는 이스코매트릭스(ISCOMATRIX, 상표)[커먼웰스 세럼 래보러토리즈(Commonwealth Serum Laboratories), 호주 소재][사용될 수 있거나 이스콤(ISCOM, 면역자극 복합체)과 같은 이로부터 생성된 입자이고, 이때 이스콤은 추가 세제가 없을 수 있음(예컨대, 제WO 00/07621호)]; (3) 완전 프로인트 보조제(CFA) 및 불완전 프로인트 보조제(IFA); (4) 사이토카인, 예컨대 인터류킨[예컨대, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12(예컨대, 제WO 99/44636호)], 인터페론(예컨대, 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF) 등; (5) 모노인지질 A(MPL) 또는 3-O-탈아실화된 MPL(3dMPL)(예컨대, 제GB 2220211호, 제EP 0 689 454호 참조)(예컨대, 제WO 00/56358호 참조); (6) 3dMPL, 예를 들어 QS21 및/또는 수중유 유화액의 조합(예컨대, 제EP 0 835 318호, 제EP 0 735 898호, 제EP 0 761 231호 참조); (7) 폴리옥시에틸렌 에터 또는 폴리옥시에틸렌 에스터(예컨대, 제WO 99/52549호 참조); (8) 옥톡시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제(예컨대, 제WO 01/21207호), 또는 옥톡시놀과 같은 하나 이상의 비이온성 계면활성제와 조합된 폴리옥시에틸렌 알킬 에터 또는 에스터 계면활성제(예컨대, 제WO 01/21152호); (9) 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드(예컨대, CpG 올리고뉴클레오티드)(예컨대, 제WO 00/62800호); (10) 면역자극제 및 금속 염의 입자(예컨대, 제WO 00/23105호 참조); (11) 사포닌 및 수중유 유화액(예컨대, 제WO 99/11241호); (12) 사포닌(예컨대, QS21) + 3dMPL + IM2(임의적으로 + 스테롤)(예컨대, 제WO 98/57659호); (13) 조성물의 효능을 향상시키기 위한 면역자극제로 작용하는 기타 물질을 포함한다. 무라밀 펩티드는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-25 아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타르닌일-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE) 등을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 보조제로서 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 CpG 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN)를 의미하고, 따라서 이러한 용어는 달리 명시되지 않는 한 상호교환적으로 사용된다. 면역자극성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 임의적으로 특정한 바람직한 염기 맥락 내에서 비메틸화된 시토신-구아닌 다이뉴클레오티드인 하나 이상의 면역자극성 CpG 모티프를 함유한다. CpG 면역자극성 모티프의 메틸화 상태는 일반적으로 다이뉴클레오티드의 시토신 잔기를 지칭한다. 하나 이상의 비메틸화된 CpG 다이뉴클레오티드를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 포스페이트 결합에 의해 3' 구아닌에 연결된 5' 비메틸화된 시토신을 함유하고, 톨(Toll)-유사 수용체 9(TLR-9)에 결합하여 면역계를 활성화시키는 올리고뉴클레오티드이다. 다른 양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 메틸화된 CpG 다이뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 이는 TLR9를 통해 면역계를 활성화시킬 것이지만, CpG 모티프가 비메틸화된 것처럼 강하지는 않다. CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 궁극적으로 CpG 다이뉴클레오티드를 포함할 수 있는 하나 이상의 회문을 포함할 수 있다. CpG 올리고뉴클레오티드는 다수의 허여된 특허, 공개된 특허출원 및 기타 공보, 예컨대 미국 특허공보 제6,194,388호; 제6,207,646호; 제6,214,806호; 제6,218,371호; 제6,239,116호; 및 제6,339,068호에 기술된다.
본 발명의 한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 제WO 2010/125480호의 제3면, 제22행 내지 제12면 제36행에 기술된 임의의 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 다른 부류가 확인된다. 이들은 A, B, C 및 P 클래스로 지칭되고, 제WO 2010/125480호의 제3면 제22행 내지 제12면 제36행에 더 자세히 기술되어 있다. 본 발명의 방법은 이러한 상이한 부류의 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다.
제형
본 발명의 면역원성 조성물은 액체 형태(즉, 용액 또는 현탁액) 또는 동결건조된 형태로 제형화될 수 있다. 액체 제형은 유리하게는 포장된 형태로부터 직접 투여될 수 있고, 따라서 본 발명의 동결건조된 조성물에 대해 달리 요구되는 바와 같이 수성 매질에서 재구성 필요 없이 주사에 이상적이다.
본 발명의 면역원성 조성물의 제형은 당업계에서 인정된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 개별 접합체는 생리학적으로 허용되는 비히클과 함께 제형화되어 조성물을 제조할 수 있다. 이러한 비히클의 예는 비제한적으로 물, 완충 염수, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 개시된 당접합체 및 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제의 임의의 조합을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
특정 양태에서, 면역원성 조성물 제형은 약학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 한 양태에서, 약학적으로 허용되는 희석제는 멸균수, 주사용수, 멸균 등장 염수 또는 생물학적 완충액을 포함한다. 폴리사카라이드-단백질 접합체 및/또는 단백질 면역원은 통상적인 방식으로 이러한 희석제 또는 담체와 혼합된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 약학적으로 허용되는 "담체"라는 용어는 인간 또는 다른 척추동물 숙주에 대한 투여와 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적절한 담체는 당업자에게 자명하고 대부분 투여 경로에 따라 달라질 것이다.
예를 들어, 면역원성 조성물 제형에 존재할 수 있는 부형제는 보존제, 화학적 안정화제 및 현탁제 또는 분산제를 포함한다. 전형적으로, 안정화제, 보존제 등은 표적화된 수용자(예컨대, 인간 대상)에서 효능을 위한 최상의 제형을 결정하기 위해 최적화된다. 보존제의 예는 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다. 안정화 성분의 예는 카사미노산, 수크로스, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 모노칼륨 다이포스페이트, 락토스, 락트알부민 가수분해물 및 건조 우유를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 액체 형태, 바람직하게는 수성 액체 형태이다.
본 개시내용의 면역원성 조성물은 완충액, 염, 2가 양이온, 비이온성 세제, 동결보호제, 예컨대 당, 및 산화방지제, 예컨대 유리 라디칼 포집제 또는 킬레이트 제 중 하나 이상, 또는 이들의 여러 조합을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 완충액을 포함한다. 한 양태에서, 상기 완충액은 약 3.5 내지 약 7.5의 pKa를 갖는다. 일부 양태에서, 완충액는 포스페이트, 석시네이트, 히스티딘 또는 시트레이트이다. 특정 양태에서, 완충액은 1 내지 10 mM의 최종 농도의 석시네이트이다. 한 특정 양태에서, 석시네이트 완충액의 최종 농도는 약 5 mM이다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 염을 포함한다. 일부 양태에서, 염은 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이들의 조합 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 양태에서, 염은 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 특정 양태에서, 염은 나트륨 클로라이드이다. 한 특정 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 150 mM의 나트륨 클로라이드를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 비이온성 계면활성제, 예컨대 비제한적으로 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터를 포함한다. 한 양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20(트윈(상표) 20), 폴리소르베이트 40(트윈(상표) 40), 폴리소르베이트 60(트윈(상표) 60), 폴리소르베이트 65(트윈(상표) 65), 폴리소르베이트 80(트윈(상표) 80), 폴리소르베이트 85(트윈(상표) 85), 트리톤(TRITON, 상표) N-101, 트리톤(상표) X-100, 옥스톡시놀 40, 노녹시놀-9, 트라이에탄올아민, 트라이에탄올아민 폴리펩티드 올레에이트, 폴리옥시에틸렌-660 하이드록시스테아레이트(PEG-15, 솔루톨(Solutol) H 15), 폴리옥시에틸렌-35-리시놀레이트(크레모포르(CREMOPHOR, 등록상표) EL), 대두 레시틴 및 폴록사머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20(트윈(상표) 20), 폴리소르베이트 40(트윈(상표) 40), 폴리소르베이트 60(트윈(상표) 60), 폴리소르베이트 65(트윈(상표) 65), 폴리소르베이트 80(트윈(상표)) 80), 폴리소르베이트 85(트윈(상표) 85), 트리톤(상표) N-101, 트리톤(상표) X-100, 옥스톡시놀 40, 노녹시놀-9, 트라이에탄올아민, 트라이에탄올아민 폴리펩티드 올레에이트, 폴리옥시에틸렌-660 하이드록시스테아레이트(PEG-15, 솔루톨 H 15), 폴리옥시에틸렌-35-리시놀레이트(크레모포르(등록상표) EL), 대두 레시틴 및 폴록사머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 조성물은 비제한적으로 BRIJ 58, BRIJ 35, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, NP40, 스판 85, 및 비이온성 계면활성제의 플루로닉 시리즈, 예컨대 플루로닉 121을 비롯한 폴리옥시에틸렌 알킬 에터 중 어느 하나를 추가로 포함한다. 한 특정 양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 0.0001% 이상 내지 10%의 폴리소르베이트 80 중량/중량(w/w)이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 0.001% 이상 내지 1%의 폴리소르베이트 80(w/w)이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 0.01% 이상 내지 1%의 폴리소르베이트 80(w/w)이다. 다른 양태에서, 제형 중 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1%의 폴리소르베이트 80(w/w)이다. 다른 양태에서, 제형 중 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 1%의 폴리소르베이트 80 (w/w)이다.
특정 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 pH 5.5 내지 7.5, 더욱 바람직하게는 pH 5.6 내지 7.0, 더욱 더 바람직하게는 pH 5.8 내지 6.0을 갖는다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 면역원성 조성물로 채워진 용기를 제공한다. 한 양태에서, 용기는 바이알, 주사기, 플라스크, 발효기, 생물반응기, 백, 자르(jar), 앰풀, 카트리지 및 일회용 펜 중 어느 하나로부터 선택된다. 한 양태에서, 용기는 바이알, 주사기, 플라스크, 발효기, 생물반응기, 백, 자르, 앰풀, 카트리지 및 일회용 펜으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 양태에서, 용기는 실리콘화된다. 한 양태에서, 본 발명의 용기는 유리, 금속(예컨대, 강, 스테인리스 강, 알루미늄 등) 및/또는 중합체(예컨대, 열가소성 수지, 엘라스토머, 열가소성 엘라스토머)로 제조된다. 한 양태에서, 본 발명의 용기는 유리로 만들어진다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 면역원성 조성물로 채워진 주사기를 제공한다. 특정 양태에서, 주사기는 실리콘화되고/되거나 유리로 만들어진다.
주사를 위한 본 발명의 면역원성 조성물의 전형적인 투약량은 0.1 내지 2 mL, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 1 mL, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5 mL의 부피를 갖는다.
따라서, 상기 정의된 용기 또는 주사기는 0.1 내지 2 mL, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 1 mL, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5 mL의 부피의 본원에 정의된 임의의 면역원성 조성물로 충전된다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 공지된 방법, 예컨대 비경구, 경점막, 근육내, 정맥내, 피부내, 비강내, 피하, 복강내 방법에 의해 대상에게 투여될 수 있고, 이에 따라 제형화된다.
한 양태에서, 본 발명의 조성물은 액체 제제의 표피 주사, 근육내 주사, 정맥내, 동맥내, 피하 주사, 또는 호흡기내 점막 주사를 통해 투여된다. 본 발명의 조성물은 단일 투약량 바이알, 다중 투약량 바이알 또는 사전-충전된 주사기로서 제형화될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여되고, 따라서 경구 투여에 적합한 형태, 즉 고체 또는 액체 제제로 제형화된다. 고체 경구 제형은 정제, 캡슐, 알약, 과립, 펠렛 등을 포함한다. 액체 경구 제형에는 용액, 현탁액, 분산액, 유화액, 오일 등을 포함한다. 액체 제형에 대한 약학적으로 허용되는 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 유화액 또는 오일이다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 주사가능한 유기 에스터, 에틸 올레이트를 포함한다.
수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 유화액 또는 현탁액, 예컨대 염수 및 완충 매질을 포함한다. 오일의 예는 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 것, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 올리브유, 해바라기유, 생선 간유, 다른 해양유, 또는 우유 또는 계란의 지질이다.
약학 조성물은 등장성, 저장성 또는 고장성일 수 있다. 주입 또는 주사를 위한 약학 조성물은 바람직하게는 투여될 때 본질적으로 등장성이다. 저장을 위해, 약학 조성물은 바람직하게는 등장성 또는 고장성일 수 있다. 약학 조성물이 저장을 위해 고장성인 경우, 투여 전에 등장성 용액이 되도록 희석될 수 있다. 등장화제는 염과 같은 이온성 등장화제, 또는 탄수화물과 같은 비이온성 등장화제일 수 있다. 이온성 등장화제의 예는 비제한적으로 NaCl, CaCl3, KCl 및 MgCl2를 포함한다. 비이온성 등장화제의 예는 비제한적으로 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다.
하나 이상의 약학적으로 허용되는 첨가제가 완충액인 것이 또한 바람직하다. 일부 목적을 위해, 예를 들어, 약학 조성물이 주입 또는 주사를 의미하는 경우, 조성물은 종종 용액을 4 내지 10, 예컨대 5 내지 9, 예를 들어 6 내지 8의 pH로 완충할 수 있는 완충액을 포함하는 것이 바람직하다. 완충액은, 예를 들어 트리스, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카보네이트, 글리시네이트, L-히스티딘, 글리신, 석시네이트 및 트라이에탄올아민 완충액 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 추가로, 완충액는, 예를 들어 비경구 용도, 특히 약학 제형이 비경구 용도인 경우, USP 상용성 완충액으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 완충액은 일염기성 산, 예컨대 아세트산, 벤조산, 글루콘산, 글리세르산 및 락트산; 이염기성 산, 예컨대 아코니트산, 아디프산, 아스코르브산, 탄산, 글루탐산, 말산, 석신산 및 타르타르산; 다염기성 산, 예컨대, 시트르산 및 인산; 및 염기, 예컨대 암모니아, 다이에탄올아민, 글리신, 트라이에탄올아민 및 트리스 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 비경구 비히클(피하, 정맥내, 동맥내 또는 근육내 주사용)은 나트륨 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 나트륨 클로라이드, 락테이트화된 링거 및 고정 오일을 포함한다. 정맥 비히클은 체액 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스를 기반으로 하는 것 등을 포함한다. 예는 계면활성제 및 기타 약학적으로 허용되는 보조제의 첨가 유무에 관계 없이 물 및 오일과 같은 멸균 액체이다. 일반적으로 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련 당 용액, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리소르베이트 80(PS-80), 폴리소르베이트 20(PS-20) 및 폴록사머 188(PI 88)은, 특히 주사용 용액의 경우 바람직한 액체 담체이다. 오일의 예는 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 것, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 올리브유, 해바라기유, 생선 간유, 다른 해양유, 또는 우유 또는 계란의 지질이다.
제형은 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 계면활성제는 비제한적으로 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제(일반적으로 트윈으로 지칭 됨), 특히 PS-20 및 PS-80; 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO) 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO)의 공중합체(다우팩스(DOWFAX, 상표)라는 상표 하에 시판 중), 예를 들어 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복 에톡시(옥시-1,2-에탄다이일) 기의 수에서 변할 수 있는 옥톡시놀(옥톡시놀-9(트리톤 X-100 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시 에탄올)가 특히 관심을 끌고 있음); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린(레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 터기톨(TERGITOL, 상표)NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올(BRIJ 계면활성제로 공지됨)로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에터, 예컨대 트라이에틸렌글리콜 모노라우릴 에터(BRIJ 30); 및 소르비탄 에스터(통상적으로 스판으로 공지됨), 예컨대 소르비탄 트라이올레이트(스판 85) 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함한다. 유화액에 포함시키기 위한 바람직한 계면활성제는 PS-20 또는 PS-80이다. 계면활성제의 혼합물, 예컨대 PS-80/스판 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(PS-80)와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터와 t-옥틸페녹시폴리에톡시 에탄올(트리톤 X-100)과 같은 옥톡시놀의 조합이 또한 적합하다. 다른 유용한 조합은 라우레스 9 + 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.
제형은 또한 pH-완충 염수 용액을 포함할 수 있다. 완충액은, 예를 들어 트리스, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카보네이트, 글리시네이트, L-히스티딘, 글리신, 석시네이트, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) 및 트라이에탄올아민 완충액 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 완충액은 4 내지 10, 5.2 내지 7.5 또는 5.8 내지 7.0의 pH로 용액을 완충할 수 있다. 특정 양상에서, 완충액는 포스페이트, 석시네이트, L-히스티딘, MES, MOPS, HEPES, 아세테이트 및 시트레이트 중 어느 하나로부터 선택된다. 또한, 완충액은, 특히 약학 제형이 비경구 용도인 경우, 비경구 용도를 위한 USP 상용성 완충액으로부터 선택될 수 있다. 완충액의 농도는 1 내지 50 mM 또는 5 내지 50 mM일 것이다. 특정 양상에서, 완충액은 5 내지 50 mM의 최종 농도의 L-히스티딘, 또는 1 내지 10 mM의 최종 농도의 석시네이트이다. 특정 양상에서, L-히스티딘은 20 ± 2 mM의 최종 농도이다.
염수 용액(즉, NaCl을 포함하는 용액)이 바람직하지만, 제형에 적합한 다른 염은 비제한적으로 CaCl3, KCl 및 MgCl2 및 이들의 조합을 포함한다. 비제한적으로 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함하는 비이온성 등장화제는 염 대신에 사용될 수 있다. 적합한 염 범위는 비제한적으로 25 내지 500 mM 또는 40 내지 170 mM을 포함한다. 한 양상에서, 염수는 NaCl이고, 임의적으로 20 내지 170 mM의 농도로 존재한다. 바람직한 양태에서, 제형은 나트륨 클로라이드가있는 L-히스티딘 완충액을 포함한다.
다른 양태에서, 약학 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달된다. 예를 들어, 제제는 정맥내 주입, 경피 패치, 리포좀 또는 기타 투여 방식을 사용하여 투여할 수 있다. 다른 양태에서, 중합체 물질이, 예컨대, 마이크로스피어 또는 임플란트로 사용된다.
활성
한 양태에서, 본원에 기술된 사카라이드는 옵소닌 활성을 유도할 수 있다. 다른 양태에서, 본원에 기술된 사카라이드는 옵소닌 및 식세포 활성(예컨대, 옵소닌포식성 활성)을 유도할 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 상응하는 야생형 사카라이드에 비해 반복 단위가 증가된 사카라이드가 야생형 사카라이드에 비해 포유동물에서 면역 반응을 증가시키는 것을 발견한다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도 상응하는 야생형 사카라이드에 비해 반복 단위가 증가된 사카라이드 및 담체 단백질을 포함하는 접합체를 포함하는 조성물이, 담체 단백질 및 상응하는 야생형 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물이 투여된 포유동물에 비해, 포유동물에서 면역 반응의 증가를 유도함을 발견한다. 기전 또는 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 반복 단위가 증가된 사카라이드는 보존된 에피토프가 증가할 수 있고, 이는 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
옵소닌 활성 또는 옵소닌화는 옵소닌(예컨대, 항체 또는 보체 인자)이 항원(예컨대, 본원에 기술된 사카라이드 또는 이의 접합체)에 결합하여 식세포 또는 식세포성 세포(예컨대, 대식세포, 수지상 세포 및 다형핵 백혈구(PMNL))에 대한 항원의 부착을 촉진하는 과정을 의미한다. 예를 들어, 캡슐의 존재로 인해 전형적으로 식균되지 않는 캡슐화된 세균과 같은 일부 세균은 옵소닌 항체로 코팅될 때 식세포에 의해 인식될 가능성이 더 높다. 한 양태에서, 사카라이드는, 예를 들어, 옵소닌인 항체와 같은 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 옵소닌 활성은 그람-음성균, 바람직하게는 에스케리치아 종에 대한 것이고, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 대장균 균주에 대한 것이다.
