CN103484478A

CN103484478A - 香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段、编码蛋白及制备方法

Info

Publication number: CN103484478A
Application number: CN201310411810.1A
Authority: CN
Inventors: 黄敏; 张思若; 刘奔; 钟民涛; 伦永志; 张伟; 王晓丽; 李星云; 曹婧; 宁安红
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-09-11
Also published as: CN103484478B

Abstract

本发明公开一种香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段、编码蛋白及制备方法，Latcripin-18基因片段，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。Latcripin-18基因片段的制备方法按如下步骤进行：提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅤ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段。

Description

香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段、编码蛋白及制备方法

技术领域

本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-18基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有PI3K样结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、自噬，调节细胞周期及抗肿瘤等功能。

背景技术

真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J]．Biochem J，2003，374：321-327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等。香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J]．中国微生态学杂志，1996，8(3)：38-180]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。[戴兵,黄敏,宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26（9）；656-658]。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取可诱导肿瘤细胞凋亡和自噬作用的基因片段、编码蛋白及制备方法等相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-18基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有PI3K样结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、自噬，调节细胞周期及抗肿瘤等功能。

本发明的技术解决方案是一种香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段，其特征在于如SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c. PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅤ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

上游引物EcoRⅤ：

5'-GATATCACTTATATGTTTCTGGGGAAGC -3'

下游引物XhoⅠ：

5'-CTCGAGTCTCCTCCCACTCAAC-3'

d.回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化747bpMarker附近的明

显条带，切胶回收DNA片段。

所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C，12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15min，再次4˚C，12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

所述c步骤的PCR反应体系50 µl：cDNA模板1µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg² ^＋plus）10 µl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5µl；反应条件：98˚C变性10s，55˚C复性10s，72˚C延伸1min，30个循环；72˚C延伸5min；4˚C冷却10min。

本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为Latcripin-18基因片段，该基因片段所编码的蛋白具有PI3K样结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、自噬，调节细胞周期及抗肿瘤等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于pET-32a（＋）原核表达体系中进行高效的表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡、自噬中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

附图说明

图1是本发明实施例所提取的香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA1%琼脂糖凝胶电泳图。

图2是本发明实施例PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳图。

图3是本发明实施例所用载体 pET-32a（＋）双酶切后的电泳图。

图4是本发明实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图5是本发明实施例目标蛋白Western-blotting鉴定显色试剂盒显色示意图。

图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。

图7是本发明实施例纯化后的目标蛋白A549细胞的生长抑制率示意图。

图8是本发明实施例纯化后的目标蛋白对A549细胞的透射电镜图。

香菇C91-3菌株保藏日期：2013年3月15日；

分类命名：香菇（Lentinula edodes）；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏号：CGMCC No.7354。

具体实施方式

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA：

取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C，12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液0.5ml并转移至另一干净的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置15min，再次4˚C,12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇1ml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

紫外分光光度计验证纯度，OD260/280比值在1.8~2.0之间。

进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示：M1：λ-EcoT14 I DigestMarker；M2：pHY Marker；TotalRNA：香菇C91-3菌丝体总RNA。表明RNA提取纯度较高。

b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

反应体系：香菇菌丝体总RNA (1 μg/μl) 1 μl、3’ RACE Adaptor (5 μM) 1 μl、dNTP Mixture (10 mM each) 1 μl、RNase Free dH₂O 4.5 μl；

反应条件：70 ˚C，10 min 立即冰上放置2分钟；

然后加入下列组分：5× M-MLV Buffer 2 μl、RNase Inhibitor (40 U/μl) 0.25 μl、Reverse Transcriptase M-MLV (无RNA酶) (200 U/ μl) 0.25 μl，体系总体积达到10 μl。

反应条件：42 ˚C，60 min 70 ˚C，15 min 得到反转录反应液（cDNA）。

c. PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板，以具有EcoRⅤ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

上游引物EcoRⅤ：

5'-GATATCACTTATATGTTTCTGGGGAAGC -3'

下游引物XhoⅠ：

5'-CTCGAGTCTCCTCCCACTCAAC-3'

引物委托宝生物（大连）公司合成。

PCR反应体系50 μl：cDNA模板1µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg² ^＋plus） 10 µl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5µl；反应条件：98˚C变性10s，55˚C复性10s，72˚C延伸1min，30个循环；72˚C延伸5min；4˚C冷却10min。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳如图2所示：M：DL2,000 DNA Marker；1：Latcripin-18目的克隆片段产物。证明成功克隆了该基因片段。

d.回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化747bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。名命为Latcripin-18基因片段。

实验：

1. Latcripin-18基因片段序列测定：

测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3 Latcripin-18基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1。Latcripin-18的基因片段序列长为747bp的cDNA，其含有249个密码子可读框（ORF）。经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因片段序列，证明此基因为一新型基因片段。

