CN1854301B - 一种表达人血清白蛋白的载体和工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达人血清白蛋白的载体和工程菌。本发明所提供的表达人血清白蛋白的载体，是在巴斯德毕赤酵母表达载体的多克隆位点插入有人血清白蛋白编码序列的质粒。该人血清白蛋白编码序列的5′端紧密连接有分泌信号肽及前导肽编码序列，分泌信号肽及前导肽编码序列的5′端紧密连接有巴斯德毕赤酵母AOX1基因的高表达特征序列GAAACG。含有上述表达人血清白蛋白的载体的巴斯德毕赤酵母菌株，特别是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCCNo.1360在廉价的非选择培养基上高密度连续培养可获得较高的人血清白蛋白产量(10g/L培养基上清)，分泌的HSA占所有分泌蛋白的80％以上，利于工业规模的分离和下游加工。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种表达人血清白蛋白的载体和工程菌。
背景技术
人血清白蛋白(以下简称HSA)是血浆中的主要蛋白组分，由585个氨基酸残基组成。人血清白蛋白在肝脏中合成后分泌进入血液，主要作用是维持血液中的正常渗透压，另外还具有结合和运输血液中小分子物质的功能。目前的HSA制剂是由人血浆提取的一类血液制剂，主要用于临床纠正因大手术、创伤、器官移植等引起的急性血容量减少及各种原因引起的水、电解质和胶体平衡失调，以防止和控制休克；还用于急性胃肠出血、肾透析、以及严重的慢性疾患，如消化道吸收不良、肝硬变、肾病综合症、脑血管意外或脑局部缺血等内科疾病，特别是合并水肿的病例。其唯一的原料来源是人血，由于肝炎、爱滋病献血、献浆员中的交叉感染，导致原料短缺和生产成本大大提高，开发一种新的HSA来源是非常必要的。
自上世纪九十年代以来，采用基因工程技术将HSA基因与适合酵母菌转化载体重组，转化于酵母菌中，获得转基因菌株，可提高HSA生产水平，并能较为有效而温和地分离白蛋白，避免了使用人血浆生产白蛋白所带来的盲目性和危害性。如US5707828介绍了将HSA表达质粒pHSA413导入巴斯德毕赤酵母GS115可获得工程菌GS115：pHSA413-6，其不足在于利用该工程菌进行发酵生产HSA，HSA产量较低，HSA表达水平为3.39g/L培养基上清(细胞干重101g DCW/L，甲醇诱导237小时)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种表达人血清白蛋白的载体。
本发明所提供的表达人血清白蛋白的载体，是在巴斯德毕赤酵母表达载体的多克隆位点插入有人血清白蛋白编码序列的质粒。
所述人血清白蛋白编码序列的5′端紧密连接有分泌信号肽及前导肽编码序列，得到具有序列表中序列1的人血清白蛋白基因片段。
序列1由1830个碱基组成，自5′端的第1位-72位碱基为所述分泌信号肽及前导肽编码序列，自5′端的第73位-1830位碱基为人血清白蛋白编码序列。
所述分泌信号肽及前导肽编码序列的5′端紧密连接有巴斯德毕赤酵母AOX1基因的高表达特征序列GAAACG，得到具有序列表中序列2的自5′端第8位-1843位碱基的人血清白蛋白基因片段。
所述巴斯德毕赤酵母表达载体可为pPICZα-A、pPICZα-B、pPICZα-C、pPIC3.5K、pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K等。
所述巴斯德毕赤酵母表达载体优选为pPICZα-A。
所述表达人血清白蛋白的载体优选为将具有序列表中序列2的核苷酸序列的人血清白蛋白基因片段插入pPICZα-A的NspV和EcoRI识别位点间得到的pAZP-HSA。
含有上述表达人血清白蛋白载体的巴斯德毕赤酵母菌株也属于本发明的保护范围。
所述含有上述表达人血清白蛋白的载体的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株优选为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360已于2005年04月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360，是将质粒pAZP-HSA导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株得到的表达HSA的工程菌。
本发明构建了可在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达成熟人血清白蛋白的表达载体和工程菌，由于该表达载体中由AOX(醇氧化酶基因)启动子起始转录，可通过甲醇严格地调控表达。在廉价的非选择培养基上高密度连续培养本发明的表达人HSA的工程菌可获得较高的人血清白蛋白产量(10g/L培养基上清，10L发酵罐批式发酵，甲醇诱导200小时)，分泌的HSA占所有分泌蛋白的80％以上，利于工业规模的分离和下游加工。本发明的表达人血清白蛋白的载体和工程菌在HSA的生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为pAZP-HSA的物理图谱