식세포 활성 또는 식세포 작용은 식세포가 물질을 삼켜서 물질을 세포질에 감싸는 과정을 지칭한다. 한 양태에서, 사카라이드는 식세포 작용을 촉진하여, 예를 들어 항체와 같은 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 식세포 활성은 그람-음성균, 바람직하게는 에스케리치아 종, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 대장균 균주에 대한 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 단리된 사카라이드에 대해 생성된 토끼 항체는, 예를 들어 시험관내 식세포 작용 검정에 의해 지시된 바와 같이 보체의 존재 하에 사카라이드를 발현하는 균주의 옵소닌포식성 작용을 특히 매개할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 사카라이드는 살균성 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 양태에서, 살균 활성은 그람-음성균, 바람직하게는 에스케리치아 종, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 대장균 균주에 대한 것이다.
생체내 세균 부하 감소를 측정함으로써(예컨대, 에스케리치아에 의해 챌린징된 포유동물의 균혈증 수준을 측정함으로써) 및/또는 시험관내 세균 세포 사멸(예컨대, 시험관내 옵소닌포식성 검정)을 측정함으로써, 옵소닌화, 식균 작용 및/또는 살균 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 양태에서, 사카라이드는, 예를 들어 열-사멸된 그람-음성균에 대해 생성된 항혈청과 비교하여, 적절한 대조군과 비교하여 옵소닌, 식세포 및/또는 살균 활성을 유도할 수 있다.
기능성 항체 및 보체의 존재 하에 식세포 효과기 세포에 의한 대장균 세포의 사멸을 측정하는 옵소닌포식성 검정은 특정 대장균 혈청형, 예를 들어 대장균 혈청형 O25B에 대한 대장균 백신의 효과를 평가하기 위한 대용일 수 있다. 시험관내 옵소닌포식성 검정은 대장균 세포, 시험되는 열 불활성화된 인간 혈청, 분화된 HL-60 세포(식세포) 및 외인성 보체 공급원(예컨대, 아기 토끼 보체)의 혼합물을 함께 항온처리함으로써 수행될 수 있다. 옵소닌포식성 작용은 항온처리 중에 진행되고, 항체와 보체로 코팅된 세균 세포는 옵소닌포식성 작용에 의해 사멸된다. 옵소닌포식성 작용에서 탈출하는 생존 세균의 콜로니 형성 단위(cfu)는 검정 혼합물을 평판배양함으로써 결정된다. OPA 역가는 시험 혈청 없이 대조군 웰에 대한 세균 수의 50% 감소를 초래하는 상호 희석으로 정의된다. OPA 역가는 이러한 50% 사멸 컷오프를 포함하는 2개의 희석액에서 보간된다.
1:8 이상의 종점 역가는 이러한 사멸 유형 OPA에서 양성 결과로 간주된다.
일부 양태에서, 대상은, 예를 들어 대장균(예컨대, 성인 대상의 경우)에 대한 자연적 노출로 인해 백신접종 전에 혈청형 특이적 OPA 역가를 가질 수 있다.
따라서, 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성을 본 발명의 면역원성 조성물과 비교하는 것은 특정 대장균 혈청형, 예를 들어 대장균 혈청형 O25B에 대한 반응을 수행하고 비교하여 반응자의 잠재적 증가를 평가할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 유의하게 증가시킨다.
면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성을 본 발명의 면역원성 조성물과 비교하는 것은 또한 OPA 역가의 잠재적 증가를 비교함으로써 수행될 수 있다.
따라서, 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성을 본 발명의 면역원성 조성물과 비교하는 것은 특정 대장균 혈청형, 예를 들어 대장균 혈청형 O25B에 대한 반응을 수행하고 비교하여 OPA 역가의 증가 가능성을 평가할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 인간 대상의 OPA 역가를 유의하게 증가시킬 수 있다.
한 양상에서, 조성물은 하나 이상의 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 대장균 혈청형은, 예를 들어 하기 대장균 혈청형 중 어느 하나를 포함하는 임의의 혈청형일 수 있다: O1(예컨대, O1A, O1B, 및 O1C), O2, O3, O4(예컨대, O4:K52 및 O4:K6), O5(예컨대, O5ab 및 O5ac(균주 180/C3)), O6(예컨대, O6:K2; K13; K15 및 O6:K54), O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18(예컨대, O18A, O18ac, O18A1, O18B, 및 O18B1), O19, O20, O21, O22, O23(예컨대, O23A), O24, O25(예컨대, O25a 및 O25b), O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45(예컨대, O45 및 O45rel), O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D1, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73(예컨대, O73(균주 73-1)), O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 및 O187. 한 양태에서, 혈청형은 O25a이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O25b이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O1A이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O2이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O6이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O6이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O17이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O15이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O18A이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O75이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O4이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O16이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O13이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O7이다. 다른 양태에서, 혈청형은 O8이다.
바람직한 양태에서, 조성물은 2개 이상의 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 다른 양태에서, 조성물은 3개 이상의 상이한 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 4개 이상의 상이한 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 5개의 상이한 대장균 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 6개 이상의 상이한 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 7개 이상의 상이한 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 8개 이상의 상이한 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 9개 이상의 상이한 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 10개 이상의 상이한 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 11개 이상의 상이한 대장균 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 12개 이상의 상이한 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 13개 이상의 상이한 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 14개 이상의 상이한 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 15개 이상의 상이한 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 16개 이상의 상이한 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 17개 이상의 상이한 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 18개 이상의 상이한 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 19개 이상의 상이한 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 양태에서, 조성물은 20개 이상의 상이한 혈청형에 대한 면역 반응을 유도한다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 특정 대장균 혈청형 사카라이드, 예를 들어 ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같이 대장균 혈청형 O25B 사카라이드에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 강화된 면역 반응은 IgG1 및/또는 IgG2a 및/또는 IgM의 생산 증가를 포함할 수 있다.
ELISA(효소-연결된 면역흡착 검정) 방법에서, 백신접종된 대상의 혈청으로부터의 항체를 고체 지지체에 흡착된 폴리사카라이드와 함께 항온처리한다. 결합된 항체는 효소-접합된 2차 검출 항체를 사용하여 검출된다. ELISA는 인간 혈청에 존재하는 유형-특이적 IgG 항-대장균 폴리사카라이드 항체를 측정한다. 인간 혈청의 희석액이 유형-특이적 폴리사카라이드-코팅된 미세역가 플레이트에 추가되는 경우, 해당 폴리사카라이드에 특이적인 항체는 미세역가 플레이트에 결합한다. 플레이트에 결합된 항체는 염소 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제-표지된 항체, 및 이어서 p-니트로페닐 포스페이트 기질을 사용하여 검출된다. 착색된 최종 생성물의 광학 밀도는 혈청에 존재하는 항-O-항원 폴리사카라이드 항체의 양에 비례한다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 대장균 혈청형 O25B, O1, O2 및 O6에 대한 인간 대상의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 포유동물에서 대장균에 대한 항체의 생산을 1,000 이상, 바람직하게는 5,000 이상 내지 200,000 이하의 초기 투약(예를 들어, 초기 투약 후 약 30일, 바람직하게는 초기 투약 후 약 60일)의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 증가시키는 데 효과적이다. 바람직한 양태에서, 조성물은 포유동물에서 대장균 혈청형 O25B에 대한 항체의 생산을 초기 투여 후 1,000 이상, 바람직하게는 5,000 이상 내지 200,000 이하의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 증가시키는 데 효과적이다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 조성물에서 사카라이드의 반복 단위에 상응하는 대장균 혈청형에 결합할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 ELISA 검정에 의해 적어도 0.2 pg/mL, 0.3 pg/mL, 0.35 pg/mL, 0.4 pg/mL 또는 0.5 pg/mL의 농도에서 IgG 항체를 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물과 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성의 비교를 수행하고 각각의 혈청형에 대한 이들의 반응에 대해 비교하여 반응자의 잠재적 증가를 평가할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성 검정에 의해 측정된 바와 같이 조성물 내의 사카라이드의 반복 단위에 상응하는 대장균 혈청형을 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 기능성 항체를 유도하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌포식성 검정에 의해 측정된 바와 같이 조성물 내의 사카라이드의 반복 단위에 상응하는 대장균 혈청형을 사멸할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 조성물의 사카라이드의 반복 단위에 상응하는 대장균 혈청형에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 1:8 이상의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 50% 이상에서 조성물의 사카라이드의 반복 단위에 상응하는 대장균 혈청형에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 대상의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상에서 조성물의 사카라이드의 반복 단위에 상응하는 대장균 혈청형에 대해 1:8 이상의 역가를 유도한다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 조성물의 사카라이드의 반복 단위에 상응하는 대장균 혈청형에 대한 반응자(즉, 시험관내 OPA에 의해 측정된 역가가 1:8 이상인 혈청을 갖는 개체)의 비율을 유의하게 증가시킨다. 한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역화 전 집단과 비교하여 조성물에서 사카라이드의 반복 단위에 상응하는 대장균 혈청형에 대한 인간 대상의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
방법
다른 양상에서, 본 발명은 효과량의 본원에 기술된 조성물(예컨대, 면역원성 조성물)을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상, 예를 들어 인간 대상의 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 효과량의 본원에 기술된 조성물(예컨대, 면역원성 조성물)을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상, 예를 들어 인간 대상의 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 효과량의 본원에 기술된 조성물(예컨대, 면역원성 조성물)을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상, 예를 들어 인간 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 효과량의 본원에 기술된 조성물(예컨대, 면역원성 조성물)을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상, 예를 들어 인간 대상에서 옵소닌포식성 항체의 생산을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "효과량"은 본원에 기술된 조성물을 대상에게 투여하는 맥락에서, 예방 및/또는 치료 효과를 갖는 조성물의 양을 지칭한다. 특정 양태에서, "효과량"은 하기 효과 중 적어도 1, 2, 3, 4 또는 그 이상을 달성하기에 충분한 조성물의 양을 지칭한다: (i) 대장균 감염 또는 이와 관련된 증상의 중증도를 감소시키거나 개선함; (ii) 대장균 감염 또는 이와 관련된 증상의 지속 기간을 감소시킴; (iii) 대장균 감염 또는 이와 관련된 증상의 진행을 방지함; (iv) 대장균 감염 또는 이와 관련된 증상의 퇴행을 유발함; (v) 대장균 감염 또는 이와 관련된 증상의 발생 또는 발병을 예방함; (vi) 대장균 감염 또는 이와 관련된 증상의 재발을 방지함; (vii) 대장균 감염과 관련된 장기 부전을 감소시킴; (viii) 대장균 감염을 갖는 대상의 입원을 감소시킴; (ix) 대장균 감염을 갖는 대상의 입원 기간을 감소시킴; (x) 대장균 감염을 갖는 대상의 생존을 증가시킴; (xi) 대상에서 대장균 감염을 제거함; (xii) 대상에서 대장균 복제를 억제 또는 감소시킴; 및/또는 (xiii) 다른 요법의 예방 또는 치료 효과를 향상시키거나 개선시킴.
한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 약제로 사용하기 위한 것이다. 본원에 기술된 면역원성 조성물은 대상에서 세균 감염, 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하기 위한 다양한 치료 또는 예방 방법에 사용될 수 있다. 특히, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 대상에서 대장균 감염, 질병 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 한 양상에서, 본 발명은 면역학적 효과량의 본 발명의 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상에서 대장균과 관련된 감염, 질병 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 면역학적 효과량의 본 발명의 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상에서 대장균과 관련된 감염, 질병 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 면역학적 효과량의 본 발명의 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상에서 대장균에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 대상에서 대장균에 의해 유발된 감염, 질병 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 다른 양상에서, 본 발명의 조성물은 대장균에 의해 유발된 감염, 질병 또는 병태로부터 포유동물을 보호하는 방법에 사용하기 위한 것이다.
한 양태에서, 본원에 개시된 임의의 면역원성 조성물은 대장균에 의한 감염에 대해 대상을 면역화하는 방법에 사용하기 위한 것이다.
한 양상에서, 본 발명은 대상에서 대장균에 의해 유발된 감염, 질병 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 개시된 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 대장균에 의한 감염에 대해 대상을 면역화하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 개시된 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 백신으로 사용하기 위한 것이다. 더욱 구체적으로, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 대상에서 대장균 감염을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 면역학적 효과량의 본 발명의 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상에서 대장균에 의한 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
일부 이러한 양태에서, 감염은 요로 감염, 담낭염, 담관염, 설사, 용혈성 요독 증후군, 신생아 수막염, 요로성 패혈증, 복강내 감염, 수막염, 복합 폐렴, 상처 감염, 전립선 생검 후 관련 감염, 신생아/유아 패혈증, 호중구감소성 열, 폐렴, 균혈증, 패혈증 및 기타 혈류 감염 중 어느 하나로부터 선택된다. 예를 들어, 신생아 수막염과 관련된 대장균 혈청형은 혈청형 O1, O6, O7, O16, O18 및 O83을 포함한다. 따라서, 한 양태에서, 조성물은 구조식 O1, 구조식 O6, 구조식 O7, 구조식 O16, 구조식 O18 및 구조식 O83 중 어느 하나로부터 선택되는 구조를 갖는 사카라이드를 포함하는 접합체 및 이들 접합체의 임의의 조합을 포함한다. 다른 예로서, 균혈증과 관련된 대장균 혈청형은 혈청형 O1, O2, O6, O15 및 O75를 포함한다. 따라서, 다른 양태에서, 조성물은 구조식 O1, O2, O6, O15 및 O75 중 어느 하나로부터 선택되는 구조를 갖는 사카라이드를 포함하는 접합체 및 이들 접합체의 임의의 조합을 포함한다. 추가 예로서, O1:K1:H7 또는 O2:K1:H4, O2:K1:H5, O2:K1:H6 및 O2:K1:H7과 같은 대장균 O1 및 O2 균주가 인간과 동물의 요로 감염, 패혈증 및 신생아 수막염의 유발 인자로 확인된다. O1 및 O2 혈청군은 둘 다 인간 환자에서 균혈증과 패혈증을 유발하는 균주의 대부분을 차지한다. 따라서, 한 양태에서, 조성물은 구조식 O1을 갖는 사카라이드를 포함하는 접합체 및 구조식 O2를 갖는 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함한다.
따라서, 이러한 용도와 방법으로 포유동물의 면역 반응을 높임으로써, 포유동물은 ExPEC 및 비-ExPEC 균주를 비롯한 대장균 감염으로부터 보호될 수 있다. 본 발명은 EPEC, EAEC, EIEC, ETEC 및 DAEC 병리형과 같은 장 병리형을 비롯한 병원성 대장균에 대한 광범위한 보호를 제공하는 데 특히 유용하다. 따라서, 포유동물은 비제한적으로 복막염, 신우신염, 방광염, 심내막염, 전립선염, 요로 감염(UTI), 수막염(특히, 신생아 수막염), 패혈증(또는 SIRS), 탈수, 폐렴, 설사(유아, 여행자, 급성, 지속성 등), 세균성 이질, 용혈성 요독 증후군(HUS), 심낭염, 세균뇨 등을 비롯한 질병에 대해 보호될 수 있다.
한 양상에서, 백신접종된 대상은 포유동물, 예컨대 인간, 고양이, 양, 돼지, 말, 소 또는 개이다. 바람직하게는, 백신접종된 대상은 인간이다. 백신이 예방용인 경우, 인간은 바람직하게는 어린이(예컨대, 유아 또는 영아) 또는 청소년 또는 성인이고; 백신이 치료용인 경우, 인간은 바람직하게는 청소년 또는 성인이다. 어린이용 백신도 안전성, 용량, 면역원성 등을 평가하기 위해 성인에게 투여될 수 있다.
본 발명의 백신은 어린이와 성인 둘 다를 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 인간 환자는 1세 미만, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세 또는 55세 이상일 수 있다. 백신을 수용하는 바람직한 환자는 노인(예컨대, 50세 이상, 60세 이상, 바람직하게는 65세 이상), 어린이(예컨대, 5세 이하), 입원 환자, 의료 종사자, 군무원 및 군인, 임산부, 만성 질환자 또는 면역결핍 환자이다. 그러나, 백신은 이러한 군에만 적합하지 않고, 집단에서 더 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 백신은 수술을 기대하는 환자 또는 다른 병원 입원 환자에게 특히 유용하다. 카테터를 삽입할 환자에게도 유용한다. 또한, 청소년기 여성(예컨대, 11 내지 18세) 및 만성 요로 감염 환자에게도 유용한다.
한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 근육내, 복강내, 피부내 또는 피하 경로에 의해 투여된다. 한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 근육내, 복강내, 피부내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
한 양태에서, 본 발명은 (i) 면역학적 효과량의 본원에 정의된 임의의 면역원성 조성물을 대상에게 주사하는 단계; (ii) 상기 대상으로부터 혈청 샘플을 수집하는 단계; (iii) 시험관내 옵소닌포식성 사멸 검정(OPA)에 의해 대장균 혈청형 O25B에 대한 옵소닌포식성 사멸 활성에 대해 상기 혈청 샘플을 시험하는 단계를 포함한다.
대상
본원에 개시된 바와 같이, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 대상에서 세균 감염, 질병 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하기 위한 다양한 치료 또는 예방 방법에 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서, 상기 대상은 인간이다. 가장 바람직한 양태에서, 상기 대상은 신생아(즉, 3개월 미만의 연령), 영아(즉, 3개월 내지 1세의 연령) 또는 유아(즉, 1 내지 4세의 연령)이다.
한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 백신으로 사용하기 위한 것이다.
한 양태에서, 백신접종되는 대상은 1세 미만일 수 있다. 예를 들어, 백신접종되는 대상은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11 또는 약 12개월의 연령일 수 있다. 한 양태에서, 백신접종되는 대상은 약 2, 4 또는 6개월의 연령이다. 다른 양태에서, 백신접종되는 대상은 2세 미만의 연령이다. 예를 들어, 백신접종되는 대상은 약 12 내지 약 15개월의 연령일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 1회 투약량만큼 필요하지만, 일부 상황에서는 2, 3 또는 4회 투약량이 투여될 수 있다.
한 양태에서, 백신접종되는 대상은 18세 미만의 연령일 수 있다. 예를 들어, 백신접종되는 대상은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16 또는 약 17세의 연령일 수 있다. 예를 들어, 백신접종되는 대상은 약 10 내지 약 18세의 연령일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 1회 투약량만큼 필요하지만, 일부 상황에서는 2, 3 또는 4회 투약량이 투여될 수 있다.
다른 양태에서, 백신접종되는 대상은 18세 이상의 연령의 인간일 수 있다. 예를 들어, 백신접종되는 대상은 약 18 내지 약 50세의 연령일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 1회 투약량만큼 필요하지만, 일부 상황에서는 2, 3 또는 4회 투약량이 투여될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 백신접종되는 대상은 50세 이상의 연령의 인간, 더욱 바람직하게는 55세 이상의 연령의 인간이다. 한 양태에서, 백신접종되는 대상은 65세 이상, 70세 이상, 75세 이상 또는 80세 이상의 연령의 인간이다. 한 양태에서, 백신접종되는 대상은 면역손상된 개체, 인간이다. 면역손상된 개체는 일반적으로 감염원에 의해 공격받는 정상적인 체액성 또는 세포 방어를 수행하는 약화 또는 감소된 능력을 나타내는 사람으로 정의된다.
본 발명의 한 양태에서, 백신접종되는 면역손상된 대상은 면역계를 손상시키고 요로 감염을 보호하거나 치료하기에 불충분한 항체 반응을 초래하는 질병 또는 병태를 앓고 있다.
한 양태에서, 상기 질병은 원발성 면역결핍 장애이다. 바람직하게는, 상기 원발성 면역결핍 장애는 조합된 T 세포 및 B 세포 면역결핍, 항체 결핍, 잘 정의된 증후군, 면역 조절장애 질환, 식세포 장애, 선천성 면역성 결핍, 자가염증 장애 및 보체 결핍 중 어느 하나로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태에서, 백신접종되는 면역손상된 대상은 HIV-감염, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 암, 만성 심장 또는 폐 질환, 울혈성 심부전, 당뇨병. 만성 간 질환, 알코올 중독, 간경변, 척수액 누출, 심근병증, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 비장 기능장애(예컨대, 겸상 적혈구 질환), 비장 기능 부족(비장결손), 혈액 악성 종양, 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨병, 림프종, 신부전, 신 증후군 및 천식 중 어느 하나로부터 선택되는 질환을 앓고 있다.
