CN113234766B - 一种添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种添加微生物诱导子的ε‑聚赖氨酸生物合成方法，筛选了对ε‑PL合成影响最大的几种微生物源诱导子，并优化了此类诱导子的最佳添加量、添加时间、最佳诱导子合成时间、诱导子的保存方式、诱导子的提取方式，并以此为基础进行了ε‑PL的分批发酵和补料分批发酵。与传统ε‑PL液态发酵相比，本发明所示的添加微生物诱导子的ε‑PL发酵方法能够显著提高ε‑PL产量、生产强度，在ε‑PL工业化生产中具有重要的意义和应用价值。

Description

一种添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法
技术领域
本发明涉及一种ε-聚赖氨酸的合成方法，具体涉及一种添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法，通过对一些微生物细胞进行萃取，将萃取得到的混合物添加于液态发酵中使得细胞高效合成ε-聚赖氨酸，属于工业生物技术领域。
背景技术
ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种由L-赖氨酸单体通过α-羧基及ε-氨基形成的同型氨基酸聚合物，其主要由链霉菌属微生物产生。ε-PL具有广泛的抑菌谱和较高的安全性，被美国FDA评价为GRAS化合物，并于2014年被我国卫计委批准用于食品的防腐保鲜。此外，ε-PL作为一种安全且环境友好的生物聚合物，还在乳化剂、食疗剂、干扰素诱导物、药物递送载体、基因递送载体、生物芯片、水凝胶等领域有着应用。然而，目前ε-PL生产成本较高，这对其应用的拓展产生了较大的制约。如何通过提高发酵水平来降低其应用成本成为了学术界和产业界共同关心的问题。
目前，液态深层发酵是工业化生产ε-PL的主要途径。本领域研究人员为提升ε-PL的生物合成水平，近年来进行了大量的研究和实践，包括高产菌的选育、发酵培养基的优化、发酵过程重要参数调控、产物原位提取、细胞固定化等。上述研究旨在于为链霉菌生物合成ε-PL 提供适宜的营养和环境，然而，对于“链霉菌为何要合成这个产物”这个根本问题，目前尚没有答案，更没有基于该问题结论所提出的科学技术构想。
大量研究实践得出，链霉菌属微生物是一类合成抑菌物质(抗生素、细菌素等)的宝库。抑菌物质对于生长繁殖慢、细胞扩散程度低的放线菌而言，是其在自然环境中对抗其他微生物保证自身获得营养和生存空间的重要手段，是其和生长迅速的细菌、扩散能力强的霉菌对抗的武器。同样，作为能够广谱抑菌的ε-PL，其合成的源动力极有可能是在收到临近微生物释放出来的某种信号后，自身产生某种应激，促使其快速合成具有抑菌效应的ε-PL来抑制或杀死周围微生物，保护自身的生存。
本发明立足于“其他微生物诱导子诱发ε-PL快速合成”这一假设，研究了不同类型微生物对ε-PL生物合成的影响，并由此开发出一套采用外源添加微生物诱导子的方式促进ε-PL合成的生产方法。本方法可显著提高ε-PL分批发酵中的生产强度，提升ε-PL补料分批发酵中的最终产量，在ε-PL生物合成中具有重要的工业应用价值。
发明内容
本发明筛选了对ε-PL合成影响最大的几种微生物源诱导子，并优化了此类诱导子的最佳添加量、添加时间、最佳诱导子合成时间、诱导子的保存方式、诱导子的提取方式，并以此为基础进行了ε-PL的分批发酵和补料分批发酵，由此提出了一种添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法。
为实现本发明的目的，本发明的微生物源诱导子来自于细菌和真菌，细菌包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，真菌包括酵母、霉菌。
本发明的反应器包括250mL三角瓶、5L液态发酵罐两种。
以上微生物源诱导子筛选、诱导子的最佳添加量、添加时间、最佳诱导子合成时间、诱导子的保存方式、诱导子的提取方式实验均在250mL三角瓶中完成，ε-PL的分批发酵和补料分批发酵在5L发酵罐中进行。
本发明添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法，包括如下步骤：
