CN112322569B - 干旱诱导香菇体内风味物质香菇精合成的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干旱诱导香菇体内风味物质香菇精合成的方法，通过向液体发酵培养基中添加化学渗透调节剂人工模拟干旱环境进行液体发酵促进香菇体内标志性风味物质香菇精的合成。通过PEG(分子量2000‑8000)的高效的吸湿性与香菇菌丝在培养基中竞争水，从而达到人工模拟干旱胁迫的目的来促使香菇精代谢途径的关键酶γ‑谷氨酰转肽酶(GTT)和半胱氨酸亚砜裂解酶(LECSL)的酶活水平上升，进而提高香菇胞内香菇精的含量。本发明所述的干旱诱导香菇风味物质香菇精合成的方法，简单易行，变量单一可控，效果显著等优点，提供了香菇风味物质代谢研究以及香菇生产品质把控的新思路。

Description

干旱诱导香菇体内风味物质香菇精合成的方法

技术领域

本发明涉及一种在液体培养基中添加高效渗透调节剂人工模拟干旱进行液体发酵促进香菇标志性风味物质香菇精合成的方法，具体为接种前在香菇液体培养基中添加聚乙二醇(PEG)，通过PEG的渗透调节作用促进香菇体内风味物质香菇精合成。

相关背景

香菇(Lentinula edodes(Berk.)sing)公认的抗肿瘤和抗人类免疫缺陷病毒医学益处，加上诱人的味道，使其成为全球市场广受欢迎的食用菌。它尤其是在中国特别受欢迎。2017年全年的香菇子实体产量为986万吨，比前年增长9.82％，占全球70％。香菇作为世界上第二大栽培食用蘑菇，其产量增长速度快于其他任何蘑菇品种。

香菇是一类富含硫的蘑菇，硫在多肽、蛋白质以及一些低分子化合物中起到关键的功能作用。香菇精(1,2,3,5,6-五硫环庚烷)是香菇中独一无二的气味物质，是一种环状的多硫化合物。除此之外，香菇精被报导对细菌和真菌是具有生物抗性,以及展现出具有凝集血小板的药理活性。香菇精来自于γ-L-谷氨酰半胱氨酸亚砜前体(香菇酸)由γ-谷氨酰转肽酶(GTT)和半胱氨酸亚砜裂解酶(LECSL)两步反应后的前体物质非酶促反应合成。

香菇的生长过程中，对水分的控制极其重要。培养过程、转色过程栽培棒会失水2％～3％，出菇过程更是会带走大量水分。由于补水时机不佳或补水不足均会影响出菇数量和品质，因此香菇不管是在菌丝生长阶段还是子实体阶段均会面临缺水胁迫的影响。开展香菇的干旱胁迫研究具有重要的科学价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进香菇体内香菇精合成的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种促进香菇体内香菇精合成的方法，通过向液体发酵培养基中添加化学渗透调节剂人工模拟干旱环境进行液体发酵促进香菇体内标志性风味物质香菇精的合成。所述的化学渗透调节剂例如PEG在培养基中发挥水的聚合作用，通过结合竞争水分又不渗透进细胞内，使香菇在液体发酵培养基中处于干旱环境来发挥功能。

作为一种优选技术方案，所述的化学渗透调节剂为PEG(分子量2000-8000)；优选为PEG2000。

作为一种优选技术方案，按重量百分含量计，所述化学渗透调节剂在液体发酵培养基中的添加量为1％-50％。进一步优选的，所述化学渗透调节剂在液体发酵培养基中的添加量为5％-30％。更进一步优选的，所述化学渗透调节剂在液体发酵培养基中的添加量为5％-20％。更进一步优选的，所述化学渗透调节剂在液体发酵培养基中的添加量为10％～20％。最优选，所述化学渗透调节剂在液体发酵培养基中的添加量为10％。

作为一种优选技术方案，所述液体发酵的发酵时间为10-30天；最优选为15天。

作为一种优选技术方案，所述的化学渗透调节剂在无菌环境中趁热添加到液体发酵培养基中。

上述方法的具体操作为：由于PEG在高温高压的环境中会分解失去聚合水分的功能，故不能高压灭菌。本发明的方法是将刚灭菌好的香菇液体培养基置于无菌环境中，趁热加入聚乙二醇搅拌溶解。待冷却后将香菇菌丝接种，于25℃，100rpm的黑暗条件下液体发酵15天。

进一步优选的：所述的香菇液体发酵培养基可以为常规的适用于香菇培养的培养基，按重量百分含量计，本发明所采用的香菇液体发酵培养基的营养成分为：2％葡萄糖，1％麦芽糖，0.5％磷酸二氢钾，0.2％酵母提取物，0.2％蛋白胨和0.1％七水合硫酸镁，余量加水，或按比例加水和化学渗透调节剂。但是香菇液体发酵培养基的配方不限于此，常规的适用于香菇培养的培养基均可以实现本发明的目的。本发明的主要发明点为通过向液体发酵培养基中添加化学渗透调节剂人工模拟干旱环境进行液体发酵促进香菇体内标志性风味物质香菇精的合成。