본 발명의 한 양태에서, 백신접종되는 대상은 영양실조를 앓고 있다.
본 발명의 한 양태에서, 백신접종되는 대상은 감염에 대한 신체의 내성을 낮추는 약물 또는 치료를 받고 있다.
본 발명의 한 양태에서, 백신접종 대상은 흡연자이다.
본 발명의 한 양태에서, 백신접종되는 대상은 1 L 당 5 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 4 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 3 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 2 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 1 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 0.5 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 0.3 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 0.1 x 109개 미만의 세포의 백혈구 수를 갖는다.
백혈구 수: 혈액내 백혈구(WBC)의 수. WBC는 통상적으로 CBC(전체 혈구 수)의 일부로서 측정된다. 백혈구는 혈액의 감염과 싸우는 세포이고, 적혈구로 알려진 적혈구(산소-운반)와 구별된다. 호중구(다형핵 백혈구, PMN), 밴드 세포(약간 미성숙 호중구), T형 림프구(T 세포), B형 림프구(B 세포), 단핵구, 호산구 및 호염기구를 비롯한 상이한 유형의 백혈구가 존재한다. 모든 유형의 백혈구는 백혈구 수에 반영된다. 백혈구 수의 정상 범위는 통상적으로 혈액 1 mm3 당 4,300 내지 10,800개의 세포이다. 이것은 또는 백혈구 수로도 지칭되고, 1 L 당 4.3 내지 10.8 x 109개의 세포의 국제 단위로 표시될 수 있다.
한 양태에서, 백신접종되는 대상은 호중구 감소증을 앓고 있다. 예를 들어, 백신접종되는 대상은 1 L 당 2 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 1 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 0.5 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 0.1 x 109개 미만의 세포, 또는 1 L 당 0.05 x 109개 미만의 세포의 호중구 수를 가질 수 있다.
낮은 백혈구 수 또는 "호중구 감소증"은 순환하는 혈액에서 비정상적으로 낮은 수준의 호중구를 특징으로 하는 병태이다. 호중구는 감염을 예방하고 퇴치하는 데 도움이 되는 특정 종류의 백혈구이다. 암 환자가 호중구 감소증을 경험하는 가장 통상적인 이유는 화학요법의 부작용이다. 화학요법-유발된 호중구 감소증은 환자의 감염 위험을 증가시키고 암 치료를 방해한다.
한 양태에서, 백신접종되는 대상은 500/mm3 미만의 CD4+ 세포 수, 300/mm3 미만의 CD4+ 세포 수, 또는 200/mm3 미만의 CD4+ 세포 수, 100/mm3 미만의 CD4+ 세포 수, 75/mm3 미만의 CD4+ 세포 수, 또는 50/mm3 미만의 CD4+ 세포 수를 갖는다.
CD4 세포 시험은 통상적으로 1 mm3 중 세포 수로 보고된다. 정상적인 CD4 수는 500 내지 1,600이고, CD8 수는 375 내지 1,100이다. CD4 수는 HIV 감염자에서 극적으로 감소한다.
본 발명의 한 양태에서, 본원에 개시된 임의의 면역손상된 대상은 인간 남성 또는 인간 여성이다.
섭생
일부 경우에, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 1회 투약량이 효과적이고, 더 큰 면역결핍 병태와 같은 다른 상황 하에, 2, 3 또는 4회 투약량이 투여될 수 있다. 초기 백신접종 후, 대상은 적절한 이격 하에 한 번 또는 여러 번의 부스터 면역화를 수용할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 백신접종 일정은 단일 투약량이다. 다른 양태에서, 상기 단일 투약 일정은 2세 이상의 연령의 건강한 사람을 위한 것이다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 백신접종 일정은 다중 투약 일정이다. 다른 양태에서, 상기 다중 투약 일정은 약 1 내지 약 2개월의 간격으로 분리된 일련의 2회 투약을 포함한다. 한 양태에서, 상기 다중 투약 일정은 약 1개월의 간격으로 분리된 일련의 2회 투약량 또는 약 2개월의 간격으로 분리된 일련의 2회 투약량을 포함한다.
다른 양태에서, 상기 다중 투약 일정은 약 1 내지 약 2개월의 간격으로 분리된 일련의 3회 투약을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 다중 투약 일정은 약 1개월의 간격으로 분리된 일련의 3회 투약, 또는 약 2개월의 간격으로 분리된 일련의 3회 투약량을 포함한다.
다른 양태에서, 상기 다중 투약 일정은 약 1 내지 약 2개월의 간격으로 분리된 일련의 3회 투약 및 이어서 제1 투약 후 약 10 내지 약 13개월의 제4 투약을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 다중 투약 일정은 약 1개월의 간격으로 분리된 일련의 3회 투약 및 이어서 제1 투약 후 약 10 내지 약 13개월의 제4 투약, 또는 약 2개월의 간격으로 분리된 일련의 3회 투약 및 제1 투약 후 약 10 내지 약 13개월의 4차 투여를 포함한다.
한 양태에서, 다중 투약 일정은 생후 첫 해에 1회 이상의 투약량(예컨대, 1, 2 또는 3회 투약량) 및 이어서 1회 이상의 유아 투약량을 포함한다.
한 양태에서, 다중 투약 일정은 2개월의 연령에 개시하여 12 내지 18개월의 연령의 유아 투약량의 약 1 내지 약 2개월의 간격으로(예컨대, 투약 사이에 28 내지 56일) 분리된 일련의 2 또는 3회 투약을 포함한다. 한 양태에서, 상기 다중 투약 일정은 2개월의 연령에 개시하여 12 내지 15개월의 연령의 유아 투약량의 약 1 내지 2개월의 간격으로(예컨대, 투약 사이에 28 내지 56일) 분리된 일련의 3회 투약을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 다중 투약 일정은 2개월의 연령에 개시하여 12 내지 18개월의 연령의 일련의 2회 투약을 포함한다.
한 양태에서, 다중 투여 일정은 생후 2, 4, 6 및 12 내지 15개월의 연령에 4회 투약량 시리즈의 백신을 포함한다.
한 양태에서, 1차 투약량은 0일에 제공되고, 하나 이상의 부스터는 약 2 내지 약 24주의 간격, 바람직하게는 4 내지 8주의 투약 간격으로 제공된다.
한 양태에서, 1차 용량은 0일에 제공되고, 부스터는 약 3개월 후에 제공된다.
키트 및 공정
한 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 면역원성 조성물 및 정보 전단지를 포함하는 키트에 관한 것이다.
한 양태에서, 상기 정보 전단지는 대장균에 대한 기능성 항체를 유도하는 조성물의 능력을 포함한다.
한 양태에서, 상기 정보 전단지는 인간 집단에서 대장균 혈청형 O25B에 대한 OPA 역가를 유도하는 조성물의 능력을 포함한다. 한 양태에서, 상기 정보 전단지는 인간 집단에서 대장균 혈청형 O1에 대한 OPA 역가를 유도하는 조성물의 능력을 포함한다. 한 양태에서, 상기 정보 전단지는 인간 집단에서 대장균 혈청형 O2에 대한 OPA 역가를 유도하는 조성물의 능력을 포함한다. 한 양태에서, 상기 정보 전단지는 인간 집단에서 대장균 혈청형 O6에 대한 OPA 역가를 유도하는 조성물의 능력을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 (i) 본 개시내용의 면역원성 조성물을 제조하는 단계, 및 (ii) 동일한 키트에서 면역원성 조성물 및 정보 전단지를 조합하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물 및 정보 전단지를 포함하는 키트를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 정보 전단지는 대장균에 대한 기능성 항체를 유도하는 상기 조성물의 능력을 언급한다.
한 양태에서, 본 발명은 (i) 본 개시내용의 면역원성 조성물을 제조하는 단계, 및 (ii) 동일한 키트에서 면역원성 조성물 및 정보 전단지를 조합하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물 및 정보 전단지를 포함하는 키트를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 정보 전단지는 인간 집단에서 대장균에 대한 항-O-항원 항체를 유도하는 조성물의 능력을 언급한다.
한 양태에서, 본 발명은 (i) 본 개시내용의 면역원성 조성물을 제조하는 단계, 및 (ii) 동일한 키트에서 면역원성 조성물 및 정보 전단지를 조합하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물 및 정보 전단지를 포함하는 키트를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 정보 전단지는 인간 집단에서 대장균에 대한 OPA 역가를 유도하는 조성물의 능력을 언급한다.
한 양태에서, 본 발명은 (i) 본 개시내용의 면역원성 조성물을 제조하는 단계, (ii) 대장균에 대한 기능성 항체를 유도하는 상기 조성물의 능력을 언급하는 정보 전단지를 인쇄하는 단계, (iii) 동일한 키트에서 상기 면역원성 조성물 및 상기 정보 전단지를 조합하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물 및 정보 전단지를 포함하는 키트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 (i) 본 개시내용의 면역원성 조성물을 제조하는 단계, (ii) 인간 집단에서 대장균에 대한 OPA 역가를 유도하는 조성물의 능력을 언급하는 정보 전단지를 인쇄하는 단계, (iii) 동일한 키트에서 상기 면역원성 조성물 및 상기 정보 전단지를 조합하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물 및 정보 전단지를 포함하는 키트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
실시예
본 발명이 더 잘 이해될 수 있도록 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이고, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 다음 실시예는 본 발명의 일부 양태를 설명한다.
실시예 1: 대장균 및 살모넬라 엔테리카 균주
임상 균주 및 유도체는 표 3에 열거된다. 추가 기준 균주는 다음을 포함한다: O25K5H1, 임상 O25a 혈청형 균주, 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 균주 LT2.
표적화된 개방-판독 프레임을 제거하지만, 짧은 흉터 서열을 남기는 대장균 균주의 유전자 녹아웃이 구축된다.
가수분해된 O-항원 쇄 및 코어 당은 단순화를 위해 이어서 O-폴리사카라이드(OPS)로 표시된다.
[표 3]
Figure 112021033935808-pct00016
실시예 2: wzzB, fepE 및 O-항원 유전자 클러스터 클로닝을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머
[표 4]
Figure 112021033935808-pct00017
Figure 112021033935808-pct00018
실시예 3: 플라스미드
플라스미드 벡터 및 서브클론은 표 5에 열거된다. 다양한 대장균 및 살모넬라 wzzB 및 fepE 유전자를 갖는 PCR 단편을 정제된 게놈 DNA로부터 증폭시키고, 인비트로겐(Invitrogen) PCR(등록상표) 블런트(Blunt) 클로닝 키트에 제공된 높은 카피 수 플라스미드로 서브클로닝한다(도 1). 이러한 플라스미드는 pUC 레플리콘을 기반으로 한다. 프라이머 P3 및 P4를 사용하여 천연 프로모터로 대장균 wzzB 유전자를 증폭하고, UDP-글루코스-6-데하이드로게나제 및 포스포리보실아데닌 뉴클레오티드 가수분해 효소를 각각 코딩하는 근위 및 원위 유전자의 영역에 결합하도록 고안된다(젠뱅크 MG1655 NC_000913에 주석 표시됨). 살모넬라 fepE 유전자 및 프로모터를 함유하는 PCR 단편은 상기 기술된 프라이머를 사용하여 증폭된다. 유사한 대장균 fepE 프라이머는 이용가능한 젠뱅크 게놈 서열 또는 내부적으로 생성된 전체 게놈 데이터(GAR2401 및 O25K5H1의 경우)를 기반으로 고안된다. 낮은 카피 수 플라스미드 pBAD33을 사용하여 아라비노스 프로모터의 제어 하에 O-항원 생합성 유전자를 발현한다. 플라스미드는 5' 프로모터 및 3' 6-포스포글루코네이트 탈수소효소(gnd) 유전자에 상동성인 범용 프라이머를 사용하여 증폭된 긴 PCR 단편의 클로닝(깁슨(Gibson) 방법을 통해)을 용이하게 하기 위해 먼저 변형된다(표 5). O25b 생합성 오페론을 함유하는 pBAD33 서브클론은 도 1에 예시된다.
[표 5]
Figure 112021033935808-pct00019
실시예 4: O-항원 정제
발효 배양액을 아세트산으로 1 내지 2%(최종 pH 4.1)의 최종 농도까지 처리한다. OAg의 추출 및 탈지질화는 산 처리된 배양액을 100℃까지 2시간 동안 가열하여 달성된다. 산 가수분해가 끝날 때, 회분을 상온으로 냉각하고, 14% NH4OH를 최종 pH 6.1로 첨가한다. 중화된 배양액을 원심분리하고, 원심액을 수집한다. 원심액에 나트륨 포스페이트 중 CaCl2를 첨가하고, 생성된 슬러리를 실온에서 30분 동안 항온처리한다. 고체를 원심분리로 제거하고, 10 kDa 막을 사용하여 원심액을 12배 농축하고, 이어서 물에 대해 2회 정용여과한다. 이어서, OAg를 함유한 보유물(retentate)을 탄소 필터를 사용하여 정제한다. 탄소 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트로 1:1(v/v) 희석한다. 최종 암모늄 설페이트 농도는 2 M이다. 암모늄 설페이트 처리된 탄소 여액은 2 M 암모늄 설페이트를 실행 완충액으로서 사용하는 막을 사용하여 추가로 정제한다. OAg는 유동을 통해 수집된다. 장쇄 OAg의 경우, HIC 여액을 농축하고, 이어서 5 kDa 막을 사용하여 물(20 정용부피)과 완충액을 교환한다. 단쇄 (천연) OAg 폴리사카라이드의 경우, MWCO를 추가로 감소시켜 수율을 강화시킨다.
실시예 5: CRM 197 에 대한 O25b 장쇄 O-항원의 접합
장쇄 O25b 폴리사카라이드-CRM197 접합체의 제1 세트를, 퍼요오데이트 산화, 및 이어서 환원적 아민화 화학(RAC)을 사용하는 접합을 사용하여 생산한다(표 7). 산화 수준을 변화시킴으로써 3개의 활성화 수준(낮음, 중간 및 높음)을 가진 접합체 변이체를 생산한다. 환원제로서 나트륨 시아노보로하이드라이드를 사용함으로써, 동결건조된 활성화된 폴리사카라이드를 DMSO 매질에서 재구성된 동결건조된 CRM197과 반응시켜 접합체를 생산한다. 접합 반응을 23℃에서 24시간 동안 수행하고, 이어서 나트륨 보로하이드라이드를 사용하여 3시간 동안 캡핑한다. 접합 급냉 단계 후, 접합체를 5 mM 석시네이트/0.9% NaCl, pH 6.0을 사용하는 100 K MWCO 재생 셀룰로스 막에 의한 한외여과/정용여과에 의해 정제한다. 접합체의 최종 여과를 0.22 μm 막을 사용하여 수행한다.
달리 명시적으로 언급하지 않는 한, 하기 실시예 전반에 걸쳐 개시된 접합체는 코어 사카라이드 모이어티를 포함한다.
1.1. 이종 폴리머라제 쇄 길이 조절자에 의해 부여된 장쇄 O-항원 발현
초기 대장균 균주 구성은 O25 혈청형에 중점을 둔다. 목표는 이종 wzzB 또는 fepE 유전자를 과발현하여 O25 wzzB 녹아웃 균주에 더 긴 장쇄 길이를 부여하는지 확인하는 것이다. 먼저, O25a 및 O25b 아형의 균주를 동정하기 위해 PCR에 의해 혈액 단리물을 선별한다. 이어서, 암피실린에 대한 민감성에 대해 균주를 선별한다. 단일 암피실린 민감성 O25b 단리물 GAR2401을 동정하고, wzzB 결실을 도입한다. 유사하게, wzzB 결실은 O25a 균주 O25K5H1에서 이루어진다. 이러한 돌연변이의 유전적 상보성을 위해, GAR 2401 및 O25K5H1의 wzzB 유전자를 높은 카피 PCR-블런트 II 클로닝 벡터에 서브클로닝하고, 전기천공에 의해 두 균주에 도입한다. 대장균 K-12 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 LT2의 추가 wzzB 유전자(마찬가지로 대장균 O25K5H1, GAR2401, O25a ETEC NR-5, O157:H7:K- 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 LT2의 fepE 유전자)를 유사하게 클로닝하고 이전한다.
wzzB 녹아웃 균주 O25K5H1(O25a) 및 GAR2401(O25b)의 플라스미드 형질전환체에서 LPS 발현의 유전적 상보성은 도 2에 도시된다. 세균을 LB 매질에서 밤새 성장시키고, LPS를 페놀로 추출하고, SDS PAGE(4 내지 12% 아크릴아미드)로 분리하고, 염색한다. 겔의 각각의 웰에 동일한 수의 세균 세포(약 2 OD600 단위)로부터 추출된 LPS를 로딩한다. LPS의 크기를 내부 천연 대장균 LPS 표준으로부터 쇄 길이의 넓은 분포를 나타내는 샘플의 부분집합에서 식별할 수 있는 사다리를 계수함으로써 추정한다(하나의 반복 단위에 따라 다름). 도 3의 패널 A의 좌측 상에, O25a O25K5HΔwzzB의 플라스미드 형질전환체의 LPS 프로파일이 도시되고; 우측 상에, 025b GAR 2401ΔwzzB 형질전환체의 유사한 프로파일이 도시된다. O25-특이적 혈청으로 프로빙된 복제 겔의 면역블롯이 도 3의 패널 B에 도시된다.
이러한 실험의 결과는 상동성 wzzB 유전자를 대장균 O25aΔwzzB 숙주에 도입하는 것이, 살모넬라 LT2 wzzB와 마찬가지로 단쇄 O25 LPS(10-20x)의 발현을 회복함을 나타낸다. GAR2401의 O25b wzzB 유전자 도입은 이러한 균주의 WzzB 효소에 결함이 있음을 시사하지 않는다. 대장균 WzzB 아미노산 서열의 비교는 A210E 및 P253S 치환이 원인일 수 있음을 시사한다. 중요하게도, O25a O25K5H1의 살모넬라 LT2 fepE 및 대장균 fepE는 매우 긴(VL) OAg LPS를 발현하는 능력을 부여하고, 살모넬라 LT2 fepE는 OAg가 대장균 fepE가 부여한 크기를 초과하는 결과를 야기한다.
유사한 발현 패턴이 GAR2401ΔwzzB 형질전환체에서 관찰된다: 대장균 O25a 또는 K12 균주 wzzB는 단쇄 LPS를 생성하는 능력을 회복한다. 살모넬라 LT2 fepE는 가장 긴 LPS를 생성하고, 대장균 fepE는 약간 더 짧은 LPS를 생성한 반면, 살모넬라 LT2 wzzB는 중간 크기의 장쇄 LPS(L)를 생성한다. 매우 긴 LPS를 생성하는 다른 대장균 fepE 유전자의 능력은 대장균 O25aΔwzzB의 형질전환체를 사용한 별도의 실험에서 평가된다. GAR2401, O25a ETEC 균주 및 O157 시겔라 독소 생산 균주의 fepE 유전자는 또한 매우 긴 LPS를 생산할 수 있는 능력을 부여하지만, 살모넬라 LT2 fepE로 생성된 LPS만큼 길지는 않다(도 4). fepE 아미노산 서열의 정렬은 도 5에 도시된다.
혈청형 O25a 및 O25b 균주에서 살모넬라 LT2 fepE가 평가된 폴리머라제 조절자 중 가장 긴 LPS를 생성한다는 사실을 확인한 후, 본 발명자들은 다른 대장균 혈청형에서도 매우 긴 LPS를 생성할지 여부를 결정하고자 한다. 혈청형 O1, O2, O6, O15 및 O75의 야생형 균혈증 단리물을 살모넬라 fepE 플라스미드로 형질전환하고, LPS를 추출한다. 도 6에 도시된 결과는 살모넬라 fepE가 혈액 감염과 관련된 다른 우세한 혈청형에서 매우 긴 LPS를 만드는 능력을 부여할 수 있음을 확인한다. 결과는 또한 살모넬라 fepE의 플라스미드-기반 발현이 이러한 균주에서 내인성 wzzB에 의해 통상적으로 발휘되는 쇄 길이의 제어를 무시하는 것으로 나타남을 제시한다.