2. Latcripin-18基因片段的克隆表达

2.1 载体构建

2.1.1 将质粒pET-32a（＋），使用EcoRⅤ/XhoⅠ进行酶切；

反应体系（37 ˚C过夜）：

pET-32a（＋）（100 ng/μl） 10 μl

10×K Buffer 5 μl

EcoRⅤ（10 U/μl） 1 μl

XhoⅠ（10 U/μl） 1 μl

dH₂O Up to 50 μl

取5 µl 进行1% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示：M ：DS 5000 DNA Marker; 1：pET-32a（＋）- EcoRⅤ/ XhoⅠ。表明质粒切割完全，可进行后续实验。

2.1.2 载体回收

使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切胶回收约5.9kbp 的DNA 片段。

2.1.3 将pET-32a（＋）载体与本发明实施例的Latcripin-18基因片段进行重组

使用In-Fusion® HD Cloning Kit，分别将本发明实施例的Latcripin-18基因片段与酶切后回收载体连接，反应体系及条件如下：

Latcripin-18基因片段（100 ng/μl） 2 μl

酶切后回收载体（50 ng/μl） 1 μl

5xIn-Fusion HD Enzyme Premix 2 μl

dH₂O Up to 10 μl

50 ˚C 15 min

取上述In-Fusion产物2.5 µl热转化至E.coli Rosetta-gami(DE3)中，涂布于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB平板上，37 ˚C 过夜培养，阳性转化菌株正常生长。同时，选取平板上生长的单克隆阳性菌落接种于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基于37 ˚C 培养14小时，采用宝生物公司Plasmid Miniprep Kit V3.l 抽提质粒进行测序鉴定，结果如SEQ ID NO.1。

2.2Latcripin-18蛋白的诱导表达及鉴定

2.2.1 Latcripin-18蛋白的自诱导表达

挑取2.1.3的单克隆阳性菌落，接种于10 ml 含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基中，于37 ˚C下，190 r/min振荡培养5小时，再接种于10ml含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的自诱导培养基中，于37 ˚C下，190r/min振荡培养3小时。取菌液进行反复冻融破碎（4次），低温（4 ˚C）离心6000r/min，10min，取沉淀，并用8M尿素按体积比1:5~6加入湿菌中，做12%SDS-PAGE电泳，如图4所示。图4中M：Premixed Protein Marker(low)；1：空白对照；2：Latcripin-18目的蛋白在E.coli Rosetta-gami中的诱导表达。

表明：重组蛋白已成功表达。

2.2.2目标蛋白Western-blotting 鉴定分析

将SDS-PAGE电泳分离样品后，将PAGE胶用湿转膜的方式转印到NC膜上，经5%脱脂牛奶室温封闭液封闭100分钟后，第一抗Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody，4 ˚C孵育过夜。再加入第二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)室温孵育60分钟，显色试剂盒显色，如图5所示。表明重组蛋白为Latcripin-18目的蛋白。

2.3 Latcripin-18蛋白的纯化及活性鉴定

2.3.1 Latcripin-18蛋白的纯化

将上述条件诱导的菌体低温6000r/min，10min~20min离心，每50~100mg菌体（湿重）加入1~2ml细菌裂解液。10000×g，4˚C离心15~20分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀（包涵体）。将沉淀重悬于Binding Buffer中。10,000×g离心20分钟，收集上清。将上清负载上柱，利用HIS标签的亲和层析进行蛋白的纯化，使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。得到单一的目的蛋白，12%SDS-PAGE电泳验证如图6所示。图6中，M: PageRuler Prestained Protein Ladder ;1:全菌液蛋白；2：洗脱液1； 3：洗脱液2；4：洗脱液3。

表明：已成功纯化Latcripin-18蛋白。

采用现有方法纯化浓缩的目标蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。此新型特异蛋白序列（Latcripin-18蛋白，简称Lp-18），经NCBI数据库氨基酸相似性检索和Pfam数据库检索分析，结果表明Latcripin-18蛋白具有PI3K样结构域，该结构域具有诱导肿瘤细胞凋亡、自噬，调节细胞周期及抗肿瘤等多种生物学功能。

2.3.2 Latcripin-18蛋白的除盐和复性

将纯化后的Lp-18蛋白进行梯度透析，将Lp-18蛋白装入MW16000的透析袋中，两端用透析袋夹夹紧。将透析袋放入0.5L~2L的透析复性液中，冰浴，搅拌透析，24~72h，每6~8h换液一次复性，逐步降低尿素浓度直至0。将透析袋中的溶液离心10000 r/min，4 ˚C离心，20~30min上清即为复性的重组蛋白。