步骤1：发酵种子培养
将小白链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于30℃恒温培养箱中培养10天，直至长出孢子；用接种环挑取2环孢子(约7×107个)置于装液量80mL的500mLM3G培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε-PL发酵的成熟小白链霉菌种子液；
步骤2：诱导微生物的培养、诱导子提取与保存
选取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、灰葡萄孢菌，分别接种于LB培养基(细菌) 或YPD培养基(真菌)，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在37℃、200rpm下培养1天，酿酒酵母在30℃、200rpm下培养1天，灰葡萄孢菌在24℃、160rpm下培养5天，离心收集细胞；细胞用去离子水洗涤2遍后，加入75％乙醇进行搅拌研磨，研磨液4500rpm离心20min后取上层清液，旋转蒸发回收其中乙醇，并用丁醇进一步萃取(体积比为1：1)，取有机相进行旋转蒸发，回收丁醇；蒸馏剩余液加水适当稀释即为微生物诱导子。该诱导子溶液经过121℃、 20min灭菌后，置于-20℃保存，有效期3天。
步骤3：添加微生物诱导子的ε-PL发酵
选择5L液态发酵罐，其中装配2组圆盘六直页涡轮搅拌器。将M3G液体培养基配好加入到5L发酵罐中，总装液量设置为3L，于115-121℃灭菌20-30min，结束冷却至室温后将以115-121℃单独灭菌20-30min的葡萄糖加入发酵罐；以8％的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子，于初始pH值6.8、温度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速控制)的培养条件下发酵，直至发酵液中葡萄糖消耗殆尽，发酵过程中添加微生物诱导子溶液；在碳源耗完后立即补充预灭菌的60％葡萄糖溶液，以控制碳源浓度在5-15g/L之间，并以预灭菌的600g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5-1g/L之间，发酵持续168h(7d)。本发酵过程中，每隔12h取样测定ε-PL浓度、菌体干重和残葡萄糖浓度。
样品的检测：
发酵液样品经4500rpm离心10min后，上清液用于测定ε-PL浓度和葡萄糖浓度，下层菌体用于测定菌体干重。ε-PL浓度采用甲基橙法测定，即用0.7mM pH 7.0磷酸钠缓冲液将发酵上清液适当稀释，取2mL稀释液与2mL 1mM甲基橙溶液进行反应，混合液在30℃条件下反应30min后4,500×g离心15min。上清经上述磷酸缓冲液稀释20倍后在465nm处测定吸光度，并参照预先制备得到的吸光度与ε-PL标准品对应的标准曲线计算得到ε-PL的浓度。葡萄糖采用HPLC法测定，即采用高效液相色谱仪(Dionex,U-3000,USA)测定发酵上清液中的葡萄糖浓度。硬件配置：有机酸柱(BIO-RAD,Aminex HPX-87H 300×7.8mm,USA)及示差检测器(Shodex,RI-101,Japan)。样品物质由5mM H2SO4流动相载负，以0.6mL/min 流速通过柱温为60℃的有机酸分析柱，所分离得到的各组分分别由示差检测器测定其含量。菌体干重(DCW)采用滤纸差量测重法。菌体沉淀加蒸馏水洗涤两次，用预先105℃烘干并称重的滤纸进行抽滤，之后滤纸置于105℃烘干至恒重后称重，计算前后重量差值。
本发明方法所涉及的菌种：小白链霉菌IFO14147(StreptomycesalbulusIFO14147)，购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC 11022)。
本发明方法所涉及的培养基：
(1)贝塔纳培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20，pH 7.5。