1.2. 통상적인 대장균 숙주 균주에서 O-항원의 플라스미드-기반 발현
생물공정 개발의 관점에서 볼 때, 여러 균주 대신 통상적인 대장균 숙주에서 상이한 혈청형의 O-항원을 생성하는 능력은 개별 항원의 제조를 크게 단순화시킬 것이다. 이를 위해, 상이한 혈청형의 O-항원 유전자 클러스터를 PCR로 증폭하고, 아라비노스 조절된 프로모터의 제어 하에 낮은 카피 수 플라스미드(pBAD33)로 클로닝한다. 이러한 플라스미드는 상이한 (p15a) 레플리콘 및 상이한 선택가능한 마커(클로람페니콜 대 카나마이신)를 보유하고 있으므로, 대장균의 살모넬라 LT2 fepE 플라스미드와 상용성이다(공존할 수 있음). 제1 실험에서, pBAD33 O25b 오페론 플라스미드 서브클론을 살모넬라 LT2 fepE 플라스미드와 함께 GAR2401△wzzB 및 0.2% 아라비노스의 존재 또는 부재 하에 성장된 형질전환체로 공동-형질감염시킨다. 도 7에 도시된 결과는 매우 긴 O-항원 LPS가 아라비노스-의존 방식으로 생산됨을 나타낸다.
다른 혈청형으로부터 클로닝된 O-항원 유전자 클러스터를 유사하게 평가하고, 결과를 도 8에 도시한다. 살모넬라 LT2 fepE 및 pBAD33-OAg 플라스미드의 공동-발현은 O1, O2(4개 클론 중 2개 클론), O16, O21 및 O75 혈청형에 상응하는 검출가능한 장쇄 LPS를 생성한다. 비공지된 이유로, pBAD33-O6 플라스미드는 시험된 4개의 단리물 모두에서 검출가능한 LPS를 생성하지 못한다. 발현 수준이 다양하지만, 결과는 공통 숙주에서 장쇄 O-항원의 발현이 가능함을 나타낸다. 그러나, 일부 경우에, 발현을 개선하기 위한 추가 최적화, 예를 들어 플라스미드 프로모터 서열의 변형이 필요할 수 있다.
살모넬라 LT2 fepE 플라스미드의 존재 또는 부재 하의 상이한 혈청형 O25 대장균 균주로부터의 LPS의 프로파일이 도 11에 도시된다. O-항원의 발효, 추출 및 정제를 위해 2개의 균주가 연구된다: 천연 단쇄 O25b OAg의 생산을 위해 GAR2831; 및 장쇄 O25b OAg의 생산을 위해 GAR2401ΔwzzB/fepE. 도 11에 도시된 상응하는 단쇄 및 장쇄 형태 LPS에서, SDS-PAGE 겔은 빨간색으로 강조된다. 폴리사카라이드를 아세트산으로 발효된 세균에서 직접 추출하고, 정제한다. 정제된 단쇄 및 장쇄 또는 매우 긴 O25b 폴리사카라이드의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일은 도 12에 도시된다. (GAR2831로부터의) 단쇄 폴리사카라이드의 2개의 로트의 특성을 (균주 GAR2401ΔwzzB/fepE로부터의) 단일 매우 긴 폴리사카라이드 제제와 비교한다. 장쇄 O-항원의 분자량은 단쇄 O-항원의 분자량보다 3.3배 크고, 반복 단위의 수는 약 65(매우 긴) 대 약 20으로 추정된다. 표 6을 참고한다.
[표 6]
Figure 112021033935808-pct00020
매우 긴 O25b O-항원 폴리사카라이드를 통상적인 환원적 아민화 공정을 사용하여 디프테리아 톡소이드 CRM197에 접합한다. 3개의 상이한 로트의 당접합체를 다양한 정도의 퍼요오데이트 활성화:중간(5.5%), 낮음(4.4%) 및 높음(8.3%)으로 제조한다. 생성된 제제 및 비접합된 폴리사카라이드는 내독소 오염이 없는 것으로 나타났다(표 7).
4 마리의 토끼의 군(뉴질랜드 화이트 암컷)에 도 13a에 제시된 일정에 따라 각각 10 mcg의 당접합체와 20 mcg의 QS21 보조제 및 혈청 샘플(VAC-2017-PRL-EC-0723)을 백신접종한다. 10 mcg 투약량은 세균성 당접합체의 평가에서 토끼에게 통상적으로 제공된 범위의 하한이라는 점에 주목할 가치가 있다(20 내지 50 mcg가 더 전형적임). 토끼의 군에 또한 동일한 투약량(10 mcg 폴리사카라이드 + 20 mcg QS21 보조제) 및 동일한 투여 일정을 사용하는 비접합된 폴리사카라이드로 별도의 연구(VAC-2017-PRL-GB-0698)에서 백신접종한다.
3개의 O25b 당접합체 제제에 대한 토끼 항체 반응을 루미넥스 검정에서 평가하고, 이때 카복시 비드는 비접합된 O25b 장쇄 폴리사카라이드로 미리 결합된 메틸화된 인간 혈청 알부민으로 코팅된다. 혈청 샘플에서 O25b-특이적 IgG 항체의 존재를 피코에리트린(PE)-표지된 항-IgG 2차 항체로 검출한다. 가장 잘 반응하는 토끼(4개의 각각의 군 중 1 마리)에서 0주(면역 전), 6주(투약 2 후, PD2), 8주(투약 3 후, PD3) 및 12주(투약 4 후, PD4)에 샘플링된 혈청에서 관찰된 면역 반응의 프로파일은 도 14에 도시된다. 12 마리의 토끼 모두에서 면역 전 혈청 IgG 역가가 유의하게 검출되지 않는다. 대조적으로, O25b 항원-특이적 항체 반응은 3개 군 모두의 토끼로부터의 백신접종 후 혈청에서 검출되고, 저 활성화 당접합체 군 반응은 중간 또는 높은 활성 당접합체 군보다 약간 높은 경향을 보인다. 투약 3 후 시점에서 최대 반응이 관찰된다. 저 활성화 군의 한 토끼와 고 활성화 군의 한 토끼는 백신접종에 반응하지 않는다(비-반응자).
장쇄 O25b OAg 폴리사카라이드의 면역원성에 대한 CRM197 담체 단백질 접합의 영향을 평가하기 위해, 비접합된 폴리사카라이드로 백신접종된 토끼의 혈청내 항체의 존재를 저 활성화 CRM197 당접합체로 백신접종된 토끼의 혈청과 비교한다(도 15). 놀랍게도, 유리 폴리사카라이드는 면역원성이 아니었고, 면역 대 면역 전 혈청에서 사실상 IgG 반응을 유도하지 않았다(패널 A). 대조적으로, O25b OAg-특이적 IgG는 혈청 희석 범위(1:100 내지 1:6,400)에 걸쳐 O25b OAg-CRM197로 백신접종된 4 마리 토끼 중 3 마리의 PD4 혈청에서 면역 전 혈청 수준보다 약 10배 높은 O25b OAg-특이적 IgG 평균 형광 강도 값(MFI)이 관찰된다. 이러한 결과는 10 mcg 투약량 수준에서 O25b OAg 폴리사카라이드에 대한 IgG 항체를 생성하기 위해 담체 단백질 접합의 필요성을 나타낸다.
TSA 플레이트에서 성장한 세균을 PBS에 현탁하고, OD600을 2.0으로 조정하고, PBS 중 4% 파라포름알데하이드에 고정한다. 4% BSA/PBS에서 1시간 동안 차단한 후, 세균을 2% BSA/PBS에서 면역 전 및 PD3 면역 혈청의 연속 희석액과 함께 배양하고, 결합된 IgG를 PE-표지된 2차 F(ab) 항체로 검출한다.
O25b OAg-CRM197에 의해 유도된 O25b 항체의 특이성은 온전한 세균을 사용한 유세포분석 실험에서 입증된다. 전체 세포에 대한 IgG의 결합은 어큐리(Accuri) 유세포분석기에서 PE-접합된 F(ab')₂단편 염소 항-토끼 IgG로 검출된다.
도 16에 도시된 바와 같이, 면역 전 토끼 항체는 야생형 혈청형 O25b 단리물 GAR2831 및 GAR2401 또는 K-12 대장균 균주에 결합하는 데 실패한 반면, 일치된 PD3 항체는 농도 의존적 방식으로 O25b 세균을 염색한다. OAg를 발현하는 능력이 없는 음성 대조군 K-12 균주는 PD3 항체의 매우 약한 결합만을 나타냈는 데, 이는 표면에 노출된 내부 코어 올리고사카라이드 에피토프의 존재에 기인할 가능성이 가장 높다. 살모넬라 fepE 플라스미드를 야생형 O25b 단리물에 도입하는 것은 더 긴 OAg 폴리사카라이드가 제공하는 더 높은 밀도의 면역원성 에피토프와 일치하는 현저하게 향상된 염색을 나타낸다.
결론: 기술된 결과는 살모넬라 fepE가 살모넬라 종에서 매우 긴 O-항원 폴리사카라이드의 결정자일 뿐만 아니라, 상이한 O-항원 혈청형의 대장균 균주에 매우 긴 OAg를 만드는 능력을 부여할 수 있음을 나타낸다. 이러한 특성은 적절한 담체 단백질에 대한 정제 및 화학적 접합을 촉진하고, 고 분자량 복합체의 형성을 통해 잠재적으로 면역원성을 향상시킴으로써, 생물공정 개발에 대한 개선된 특성을 갖는 O-항원 백신 폴리사카라이드를 생성하는 데 이용될 수 있다.
실시예 6: 초기 토끼 연구는 RAC O25b OAg-CRM 197 에 대한 최초의 다클론 항체 시약 및 IgG 반응을 생성한다
장쇄 O25b 폴리사카라이드-CRM197 접합체를, 퍼요오데이트 산화 및 이어서 환원적 아민화 화학(RAC)을 사용하는 접합을 사용하여 생산한다(표 7). 표 17을 참고한다.
[표 7]
Figure 112021033935808-pct00021
토끼 연구 1(VAC-2017-PRL-EC-0723)(실시예 5에서도 전술됨)에서, 10 μg L-, M- 또는 H-활성화 RAC(+ QS21)를 갖는 5개의 토끼/군은 도 13a에 도시된 일정에 따른 조성물을 수용한다. 비접합된 유리 O25b 폴리사카라이드는 후속 토끼 연구(VAC-2017-PRL-GB-0698)에서 면역원성이 아닌 것으로 관찰된다(도 18 참조).
토끼 연구 2(VAC-2018-PRL-EC-077)에서, L-RAC(AlOH3, QS21 또는 보조제 부재)를 갖는 2 마리의 토끼/군은 도 13b에 도시된 일정에 따라 조성물을 수용한다.
토끼 4-1, 4-2, 5-1, 5-2, 6-1 및 6-2는 실시예 5에 기술된 매우 긴 비접합된 O25b 폴리사카라이드를 수용하고, 18주 혈청을 시험한다.
더욱 구체적으로, 50 μg 비접합된 O25b, 100 μg AlOH3 보조제를 포함하는 조성물을 토끼 4-1에 투여한다. 50 μg 비접합된 O25b, 100 μg AlOH3 보조제를 포함하는 조성물을 토끼 4-2에 투여한다. 50 μg 비접합된 O25b, 50 μg QS-21 보조제를 포함하는 조성물을 토끼 5-1에 투여한다. 50 μg 비접합된 O25b, 50 μg QS-21 보조제를 포함하는 조성물을 토끼 5-2에 투여한다. 보조제 부재 하에 50 μg의 비접합된 O25b를 포함하는 조성물을 토끼 6-1에 투여한다. 보조제 부재 하에 50 μg 비접합된 O25b를 포함하는 조성물을 토끼 6-2에 투여한다.
실시예 7: O25b RAC 접합체를 사용한 토끼 연구: dLIA 혈청 희석 역가
토끼 연구 2(VAC-2018-PRL-EC-077) O25b dLIA 혈청 희석 역가 대 연구 1의 최선 반응 토끼(VAC-2017-PRL-EC-0723). 이러한 실험을 위해, O25b 장쇄 O-항원의 폴리리신 접합체가 전술된 메틸화된 혈청 알부민 장쇄 O-항원 혼합물 대신 루미넥스(Luminex) 카복시 비드 상에 수동적으로 흡착된 변형된 직접 결합 루미넥스 검정이 구현된다. 폴리리신-O25b 접합체의 사용은 검정의 민감도와 IgG 농도 의존 반응의 품질을 개선하여 곡선-정합(4개의 파라미터의 비선형 방정식)을 사용하여 혈청 희석 역가를 결정할 수 있게 한다. 제1 연구에서 최고 역가 토끼의 혈청내 O25b IgG 역가를 표 8의 두 번째 연구 토끼의 혈청과 비교한다.
[표 8]
Figure 112021033935808-pct00022
두 번째 토끼 연구에서 더 높은 투약량(50/20 μg 대 10 μg)은 IgG 역가를 개선하지 못한다.
2개월 휴식은 IgG 반응을 증가시킨다(짧은 간격에서는 관찰되지 않음).
명반은 QS21 또는 보조제 부재와 비교하여 토끼에서 IgG 반응을 향상시키는 것으로 나타났다.
O-항원 당접합체의 기능적 면역원성을 측정하기 위해 아기 토끼 보체(BRC) 및 HL60 세포를 호중구의 공급원으로 사용하는 옵소닌포식성 검정(OPA)을 확립한다. 대장균 GAR2831의 사전-동결된 세균 스톡을 37℃에서 루리아(Luria) 배양액(LB) 매질에서 성장한다. 세포를 펠릿화하고, 20% 글리세롤이 보충된 PBS에서 1 mL 당 1 OD600 단위의 농도로 현탁하고, 동결시킨다. 사전-역가된 해동된 세균을 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution, 행크의 균형 염 용액)에서 1% 젤라틴과 함께 0.5 x 105 CFU/mL로 희석하고, 10 μL(103 CFU)를 U-바닥 조직 배양 마이크로플레이트 조직에서 연속 희석된 20 μL의 혈청과 조합하고, 혼합물을 700 rpm 벨코 쉐이커(BELLCO Shaker)에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 진탕한다. 10 μL의 2.5% 보체(아기 토끼 혈청, PEL-FREEZ 31061-3, HBG에서 사전-희석됨) 및 20 μL의 HBG를 U-바닥 조직 배양 마이크로플레이트에 첨가하고, 혼합물을 700 rpm 벨코 쉐이커에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 45분 동안 진탕한다. 이어서, 각각의 100 μL 반응의 10 μL를, 100 μL 물을 적용함으로써 제조된 사전-습윤된 밀리포어 멀티스크린(MILLIPORE MULTISCREEN)HTS HV 필터 플레이트의 상응하는 웰로 옮기고, 진공 여과하고, 150 μL의 50% LB를 적용한다. 필터 플레이트를 진공 여과하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 항온처리한다. 다음날, 이뮤노스팟(IMMUNOSPOT, 등록상표) 분석기 및 이뮤노캡쳐(IMMUNOCAPTURE) 소프트웨어를 사용하여 쿠마시(COOMASSIE) 염료 및 데스테인(Destain) 용액으로 고정, 염색 및 탈색한 후, 콜로니를 열거한다. OPA 활성의 특이성을 확립하기 위해, OPA 반응에서 다른 검정 성분과 조합하기 전에 면역 혈청을 100 μg/mL 정제된 장쇄 O25b O-항원과 사전-항온처리한다. OPA 검정은 HL60 세포 또는 보체 부재하의 대조 반응을 포함하여 이러한 성분에 대한 임의의 관찰된 사멸의 의존성을 입증한다.
두 토끼 연구의 대표적인 토끼로부터의 일치된 면역 전 및 백신접종 후 혈청 샘플을 검정에서 평가하고, 혈청 희석 역가를 결정한다(표 9, 도 19a 및 19b). 비접합된 O25b 장쇄 O-항원 폴리사카라이드와의 사전-항온처리는 OPA의 특이성을 나타내는 살균 활성을 차단한다(도 19c)(표 9 OPA 역가)
토끼 2-3은 다음과 같이 투약된다: 토끼 2-3 투약: 10/10/10/10 μg RAC 접합체 + QS21, 투약 후(PD) 4 채혈. 토끼 1-2는 다음과 같이 투약된다: 50/20/20/20 μg RAC 접합체 + Al(OH)3, PD4 채혈.
[표 9]
Figure 112021033935808-pct00023
실시예 8: 비접합된 O25b 장쇄 O-항원 폴리사카라이드 및 유도된 O25b RAC/DMSO 장쇄 O-항원 당접합체에 의해 유도된 O-항원 O25b IgG 수준
10 마리의 CD-1 마우스의 군에 0, 5 및 13주에 0.2 또는 2.0 μg/동물의 O25b RAC/DMSO 장쇄 O-항원 당접합체를 피하 주사함으로써 투약하고, 면역원성 시험을 위한 3주(투약 1 후, PD1), 6주(투약 2 후, PD2) 및 13주(투약 3 후, PD3) 시점에 채혈한다. 항원-특이적 IgG의 수준을 내부 표준으로서 O25b-특이적 마우스 mAb를 사용하여 정량적 루미넥스 검정(실시예 7의 세부사항 참조)에 의해 측정한다. 기준선 IgG 수준(점선)을 20x 무작위로 선택되는 백신접종되지 않은 마우스로부터 풀링된 혈청에서 결정한다. 유리 비접합된 O25b 장쇄 O-항원 폴리사카라이드 면역원은 어떤 시점에서도 기준선 수준 이상으로 IgG를 유도하지 않았다. 대조적으로, IgG 반응은 O25b-CRM197 RAC 장쇄 접합체 당접합체를 2회 투약 후에 관찰한다: PD3에 의해 강력하고 균일한 IgG 반응이 관찰되고, PD2에서 중간 및 더 가변적인 IgG 수준이 관찰된다. GMT IgG 값(ng/mL)은 95% CI 오류 막대로 표시된다. 도 20을 참고한다.
실시예 9: O25b 아기 토끼 보체(BRC) OPA의 특이성
A-B) 토끼 2-3 및 1-2의 O25b RAC/DMSO 장쇄 O-항원 면역 후 혈청(그러나, 일치하지 않는 면역 전 대조군 혈청이 아님)은 살균성 OPA 활성을 나타낸다. C) 토끼 1-2의 면역 혈청의 OPA 활성을 100 μg/mL 길이의 O-항원 O25b 폴리사카라이드와 사전-배양하여 차단한다. 균주 GAR2831 세균을 HL60s, 2.5% BRC 및 혈청의 연속 희석액과 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고, 필터 플레이트에서 마이크로콜로니(CFU)를 계수하여 생존 세균을 계수한다. 도 19를 참고한다.
실시예 10: RAC 및 eTEC O25b 장쇄 당접합체는 단일-말단 당접합체보다 더 면역원성이다
카르바페넴-내성 플루오로퀸론-내성 MDR 균주 Atlas187913을 사용한 BRC OPA 검정. 20개의 CD-1 마우스 군에 도 21에 도시된 바와 동일한 일정에 따라 2 μg의 당접합체를 백신접종하고, OPA 반응을 투약 2 후(PD2)(패널 A) 및 투약 3 후(PD3)(패널 B) 시점에서 측정한다. 막대는 95% CI를 갖는 GMT를 나타낸다. 백신접종되지 않은 기준선 이상의 반응자 비율이 표시된다. 상이한 군의 로그 변환 데이터를 평가하여 웰치(Welch) 보정[그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)]과 함께 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 차이가 통계적으로 유의한지 평가한다. 결과는 표 10에 요약된다. 도 21을 참고한다. 2 μg의 eTEC O1a 장쇄 당접합체가 백신접종된 마우스에서, O1a, PD2 및 PD3에 대한 OPA 역가(데이터는 표시되지 않음)가 각각 표 10에 제시된 O25b, PD2 및 PD3에 대한 OPA 역가보다 더 큰 것으로 관찰된다.
