CN104789498A - 一株鸡源屎肠球菌菌株及其应用 - Google Patents

一株鸡源屎肠球菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株鸡源屎肠球菌（Enterococcus facium）C8GF20-06菌株，其保藏编号为：CGMCC No.8476。本发明从C8GF20菌株出发，选育出1株鸡源屎肠球菌CGMCC No.8476，该菌株是一种革兰氏阳性菌，属于肠球菌属，具有转化多糖能力高的特点，可用于中药如党参、黄芪等的发酵，具有提高药物中有效成分和活性物质的提取率，增强功效，减少中药资源的浪费等优点。

Description

一株鸡源屎肠球菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物菌种选育技术领域，具体涉及一株鸡源屎肠球菌菌株及其应用。
背景技术
中药发酵技术是指利用自然界所存在的微生物强大的生物转化能力，对药材进行活性成分转化、毒性成分降低以及有效成分的提取与分离。微生物发酵中药主要具有以下特点和优势：反应温和，保护活性；提高药效，减少毒副；修饰结构，发现新药；稳定质量，利于现代；菌种丰富，方向可控；节约药源，增加效益。优良的微生物菌种是中药发酵技术的基础和关键，要使发酵中药及中药有效成份产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。
屎肠球菌（Enterococcusfacium）属肠球菌属，是人及动物肠道中正常菌群的重要组成部分，在促进肠道健康（调节肠道微生态平衡和防治腹泻）和提高生长性能方面有显著功能，是我国农业部2003年公布的《饲料添加剂品种目录》中允许使用的益生菌种。该菌相对于严格厌氧、培养和保存条件都苛刻的双歧杆菌、乳杆菌来说，更有利于生产和使用。经研究证明，屎肠球菌及其代谢产物可用于兽药和饲料，具有提高促生长、抑制病原菌和腐败菌、提高免疫力、降低幼畜腹泻率等生理功效。有关利用屎肠球菌进行中药，特别是党参、黄芪的发酵，目前尚未见国内外文献报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本申请人从鸡肠道混合菌( C8GF20)中分离出了一株厚壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，肠球菌科，肠球菌属的屎肠球菌，并利用物理、化学诱变的方法，选育出可用于发酵中药，特别是发酵黄芪和党参转化多糖性能好的菌株，将其命名为屎肠球菌（Enterococcusfacium）C8GF20-06，并送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏时间2013年11月15日，保藏号CGMCC No.8476。
本发明的第二个目的是提供上述菌株在发酵黄芪和党参中的应用。
优选地，所述在发酵党参中的应用为：在党参发酵培养基中加入3%～5% 屎肠球菌CGMCC No.8476细菌悬液，置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵党参；其中，所述党参发酵培养基的配方为：玉米粉 25.79 g；氮源 0.6g；胡萝卜粉 2.28 g；牛肉浸膏 1.56 g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 2.18g；党参120-150g；1000mL蒸馏水。
优选地，所述在发酵黄芪中的应用为：在黄芪发酵培养基中加入3%屎肠球菌CGMCC No.8476细菌悬液，置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵黄芪；其中，所述黄芪发酵培养基的配方为：乳清粉5.158g；蛋白胨0.456g；葡萄糖0.12g；酵母粉0.312g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 0.194g；黄芪16g；200mL蒸馏水。
本发明的第三个目的是提供发酵黄芪的制备方法，在黄芪发酵培养基中加入3%屎肠球菌CGMCC No.8476细菌悬液，置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵黄芪；其中，所述黄芪发酵培养基的配方为：乳清粉5.158g；蛋白胨0.456g；葡萄糖0.12g；酵母粉0.312g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 0.194g；黄芪16g；200mL蒸馏水。
本发明的第四个目的是提供发酵党参的制备方法，在党参发酵培养基中加入3%～5% 屎肠球菌CGMCC No.8476细菌悬液，置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵党参；其中，所述党参发酵培养基的配方为：玉米粉 25.79 g；氮源 0.6g；胡萝卜粉 2.28 g；牛肉浸膏 1.56 g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 2.18g；党参120-150g；1000mL蒸馏水。
本发明将C8GF20的菌悬液各以1%的接种量接种于含12.5%党参的乳杆菌选择性培养基MRS中厌氧培养并传代纯化，获得了1株长势好的菌株C8GF20-01,并对其进行紫外-亚硝基胍复合诱变后选育出的1株可发酵黄芪和党参转化多糖性能好的菌株屎肠球菌C8GF20-06（菌种保藏号为CGMCC No.8476）。利用分子生物学鉴定法、细菌形态学观察及生化反应鉴定法，确定C8GF20-06为厚壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，肠球菌科，肠球菌属。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为屎肠球菌C8GF20-06菌株的革兰氏染色显微镜图（×1000）；
图2为屎肠球菌C8GF20-06菌株的16S rDNA扩增电泳图；泳道1、2分别为C8GF20-01、C8GF20-06菌株基因组。左图为DNA Marker。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
屎肠球菌（Enterococcusfacium）C8GF20-06菌株CGMCC No.8476的获得：
1、屎肠球菌C8GF20混合菌种的分离和纯化
在前期研究中，发明人所在课题组从健康、未使用过抗生素的健康土鸡盲肠中分离出混合菌C8GF20，并已于以下方式公开：1、张凯，杨志强等，鸡肠内菌发酵党参转化多糖实验研究，中兽医医药杂志，2008年；2、李建喜，中兽药生物转化技术研究——益生菌发酵对黄芪党参多糖提取影响，中国农业科学院，博士论文，2012。上述人员保证自申请日起二十年内向公众提供分离得到的混合菌C8GF20。
取C8GF20的菌悬液以1%的接种量接种于含12.5%党参药液的选择性培养基MRS，37℃厌氧培养24h为第一代。勾出生长良好的单一菌落，同一培养条件连续划线厌氧传代6次后，获得了1株长势好的单个菌落C8GF20-01。