图2为不同菌株表达的HSA的SDS-PAGE电泳结果
图3A为电喷雾质谱测定巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCCNo.1360表达的HSA分子量结果
图3B为电喷雾质谱测定血源HSA分子量结果
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、表达HSA的载体pAZP-HSA和工程菌巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)HSA75-10CGMCC No.1360的构建
1、从人肝脏组织中分离HSA mRNA
从事故死亡儿童的肝脏中分离信使RNA(mRNA)。具体方法如下：
在10.5g冷冻的人肝组织中加入210ml裂解液(4mol/L硫氰胍，0.1mol/LTris-HCl，0.1mol/L2-巯基乙醇，pH7.5)匀浆。在10000rpm，4℃条件下离心10分钟沉淀细胞碎片。将上清转移到新的离心管中，加入是上清0.04倍体积的1mol/L磷酸和是上清0.5倍体积的95％乙酸，-20℃放置2小时。而后7500rpm，4℃离心10分钟。沉淀物重悬于50ml洗涤液(6mol/L盐酸胍，10mmol/L Na2EDTA，10mmol/L DTT，pH7.0)中，5500rpm离心10分钟。上清转移到另一新的离心杯中。加入是上清0.04倍体积的1mol/L醋酸和是上清0.5倍体积的95％乙醇。-20℃放置2小时后7200rpm离心20分钟。沉淀重悬于20ml洗涤液中，加入是沉淀0.04倍体积的1mol/L醋酸和是沉淀0.5倍体积的95％乙醇，-20℃放置12小时。4℃，8000rpm离心10分钟。沉淀用15ml ddH2O重悬，加入等体积的氯仿：正丁醇(4：1)进行抽提，将水相转移到新的离心管中，加入是水相0.1倍体积的2.4mol/L NaAc和是水相2.5倍体积的95％乙醇。-20℃放置2.5小时，RNA通过离心沉淀下来，并重悬于2ml ddH2O中，总共得到19.2mg RNA。
采用常规使用的寡聚dT-纤维素和层析法从总RNA中分离mRNA。将装有5g寡聚dT-纤维素的层析柱用等柱体积的0.1mol/L NaOH洗涤以使RNase变性。然后用高盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，0.5％SDS，pH7.5)平衡。溶于2ml ddH2O内的总RNA，70℃加热1分钟，然后冰浴降至室温。下一步将0.2ml的5mol/L NaCl，0.04ml0.5mol/L Tris-HCl pH7.5，以及0.1ml1％SDS加入到RNA中。然后加入8ml高盐缓冲液，以10滴/分钟的速率上样。样品上完后，用高盐缓冲液洗去未结合的RNA，部分收集洗脱液(0.5ml/管)。在分光光度计上测A260。一直到A260低于0.05时停止用高盐缓冲液洗脱。然后进一步用低盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，0.1％SDS，pH7.4)洗涤，剩余的非结合RNA同上洗至A260小于0.05。
下一步即用洗脱缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.1％SDS，pH7.4)将mRNA从介质中洗脱下来。部分收集(1ml)洗脱液直至A260<0.05，开始的15个管(A260较高)集中在一起。加入是15个管洗脱液(15ml)的0.1倍体积的2.4mol/LNaAc和是15个管洗脱液的2.5倍体积的95％乙醇，-20℃放置12小时，沉淀mRNA。洗脱液的mRNA离心沉淀并重悬于800μl洗脱液中。将悬液70℃加热90秒，冰浴，然后加入是悬液0.1倍体积的5mol/L NaCl和是悬液0.05倍体积的10％SDS，第二次过寡聚dT-纤维素柱作进一步纯化。用NaOH洗涤装有0.1g寡聚dT-纤维素的层析柱，然后按照第一次纯化的方法得到二次纯化的mRNA。
2、HSA cDNA第一条链的合成；
以步骤1纯化的mRNA为模板首先合成第一条cDNA链，以引物2：5’gcggaattcttataagcctaaggcagc3’作为引物，按以下步骤进行：
在冰浴条件下制备如下混合物：
然后加入如下组分：
注：禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶需要在-80℃存放，使用前溶化并尽快加入反应体系中(在所有组分加完后)。
将反应混合物冰浴5分钟，然后将反应液46℃温育30分钟。加入20μl0.5mol/L EDTA，pH8.0终止反应。最后用等体积的酚：氯仿(1：1)抽提反应混合物，得到cDNA的第一条链。
3、HSA cDNA扩增及序列分析
将反转录得到的cDNA第一条链作为PCR反应的模板，使用pfu DNA聚合酶进行扩增，反应体系如下：