[표 10]
Figure 112021033935808-pct00024
실시예 11: eTEC 화학의 OPA 면역원성은 폴리사카라이드 활성화 수준을 변경함으로써 개선될 수 있다
카르바페넴-내성 플루오로퀸론-내성 MDR 균주 Atlas187913을 사용한 BRC OPA 검정. 20개의 CD-1 마우스의 군에 0.2 μg 또는 2 μg의 지시된 장쇄 O25b eTEC 당접합체를 백신접종하고, OPA 반응을 PD2 시점에 측정한다. 4% 활성화 대 17% 활성화 군에서 집계된 로그 변환 데이터를 평가하여 웰치 보정(그래프패드 프리즘)과 함께 짝을 이루지 않은 t-시험를 사용하여 OPA 반응의 차이가 통계적으로 유의함을 확인한다. 개별 군에 대한 GMT 및 반응자 비율은 표 11에 요약되어 있다. 도 22를 참고한다.
[표 11]
Figure 112021033935808-pct00025
실시예 12: 챌린지 연구는 장쇄 대장균 O25b eTEC 접합체가 3회 투약 후 보호를 유도함을 나타낸다
표시된 일정에 따라 2 μg 투약량으로 면역화된 20x CD-1 마우스의 군에 균주 GAR2831의 1 x 109개 세균으로 IP 챌린지를 받았다. 후속 생존을 6일 동안 모니터링한다. 4%, 10% 또는 17% 수준에서 활성화된 eTEC 당접합체로 백신접종된 마우스 군은 치명적 감염으로부터 보호되는 반면, 백신접종되지 않은 대조군 마우스 또는 2 μg 비접합된 O25b 장쇄 폴리사카라이드로 백신접종된 마우스는 그렇지 않았다. 도 23을 참고한다.
실시예 13: eTEC 연결된 당접합체의 제조 방법
시스타민 다이하이드로클로라이드를 사용한 사카라이드 및 티올화의 활성화. 사카라이드는 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에서 재구성된다. 용액의 수분 함량은 칼 피셔(Karl Fischer, KF) 분석에 의해 측정되고, 수분 함량이 0.1 및 1.0%, 전형적으로 0.5%에 도달하도록 조정된다.
활성화를 개시하기 위해, 1,1'-카보닐-다이-1,2,4-트라이아졸(CDT) 또는 1,1'-카보닐다이이미다졸(CDI) 용액을 DMSO에서 100 mg/mL의 농도로 새로 제조한다. 사카라이드는 다양한 양의 CDT/CDI(1 내지 10 몰 당량)로 활성화되고, 반응을 실온 또는 35℃에서 1 내지 5시간 동안 진행된다. 물을 첨가하여 활성화 반응 용액에서 임의의 잔류 CDI/CDT를 급냉시킨다. 추가된 물의 양을 결정하고, 최종 수분 함량이 총 수성 물질의 2 내지 3%가 되도록 계산을 수행한다. 반응을 실온에서 0.5시간 동안 진행한다. 시스타민 다이하이드로클로라이드를 50 mg/mL의 농도로 무수 DMSO에서 새로 제조한다. 활성화된 사카라이드는 1 내지 2 몰 당량의 시스타민 다이하이드로클로라이드와 반응시킨다. 다르게는, 활성화된 사카라이드를 1 내지 2 몰 당량의 시스타민 다이하이드로클로라이드와 반응시킨다. 티올화 반응을 실온에서 5 내지 20시간 동안 진행하여 티올화된 사카라이드를 생성한다. 티올화 수준은 CDT/CDI의 첨가된 양에 의해 결정된다.
활성화된 티올화된 사카라이드의 환원 및 정제. 티올화된 사카라이드 반응 혼합물에 트리스(2-카복시에틸) 포스핀(TCEP) 용액(3 내지 6 몰 당량)을 첨가하고, 실온에서 3 내지 5시간 동안 진행한다. 이어서, 반응 혼합물을 사전-냉각된 10 mM 나트륨 포스페이트(일염기성)에 첨가하여 5 내지 10배 희석하고, 5 μm 필터를 통해 여과한다. 서전-냉각된 10 mM 나트륨 포스페이트(일염기성)의 30 내지 40배 부피에 대해 티올화된 사카라이드의 정용여과를 수행한다. 활성화된 티올화된 사카라이드 보유물의 분취량을 추출하여 사카라이드 농도 및 티올 함량[엘만(Ellman)] 분석에 의해 측정한다.
브로모아세틸화된 담체 단백질의 활성화 및 정제. 담체 단백질의 유리 아미노 기를 브로모아세틸화제, 예컨대 브로모아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스터(BAANS), 브로모아세틸 브로마이드 또는 다른 적합한 시약과 반응시킴으로써 브로모아세틸화시킨다.
담체 단백질(0.1 M 나트륨 포스페이트 중, pH 8.0 ± 0.2)은 활성화 전에 약 pH 7에서 8 ± 3℃로 먼저 유지된다. 단백질 용액에 저장 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 용액(20 mg/mL)인 브로모아세트산의 N-하이드록시석신이미드 에스터(BAANS)를 0.25 내지 0.5 BAANS:단백질(w/w)의 비율로 첨가한다. 반응 생성물을 5 ± 3℃에서 30 내지 60분 동안 천천히 혼합된다. 생성된 브로모아세틸화된(활성화된) 단백질을, 예를 들어 10 mM 포스페이트(pH 7.0) 완충액을 사용하는 10 kDa MWCO 막을 사용하는 한외여과/정용여과에 의해 정제한다. 정제 후, 브로모아세틸화된 담체 단백질의 단백질 농도는 로우리(Lowry) 단백질 검정에 의해 추정된다.
활성화도를 억제된 전도도 검출(이온 크로마토그래피)과 커플링된 이온-교환 액체 크로마토그래피에 의한 총 브로마이드 검정에 의해 측정한다. 활성화된 브로모아세틸화된 단백질에 결합된 브로마이드를 검정 샘플 준비에서 단백질로부터 절단하고, 존재할 수 있는 임의의 유리 브로마이드와 함께 정량화시킨다. 단백질에 잔류하는 공유 결합된 브롬은 알칼리성 2-머캅토에탄올에서 샘플을 가열하여 이온 성 브로마이드로 전환함으로써 방출된다.
브로모아세틸화된 CRM 197 의 활성화 및 정제. CRM197을 10 mM 포스페이트 완충된 0.9% NaCl pH 7(PBS)로 5 mg/mL로 희석하고, 이어서 1 M 저장 용액을 사용하여 0.1 M NaHCO3 pH 7.0으로 만들었다. BAANS를 20 mg/mL DMSO의 BAANS 저장 용액을 사용하여 CRM197:BAANS 비 1:0.35(w:w)로 첨가한다. 반응 혼합물을 3 내지 11℃에서 30분 내지 1시간 동안 항온처리하고, 이어서 10 K MWCO 막 및 10 mM 나트륨 포스페이트/0.9% NaCl, pH 7.0을 사용하여 한외여과/정용여과로 정제한다. 정제된 활성화된 CRM197을 로우리 검정에 의해 검정하여 단백질 농도를 측정하고, 이어서 PBS로 5 mg/mL로 희석한다. 수크로스를 동결보호제로서 5% 중량/부피로 첨가하고, 활성화된 단백질을 동결하고, 접합에 필요할 때까지 25℃에서 보관한다.
CRM197의 리신 잔기의 브로모아세틸화는 매우 일관적이고, 이용가능한 39개의 리신에서 15 내지 25개의 리신을 활성화시킨다. 반응은 높은 수율의 활성화된 단백질을 생산한다.
활성화된 티올화된 사카라이드와 브로모아세틸화된 담체 단백질의 접합. 브로모아세틸화된 담체 단백질 및 활성화된 티올화된 사카라이드를 후속적으로 첨가한다. 사카라이드/단백질 입력 비는 0.8 ± 0.2이다. 반응 pH를 1 M NaOH 용액으로 9.0 ± 0.1로 조정한다. 접합 반응을 5℃에서 20 ± 4시간 동안 진행한다.
잔류 반응성 작용기의 캡핑. 담체 단백질 상의 미반응된 브로모아세틸화 잔기를 캡핑제로서 2 몰 당량의 N-아세틸-L-시스테인과 5℃에서 3 내지 5시간 동안 반응시켜 급냉시킨다. 잔류하는 유리 설프하이드릴 기를 4 몰 당량의 요오도아세트아미드(IAA)로 5℃에서 20 내지 24시간 동안 캡핑한다.
eTEC-연결된 당접합체의 정제. 접합 반응(IAA 후 캡핑됨) 혼합물을 0.45 μm 필터를 통해 여과한다. 당접합체의 한외여과/정용여과를 5 mM 석시네이트-0.9% 염수, pH 6.0에 대해 수행한다. 이어서, 당접합체 보유물을 0.2 μm 필터를 통해 여과한다. 당접합체의 분취량을 검정을 위해 추출한다. 잔류하는 당접합체를 5℃에서 저장한다. 표 14, 표 15, 표 16, 표 17 및 표 18을 참고한다.
실시예 14: 대장균-O25B ETEC 접합체의 제조
활성화 공정: 대장균-O25b 리포폴리사카라이드의 활성화. 동결건조된 대장균-O25b 폴리사카라이드를 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에서 재구성한다. 동결건조된 O25b/DMSO 용액의 수분 함량을 칼 피셔(KF) 분석에 의해 측정한다. 수분 함량을, WFI를 O25b/DMSO 용액에 첨가하여 0.5%의 수분 함량에 도달하도록 조정한다.
활성화를 개시하기 위해, 1,1'-카보닐다이이미다졸(CDI)을 DMSO 용액에 100 mg/mL로 새로 준비한다. 대장균-O25b 폴리사카라이드를 티올화 단계 전에 다양한 양의 CDI로 활성화시킨다. CDI 활성화를 실온 또는 35℃에서 1 내지 3시간 동안 수행한다. 물을 첨가하여 활성화 반응 용액에서 잔류하는 CDI를 급냉시킨다. 추가된 물의 양을 측정하고 최종 수분 함량이 총 수성 물질의 2 내지 3%가 되도록 계산을 수행한다. 반응을 실온에서 0.5시간 동안 진행한다.
활성화된 대장균-O25b 폴리사카라이드의 티올화. 시스타민 다이하이드로클로라이드를 무수 DMSO에서 새로 준비하고, 1 내지 2 몰 당량의 시스타민 다이하이드로클로라이드를 활성화된 폴리사카라이드 반응 용액에 첨가한다. 반응을 실온에서 20 ± 4시간 동안 진행한다.
활성화된 티올화된 대장균-O25b 폴리사카라이드의 환원 및 정제. 티올화된 사카라이드 반응 혼합물에 트리스(2-카복시에틸) 포스핀(TCEP) 용액(3 내지 6 몰 당량)을 첨가하고, 실온에서 3 내지 5시간 동안 진행한다. 이어서, 반응 혼합물을 사전-냉각된 10 mM 일염기성 나트륨 포스페이트에 첨가하여 5 내지 10배 희석하고, 5 μm 필터를 통해 여과한다. 5 K MWCO 한외여과 막 카세트를 사용하여 사전-냉각된 10 mM 일염기성 나트륨 포스페이트의 40배 정용부피에 대해 티올화된 사카라이드의 정용여과를 수행한다. 티올화된 O25b 폴리사카라이드 보유물을 사카라이드 농도 및 티올(엘만) 검정 둘 다를 위해 추출한다. 활성화 공정의 흐름도는 도 25a에 제공된다.
접합 공정: 브로모아세틸화된 CRM 197 에 대한 티올화된 대장균-O25b 폴리사카라이드의 접합. CRM197 담체 단백질을 실시예 13에 기술된 바와 같이 브로모아세틸화에 의해 개별적으로 활성화시키고, 이어서 접합 반응을 위해 활성화된 대장균-O25b 폴리사카라이드와 반응시킨다. 브로모아세틸화된 CRM197 및 티올화된 O25b 폴리사카라이드를 반응 용기에서 함께 혼합한다. 사카라이드/단백질 입력 비는 0.8 ± 0.2이다. 반응 pH를 8.0 내지 10.0으로 조정한다. 접합 반응을 5℃에서 20 ± 4시간 동안 진행한다.
브로모아세틸화된 CRM 197 및 티올화된 대장균-O25b 폴리사카라이드에 대한 반응성 기의 캡핑. CRM197 단백질의 미반응된 브로모아세틸화된 잔기를, 2 몰 당량의 N-아세틸-L-시스테인과 5℃에서 3 내지 5시간 동안 반응시키고, 이어서 티올화된 O25b-폴리사카라이드의 잔류하는 유리 설프하이드릴 기를 4 몰 당량의 요오도아세트아미드(IAA)로 5℃에서 20 내지 24시간 동안 캡핑함으로써, 캡핑한다.
eTEC-연결된 대장균-O25b 당접합체의 정제. 접합 용액을 0.45 μm 또는 5 μm 필터를 통해 여과한다. O25b 당접합체의 정용여과를 100 K MWCO 한외여과 막 카세트로 수행한다. 5 mM 석시네이트-0.9% 염수, pH 6.0에 대해 정용여과를 수행한다. 대장균-O25b 당접합체 100K 보유물을 0.22 μm 필터를 통해 여과하고, 5℃에서 보관한다.
접합 공정의 흐름도는 도 25b에 제공된다.
결과
대장균-O25b eTEC 당접합체의 여러 회분에 대한 반응 파라미터 및 특성화 데이터는 표 12에 제시된다. 시스타민 다이하이드로클로라이드를 사용한 CDI 활성화-티올화는 41 내지 92%의 사카라이드 수율 및 5% 초과 내지 14%의 유리 사카라이드를 갖는 당접합체를 생성한다. 표 14, 표 15, 표 16, 표 17 및 표 18을 참고한다.
[표 12]
Figure 112021033935808-pct00026
실시예 15: 대장균 O-항원 폴리사카라이드-CRM 197 eTEC 접합체의 제조 과정(대장균 혈청형 O25b, O1a, O2 및 O6의 O-항원에 적용됨)
폴리사카라이드의 활성화
대장균 O-항원 폴리사카라이드를 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에서 재구성한다. 활성화를 개시하기 위해, 다양한 양의 1,1'-카보닐다이이미다졸(CDI)(1 내지 10 몰 당량)을 폴리사카라이드 용액에 첨가하고, 반응을 실온 또는 35℃에서 1 내지 5시간 동안 진행한다. 이어서, 물(2 내지 3%, v/v)을 첨가하여 활성화 반응 용액에 잔류하는 임의의 CDI를 급냉시킨다. 반응을 실온에서 0.5시간 동안 진행 한 후, 1 내지 2 몰 당량의 시스타민 다이하이드로클로라이드를 첨가한다. 반응을 실온에서 5 내지 20시간 동안 진행하고, 이어서 3 내지 6 몰 당량의 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)의 당량을 사용하여 티올화된 사카라이드를 생성한다. 티올화 수준을 CDI의 첨가된 양에 의해 측정한다.
이어서, 반응 혼합물을 사전-냉각된 10 mM 일염기성 나트륨 포스페이트에 첨가하여 5 내지 10배 희석하고, 5 μm 필터를 통해 여과한다. 사전-냉각된 10 mM 일염기성 나트륨 포스페이트의 30 내지 40배 정용부피에 대해 티올화된 사카라이드의 정용여과를 수행한다. 활성화된 티올화된 사카라이드 보유물의 분취량을 추출하여 사카라이드 농도 및 티올 함량(엘만) 검정을 결정한다.
담체 단백질(CRM 197 )의 활성화
CRM197(0.1 M 나트륨 포스페이트 중, pH 8.0 ± 0.2)을 활성화 전에 약 pH 8에서 먼저 8 ± 3℃로 유지한다. 단백질 용액에 저장 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 용액(20 mg/mL)으로서 브로모아세트산의 N-하이드록시석신이미드 에스터(BAANS)를 0.25 내지 0.5 BAANS:단백질(w/w)의 비로 첨가한다. 반응 생성물을 5 ± 3℃에서 30 내지 60분 동안 천천히 혼합한다. 생성된 브로모아세틸화된(활성화된) 단백질을, 예를 들어 10 mM 포스페이트(pH 7.0) 완충액을 사용하는 10 kDa MWCO 막을 사용하는 한외여과/정용여과에 의해 정제한다. 정제 후, 브로모아세틸화된 담체 단백질의 단백질 농도를 로우리 단백질 검정에 의해 추정한다.
접합
활성화된 CRM197 및 활성화된 대장균 O-항원 폴리사카라이드를 후속적으로 반응기에 첨가하고, 혼합한다. 사카라이드/단백질 입력 비는 1 ± 0.2이다. 반응 pH를 1 M NaOH 용액으로 9.0 ± 0.1로 조정한다. 접합 반응을 5℃에서 20 ± 4시간 동안 진행한다. 담체 단백질 상의 미반응된 브로모아세틸화된 잔기를, 캡핑 시약으로서 2 몰 당량의 N-아세틸-L-시스테인을 5℃에서 3 내지 5시간 동안 반응시킴으로써 급냉시킨다. 잔류하는 유리 설프하이드릴 기를 4 몰 당량의 요오도아세트아미드(IAA)로 5℃에서 20 내지 24시간 동안 캡핑한다. 이어서, 5 mM 석시네이트-0.9% 염수, pH 6.0에 대해 수행된 한외여과/정용여과를 사용하여 반응 혼합물을 정제한다. 이어서, 정제된 접합체를 0.2 μm 필터를 통해 여과한다. 표 14, 표 15, 표 16, 표 17 및 표 18을 참고한다.
실시예 16: 일반적인 절차: 환원적 아민화 화학(RAC)에 의한 O-항원(대장균 혈청형 O1, O2, O6, 25b로부터) 폴리사카라이드의 접합
다이메틸 설폭사이드(RAC/DMSO)에서의 접합
폴리사카라이드 활성화
계산된 양의 500 mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.0) 및 주사용수(WFI)를 순차적으로 첨가하여 100 mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.0 ± 0.2)에서 폴리사카라이드 산화를 수행하여 2.0 g/L의 최종 폴리사카라이드 농도를 수득한다. 필요에 따라, 반응 pH를 약 pH 6.0으로 조정한다. pH 조정 후, 반응 온도를 4℃로 냉각한다. 약 0.09 내지 0.13 몰 당량의 나트륨 퍼요오데이트을 첨가함으로써 산화를 개시한다. 산화 반응을 5 ± 3℃에서 약 20 ± 4시간 동안 수행한다.
활성화된 폴리사카라이드의 농축 및 정용여과를 5 K MWCO 한외여과 카세트를 사용하여 수행한다. 정용여과를 WFI의 20배 정용부피에 대해 수행한다. 정제된 활성화된 폴리사카라이드를 5 ± 3℃에서 저장한다. 정제된 활성화된 사카라이드를 특히 (i) 비색 검정에 의한 사카라이드 농도; (ii) 비색 검정에 의한 알데하이드 농도; (iii) 산화도; 및 (iv) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특성화된다.
활성화된 폴리사카라이드와 수크로스 부형제의 화합 및 동결건조
활성화된 폴리사카라이드를 활성화된 폴리사카라이드 1 g 당 25 g의 수크로스의 비로 수크로스와 화합한다. 이어서, 화합된 혼합물의 병을 동결건조한다. 동결건조 후, 동결건조된 활성화된 폴리사카라이드를 함유하는 병을 -20 ± 5℃에서 저장한다. CRM197 단백질의 계산된 양을 껍질-동결 및 별도로 동결건조한다. 동결건조된 CRM197을 -20 ± 5℃에서 저장한다.
동결건조된 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 재구성
동결건조된 활성화된 폴리사카라이드를 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에서 재구성한다. 폴리사카라이드가 완전한 용해 시, 동량의 무수 DMSO를 동결건조된 CRM197에 첨가하여 재구성한다.