(2)M3G培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉5，(NH4)2SO4 10，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO4 1.36，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8。
(3)LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.4。
(4)YPD培养基(g/L)：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，pH 6.5。
以上凡涉及到葡萄糖，均分开配制，121℃高温灭菌20min后再加入培养基中。
与传统ε-PL液态发酵相比，本发明所示的添加微生物诱导子的ε-PL发酵方法能够显著提高ε-PL产量、生产强度，在ε-PL工业化生产中具有重要的意义和应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件以及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明方法所涉及的菌种：小白链霉菌IFO14147(Streptomyces albulus IFO14147，CICC 11022)，枯草芽孢杆菌(CICC 10001)，大肠杆菌(CICC 10003)，购自中国工业微生物菌种保藏中心；灰葡萄孢菌(CGMCC3.4584)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本发明方法所涉及的培养基：
(1)贝塔纳培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20，pH 7.5。
(2)M3G培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉5，(NH4)2SO4 10，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO4 1.36，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8。
(3)LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.4。
(4)YPD培养基(g/L)：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，pH 6.5。
以上凡涉及到葡萄糖，均分开配制，121℃高温灭菌20min后再加入培养基中。
实施例1：可促进ε-PL合成的微生物诱导子筛选
选取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、灰葡萄孢菌，分别接种于LB培养基(细菌) 或YPD培养基(真菌)，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在37℃下200rpm培养1天，酿酒酵母在30℃200rpm下培养1天，灰葡萄孢菌在24℃160rpm下培养4天，离心分开收集发酵上清液和细胞。细胞用去离子水洗涤2遍后，置于超声波破碎仪下进行细胞破碎，破碎液离心后取上清作为细胞破碎液。将以上制备得到的发酵上清液和细胞破碎液6000rpm离心20min，上清过0.22μm膜过滤杂菌，在发酵起始时添加到发酵M3G培养基中，接入培养成熟的小白链霉菌种子液，考察不同微生物来源(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、灰葡萄孢菌)的发酵上清液及细胞破碎液对三角瓶发酵中ε-PL合成的影响。本部分考察了3、6、9、15、21、 27％上清液添加比例，以及6、12、18、24、30、36(g细胞湿重/L)细胞破碎液添加比例，发酵2天后，测定其中ε-PL浓度和菌体干重。