2、C8GF20-01的诱变与筛选
采用亚硝基胍诱变法对上述筛选的菌株C8GF20-01进行诱变,通过测定发酵型党参多糖的转化率筛选得到优良的高产菌株C8GF20-06，可用于厌氧发酵产党参多糖的生产。具体操作方法如下：
（1）选用1.0mg/ mL的NTG加至C8GF20-01的菌悬液中，分别在37℃水浴中处理 0、10、15、20、25、30、35min，用PBS洗涤3次除去NTG残留，振荡悬浮菌体沉淀，用无菌生理盐水梯度稀释后涂布MRS平板培养基，37℃厌氧培养72 h。
（2）选择在MRS平板培养基上生长速率快、形态饱满的单菌落，接入MRS肉汤，120r/min、37℃厌氧摇床培养；传3代后，按体积分数3 %的接菌量接入100mL党参发酵培养基（党参发酵培养基配方为：玉米粉 25.79 g；氮源 0.6g；胡萝卜粉 2.28 g；牛肉浸膏 1.56 g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 2.18g；党参120-150g；1000mL蒸馏水），置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h。
发酵结束后，4000r/min 离心10min进行固液分离，上清转入另一洁净器皿保存；沉淀加入100mL的蒸馏水煮沸1.5h，冷却到室温后，离心取上清。混合两次的上清，沸水浴中浓缩至35mL，加入3倍体积的95%乙醇，边加边搅拌，4℃静置24h，收集沉淀；将醇沉过夜后的上清，再4000r/min 离心10min，将两次沉淀混合，回收乙醇。沉淀干燥后用100mL蒸馏水溶解，再稀释400倍，取2.0mL稀释好的粗多糖溶液置于具塞试管中，采用苯酚硫酸法测定发酵产物中多糖含量。由表1可知，正突变株为用1.0mg/ml NTG作用30min得到的，将其命名为菌株C8GF20-06，该菌株较原菌发酵党参时多糖含量增加了21.37%。
表1  NTG诱变C8GF20-01正突变株筛选
3、屎肠球菌C8GF20-06菌株的生物学特性研究
分别采用显微观察、生化鉴定管和分子生物学鉴定等方法，对C8GF20-06菌株的生物学特性进行了研究。
（一）C8GF20-06的显微观察、生化鉴定
（1）取洁净载玻片，滴加一滴蒸馏水，接种环挑取C8GF20-06菌落于水滴中并涂布均匀，待自然干燥后，酒精灯火焰上固定。革兰氏染色后，进行显微观察。结果见图1，C8GF20-06为革兰氏阳性,单个菌体呈圆形或卵圆形、无芽孢、无鞭毛，多为成对或聚拢状。
（2）吸取C8GF20-06菌悬液200μL分别接种于苦杏仁苷、纤维二糖、乳糖、氧化酶、6.5%NaCl等生化鉴定管，厌氧，37℃培养24h，观察结果。根据其颜色的变化判定结果为阴性还是阳性。结果见表2。
表2 C8GF20-06菌株生化鉴定结果
将细菌显微观察结果和生化鉴定结果与细菌鉴定手册中关于肠球菌属的特征描述进行比较, 二者的比较结果相似。
（二）C8GF20-06的分子生物学鉴定（16S rDNA序列分析）
（1）细菌基因组DNA提取
取对数生长期菌液2 mL,按细菌基因组提取试剂盒（（购自宝生物工程(大连) 有限公司））说明提取菌株的基因组，将提取液经1%的琼脂糖凝胶电泳验证。
（2）16S rDNA片段的PCR扩增
按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit说明书进行目的片段的扩增，扩增引物是试剂盒中的通用引物，上游引物 5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′、下游引物 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′，PCR反应条件如下：
94℃ 5 min；
94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30 Cycles；
72℃ 5 min。
PCR扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳验证。
按照胶回收纯化试剂盒步骤操作，切取含有16s rDNA片段的凝胶，经融化、上柱、冲洗、洗脱等步骤，最终得到纯化的16s rDNA；依次加入纯化的基因片段、pGEM-T Easy Vector、ddH2O、连接酶混匀, 低速离心数秒，4℃连接12h。将连接产物10ul转化到100ul大肠杆菌感受态细胞JM109中,复苏后，涂于筛选平板上，挑选白 斑，接种于含有氨苄青霉素(100 μg/mL)的L B液体培养基，37℃，200r/min，12h，提取质粒并用EcoRⅠ进行酶切鉴定，筛选出阳性重组质粒。将其送至北京华大基因进行测序。测序结果参见序列表SEQ ID No.1。
（3）16S rDNA序列分析
将测序结果提交至NCBI数据库，运行BLAST程序进行序列相似性搜索和分析。利用MEGA5软件构建系统发育树。经BLAST序列分析显示，C8GF20菌株与屎肠球菌同源性最高，为屎肠链菌，故命名为屎肠球菌（Enterococcusfacium）C8GF20-06菌株。将其送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.8476。
实施例2
应用本发明的屎肠球菌CGMCC No.8476发酵黄芪、党参的试验：
（1）发酵党参
取屎肠球菌CGMCC No.8476接入MRS肉汤，120r/min、37℃厌氧摇床培养；传3代后，按体积分数3%的接菌量接入100mL党参发酵培养基（党参发酵培养基配方为：玉米粉 25.79 g；氮源 0.6g；胡萝卜粉 2.28 g；牛肉浸膏 1.56 g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 2.18g；党参120-150g；1000mL蒸馏水），置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵党参。经检测，发酵党参中多糖含量为196.76±14.16mg/g。
本申请人对发酵培养基的配方及发酵条件进行了试验选择，经试验，选择上述发酵培养基和发酵条件时，发酵党参中多糖含量最高。
（2）发酵黄芪
取屎肠球菌CGMCC No.8476接入MRS肉汤，120r/min、37℃厌氧摇床培养；传3代后，按体积分数3%的接菌量接入含有8%黄芪药液的100mL黄芪发酵培养基（黄芪发酵培养基配方为：乳清粉5.158g；蛋白胨0.456g；葡萄糖0.12g；酵母粉0.312g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 0.194g；黄芪16g；200mL蒸馏水。），置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵黄芪。
本申请人对发酵培养基的配方及发酵条件进行了试验选择，经试验，选择上述发酵培养基和发酵条件时，发酵黄芪中多糖含量最高。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
 