本发明的提升香菇菌丝香菇精含量的方法，将香菇接种于含有化学渗透调节剂例如PEG2000的培养基中，PEG 2000发挥胁迫作用促进香菇体内香菇精的合成。所使用的EPG2000不会渗透到细胞内，对香菇本身不会有毒害作用。

本发明所述的室温为25±5℃。

本发明的有益效果

本发明通过添加PEG的方式，人工模拟干旱环境促进香菇体内香菇精的含量。在最优选的10％PEG 2000模拟干旱环境下调控香菇精合成代谢通路的关键酶GTT和LECSL的酶活显著上升，分别升高1.173倍和1.538。GTT和LECSL基因的转录水平分别显著上调均在2倍以上。最优选方案的PEG 2000添加量使干旱胁迫下的香菇胞内香菇精提高2.891倍。

附图说明

图1为不同浓度PEG 2000处理条件下的香菇精水平。

图2为10％PEG 2000处理下半胱氨酸亚砜裂解酶(LECSL)相关基因转录水平。

图3为10％PEG 2000处理下γ-谷氨酰转肽酶(GTT)相关基因转录水平。

图4为10％PEG 2000处理下半胱氨酸亚砜裂解酶(LECSL)酶活水平。

图5为10％PEG 2000处理下γ-谷氨酰转肽酶(GTT)酶活水平。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步详细说明：

实施例1：香菇在PEG 2000诱导的干旱环境中体内香菇精含量检测

1.PEG 2000干旱胁迫液体培养基配置和香菇发酵

(1)基础香菇液体发酵培养基配置：含有2g葡萄糖，1g麦芽糖，0.5g磷酸二氢钾，0.2g酵母提取物，0.2g蛋白胨和0.1g七水合硫酸镁培养基，分别加水96g，91g，86g，76g和66g，最终各体系培养基质量为100g，95g，90g，80g，70g。

(2)干旱胁迫液体培养基配置：将刚灭菌好的95g，90g，80g和70g的基础香菇液体发酵培养基置于超净工作台，趁热分别加入5g，10g，20g和30g PEG 2000后迅速搅拌至溶解。趁热加入的PEG 2000不能顺利溶解，可以100℃水浴助其完全溶解。无菌条件下将各体系的培养基各自配置成100g，用于后续液体发酵。

(3)待培养基冷却后，将香菇菌丝块等量接种于培养基中，静置48小时。静置结束后黑暗条件下以100rpm的转速在25℃的摇床培养15天。

2.气相微萃取和气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检查香菇精含量

(1)气相微萃取的条件和方法：香菇菌丝体于40℃低温烘干，研磨粉碎，称重置于20ml顶空瓶中，加入5ml的蒸馏水并摇匀，加入1μL 2,4-二氯苯作为内标(终浓度为3.3μg/mL)。设置含有1μL 2,4-二氯苯和0.1μL香菇精的对照组作为校准空白。顶空瓶置于50℃水浴锅水浴10min使瓶内气相平衡，插入100μm PDMS-SPME萃取纤维头(纤维头高于液面2cm)后进行萃取气相中的有机相。萃取期间每隔10min轻轻摇晃一次，保持30min。

(2)GC-MS检测香菇精的条件和方法：将萃取结束的SPME纤维头插入进样口。气相色谱条件为：HP-5MS弹性毛细管柱(30m x 0.25mm x 0.25μm)，升温程序为柱初温50℃，保持5min，以4℃/min上升到210℃，再以10℃/min上升到250℃，保持5min，载气流量(He)2mL/min，进口压力80kPa，进样口温度250℃，进样量1μL，不分流模式。质谱条件为传输线温度250℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，降口温度250℃，扫描范围45-400amu，电离方式EI，电离电压70ev。最终结果以香菇精的峰信号强度与内标的峰信号强度之间的比值，经过校准空白校正后最终以相对含量的方式呈现。

实施例2：香菇体内γ-谷氨酰转肽酶(GTT)和半胱氨酸亚砜裂解酶(LECSL)转录水平和酶活测定

1.LECSL和GTT的转录水平鉴定

将培养好的香菇菌丝体收集，用于提取香菇RNA。

(1)研钵煮沸20min后液氮预冷备用，将样品置于研钵中，加入液氮研磨成粉。取适量样品移入含800μL RNAiso Plus的离心管中，剧烈颠倒混匀，冰上静置5min；

(2)12000rpm，4℃，离心5min后取650μL上清液至1.5mL离心管，加入130μL氯仿，剧烈震荡，冰上静置10min；

(3)12000rpm，4℃，离心15min，分三层后取300μL上清液，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；