最终筛选得到灰葡萄孢菌的胞内外代谢物在促进ε-PL合成方面功效显著，其发酵上清液在21％添加量时ε-PL产量为0.65g/L，稍比对照(添加等体积水)0.57g/L高，而灰葡萄孢菌细胞破碎液在30g细胞湿重/L添加量时，ε-PL产量为0.93g/L，为对照(添加等体积水)产量(0.57g/L)的1.57倍，提高显著。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌代谢物对ε-PL合成产生负面作用，如大肠杆菌发酵上清液添加27％时，ε-PL产量为0.46g/L，相应添加量的枯草芽孢杆菌产量为0.51g/L；大肠杆菌细胞破碎液添加36％时，ε-PL产量为0.33g/L，相应添加量的枯草芽孢杆菌产量为0.51g/L。酿酒酵母代谢物对ε-PL合成有部分促进作用，但不是最优，如其发酵上清液添加21％时，ε-PL产量为0.60g/L，细胞破碎液添加量为30g细胞湿重/L时，ε-PL产量为0.80g/L。
实施例2：灰葡萄孢菌胞内诱导子热稳定性及保存方法探索
将灰葡萄孢菌细胞破碎液在6000rpm下离心20min，上清进行如下处理，其一，经0.22μm 膜过滤除杂菌，并置于-20℃环境冷冻保藏；其二，121℃高温处理20min杀菌，之后置于-20℃环境冷冻保藏。分别考察以上两种诱导子的活性随保存时间变化的规律，即每天取出部分诱导子，以30g细胞湿重/L的量在发酵起始时添加于ε-PL三角瓶发酵中，发酵2天后，测定ε-PL 终浓度，由此判定其热稳定性和保藏时间的适用性。最终，经膜过滤除菌后的不同保藏时间的诱导子，添加发酵后ε-PL产量分别为，0.94g/L(0d)，0.90g/L(1d)，0.72g/L(2d)，0.60 g/L(3d)，0.59g/L(4d)，0.56g/L(5d)，0.52g/L(6d)，0.51g/L(7d)；经高温灭菌后不同保藏时间的诱导子，添加发酵后ε-PL产量分别为，0.94g/L(0d)，0.91g/L(1d)，0.87g/L (2d)，0.86g/L(3d)，0.83g/L(4d)，0.81g/L(5d)，0.78g/L(6d)，0.75g/L(7d)。可见，该微生物诱导子对热稳定行强，且适合高温灭菌后的储藏，但是储藏时间不宜过长，制备后 3天内使用较好。
实施例3：灰葡萄孢菌诱导子添加ε-PL发酵中重要参数的优化
对于诱导子添加时间优化，首先，在装有100mLYPD液体培养基的500mL三角瓶中接入灰葡萄孢菌孢子，并在24℃160rpm条件下培养5天，培养结束后将菌体以去离子水洗涤2遍，并以细胞破碎仪或研钵进行细胞破碎，离心后上清液进行收集作为灰葡萄孢菌诱导子。ε-PL三角瓶发酵中，在发酵0h，6h，12h，18h，24h，30h，36h，42h时，分别添加以上终浓度为30g细胞湿重/L的灰葡萄孢菌诱导子，并在24h时添加终浓度为20g/L柠檬酸钠(pH 4.0)缓冲液控制发酵pH，48h结束发酵，测定ε-PL浓度。其ε-PL产量分别为，0.90g/L(0h)， 0.89g/L(6h)，0.79g/L(12h)，0.97g/L(18h)，1.21g/L(24h)，1.07g/L(30h)，0.81g/L (36h)，0.52g/L(42h)，数据说明在ε-PL发酵24h时添加最优。
对于灰葡萄孢菌诱导子产生时间优化，在装有100mLYPD液体培养基的500mL三角瓶中接入灰葡萄孢菌孢子，并在24℃160rpm条件下培养2天以获得灰葡萄孢菌种子液。以此种子液接种新鲜YPD培养基，分别发酵1d、2d、3d、4d、5d，其菌丝体进行洗涤、破碎处理，获得不同培养时间的灰葡萄孢菌诱导子。在ε-PL三角瓶发酵24h时，分别添加以上获得的培养不同时间灰葡萄孢菌的诱导子溶液，同时添加终浓度为20g/L柠檬酸钠(pH 4.0)缓冲液控制发酵pH，继续发酵1天，即48h结束发酵，测定溶液中ε-PL浓度。其ε-PL产量分别为， 0.76g/L(1d)，0.95g/L(2d)，1.09g/L(3d)，1.20g/L(4d)，1.12g/L(5d)，数据说明经过 4d培养的灰葡萄孢菌产生的诱导子最多。