<110>  中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
 
<120>  一株鸡源屎肠球菌菌株及其应用
    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  1418
<212>  DNA
<213>  屎肠球菌CGMCC No.8476的16S rDNA序列
 
<400>  1
gctaatacat gcaagtcgta cgcttctttt tccaccggag cttgctccac cggaaaaaga       60
 
ggagtggcga acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc atcagaaggg gataacactt      120
 
ggaaacaggt gctaataccg tataacaatc gaaaccgcat ggttttgatt tgaaaggcgc      180
 
tttcgggtgt cgctgatgga tggacccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct      240
 
caccaaggcc acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacattg ggactgagac      300
 
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acgtgctaca atgggaagta caacgagttg cgaagtcgcg aggctaagct aatctcttaa     1260

Claims (6)

1.一株鸡源屎肠球菌（Enterococcusfacium）C8GF20-06菌株，其特征在于：所述菌株的保藏编号为：CGMCC No.8476。
2.权利要求1所述的菌株在发酵黄芪和党参中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述在发酵党参中的应用为：在党参发酵培养基中加入3%～5% 屎肠球菌CGMCC No.8476细菌悬液，置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵党参；其中，所述党参发酵培养基的配方为：玉米粉 25.79 g；氮源 0.6g；胡萝卜粉 2.28 g；牛肉浸膏 1.56 g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 2.18g；党参120-150g；1000mL蒸馏水。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述在发酵黄芪中的应用为：在黄芪发酵培养基中加入3%屎肠球菌CGMCC No.8476细菌悬液，置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵黄芪；其中，所述黄芪发酵培养基的配方为：乳清粉5.158g；蛋白胨0.456g；葡萄糖0.12g；酵母粉0.312g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 0.194g；黄芪16g；200mL蒸馏水。
5.发酵黄芪的制备方法，其特征在于：在黄芪发酵培养基中加入3%屎肠球菌CGMCC No.8476细菌悬液，置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵黄芪；其中，所述黄芪发酵培养基的配方为：乳清粉5.158g；蛋白胨0.456g；葡萄糖0.12g；酵母粉0.312g；无机盐K2HPO4-KH2PO4  0.194g；黄芪16g；200mL蒸馏水。
6.发酵党参的制备方法，其特征在于：在党参发酵培养基中加入3%～5% 屎肠球菌CGMCC No.8476细菌悬液，置于37℃，初始pH为6.4～7.4的厌氧环境下，120r/min发酵48h；取发酵液真空冷冻干燥，即得发酵党参；其中所述党参发酵培养基的配方为：玉米粉 25.79 g；氮源 0.6g；胡萝卜粉 2.28 g；牛肉浸膏 1.56 g；无机盐K2HPO4-KH2PO4 2.18g；党参120-150g；1000mL蒸馏水。
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