접합 및 캡핑
재구성된 활성화된 폴리사카라이드를 반응 용기에서 재구성된 CRM197과 조합하고, 이어서 완전히 혼합하여 투명한 용액을 수득한 후, 나트륨 시아노보로하이드라이드와의 접합을 개시한다. 반응 용액의 최종 폴리사카라이드 농도는 약 1 g/L이다. 0.5 내지 2.0 MEq의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 반응 혼합물에 첨가하고, 23 ± 2℃에서 20 내지 48시간 동안 항온처리함으로써 접합을 개시한다. 2 MEq의 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4)를 첨가하여 미반응된 알데하이드를 캡핑함으로써 접합 반응을 종결시킨다. 이러한 캡핑 반응은 23 ± 2℃에서 3 ± 1시간 동안 계속한다.
접합체의 정제
100 내지 300 K MWCO 막을 사용하는 접선 유동 여과에 의한 정제를 위한 준비에서 접합체 용액을 냉각된 5 mM 석시네이트-0.9% 염수(pH 6.0)로 1:10으로 희석한다.
희석된 접합체 용액을 5 μm 필터에 통과시키고, 5 mM 석시네이트/0.9% 염수(pH 6.0)를 매질로서 사용하여 정용여과를 수행한다. 정용여과가 완료된 후, 접합체 보유물을 0.22 μm 필터를 통해 옮겼다. 접합체를 5 mM 석시네이트/0.9% 염수(pH 6)로 약 0.5 mg/mL의 표적 사카라이드 농도까지 추가로 희석한다. 다르게는, 접합체를 100 내지 300 K MWCO 막을 사용하는 접선 유동 여과에 의해 20 mM 히스티딘-0.9% 염수(pH 6.5)를 사용하여 정제한다. 최종 0.22 μm 여과 단계를 완료하여 면역원성 접합체를 수득한다. 표 14, 표 15, 표 16, 표 17 및 표 18을 참고한다.
실시예 17: 대장균 혈청형 O25B, O1A, O2 및 O6에 적용되는 수성 완충액(RAC/수성)에서의 접합
폴리사카라이드 활성화 및 정용여과를 DMSO 기반 접합에 대한 것과 동일한 방식으로 수행한다.
여과된 활성화된 사카라이드를 혈청형에 따라 0.4 내지 2 w/w의 폴리사카라이드 대 단백질 질량 비로 CRM197과 합성한다. 이러한 입력 비를 생성된 접합체에서 폴리사카라이드 대 CRM197 비를 제어하기 위해 선택한다.
이어서, 화합된 혼합물을 동결건조한다. 접합 시, 폴리사카라이드와 단백질 혼합물을 0.1 M 나트륨 포스페이트 완충액에 혈청형에 따라 5 내지 25 g/L의 폴리사카라이드 농도로 용해시키고, pH를 혈청형에 따라 6.0 내지 8.0으로 조정한다. 0.5 내지 2.0 MEq의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 반응 혼합물에 첨가하고, 23 ± 2℃에서 20 내지 48시간 동안 항온처리함으로써 접합을 개시한다. 1 내지 2 MEq의 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4)를 첨가하여 미반응된 알데하이드를 캡핑함으로써 접합 반응을 종결시킨다.
다르게는, 여과된 활성화된 사카라이드 및 계산된 양의 CRM197 단백질을 껍질-동결하고, 별도로 동결건조하고, 이어서 0.1 M 나트륨 포스페이트 완충액에 용해시 조합하고, 상기 기술된 바와 같이 후속 접합을 진행할 수 있다.
[표 13]
Figure 112021033935808-pct00027
실시예 18: 대장균 O-항원 폴리사카라이드-CRM 197 단일-말단 접합체의 제조 과정
그람-음성균의 외막의 공통 성분인 리포폴리사카라이드(LPS)를 지질 A, 코어 영역 및 O-항원(O-특이적 폴리사카라이드 또는 O-폴리사카라이드로도 지칭됨)을 포함한다. O-항원 반복 단위의 다른 혈청형은 조성, 구조 및 혈청학적 특징이 상이하다. 본 발명에서 사용되는 O-항원은 쇄 말단에 2-케토-3-데옥시옥탄(KDO)으로 지칭되는 당 단위를 함유하는 코어 도메인에 부착된다. 폴리사카라이드 쇄의 무작위 활성화(예컨대, 나트륨 퍼요오데이트 또는 카보다이이미드에 의한 활성화)에 기반하는 일부 접합 방법과는 상이하다. 본 발명은 다이설파이드 아민 링커에 의한 KDO의 선택적인 활성화를 포함하는 접합 공정을 개시하고, 티올 작용기의 언마스킹(unmasking) 시, 도 24에 도시된 브로모 활성화된 CRM197 단백질에 접합된다(단일-말단 접합체의 제조).
시스타민 링커(A1)를 기반으로 하는 접합
O-항원 폴리사카라이드 및 시스타민(50 내지 250 몰 당량의 KDO)을 포스페이트 완충액에서 혼합하고, pH를 6.0 내지 7.0으로 조정한다. 혼합물에 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3)(5 내지 30 몰 당량의 KDO)를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 48 내지 72시간 동안 교반한다. 실온으로 냉각하고 동일한 부피의 포스페이트 완충액으로 희석한 후, 혼합물을 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)(1.2 몰 당량의 시스타민이 첨가됨)으로 처리한다. 이어서, 혼합물을 10 mM 일염기성 나트륨 포스페이트성 용액에 대해 5 KDa MWCO 막을 사용하여 정용여과를 통해 정제하여 O-항원 폴리사카라이드를 함유하는 티올을 제공한다. 티올 함량을 엘만 검정에 의해 측정할 수 있다.
이어서, 0.5 내지 2.0의 비로 상기 티올 활성화된 O-항원 폴리사카라이드와 브로모 활성화된 CRM197 단백질을 혼합하여 접합을 진행한다. 반응 혼합물의 pH를 1 M NaOH 용액으로 8.0 내지 10.0으로 조정한다. 접합 반응을 5℃에서 24 ± 4시간 동안 진행한다. 2 몰 당량의 N-아세틸-L-시스테인과 5℃에서 3 내지 5시간 동안 반응함으로써, 담체 단백질 상의 미반응된 브로모 잔기를 급냉시킨다. 3 몰 당량의 요오도아세트아미드(첨가된 N-아세틸-L-시스테인과 관련됨)를 첨가하고, 잔류하는 유리 설프하이드릴 기를 캡핑한다. 이러한 캡핑 반응을 5℃에서 추가로 3 내지 5시간 동안 진행하고, 두 캡핑 단계의 pH를 1 M NaOH의 첨가에 의해 8.0 내지 10.0으로 유지한다. 5 mM 석시네이트-0.9% 염수, pH 6.0에 대해 30 kDa MWCO 막을 사용하여 한외여과/정용여과 후에 생성된 접합체를 수득한다. 표 14, 표 15, 표 16, 표 17 및 표 18을 참고한다.
실시예 19: 3,3'-다이티오 비스(프로판산 다이하이드라자이드) 링커(A4)를 기반으로 하는 접합
O-항원 폴리사카라이드 및 3,3'-다이티오 비스(프로판산 다이하이드라자이드)(5 내지 50 몰 당량의 KDO)를 아세테이트 완충액에서 혼합하고, pH를 4.5 내지 5.5로 조정한다. 혼합물에 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3)(5 내지 30 몰 당량의 KDO)를 첨가하고, 혼합물을 23 내지 37℃에서 24 내지 72시간 동안 교반한다. 이어서, 혼합물을 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)(1.2 몰 당량의 3,3'-다이티오 비스(프로판산 다이하이드라자이드) 링커가 첨가됨)으로 처리한다. 이어서, 혼합물을 10 mM 일염기성 나트륨 포스페이트 용액에 대해 5 KDa MWCO 막을 사용하여 정용여과를 통해 정제하여 O-항원 폴리사카라이드를 함유하는 티올을 제공한다. 티올 함량을 엘만 분석에 의해 측정할 수 있다.
이어서, 0.5 내지 2.0의 비로 상기 티올 활성화된 O-항원 폴리사카라이드를 브로모 활성화된 CRM197 단백질을 혼합함으로써, 접합을 진행한다. 반응 혼합물의 pH를 1 M NaOH 용액으로 8.0 내지 10.0으로 조정된다. 접합 반응을 5℃에서 24 ± 4시간 동안 진행한다. 담체 단백질 상의 미반응된 브로모 잔기를 2 몰 당량의 N-아세틸-L-시스테인과 5℃에서 3 내지 5시간 동안 반응시킴으로써 급냉시킨다. 이어서, 3 몰 당량의 요오도아세트아미드(첨가된 N-아세틸-L-시스테인과 관련됨)를 첨가하고, 이어서 잔류하는 유리 설프하이드릴 기를 캡핑한다. 이러한 캡핑 반응을 5℃에서 추가로 3 내지 5시간 동안 진행하고, 두 캡핑 단계의 pH를 1 M NaOH의 첨가에 의해 8.0 내지 10.0으로 유지한다. 5 mM 석시네이트-0.9% 염수, pH 6.0에 대해 30 kDa MWCO 막을 사용하는 한외여과/정용여과 후에 생성된 접합체를 수득한다.
실시예 20: 2,2'-다이티오-N,N'-비스(에탄-2,1-다이일) 비스(2-(아미노옥시)아세트아미드) 링커(A6)를 기반으로 하는 접합
O-항원 폴리사카라이드와 2,2'-다이티오-N,N'-비스(에탄-2,1-다이일) 비스(2-(아미노옥시)아세트아미드)(5 내지 50 몰 당량의 KDO)를 아세테이트 완충액에서 혼합하고, pH를 4.5 내지 5.5로 조정한다. 이어서, 혼합물을 23 내지 37℃에서 24 내지 72시간 동안 교반하고, 이어서 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3)(5 내지 30 몰 당량의 KDO)를 첨가하고, 혼합물을 추가로 3 내지 24시간 동안 교반한다. 이어서, 혼합물을 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)(1.2 몰 당량의 링커가 첨가됨)으로 처리한다. 이어서, 혼합물을 10 mM 일염기성 나트륨 포스페이트 용액에 대해 5 KDa MWCO 막을 사용하여 정용여과를 통해 정제하여 O-항원 폴리사카라이드를 함유하는 티올을 제공한다. 티올 함량을 엘만 검정에 의해 측정할 수 있다.
이어서, 0.5 내지 2.0의 비로 상기 티올 활성화된 O-항원 폴리사카라이드와 브로모 활성화된 CRM197 단백질을 혼합하여 접합을 진행한다. 반응 혼합물의 pH를 1 M NaOH 용액으로 8.0 내지 10.0으로 조정한다. 접합 반응을 5℃에서 24 ± 4시간 동안 진행한다. 담체 단백질 상의 미반응된 브로모 잔기를, 2 몰 당량의 N-아세틸-L-시스테인과 5℃에서 3 내지 5시간 동안 반응시킴으로써 급냉시킨다. 이어서, 3 몰 당량의 요오도아세트아미드(첨가된 N-아세틸-L-시스테인과 관련됨)를 첨가하고, 잔류하는 유리 설프하이드릴 기를 캡핑한다. 이러한 캡핑 반응을 5℃에서 추가로 3 내지 5시간 동안 진행하고, 두 캡핑 단계의 pH를 1 M NaOH의 첨가에 의해 8.0 내지 10.0으로 유지한다. 5 mM 석시네이트-0.9% 염수, pH 6.0에 대해 30 kDa MWCO 막을 사용하여 한외여과/정용여과 후에 생성된 접합체를 수득한다.
실시예 21: 브로모 활성화된 CRM 197 의 제조
CRM197을 0.1 M 나트륨 포스페이트, pH 8.0 ± 0.2 용액에서 제조하고, 5 ± 3℃까지 냉각한다. 단백질 용액에 저장 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 용액(20 mg/mL)으로서 브로모아세트산의 N-하이드록시석신이미드 에스터(BAANS)를 0.25 내지 0.5 BAANS:단백질(w/w)의 비로 첨가한다. 반응 생성물을 5 ± 3℃에서 30 내지 60분 동안 천천히 혼합한다. 생성된 브로모아세틸화된(활성화된) 단백질을, 예를 들어 10 mM 포스페이트(pH 7.0) 완충액을 사용하는 10 kDa MWCO 막을 사용하는 한외여과/정용여과에 의해 정제한다. 정제 후, 브로모아세틸화된 담체 단백질의 단백질 농도를 로우리 단백질 분석에 의해 추정한다.
[표 14]
Figure 112021033935808-pct00028
[표 15]
Figure 112021033935808-pct00029
[표 16]
Figure 112021033935808-pct00030
[표 17]
Figure 112021033935808-pct00031
[표 18]
Figure 112021033935808-pct00033
실시예 22: 대장균 O-Ag-TT 접합체의 제조
대장균 혈청형 O25b 장쇄 폴리사카라이드(로트 709766-30, 약 6.92 mg/mL, MW: 약 39 kDa, 50 mg, 동결건조됨)를 파상풍 톡소이드(TT) 접합에 사용한다.
대장균 혈청형 O1a 장쇄 폴리사카라이드(710958-142-3, 약 6.3 mg/mL, MW: 약 44.3 kDa)(50 mg, 7.94 mL)를 동결건조한다.
대장균 혈청형 O6 장쇄 폴리사카라이드(710758-121-1, 약 16.8 mg/mL, MW: 약 44 kDa)(50 mg, 2.98 mL)를 동결건조한다.
상기 열거된 각각의 동결건조된 폴리사카라이드를 WFI에 용해시켜 약 5 내지 10 mg/mL로 만들고, 1 mL 아세토니트릴 중 100 mg 1-시아노-4-다이메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP) 용액 0.5 mL를 첨가하고, 실온에서 교반한다. 트라이에틸아민(TEA) 0.2 M(2 mL)을 첨가하고, 실온에서 교반한다.
파상풍 톡소이드(TT)의 제조: TT(100 mg, 47 mL)를 약 20 mL로 농축하고, 여과 튜브를 사용하여 염수(2 x 50 mL)로 2회 세척한다. 이어서, HEPES와 염수로 희석하여 최종 HEPES 농도를 약 0.25 M로 만든다. TT를 전술한 바와 같이 제조하고, 반응의 pH를 약 9.1 내지 9.2로 조정한다. 반응 혼합물을 실온에서 교반한다.
20 내지 24시간 후, 반응 생성물을 글리신(0.5 mL)으로 급냉한다. 이어서, MWCO 재생 셀룰로스 막을 사용하여 농축하고, 염수에 대해 정용여과를 수행한다. 여과하고, 분석한다. 표 19를 참고한다.
[표 19]
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실시예 23: O-항원 발효, 정제 및 접합의 추가적인 결과
하기 기술된 예시적인 공정은 일반적으로 모든 대장균 혈청형에 적용가능하다. 각각의 폴리사카라이드의 생산은 회분 생산 발효 및 이어서 하류 정제 전의 화학적 불활성화를 포함한다.
균주 및 저장. 단쇄 O-항원의 생합성에 사용된 균주는 대장균의 임상 야생형 균주이다. 장쇄 O-항원을, 천연 wzzb 유전자의 결실을 갖는 와너-다트센코(Wanner-Datsenko) 방법에 의해 조작된 단쇄 생산자의 유도체로 생산하고, 살모넬라의 "장쇄" 연장자 기능 fepE에 의해 보완한다. fepE 기능은 T7 프로모터 영역이 결실된 고 카피 colE1-기반 "topo" 벡터 또는 colE1-기반 벡터 pET30a의 저 카피 유도체에서 천연 프로모터로부터 발현된다.
동물 유리 LB 또는 최소 매질에서 3.0 이상의 OD600으로 세포를 성장시켜 세포 뱅크를 준비한다. 이어서, 배양액을 새로운 매질에 희석하고, 80% 글리세롤과 조합하여 2.0 OD600/mL의 20% 글리세롤 최종 농도를 수득한다.
종자 배양 및 발효에 사용되는 매질. 사용된 종자 및 발효 매질은 하기 제형을 공유한다: KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 나트륨 시트레이트, Na2SO4, 아스파르트 산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O.
종자 및 발효 조건. 단일 종자 바이알에서 종자를 0.1%로 접종한다. 종자 플라스크를 37℃에서 16 내지 18시간 동안 항온처리하고, 전형적으로 10 내지 20 OD600/mL를 달성한다.
발효를 10 L 스테인리스 강, 스팀 제자리 발효기에서 수행한다.
발효기의 접종은 전형적으로 10 OD600 종자에서 1:1,000이다. 10 g/L 회분 글루코스에서 성장이 진행되는 기간인 회분 단계를 전형적으로 8시간 동안 지속한다. 글루코스가 고갈되면, 용존 산소가 급격히 상승하고, 이때 글루코스가 발효에 공급된다. 이어서, 발효를 전형적으로 120 OD600/mL 초과를 제공하는 수확과 함께 16 내지 18시간 동안 진행한다.
혈청형 O1a, O2, O6 및 O25b에 대한 단쇄/장쇄 O-항원 생산의 초기 평가. O1a, O2, O6 및 O25b에 대한 야생형 균주를 회분 모드에서 보충된 최소 매질에서 OD600 = 15 내지 20으로 발효시킨다. 글루코스가 고갈되어 산소 소비가 급격히 감소하고, 글루코스 용액에서 성장 제한 글루코스 공급을 16 내지 18시간 동안 적용한다. 124 내지 145 OD600 단위/mL의 세포 밀도에 도달한다. 이어서, 수확 배양액의 pH를 약 3.8로 조정하고, 2시간 동안 95℃로 가열한다. 이어서, 가수분해된 배양액을 25℃로 냉각하고, pH 6.0으로 만들고, 원심분리하여 고체를 제거한다. 이어서, 생성된 상청액을 O-항원의 정량을 위해 SEC-HPLC 컬럼에 적용한다. 2,240 내지 4,180 mg/L의 생산성을 수득한다. 이러한 회분으로부터의 정제된 단쇄 O-항원의 분자량은 10 내지 15 kDa인 것으로 밝혀졌다. 또한, O2 및 O6 가수분해물의 SEC 크로마토그래피가 O1a 및 O25b 가수분해물에서 분명하지 않은 뚜렷하고 분리가능한 오염 폴리사카라이드를 나타냈다는 점이 주목된다.
O1a, O2, O6 및 O25b O-항원의 장쇄 버전을 고 카피 카나마이신-선택가능한 topo 플라스미드에서 이종의 상보적인 fepE 유전자를 보유한 각각의 균주의 wzzb 결실 버전의 발효를 통해 평가한다. 카나마이신 선택에도 불구하고, 단쇄에 대해 발효를 수행한다. 124 내지 177 OD600/mL에서 관찰된 최종 세포 밀도는 3,500 내지 9,850 mg/L의 O-항원 생산성과 관련된다. 장쇄 O-항원의 상보성-기반 합성은 적어도 모 단쇄 균주에서와 같이 생산적이고, 일부 경우에는 더 그렇다. 정제된 O-항원 폴리사카라이드의 분자량은 33 내지 49 kDa이거나, 상응하는 단쇄 크기의 약 3배이다.
O2 및 O6에 대한 장쇄 가수분해물은 장쇄 항원의 경우 주요 O-항원 피크에서 어깨로 관찰되는 오염 폴리사카라이드 피크의 증거를 나타내고; O1 및 O25b는 이전에 단쇄 모체에서 볼 수 있듯이 오염된 폴리사카라이드의 생성 증거를 나타내지 않음에 주목한다.
성장률 억제는 fepE 부재 하의 topo 레플리콘의 존재와 관련되는 것으로 밝혀진다. 또한, △wzzb 돌연변이 자체는 성장률에 악영향을 미치지 않고, 이는 방해된 성장률이 플라스미드 벡터에 의해 전달됨을 나타낸다.
O11, O13, O16, O21 및 O75 O-항원의 생산을 위한 균주 평가. 혈청형 O11, O13, O16, O21 및 O75의 여러 야생형 균주를 SEC-HPLC에 의한 발효에서 원하지 않는 폴리사카라이드를 생성하는 성향에 대해 평가한다. O11, O13, O16, O21 및 O75에 대한 균주는 오염 폴리사카라이드가 없는 것으로 선택되었을 뿐만 아니라, 1,000 mg/L 초과의 O-항원을 생성하는 능력과 △wzzb 형질의 도입을 위해 와너-다트센코 재조합을 허용하는 항생제 민감성 프로필의 표시를 위해 선택된다.