其中，pfu DNA聚合酶和dNTP均为上海生工公司产品，10×PCR缓冲液为上海生工公司pfu DNA聚合酶产品所附带。引物1：5’cggttcgaaacgatgaagtgggtaacc3’(含有限制性内切酶Nsp V位点，为HSA表达区上游引物)；引物2：5’gcggaattcttataagcctaaggcagc3’(含有限制性内切酶EcoRI位点，为HSA表达区下游引物)
反应条件：
94℃预变性4分钟
94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃扩增3分钟；30循环
72℃加入1UTaqDNA聚合酶(购自上海生工公司)加尾60分钟
4℃保存。
将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后采用上海生工公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA片段的回收，和pGEM-T Easy Vector(购自Promega公司)连接后转化大肠杆菌DH5α菌株，经蓝白斑法筛选重组克隆，提取质粒后进行交上海生工公司进行DNA测序，经比对分析后发现3号克隆测序结果正确，其含有具有序列表中序列2的DNA序列的PCR扩增片段，命名为pGEM-HSA3。
4、重组质粒pAZP-HSA的构建
将pGEM-HSA3和pPICZα-A(购自Invitrogen公司)载体分别利用限制性内切酶Nsp V和EcoRI共同消化，分别回收1.9Kb DNA片段和3.2KbDNA片段，将以上回收到的DNA片段采用宝生物公司的DNA连接试剂盒进行DNA连接反应，将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有25μg/ml的Zeocin(Invitrogen公司产品)的低盐LB(配方见Invitrogen公司EasySelectTM Pichia Expression Kit产品说明书)平板培养转化菌株，筛选到含有HSA基因的重组质粒的菌株，将该含有HSA基因的重组质粒命名为pAZP-HSA(图1)。
5、工程菌的获得
选择巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株(购自Invitrogen公司)作为宿主菌，将质粒pAZP-HSA经限制性内切酶ScaI消化，按照以下步骤进行转化操作：
将100ul甘油管保存的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株接种于装有5ml YPD培养基的试管中，30℃震荡培养10小时后转接至装有50ml YPD培养基的250ml三角瓶中，30℃培养12小时；将50ml培养液转移至50ml离心管中离心收获菌体(3000g，15min)，用超纯水洗涤菌体2次，用1mol/L山梨醇洗涤菌体一次，2ml1mol/L山梨醇重悬洗涤后的菌体。取80ul菌体转移到冰预冷的0.2cm电转杯(购自Bio-Rad公司)中，加入线性化过的DNA10ul混匀，使用Gene Pulser(购自Bio-Rad公司)于1500v、25uF、200Ω条件下电击4毫秒，将电击过的菌体溶于1ml1mol/L山梨醇中，30℃恢复1.5小时。取300ul涂含有100μg/ml的Zeocin的YPDS(配方见Invitrogen公司EasySelectTM Pichia Expression Kit产品说明书)平板，30℃培养3-4天，将生长出的100个克隆点接到100μg/ml的Zeocin的YPDS平板并编号。
将转化得到的克隆分别接种到BMGY液体培养基中，30℃培养24小时，取4ml培养物转入BMMY培养基进行诱导培养，培养96小时后，将发酵液在7500rpm，4℃离心10分钟，取上清，通过Bradford方法测定蛋白表达量，选择高表达的菌株发酵液的上清液进行SDS-PAGE分析，部分表达HSA菌株的SDS-PAGE分析结果如图2中，箭头示HSA条带。图中，MO.25表示含量为0.25g/L的标准人血清白蛋白样品(购自Sigma公司)，MO.5表示含量为0.5g/L的标准人血清白蛋白样品，其余泳道为不同菌株编号。完成初筛后选择高表达HSA菌株进行复筛，最后选定编号75-10的菌株，命名为HSA75-10，即巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)HSA75-10CGMCC No.1360，作为工程菌株。
6、用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360菌株进行摇瓶表达HSA
将巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360接入装有40ml BMGY培养基的250ml三角瓶中，30℃100rpm摇培24小时，取10ml培养物转入装有100mlBMMY培养基的1000ml三角瓶中进行诱导，30℃220rpm摇培96小时后，将发酵液在7500rpm，4℃离心10分钟，取发酵液的上清液进行SDS-PAGE分析，结果表明该菌株的摇瓶发酵HSA表达水平为0.8g/L，HSA的含量占所有分泌蛋白的85％。