2.3.3 Latcripin-18蛋白的活性分析

2.3.3.1 MTT法

将纯化浓缩的目的蛋白进行微量BCA蛋白定量后，用MTT法检测细胞存活和生长情况。将目的蛋白作用的终浓度分别调整为30μg/ml、60μg/ml，以RPMI-1640作为空白对照。评价其对肿瘤细胞的细胞毒作用。选用人肺癌A549细胞进行MTT实验。用0.25%胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5~10×10⁴/ml。每孔加入100μl，边缘孔用无菌PBS填充，5%CO₂，37˚C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）加入上述30μg/mL、60μg/mL，浓度梯度的药物每孔100μl，每个浓度设6个复孔，5%CO₂，37˚C孵育24小时，48小时。然后每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min。在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光值，参考波长630nm，按照下面公式计算抑瘤率（细胞生长抑制率）：IR（inhibited rate）=（对照组平均OD值－实验组平均OD值）/ 对照组平均OD值。在目标蛋白浓度为30μg/ml、60μg/ml时，及24h，48h的抑瘤率如图7所示，目标蛋白的MTT实验结果说明本发明基因表达的Latcripin-18蛋白对人肺癌A549细胞有显著地抑制作用。

2.3.3.2透射电镜观察细胞亚显微结构

调整蛋白浓度加入培养瓶中，处理48小时后，用0.25%胰酶消化法收集细胞，室温离心。弃去上清后，3%戊二醛固定，梯度脱水，包埋，固化，切片，染色，拍片，电镜下观察细胞超微结构的特征如图8（25000X）所示。通过透射电镜观察，对照组A549细胞形态规整，细胞核较大，线粒体丰富，膜相结构完整；Latcripin-18蛋白作用组细胞呈现凋亡和自噬状态，并且在较大范围细胞中出现了大量的自噬小体聚集。

序列表

<110> 大连医科大学

<120>香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段、编码蛋白及制备方法

<160> 4

<210> 1

<211> 747

<212> DNA

<24>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）

<400> 1

1 ACTTATATGT TTCTGGGGAA GCCGAAAGAT GACCTGCGGA AGGATGCGCG GCTTATGGAC

61 TTTAACGCGA TAATAAACAA GCTGCTGAAA GCGAACTCTG AGTCGCGGCG GCGGCAGCTG

121 CACATACAAA CGTACGGGGT GGTGACTCTG AACGAAGAGT GCGGGTTTAT ACAATGGGTG

181 CCGCATACGA GACCGGTGCG GCCRATAATA GTAAATCTGT ACAATAATAG GCAMATACCG

241 GGGTGGGGGG CGGAAATGGC TGATGTGTTC ACGAGAATAA AAGGGACGAA CGACGGGAAT

301 AAGGCGGCTG ATCTGTTTAC GAAGAAAATT CACTCGCTGT TTCCTCCGGT GTTTCACGAG

361 TGGTTTATAG AAACGTTTCC TGAGCCGACG GCGTGGTTGG CGAGTAGACT CACGTACGCG

421 CGGACAACGG CGGTTATGTC GATGGTGGGG TTGATATTGG GGCTGGGGGA TCGYCATTGC

481 GAGAACATAC TTCTTGCGGA GAATACGGGT GATTTAATTC ATGTGGACTT TAACTGCCTT

541 TTCGAAAAGG GGAAGACGTT CGAAACGCCG GAGCGGGTTC CTTTCAGACT GACGCAAAAT

601 TTAGTGGACG CGTTAGGGGT TACGGGGGTT GAGGGGGTTT TTCGGACTGC GTGTGAGGTT

661 ACTATGCAGC TGCTGCGGGA CAATAAGGAT TCTCTGATGA GTGTGCTGGA TGCGTTTGTG

721 CATGACCCGT TGGTTGAGTG GGAGGAG 747

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<24>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）表达产物

<400> 2

1 TYMFLGKPKD DLRKDARLMD FNAIINKLLK ANSESRRRQL HIQTYGVVTL NEECGFIQWV

61 PHTRPVRPII VNLYNNRXIP GWGAEMADVF TRIKGTNDGN KAADLFTKKI HSLFPPVFHE

121 WFIETFPEPT AWLASRLTYA RTTAVMSMVG LILGLGDRHC ENILLAENTG DLIHVDFNCL

181 FEKGKTFETP ERVPFRLTQN LVDALGVTGV EGVFRTACEV TMQLLRDNKD SLMSVLDAFV

241 HDPLVEWEE 249

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<24>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

GATATCACTTATATGTTTCTGGGGAAGC 28

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<24>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

CTCGAGTCTCCTCCCACTCAAC 22

Claims

1.一种香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段，其特征在于如SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c. PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板, 以具有EcoRⅤ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

上游引物EcoRⅤ：

5'-GATATCACTTATATGTTTCTGGGGAAGC -3'

下游引物XhoⅠ：

5'-CTCGAGTCTCCTCCCACTCAAC-3'

d.回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化747bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。

4.根据权利要求3所述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段的制备方法，其特征在于所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C, 12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15min，再次4˚C，12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

5.根据权利要求4所述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段的制备方法，其特征在于所述c步骤的PCR反应体系50µl：cDNA模板1µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，dNTP Mixture 4 µl、5×PrimeSTAR Buffer 10 µl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5µl；反应条件：98˚C变性10s，55 ˚C复性10s，72 ˚C延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；4˚C冷却10min。