(4)12000rpm，4℃，离心5min，出现沉淀，弃上清，沿管壁加入400μL 75％乙醇，轻微颠倒洗涤沉淀；

(5)12000rpm，4℃，5min，弃乙醇，瞬离，用枪吸出剩余液体；加入30μL RNase-freeddH₂O溶解，RNA保存于-70℃。

(6)将提取RNA用RNA反转录试剂盒反转录成cDNA用于Real-time-PCR检测GTT和LECSL的转录水平。GTT和LECSL基因的上下游引物序列信息参考表1。

2.LECL和GTT酶活检测方法

(1)取新鲜香菇菌丝样品，置于液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末状。加入5mL Tris-HCl(0.05mol/L，pH 7.0)缓冲液，混匀后冰上放置5分钟，4℃8000rpm离心10min，将上清液转移到新的离心管，上清液即粗酶液。

(2)GTT酶活测定:1mL粗酶液中加入0.5mL 5mmol/l L-谷氨酰基-4-硝基苯胺和0.1mL 100mmol/l蛋氨酸，在37℃环境中反应40min，加0.4ml冰乙酸终止反应，于410nm处测定吸光值。样品平行测定3次。最终GTT酶活以粗酶液的蛋白浓度进行标定，粗酶液蛋白浓度用考马斯亮蓝染色法进行测定。

(3)LECSL酶活测定:0.2mL粗酶液中加入0.2mL10 mM S-甲基-L-半胱氨酰亚砜，在37℃环境中反应10min，加10％TCA0.4mL终止反应，然后加0.2mL 5mM 2.4-二硝基苯肼，室温5min，再加1mL 2.5mol/L NaOH于室温下显色10min，在520nm处测定吸光值。样品平行测定3次。最终LECSL酶活以粗酶液的蛋白浓度进行标定，粗酶液蛋白浓度用考马斯亮蓝染色法进行测定。

结果：

1.按照实施例1的干旱胁迫培养基配方，接种后培养15天进行设定的参数进行GC-MS检测香菇精含量。香菇精结果如附图1所示，5％PEG 2000的干旱胁迫条件下培养的香菇体内香菇精含量较对照高了1.572倍。10％PEG 2000处理的香菇体内香菇精含量升高最为显著，为2.891倍。20％PEG 2000组的香菇精水平较对照升高2.549倍。PEG 2000浓度升高到30％会降低香菇体内香菇精的含量，香菇精含量为对照组的0.763倍。

2.按照实施例2的Real-time PCR方案检测了6个GTT同源基因(GTT-1、GTT-2、GTT-3、GTT-4、GTT-5、GTT-6)和5个LECSL同源基因(LECSL-1、LECSL-2、LECSL-3、LECSL-4、LCESL-5)。结果如图2和图3所示，其中GTT-1在10％PEG 2000处理条件下转录水平上调了3.126倍，GTT-2表达水平上调了2.054倍，GTT-3表达水平上调了2.225倍，GTT-4表达水平上调了3.150倍，GTT-5表达水平上调了1.835倍，GTT-6表达水平为3.995倍。LECSL-1、LECSL-2、LECSL-3、LECSL-4和LCESL-5五个基因在10％PEG2000处理的条件下表达水平分别上调8.162倍、5.284倍、3.226倍、4.365倍以及2.107倍。

3.按照实施例2的酶活检测方案检测了香菇在10％浓度的PEG 2000的模拟干旱培养基中的胞内GTT和LECSL的酶活水平。结果如附图4和图5所示，我们通过对10％PEG2000处理的液体发酵香菇菌丝胞内GTT和LECSL酶活测定，结果10％PEG 2000条件处理下的香菇体内GTT酶活水平上升2.112倍，LECSL酶活水平在干旱胁迫处理下则上升至3.213倍。

试验证明，在液体发酵培养基中添加10％的PEG 2000可以人工模拟干旱并促进香菇体内重要风味物质香菇精的大量合成；此干旱模型中，香菇精代谢途径关键基因γ-谷氨酰转肽酶(GTT)和半胱氨酸亚砜裂解酶(LECSL)的相关同源基因(GTT-1、GTT-2、GTT-3、GTT-4、GTT-5和6；LECSL-1、LECSL-2、LECSL-3、LECSL-4和LECSL-5)转录活性均显著提高；同时GTT和LECSL的酶活水平在10％PEG 2000的处理下显著升高。

表1调控γ-谷氨酰转肽酶(GTT)和半胱氨酸亚砜裂解酶(LECSL)相关基因引物信息

Claims (5)

1.一种促进香菇体内香菇精合成的方法，其特征在于，通过向液体发酵培养基中添加化学渗透调节剂人工模拟干旱环境进行液体发酵促进香菇体内香菇精的合成；

所述的化学渗透调节剂是分子量为2000-8000的聚乙二醇；

按重量百分含量计，所述化学渗透调节剂在液体发酵培养基中的添加量为5%-20%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按重量百分含量计，所述化学渗透调节剂在液体发酵培养基中的添加量为10%~20%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液体发酵的发酵时间为10-30天。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述液体发酵的发酵时间为15天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的化学渗透调节剂在无菌环境中趁热添加到液体发酵培养基中。

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