7、用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360进行批式发酵表达HSA
按照Invitrogen公司公开的“Pichia Fermentation Process Guidelines”进行发酵培养，具体工艺如下：
1).培养基
种子培养基：2％的细菌胨、1％的酵母抽提物、2％的甘油。
批次发酵培养基：每L中含有
甘油 50.0g
H3PO4(85％) 14.0ml
CaSO4.2H2O 0.6g
K2SO4 9.5g
MgSO4.7H2O 7.8g
KOH 2.6g
0.2g/L生物素溶液 1.6ml
YTB溶液 2ml
(YTB溶液：每1L含FeSO4.7H2O65.0g，CuSO4.5H2O6.0g，ZnSO4.7H2O20.0g，MnSO4.5H2O3.0g，H2SO45.0ml)
补料培养基：
甘油 2000ml
YTB溶液 2ml
甲醇 2000ml
2).种子培养
从冷冻管中取出1ml含巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCCNo.1360的菌液，接入含200ml种子培养基的1000ml带挡板的摇瓶中，在30℃条件下，摇床培养24小时。培养24小时。
3).发酵培养
把200ml种子培养液接入含5L批次发酵培养基的10L发酵罐(购自B.BRAUN公司)中，通气搅拌培养。主发酵在恒定30℃下进行。搅拌转速的低限与高限分别为200与1000rpm，主发酵溶氧控制在饱和溶氧的50％。当批次发酵培养基中的甘油消耗完，此时溶氧值迅速升至100％，即开始补料，补入补料培养基，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之间，发酵过程中，pH控制在5.5，在发酵过程中泡沫过大时加入泡敌消泡。
利用10L发酵罐进行批式发酵试验，实验重复三次，诱导培养时间为200小时左右，将发酵液在7500rpm，4℃离心10分钟，取发酵液的上清液稀释后进行SDS-PAGE分析，将电泳图谱进行扫描后利用Image Master软件分析计算得到HSA表达水平，结果数据参见表1。
表1不同菌株发酵表达HSA的水平比较
| 实验组 | HSA表达水平(g/l) | HSA占所有分泌蛋白的含量 | 甲醇诱导时间(小时) |
| HSA75-10菌株发酵液一 | 10.1 | 85％ | 200 |
| HSA75-10菌株发酵液二 | 10.0 | 85％ | 200 |
| HSA75-10菌株发酵液三 | 10.3 | 86％ | 216 |
| 对比菌株(GS115Albumin*) | 2.0 | 75％ | 216 |
| US pat ent5707828 | 3.39 | 237 |
*：GS115Albumin为Invitrogen公司EasySelectTM Pichia Expression Kit中所附带的HSA表达菌株。
表2数据表明巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360的HSA表达水平均可达到10g/L培养基上清，HSA的含量占所有分泌蛋白的85％。以上表达水平明显高于已经报道的利用相同Pichia酵母表达系统表达人血清白蛋白(HSA)的表达水平(US patent5707828，5756313)。
实施例2、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360表达的HSA的分子量测定
1、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360表达的HSA的纯化
在纯化过程中所用的各种缓冲液如表2所示。
表2.缓冲液
| 名称 | 缓冲液配方 |
| 溶液A | pH4.5的25mmol/L的醋酸钠 |
| 溶液B | pH7.0的50mmol/L磷酸纳，0.1mol/L氯化钠，10mmol/L的辛酸钠 |
| 溶液C | pH6.0的50mmol/L磷酸纳，0.1mol/L氯化钠 |
| 溶液D | pH6.0的50mmol/L磷酸纳，0.2mol/L氯化钠 |
(1)发酵液的加热处理
将7L按照实施例1步骤7的方法制备的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360的发酵上清液用0.22um膜(MILLIPORE公司生产)过滤，然后加入2％活性碳，加入辛酸钠和EDTA，使辛酸钠的终浓度为5mmol/L、EDTA的终浓度为5mmol/L，调pH值至5.8-7.0，在72℃下加热20分钟，快速冷却，然后用乙酸调pH值4.5。
(2)高盐阳离子层析分离
将上述经过处理的样品经膜过滤后直接以150cm/h流速上样高盐阳离子CST-II FF柱(XK50/60，Vt＝300ml，Amersham Biosciences公司制造，预先用溶液A平衡)上样结束后，用溶液A洗涤2柱体积；然后用pH值4.5，含2mol/L氯化钠的25mmol/L乙酸钠溶液洗涤2柱体积；再用溶液A洗涤2柱体积；最后用溶液B洗脱，得CST-II BD组分。