일반적으로 카나마이신-내성인 것으로 밝혀진 O11, O13, O16, O21 및 O75 △wzzb 균주에 fepE를 도입할 수 있도록 topo-fepE 및 pET-fepE의 클로람페니콜-선택가능한 버전이 구축된다. 생성된 topo-fepE 및 pET-fepE 보유 균주를 클로람페니콜 선택적으로 발효하고, 산-가수분해된 배양액의 상청액을 SEC-HPLC로 평가한다. 고(topo) 및 저 카피(pET) fepE 구축물은 둘 다 모 야생형과 동등한 각각에 대한 생산성을 갖는 O-항원의 합성을 지향한다. 잠재적으로 간섭하는 폴리사카라이드의 발현은 관찰되지 않는다.
wzzb 플라스미드-함유 균주에 대한 성장률의 평가는 O11, O13 및 O21이 pET-fepE가 아닌 topo-fepE의 존재에 의해 지연됨을 나타내고; O16 및 O75 균주는 레플리콘 선택에 관계 없이 허용가능한 성장률을 나타낸다.
[표 20]
Figure 112021033935808-pct00035
폴리사카라이드의 정제 공정은 O-항원을 방출하기 위한 산 가수분해를 포함한다. 발효 반응기에서 혈청형 특이적 대장균 배양액의 조질 현탁액을 아세트산으로 최종 pH 3.5 ± 0.5로 직접 처리하고, 산성화된 배양액을 1시간 이상 동안 95 ± 5℃의 온도까지 가열한다. 이러한 처리는 올리고사카라이드의 근위 말단에 있는 KDO와 지질 A 사이의 불안정한 연결기를 절단하여 O-Ag 쇄를 방출한다. 방출된 O-Ag를 함유하는 산성화된 배양액은 NH4OH를 사용하여 20 ± 10℃로 냉각된 후, pH 7 ± 1.0으로 중화된다. 이러한 공정은 여러 원심분리, 여과 및 농축/정용여과 작업 단계를 추가로 포함한다.
[표 21]
Figure 112021033935808-pct00036
Figure 112021033935808-pct00037
Figure 112021033935808-pct00038
하기 항들은 본 발명의 추가적인 양태를 기술한다:
Cl. 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 62D1, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187(이때, n은 1 내지 10의 정수임)로부터 선택되는 하나 이상의 구조를 포함하는 사카라이드.
C2. C1항에 있어서, 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O10, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O21, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O28, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O58, 구조식 O64, 구조식 O69, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O75, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O86, 구조식 O88, 구조식 O90, 구조식 O98, 구조식 O104, 구조식 0111, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O119, 구조식 O121, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O136, 구조식 O138, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O147, 구조식 O149, 구조식 O152, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O164, 구조식 O173, 구조식 62D1, 구조식 O22, 구조식 O35, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O83, 구조식 O91, 구조식 O105, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O139, 구조식 O153, 구조식 O167 및 구조식 O172(이때, n은 20 내지 100의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함하는 사카라이드.
C3. C2항에 있어서, 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4(예컨대, 구조식 O4:K52 및 구조식 O4:K6), 구조식 O5(예컨대, 구조식 O5ab 및 구조식 O5ac(균주 180/C3)), 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O7, 구조식 O10, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18(예컨대, 구조식 O18A, 구조식 O18ac, 구조식 O18A1, 구조식 O18B 및 구조식 O18B1), 구조식 O21, 구조식 O23(예컨대, 구조식 O23A), 구조식 O24, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b), 구조식 O26, 구조식 O28, 구조식 O44, 구조식 O45(예컨대, 구조식 O45 및 구조식 O45rel), 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O58, 구조식 O64, 구조식 O69, 구조식 O73(예컨대, 구조식 O73(균주 73-1)), 구조식 O75, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O86, 구조식 O88, 구조식 O90, 구조식 O98, 구조식 O104, 구조식 0111, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O119, 구조식 O121, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O136, 구조식 O138, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O147, 구조식 O149, 구조식 O152, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O164, 구조식 O173 및 구조식 62D1(이때, n은 20 내지 100의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함하는 사카라이드.
C4. C2항에 있어서, 구조식 O1(예컨대, 구조식 O1A, 구조식 O1B 및 구조식 O1C), 구조식 O2, 구조식 O6(예컨대, 구조식 O6:K2; K13; K15 및 구조식 O6:K54), 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O21, 구조식 O25(예컨대, 구조식 O25a 및 구조식 O25b) 및 구조식 O75로부터 선택되는 구조를 포함하는 사카라이드.
C5. C1항에 있어서, 구조식 O8, 구조식 O9a, 구조식 O9, 구조식 O20ab, 구조식 O20ac, 구조식 O52, 구조식 O97 및 구조식 O101로부터 선택되는 구조를 포함하지 않는 사카라이드.
C6. C1항에 있어서, 구조식 O12로부터 선택되는 구조를 포함하지 않는 사카라이드.
C7. C4항에 있어서, 그람-음성균의 wzz 계열 단백질을 발현하여 사카라이드를 생성함으로써 생산된 사카라이드.
C8. C7항에 있어서, wzz 계열 단백질이 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사카라이드.
C9. C7항에 있어서, wzz 계열 단백질이 wzzB인, 사카라이드.
C10. C7항에 있어서, wzz 계열 단백질이 fepE인, 사카라이드.
C11. C7항에 있어서, wzz 계열 단백질이 wzzB 및 fepE인, 사카라이드.
C12. C7항에 있어서, wzz 계열 단백질이 살모넬라 엔테리카로부터 유래하는, 사카라이드.
C13. C7항에 있어서, wzz 계열 단백질이 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는, 사카라이드.
C14. C7항에 있어서, wzz 계열 단백질이 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19 중 어느 하나에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 사카라이드.
C15. C7항에 있어서, wzz 계열 단백질이 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는, 사카라이드.
C16. C1항에 있어서, 합성적으로 합성되는 사카라이드.
C17. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 R1 모이어티를 추가로 포함하는 사카라이드.
C18. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 R2 모이어티를 추가로 포함하는 사카라이드.
C19. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 R3 모이어티를 추가로 포함하는 사카라이드.
C20. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 R4 모이어티를 추가로 포함하는 사카라이드.
C21. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 K-12 모이어티를 추가로 포함하는 사카라이드.
C22. C1항 내지 C21항 중 어느 한 항에 있어서, 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산(KDO) 모이어티를 추가로 포함하는 사카라이드.
C23. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 R1 모이어티를 추가로 포함하지 않는 사카라이드.
C24. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 R2 모이어티를 추가로 포함하지 않는 사카라이드.
C25. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 R3 모이어티를 추가로 포함하지 않는 사카라이드.
C26. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 R4 모이어티를 추가로 포함하지 않는 사카라이드.
C27. C1항 내지 C16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 K-12 모이어티를 추가로 포함하지 않는 사카라이드.
C28. C1항 내지 C21항 중 어느 한 항에 있어서, 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산(KDO) 모이어티를 추가로 포함하지 않는 사카라이드.
C29. C1항 내지 C22항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 A를 포함하지 않는 사카라이드.
C30. C1항 내지 C29항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드가 10 내지 2,000 kDa, 또는 50 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는, 사카라이드.
C31. C1항 내지 C30항 중 어느 한 항에 있어서, 20 내지 40 kDa의 평균 분자량을 갖는 사카라이드.
C32. C1항 내지 C31항 중 어느 한 항에 있어서, 40,000 내지 60,000 kDa의 평균 분자량을 갖는 사카라이드.
C33. C1항 내지 C32항 중 어느 한 항에 있어서, n이 31 내지 90의 정수인 사카라이드.
C34. 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하되, 사카라이드가 대장균으로부터 유래하는, 접합체.
C35. 담체 단백질에 공유 결합된 C1항 내지 C33항 중 어느 한 항에 따른 사카라이드를 포함하는 접합체.
C36. C34항 또는 C35항에 있어서, 담체 단백질이 CRM197, 디프테리아 독소 단편 B(DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드(DT), 파상풍 톡소이드(TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 녹농균으로부터의 외독소 A; 녹농균의 해독된 외독소 A(EPA), 말토스 결합 단백질(MBP), 황색 포도상구균의 해독된 헤모리신 A, 응집 인자 A, 응집 인자 B, 콜레라 독소 B 아단위(CTB), 폐렴 연쇄쌍구균 뉴모리신 및 이의 해독된 변이체, 캄필로박터 제주니 AcrA, 및 캄필로박터 제주니 천연 당단백질 중 어느 하나로부터 선택되는, 접합체.
C37. C34항 내지 C36항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 CRM197인, 접합체.
C38. C34항 내지 C36항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드(TT)인, 접합체.
C39. C34항 내지 C38항 중 어느 한 항에 있어서, 환원적 아민화에 의해 제조된 접합체.
C40. C34항 내지 C38항 중 어느 한 항에 있어서, CDAP 화학에 의해 제조된 접합체.
C41. C34항 내지 C38항 중 어느 한 항에 있어서, 단일-말단 연결된 접합된 사카라이드인 접합체.
C42. C34항 내지 C38항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합되는, 접합체.
C43. C42항에 있어서, 사카라이드가 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합되되, 사카라이드가 카바메이트 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 연결되고, 담체 단백질이 아미드 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 연결되는, 접합체.
C44. C42항 또는 C43항에 있어서, CRM197이 eTEC 스페이서를 통해 폴리사카라이드에 공유 연결된 2 내지 20, 또는 4 내지 16개의 리신 잔기를 포함하는, 접합체.
C45. C34항 내지 C44항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드:담체 단백질 비(w/w)가 0.2 내지 4인, 접합체.
C46. C34항 내지 C44항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드 대 단백질의 비가 0.5 이상 내지 2 이하인, 접합체.
C47. C34항 내지 C44항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드 대 단백질의 비가 0.4 내지 1.7인, 접합체.
C48. C41항 내지 C47항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산(KDO) 잔기를 통해 담체 단백질에 접합되는, 접합체.
C49. 담체 단백질에 공유 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체로서, 상기 사카라이드가 구조식 O8, 구조식 O9a, 구조식 O9, 구조식 O20ab, 구조식 O20ac, 구조식 O52, 구조식 O97 및 구조식 O101로부터 선택되는 구조를 포함하고, n이 1 내지 10의 정수인, 접합체.
C50. C1항 내지 C33 중 어느 한 항에 따른 사카라이드 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 조성물.
C51. C34항 내지 C49 중 어느 한 항에 따른 접합체 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 조성물.
C52. C51항에 있어서, 조성물 내의 사카라이드의 총량과 비교하여 약 25% 이하의 유리 사카라이드를 포함하는 조성물.
C53. C50항 또는 C51항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
C54. C50항 또는 C51항에 있어서, 알루미늄을 추가로 포함하는 조성물.
C55. C50항 또는 C51항에 있어서, QS-21을 추가로 포함하는 조성물.
C56. C50항 또는 C51항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 조성물.
C57. C50항 또는 C51항에 있어서, 보조제를 포함하지 않는 조성물.
C58. (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 대장균으로부터 유래된 사카라이드를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리사카라이드가 카바메이트 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 연결되고, 상기 담체 단백질이 아미드 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 연결되는, 조성물.
C59. C58항에 있어서, 사카라이드가 대장균으로부터 유래된 O-항원인, 조성물.
C60. C58항에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 조성물.
C61. C58항에 있어서, 사카라이드가 대장균으로부터 유래된 O-항원인, 조성물.
C62. (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 C1항 내지 C16항 중 어느 하나에 따른 사카라이드를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리사카라이드가 카바메이트 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 연결되고, 상기 담체 단백질이 아미드 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 연결되는, 조성물.
C63. (i) 담체 단백질에 공유 커플링된 대장균 O25B 항원의 접합체, (ii) 담체 단백질에 공유 커플링된 대장균 O1A 항원의 접합체, (iii) 담체 단백질에 공유 커플링된 대장균 O2 항원의 접합체, 및 (iv) 담체 단백질에 공유 커플링된 O6 항원의 접합체를 포함하는 조성물로서, 상기 대장균 O25B 항원이 구조식 O25B의 구조를 포함하고, 이때 n이 30 초과의 큰 정수인, 조성물.
C64. C63항에 있어서, O1A 항원, O6 항원 및 O2 항원이 각각 하기 구조식을 포함하는, 조성물.
C65. C63항에 있어서, 담체 단백질이 CRM197, 디프테리아 독소 단편 B(DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드(DT), 파상풍 톡소이드(TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 또는 녹농균의 외독소 A; 녹농균의 해독된 외독소 A(EPA), 말토스 결합 단백질(MBP), 황색 포도상구균의 해독된 헤모리신 A, 응집 인자 A, 응집 인자 B, 콜레라 독소 B 아단위(CTB), 폐렴 연쇄쌍구균 뉴모리신 및 이의 해독된 변이체, 캄필로박터 제주니 AcrA 및 캄필로박터 제주니 천연 당단백질 중 어느 하나로부터 선택되는, 접합체.
C66. (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 사카라이드를 포함하는 접합체의 제조 방법으로서, a) 사카라이드를 1,1'-카보닐-다이-(1,2,4-트라이아졸)(CDT) 또는 1,1'-카보닐다이이미다졸(CDI)과 유기 용매에서 반응시켜 활성화된 사카라이드를 생성하는 단계; b) 활성화된 사카라이드를 시스타민 또는 시스테아민 또는 이의 염과 반응시켜 티올화된 사카라이드를 생성하는 단계; c) 티올화된 사카라이드를 환원제와 반응시켜 하나 이상의 유리 설프하이드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화된 사카라이드를 생성하는 단계; d) 활성화된 티올화된 사카라이드를 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화된 담체 단백질과 반응시켜 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 생성하는 단계; 및 e) 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 (i) 활성화된 담체 단백질의 비접합된 α-할로아세트아미드 기를 캡핑할 수 있는 제1 캡핑 시약; 및/또는 (ii) 비접합된 유리 설프하이드릴 잔기를 캡핑할 수 있는 제2 캡핑 시약과 반응시켜 eTEC 연결된 당접합체가 생성하는 단계(이때, 사카라이드는 대장균으로부터 유래됨)를 포함하는 제조 방법.
C67. C66항에 있어서, 사카라이드가 C1항 내지 C33항 중 어느 한 항에 따른 사카라이드를 포함하는, 제조 방법.
C68. C66항 또는 C67항에 있어서, 캡핑 단계 e)가 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 (i) 제1 캡핑 시약으로서 N-아세틸-L-시스테인, 및/또는 (ii) 제2 캡핑 시약으로서의 요오도아세트아미드와 반응시킴을 포함하는, 제조 방법.
C69. C66항 내지 C68항 중 어느 한 항에 있어서, 트라이아졸 또는 이미다졸과의 반응에 의해 사카라이드를 화합하여 화합된 사카라이드를 제공하는 단계를 추가로 포함하되, 단계 a) 전에, 상기 화합된 사카라이드가 전에 유기 용매에서 껍질-동결되고, 동결건조되고, 유기 용매에서 재구성되는, 제조 방법.
C70. 66항 내지 C69항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 생성된 티올화된 폴리사카라이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하되, 정제 단계가 정용여과를 포함하는, 제조 방법.
C71. C66항 내지 C70항 중 어느 한 항에 있어서, 정용여과에 의해 eTEC 연결된 당접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
C72. C66항 내지 C71항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 유기 용매가 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 다이메틸 포름아미드(DMF), 다이메틸 아세트아미드(DMA), N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 아세토니트릴, 1,3-다이메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2(1H)-피리미딘온(DMPU) 및 헥사메틸포스포르아미드(HMPA) 및 이들의 혼합물중 어느 하나로부터 선택되는 극성 비양성자성 용매인, 제조 방법.
C73. KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 나트륨 시트레이트, Na2SO4, 아스파르트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 또는 CaCl2-2H2O를 포함하는 매질.
C74. C73항에 있어서, 대장균을 배양하기 위해 사용되는 매질.
C75. C1항 내지 C33항 중 어느 한 항에 따른 사카라이드를 생산하는 방법으로서, 매질에서 재조합 대장균을 배양하는 단계; 상기 매질에서 상기 세포를 배양함으로써 상기 사카라이드를 생성하여 상기 세포가 상기 사카라이드를 생산하는, 방법.
C76. C75항에 있어서, 매질이 KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 나트륨 시트레이트, Na2SO4, 아스파르트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O 중 어느 하나로부터 선택되는 요소를 포함하는, 방법.
C77. C75항에 있어서, 매질이 대두 가수분해물을 포함하는, 방법.
C78. C75항에 있어서, 매질이 효모 추출물을 포함하는, 방법.
C79. C75항에 있어서, 매질이 대두 가수분해물 및 효모 추출물을 추가로 포함하지 않는, 방법.
C80. C75항에 있어서, 대장균 세포가 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2 중 어느 하나로부터 선택되는 이종 wzz 계열 단백질을 포함하는, 방법.
C81. C75항에 있어서, 대장균 세포가 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2 중 어느 하나로부터 선택되는 살모넬라 엔테리카 wzz 계열 단백질을 포함하는, 방법.
C82. C81항에 있어서, wzz 계열 단백질이 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하는, 방법.
C83. C75항에 있어서, 배양이 120 OD600/mL 초과의 수율을 생성하는, 방법.
C84. C75항에 있어서, 사카라이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
C85. C75항에 있어서, 정제 단계가 투석, 농축 작업, 정용여과 작업, 접선 유동 여과, 침전, 용리, 원심분리, 침전, 한외여과, 심층 여과 및 컬럼 크로마토그래피(이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 이온 교환 크로마토그래피, DEAE 및 소수성 상호작용 크로마토그래피) 중 어느 하나를 포함하는, 방법.
C86. C50항 내지 C62항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법.
C87. C86항에 있어서, 면역 반응이 항-대장균 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체의 유도를 포함하는, 방법.
C88. C86항에 있어서, 면역 반응이 항-대장균 IgG 항체의 유도를 포함하는, 방법.
C89. C86항에 있어서, 면역 반응이 대장균에 대한 살균 활성의 유도를 포함하는, 방법.
C90. C86항에 있어서, 면역 반응이 대장균에 대한 옵소닌포식성 항체의 유도를 포함하는, 방법.
C91. C86항에 있어서, 면역 반응이 초기 투약 후 1,000 이상 내지 200,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준을 포함하는, 방법.
C92. C86항에 있어서, 조성물이 구조식 O25(이때, n은 40 내지 100의 정수임)를 포함하는 사카라이드를 포함하고, 면역 반응이 초기 투약 후 1,000 이상 내지 200,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준을 포함하는, 방법.
C93. C86항에 있어서, 포유동물이 요로 감염, 담낭염, 담관염, 설사, 용혈성 요독 증후군, 신생아 수막염, 요로성 패혈증, 복강내 감염, 수막염, 복합 폐렴, 상처 감염, 전립선 생검 후 관련 감염, 신생아/유아 패혈증, 호중구감소성 열, 기타 혈류 감염, 폐렴, 균혈증 및 패혈증으로부터 선택되는 어느 하나의 병태의 위험을 갖는, 방법.
C94. C86항에 있어서, 포유동물이 요로 감염, 담낭염, 담관염, 설사, 용혈성 요독 증후군, 신생아 수막염, 요로성 패혈증, 복강내 감염, 수막염, 복합 폐렴, 상처 감염, 전립선 생검 후 관련 감염, 신생아/유아 패혈증, 호중구감소성 열, 기타 혈류 감염, 폐렴, 균혈증 및 패혈증으로부터 선택되는 어느 하나의 병태를 갖는, 방법.
C95. (i) 장외 병원성 대장균에 대해 대상에서 면역 반응을 유도하거나, (ii) 장외 병원성 대장균에 대해 대상에서 면역 반응을 유도하거나, (iii) 장외 병원성 대장균에 대해 특이적인 대상에서 옵소닌포식성 항체의 생산을 유도하는 방법으로서, 효과량의 C50항 내지 C65항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는 방법.
C96. C95항에 있어서, 대상이 요로 감염의 위험을 갖는, 방법.
C97. C95항에 있어서, 대상이 균혈증의 위험을 갖는, 방법.
C98. C95항에 있어서, 대상이 패혈증의 위험을 갖는, 방법.
C99. (i) 담체 단백질에 공유 커플링된 대장균 O25B 항원의 접합체, (ii) 담체 단백질에 공유 커플링된 대장균 O1A 항원의 접합체, (iii) 담체 단백질에 공유 커플링된 대장균 O2 항원의 접합체, 또는 (iv) 담체 단백질에 공유 커플링된 대장균 O6 항원의 접합체(이때, 대장균 O25B 항원은 구조식 O25B의 구조를 포함하고, n은 30 초과의 정수임)를 포함하는 조성물.
C100. C99항에 있어서, O1A 항원, O6 항원 및 O2 항원이 각각 다음 구조식을 포함하는 조성물.
C101. C99항에 있어서, 담체 단백질이 CRM197, 디프테리아 독소 단편 B(DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드(DT), 파상풍 톡소이드(TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 또는 녹농균의 외독소 A; 녹농균의 해독된 외독소 A(EPA), 말토스 결합 단백질(MBP), 황색 포도상구균의 해독된 헤모리신 A, 응집 인자 A, 응집 인자 B, 콜레라 독소 B 아단위(CTB), 폐렴 연쇄쌍구균 뉴모리신 및 이의 해독된 변이체, 캄필로박터 제주니 AcrA 및 캄필로박터 제주니 천연 당단백질 중 어느 하나로부터 선택되는, 조성물.
C102. (i) 장외 병원성 대장균에 대해 대상에서 면역 반응을 유도하거나, (ii) 장외 병원성 대장균에 대해 대상에서 면역 반응을 유도하거나, (iii) 장외 병원성 대장균에 대해 특이적인 대상에서 옵소닌포식성 항체의 생산을 유도하는 방법으로서, 효과량의 C99항에 따른 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는 방법.
C103. C102항에 있어서, 대상이 요로 감염의 위험을 갖는, 방법.
C104. C102항에 있어서, 대상이 균혈증의 위험을 갖는, 방법.
C105. C102항에 있어서, 대상이 패혈증의 위험을 갖는, 방법.
C106. 대장균의 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 5개 이상의 반복 단위의 증가를 포함하는 사카라이드.
C107. C106항에 있어서, 사카라이드가 구조식 O25a를 포함하고, 대장균이 대장균 혈청형 O25a인, 사카라이드.
C108. C106항에 있어서, 사카라이드가 구조식 O25b를 포함하고, 대장균이 대장균 혈청형 O25b인, 사카라이드.
C109. C106항에 있어서, 사카라이드가 구조식 O2를 포함하고, 대장균이 대장균 혈청형 O2인, 사카라이드.
C110. C106항에 있어서, 사카라이드가 구조식 O6을 포함하고, 대장균이 대장균 혈청형 O6인, 사카라이드.
C111. C106항에 있어서, 사카라이드가 구조식 O1을 포함하고, 대장균이 대장균 혈청형 O1인, 사카라이드.
C112. C106항에 있어서, 사카라이드가 구조식 O17을 포함하고, 대장균이 대장균 혈청형 O17인, 사카라이드.
C113. C106항에 있어서, 구조식 O1, 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4, 구조식 O5, 구조식 O6, 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18, 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23, 구조식 O24, 구조식 O25, 구조식 O25b, 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45, 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73, 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187(이때, n은 5 내 1,000의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함하는 사카라이드.
C114. C106항에 있어서, 대장균이 O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O25b, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 및 O187로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균 혈청형인, 사카라이드.
C115. C106항에 있어서, 사카라이드를 생성하기 위해 그람-음성균에서 과발현하는 wzz 계열 단백질을 포함하는 배양물에서 그람-음성균에 의해 생성된 O-폴리사카라이드의 반복 단위를 증가시킴으로써 생성되는 사카라이드.
C116. C115항에 있어서, 과발현된 wzz 계열 단백질이 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사카라이드.
C117. C115항에 있어서, 과발현된 wzz 계열 단백질이 wzzB인, 사카라이드.
C118. C115항에 있어서, 과발현된 wzz 계열 단백질이 fepE인, 사카라이드.
C119. C115항에 있어서, 과발현된 wzz 계열 단백질이 wzzB 및 fepE인, 사카라이드.
C120. C106항에 있어서, 합성적으로 합성되는 사카라이드.
C121. 담체 단백질에 공유 결합된 C106항에 따른 사카라이드를 포함하는 접합체.
C122. C121항에 있어서, 담체 단백질이 CRM197인, 접합체.
C123. C121항에 있어서, 사카라이드가 구조식 O1, 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4, 구조식 O5, 구조식 O6, 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18, 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23, 구조식 O24, 구조식 O25, 구조식 O25b, 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45, 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73, 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187(이때, n은 5 내지 1,000의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함하는, 접합체.
C124. C121항에 있어서, 사카라이드가 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 5개 이상의 반복 단위의 증가를 포함하는, 접합체.
C125. C1항에 따른 사카라이드를 포함하고, 약학적으로 허용되는 희석제를 추가로 포함하는 조성물.
C126. C125항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
C127. C125항에 있어서, 알루미늄을 추가로 포함하는 조성물.
C128. C125항에 있어서, QS-21을 추가로 포함하는 조성물.
C129. C125항에 있어서, 보조제를 포함하지 않는 조성물.
C130. C125항에 따른 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
C131. C121항에 따른 접합체를 포함하고, 약학적으로 허용되는 희석제를 추가로 포함하는 조성물.
C132. C131항에 따른 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
C133. C130항 또는 C132항에 있어서, 면역 반응이 항-대장균 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체의 유도를 포함하는, 방법.
C134. C133항에 있어서, 항-대장균 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체가 IgG 항체인, 방법.
C135. C133항에 있어서, 항-대장균 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체가 대장균에 대한 살균 활성을 갖는 IgG 항체인, 방법.
C136. (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 대장균으로부터 유래된 사카라이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 폴리사카라이드가 카바메이트 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 연결되고, 담체 단백질이 아미드 연결기를 통해 eTEC 스페이서에 공유 연결되는, 면역원성 조성물.
C137. C136항에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C138. C136항에 있어서, 사카라이드가 대장균으로부터 유래된 O-항원인, 면역원성 조성물.
C139. C136항에 있어서, 사카라이드가 구조식 O1, 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4, 구조식 O5, 구조식 O6, 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18, 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23, 구조식 O24, 구조식 O25, 구조식 O25b, 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45, 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73, 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187(이때, n은 5 내지 1,000의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함하는, 면역원성 조성물.
C140. C136항에 있어서, 사카라이드가 75 내지 100%의 O-아세틸화도를 갖는, 면역원성 조성물.
C141. C136항에 있어서, 담체 단백질이 CRM197인, 면역원성 조성물.
C142. C141항에 있어서, CRM197이 eTEC 스페이서를 통해 폴리사카라이드에 공유 연결된 2 내지 20개의 리신 잔기를 포함하는, 면역원성 조성물.
C143. C141항에 있어서, CRM197이 eTEC 스페이서를 통해 폴리사카라이드에 공유 연결된 4 내지 16개의 리신 잔기를 포함하는, 면역원성 조성물.
C144. C136항에 있어서, 추가적인 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C145. C136항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C146. C145항에 있어서, 보조제가 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이드록사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 알루미늄-기반 보조제인, 면역원성 조성물.
C147. C136항에 있어서, 보조제를 포함하지 않는 면역원성 조성물.
C148. 담체 단백질에 접합된 대장균으로부터 유래된 사카라이드를 포함하는 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 당접합체가 환원적 아민화를 사용하여 제조되는, 면역원성 조성물.
C149. C148항에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C150. C148항에 있어서, 사카라이드가 대장균으로부터 유래된 O-항원인, 면역원성 조성물.
C151. C148항에 있어서, 사카라이드가 구조식 O1, 구조식 O2, 구조식 O3, 구조식 O4, 구조식 O5, 구조식 O6, 구조식 O7, 구조식 O8, 구조식 O9, 구조식 O10, 구조식 O11, 구조식 O12, 구조식 O13, 구조식 O14, 구조식 O15, 구조식 O16, 구조식 O17, 구조식 O18, 구조식 O19, 구조식 O20, 구조식 O21, 구조식 O22, 구조식 O23, 구조식 O24, 구조식 O25, 구조식 O25b, 구조식 O26, 구조식 O27, 구조식 O28, 구조식 O29, 구조식 O30, 구조식 O32, 구조식 O33, 구조식 O34, 구조식 O35, 구조식 O36, 구조식 O37, 구조식 O38, 구조식 O39, 구조식 O40, 구조식 O41, 구조식 O42, 구조식 O43, 구조식 O44, 구조식 O45, 구조식 O46, 구조식 O48, 구조식 O49, 구조식 O50, 구조식 O51, 구조식 O52, 구조식 O53, 구조식 O54, 구조식 O55, 구조식 O56, 구조식 O57, 구조식 O58, 구조식 O59, 구조식 O60, 구조식 O61, 구조식 O62, 구조식 O63, 구조식 O64, 구조식 O65, 구조식 O66, 구조식 O68, 구조식 O69, 구조식 O70, 구조식 O71, 구조식 O73, 구조식 O74, 구조식 O75, 구조식 O76, 구조식 O77, 구조식 O78, 구조식 O79, 구조식 O80, 구조식 O81, 구조식 O82, 구조식 O83, 구조식 O84, 구조식 O85, 구조식 O86, 구조식 O87, 구조식 O88, 구조식 O89, 구조식 O90, 구조식 O91, 구조식 O92, 구조식 O93, 구조식 O95, 구조식 O96, 구조식 O97, 구조식 O98, 구조식 O99, 구조식 O100, 구조식 O101, 구조식 O102, 구조식 O103, 구조식 O104, 구조식 O105, 구조식 O106, 구조식 O107, 구조식 O108, 구조식 O109, 구조식 O110, 구조식 0111, 구조식 O112, 구조식 O113, 구조식 O114, 구조식 O115, 구조식 O116, 구조식 O117, 구조식 O118, 구조식 O119, 구조식 O120, 구조식 O121, 구조식 O123, 구조식 O124, 구조식 O125, 구조식 O126, 구조식 O127, 구조식 O128, 구조식 O129, 구조식 O130, 구조식 O131, 구조식 O132, 구조식 O133, 구조식 O134, 구조식 O135, 구조식 O136, 구조식 O137, 구조식 O138, 구조식 O139, 구조식 O140, 구조식 O141, 구조식 O142, 구조식 O143, 구조식 O144, 구조식 O145, 구조식 O146, 구조식 O147, 구조식 O148, 구조식 O149, 구조식 O150, 구조식 O151, 구조식 O152, 구조식 O153, 구조식 O154, 구조식 O155, 구조식 O156, 구조식 O157, 구조식 O158, 구조식 O159, 구조식 O160, 구조식 O161, 구조식 O162, 구조식 O163, 구조식 O164, 구조식 O165, 구조식 O166, 구조식 O167, 구조식 O168, 구조식 O169, 구조식 O170, 구조식 O171, 구조식 O172, 구조식 O173, 구조식 O174, 구조식 O175, 구조식 O176, 구조식 O177, 구조식 O178, 구조식 O179, 구조식 O180, 구조식 O181, 구조식 O182, 구조식 O183, 구조식 O184, 구조식 O185, 구조식 O186 및 구조식 O187(이때, n은 5 내지 1,000의 정수임)로부터 선택되는 구조를 포함하는, 면역원성 조성물.
C152. C148항에 있어서, 사카라이드가 75 내지 100%의 O-아세틸화도를 갖는, 면역원성 조성물.
C153. C148항에 있어서, 담체 단백질이 CRM197인, 면역원성 조성물.
C154. C148항에 있어서, 추가적인 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C155. C148항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C156. C155항에 있어서, 보조제가 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이드록사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 알루미늄-기반 보조제인, 면역원성 조성물.
C157. C148항에 있어서, 보조제를 포함하지 않는, 면역원성 조성물.
C158. C136항 내지 C157항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
C159. C158항에 있어서, 면역 반응이 항-대장균 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체의 유도를 포함하는, 방법.
C160. C133항에 있어서, 항-대장균 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체가 IgG 항체인, 방법.
C161. C133항에 있어서, 항-대장균 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체가 대장균에 대한 살균 활성을 갖는 IgG 항체인, 방법.
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30 Thr Ile Ile Ile Ser Val Val Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 35 40 45 Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 50 55 60 Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 65 70 75 80 Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 85 90 95 Gly Arg Phe Ser Phe Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 100 105 110 Gln Lys Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 115 120 125 Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Asp Ala 130 135 140 Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 145 150 155 160 Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Leu Ala Leu Gly Arg Lys 165 170 175 Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 180 185 190 Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 195 200 205 Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 225 230 235 240 Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr 245 250 255 Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Asn Leu Lys Val Asp Asp 260 265 270 Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile 275 280 285 Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu 290 295 300 Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu 305 310 315 320 Arg Asn Tyr Asn Ser Lys 325 <210> 23 <211> 326 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 23 Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 1 5 10 15 Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 20 25 30 Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 35 40 45 Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 50 55 60 Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 65 70 75 80 Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 85 90 95 Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 100 105 110 Gln Glu Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 115 120 125 Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala 130 135 140 Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 145 150 155 160 Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys 165 170 175 Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 180 185 190 Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 195 200 205 Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 225 230 235 240 Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr 245 250 255 Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp 260 265 270 Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile 275 280 285 Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu 290 295 300 Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu 305 310 315 320 Arg Asn Tyr Asn Ala Lys 325 <210> 24 <211> 327 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 24 Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu 1 5 10 15 Gln Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Leu Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 20 25 30 Thr Ile Ile Val Ala Val Ile Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Gly Tyr 35 40 45 Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 50 55 60 Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu 65 70 75 80 Tyr Gly Gly Asn Ala Pro Lys Ile Ser Glu Val Gln Ala Asn Phe Ile 85 90 95 Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn 100 105 110 Gln Lys Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Gln Ser Val Lys Gly Gln 115 120 125 Ala Leu Pro Leu Ser Val Ser Tyr Val Ser Thr Thr Ala Glu Gly Ala 130 135 140 Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala 145 150 155 160 Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys 165 170 175 Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 180 185 190 Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp 195 200 205 Glu Ala Lys Ile Thr Gln Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gln Asp Val Thr 210 215 220 Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile 225 230 235 240 Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln 245 250 255 Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp 260 265 270 Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg 275 280 285 Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu 290 295 300 Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg 305 310 315 320 Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu 325

Claims (27)

  1. 구조식 O1, 구조식 O1A, 구조식 O2, 구조식 O6, 구조식 O11, 구조식 O13, 구조식 O16, 구조식 O21, 구조식 O25b 및 구조식 O75로부터 선택되는 어느 하나 구조를 포함하는 사카라이드로서, 각각의 사카라이드 분자에 대한 구조식에서 n은 31 내지 100의 정수인, 사카라이드.
  2. 제1항에 있어서,
    구조식 O1A, 구조식 O2, 구조식 O6 및 구조식 O25B로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 포함하는 사카라이드.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 wzz 계열 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포에서 생성되는 사카라이드.
  4. 제3항에 있어서,
    단백질이 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19 중 어느 하나를 포함하는, 사카라이드.
  5. 제1항에 있어서,
    합성적으로 합성된 사카라이드.
  6. 구조식 O1, 구조식 O1A, 구조식 O2, 구조식 O6, 구조식 O11, 구조식 O13, 구조식 O16, 구조식 O21, 구조식 O25b 및 구조식 O75로부터 선택되는 어느 하나 구조를 포함하는 사카라이드에 공유 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체로서, 각각의 사카라이드 분자에 대한 구조식에서 n은 31 내지 100의 정수인, 접합체.
  7. 제6항에 있어서,
    사카라이드가 구조식 O25b, 구조식 O1A, 구조식 O2 및 구조식 O6 중 어느 하나를 포함하는, 접합체.
  8. 제6항에 있어서,
    사카라이드가 대장균 R1 모이어티, 대장균 R2 모이어티, 대장균 R3 모이어티, 대장균 R4 모이어티 및 대장균 K-12 모이어티 중 어느 하나를 추가로 포함하는, 접합체.
  9. 제6항에 있어서,
    사카라이드가 대장균 R1 모이어티, 대장균 R2 모이어티, 대장균 R3 모이어티, 대장균 R4 모이어티 및 대장균 K-12 모이어티 중 어느 하나를 추가로 포함하지 않는, 접합체.
  10. 제6항에 있어서,
    사카라이드가 대장균 R2 모이어티를 추가로 포함하지 않는, 접합체.
  11. 제6항에 있어서,
    사카라이드가 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산(KDO) 모이어티를 추가로 포함하는, 접합체.
  12. 제6항에 있어서,
    담체 단백질이 CRM197, 디프테리아 독소 단편 B(DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드(DT), 파상풍 톡소이드(TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 외독소 A, 녹농균의 해독된 외독소 A(EPA), 말토스 결합 단백질(MBP), 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 해독된 헤모리신 A, 응집 인자 A, 응집 인자 B, 콜레라 독소 B 아단위(CTB), 폐렴 연쇄쌍구균(Streptococcus pneumoniae) 뉴모리신 또는 해독된 뉴모리신, 캄필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) AcrA 및 캄필로박터 제주니 천연 당단백질 중 어느 하나로부터 선택되는, 접합체.
  13. 제6항에 있어서,
    담체 단백질이 CRM197인, 접합체.
  14. 제6항에 있어서,
    담체 단백질이 파상풍 톡소이드인, 접합체.
  15. 제6항에 있어서,
    담체 단백질에 대한 사카라이드의 질량비가 0.5 이상 내지 2 이하인, 접합체.
  16. 제6항에 있어서,
    환원적 아민화를 통해 제조되는 접합체.
  17. 제6항에 있어서,
    사카라이드가 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합되는, 접합체.
  18. 제6항에 있어서,
    사카라이드가 단일-말단 연결된 접합된 사카라이드인, 접합체.
  19. 제11항에 있어서,
    사카라이드가 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산(KDO) 모이어티를 통해 담체 단백질에 접합되는, 접합체.
  20. 제6항에 있어서,
    CDAP 화학을 통해 제조되는 접합체.
  21. (a) 각각의 사카라이드 분자에 대한 구조식에서 n이 31 내지 90의 정수인 구조식 O25b를 포함하는 사카라이드에 공유 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체,
    (b) 각각의 사카라이드 분자에 대한 구조식에서 n이 31 내지 90의 정수인 구조식 O1A를 포함하는 사카라이드에 공유 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체,
    (c) 각각의 사카라이드 분자에 대한 구조식에서 n이 31 내지 90의 정수인 구조식 O2를 포함하는 사카라이드에 공유 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체, 및
    (d) 각각의 사카라이드 분자에 대한 구조식에서 n이 31 내지 90의 정수인 구조식 O6을 포함하는 사카라이드에 공유 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체
    를 포함하는, 대장균 감염으로부터 포유동물을 보호하기 위한 면역원성 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    각각의 사카라이드 분자에 대한 구조식에서 n이 31 내지 90의 정수인, 구조식 O16 및 구조식 O75로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 포함하는 사카라이드에 공유 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  23. 제21항에 있어서,
    조성물 중 사카라이드의 총량과 비교하여 25% 이하의 유리 사카라이드를 포함하는 면역원성 조성물.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물에게 유효량의 조성물을 투여함으로써 포유동물에서 대장균에 대한 면역 반응의 증가를 유도하기 위한 면역원성 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    면역 반응이 대장균에 대한 옵소닌포식성(opsonophagocytic) 항체의 생성을 포함하는, 면역원성 조성물.
  26. 제24항에 있어서,
    면역 반응이 대장균 감염으로부터 포유동물을 보호하는, 면역원성 조성물.
  27. 삭제
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WO2016168324A1 (en) * 2015-04-13 2016-10-20 University Of Maryland, Baltimore Compositions and methods for producing bacterial conjugate vaccines

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