(3)加热处理
向所得CST-II BD组分中加入辛酸钠和半胱氨酸，至辛酸钠最终浓度为5mmol/L和半胱氨酸最终浓度为10mmol/L，在60℃加热60分钟，迅速冷却。
(4)疏水层析分离和浓缩
加热后样品分别经0.45和0.22um的膜过滤，进入Phenyl SepharoseTMFastFlow(highsub)介质(XK50/60，Vt＝500ml，Amersham Biosciences公司，预先用溶液C平衡)。在此条件下，HSA未被吸附，在流穿部分，收集上样流出液，用分子截留量3万的浓缩膜包(Millipore公司生产)进行浓缩至100mg/ml。
(5)硼酸/硼酸盐脱糖处理
向浓缩组分中加入四硼酸钠和氯化钙，使它们的最终浓度均为50—100mmol/L，调pH值9.0，静置过夜。离心分离，用截留分子量30000的超滤膜浓缩，然后用溶液C换液。
(6)弱阴离子层析分离
将上述浓缩组分直接进入Aminobutyl SepharoseTMFast Flow柱(XK50/60，Vt＝500ml，Amersham Biosciences公司制造，用溶液C平衡)，上样结束后，用溶液C洗涤2倍柱体积，然后用溶液D进行洗脱，得Amino-BD组分。
(7)浓缩换液
由用截留分子量30000的超滤膜浓缩，然后用含辛酸钠的氯化钠溶液换液，得到最终含HSA20％的终产品。
2、测定巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360表达的HSA的分子量
对血源人血清白蛋白产品pHSA(购自Sigma公司)和步骤1纯化的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360表达的HSA用G-25柱(5ml，Pharmacia公司产品)进行脱盐处理，然后用电喷雾质谱方法测定分子量，结果如图3A和图3B所示，表明巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCCNo.1360表达的HSA分子量为66530Da，pHSA的分子量为66606Da，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360表达的HSA分子量与其理论值66472Da更接近。图3A和图3B中，箭头示目的峰。
实施例3、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360表达的HSA的C末端和N末端序列测定
将步骤二中1纯化的HSA分别交中国科学院上海生化与细胞所和北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室进行C末端和N末端测序，C末端测序结果表明巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360表达的HSA的C末端序列为AALGL，N末端测序结果表明巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360表达的HSA的N末端序列为DAHKSEVAHRFKDLG，与人血液中纯化的HSA的C末端和N末端序列一致。
序列表
<160>2
<210>1
<211>1830
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>1854
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>2
Claims (1)
1.一种能高表达人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株HSA75-10，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.1360。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1235981A (zh) * | 1998-05-15 | 1999-11-24 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化 |
-
2005
- 2005-04-29 CN CN 200510068186 patent/CN1854301B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1235981A (zh) * | 1998-05-15 | 1999-11-24 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1854301A (zh) | 2006-11-01 |
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