对于灰葡萄孢菌诱导子添加量的优化，在装有100mLYPD液体培养基的500mL三角瓶中接入灰葡萄孢菌孢子，并在24℃160rpm条件下培养2天以获得灰葡萄孢菌种子液。以此种子液接种新鲜YPD培养基以相同条件发酵4d，其菌丝体进行洗涤、破碎处理，获得灰葡萄孢菌诱导子。ε-PL三角瓶发酵中，在发酵24h分别添加以上终浓度为6、12、18、24、30、36、48、60、72、84g细胞湿重/L的灰葡萄孢菌诱导子，并在24h时添加终浓度为20g/L柠檬酸钠(pH4.0)缓冲液控制发酵pH，48h结束发酵，测定ε-PL浓度。其ε-PL产量分别为， 0.53g/L(6g细胞湿重/L)，0.64g/L(12g细胞湿重/L)，0.82g/L(18g细胞湿重/L)，0.96g/L (24g细胞湿重/L)，1.08g/L(30g细胞湿重/L)，1.17g/L(36g细胞湿重/L)，1.11g/L(48g 细胞湿重/L)，0.78g/L(60g细胞湿重/L)，0.56g/L(72g细胞湿重/L)，0.52g/L(84g细胞湿重/L)，数据说明36g细胞湿重/L为灰葡萄孢菌诱导子在ε-PL发酵中的最优添加量。
实施例4：灰葡萄孢菌诱导子的初步提取优化及性状分析
在装有100mLYPD液体培养基的500mL三角瓶中接入灰葡萄孢菌孢子，并在24℃160rpm 条件下培养2天以获得灰葡萄孢菌种子液。以此种子液接种新鲜YPD培养基以相同条件发酵 4d，其菌丝体先采用75％乙醇浸泡过夜并研磨，4000rpm离心20min，取得上清液(S组分) 和沉淀(D组分)。上清液(S组分)在旋转蒸发仪中除去乙醇，清液分成4等份，分别与3 倍体积的乙酸乙酯、氯仿、丁醇和石油醚混合8h进行萃取，离心取有机相，分别于旋转蒸发仪中除去有机溶剂，并以一定得去离子水复溶，制备为乙酸乙酯萃取液(E组分)、氯仿萃取液(C组分)、丁醇萃取液(B组分)、石油醚萃取液(P组分)。ε-PL三角瓶发酵中，在发酵24h分别添加以上制得得不同细胞提取物组分(S、D、E、C、B、P组分)，终浓度为36g细胞湿重/L的灰葡萄孢菌诱导子，并在24h时添加终浓度为20g/L柠檬酸钠(pH 4.0)缓冲液控制发酵pH，48h结束发酵，测定ε-PL浓度。其ε-PL产量分别为，0.98g/L(S组分)，0.60 g/L(D组分)，0.71g/L(E组分)，0.60g/L(C组分)，0.85g/L(B组分)，0.57g/L(P组分)，数据说明诱导子主要存在于乙醇和丁醇相中，其分析结构与这两者类似，并且诱导子似乎不是蛋白质、多糖及脂溶性强的成分，具体结构还需下一步解析。
实施例5：基于添加灰葡萄孢菌诱导子的ε-PL 5L发酵罐分批发酵
选择5L液态发酵罐，其中装配2组圆盘六直页涡轮搅拌器。将M3G液体培养基配好，加入到5L发酵罐中，总装液量设置为3L，于115-121℃灭菌20-30min，结束冷却至室温后将以115-121℃单独灭菌20-30min的葡萄糖加入发酵罐。以8％的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子，于初始pH值6.8、温度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速控制)的培养条件下发酵，直至发酵液中葡萄糖消耗殆尽；待发酵pH值自发下降到4.0时，采用自动流加12.5％氨水的方式控制pH值为4.0直至分批发酵结束。灰葡萄孢菌诱导子于24h时，以终浓度为36g细胞湿重/L的量添加进发酵罐，对照发酵罐添加进等体积去离子水。本发酵过程中，每隔12h取样测定ε-PL浓度、菌体干重和残葡萄糖浓度。其中，实验组(添加有灰葡萄孢菌诱导子)发酵总时间为52.6h，ε-PL产量为4.32g/L，菌体干重为14.6g/L，生产强度为0.082g/L/h；对照组(添加等体积水)发酵总时间为60.1h，ε-PL产量为2.81g/L，菌体干重为10.23g/L，生产强度为0.047g/L/h。可知，相比对照组，实验组ε-PL产量为对照的1.54倍，菌体干重为对照的1.43倍，发酵时间缩短了12.5％，生产强度提升至对照的1.74倍，发酵提升效果显著。
实施例6：基于添加灰葡萄孢菌诱导子的ε-PL 5L发酵罐补料分批发酵
选择与上述分批发酵相同的发酵罐及相关培养基、培养条件，不同之处在于在碳源耗完后立即补充预灭菌的60％葡萄糖溶液，以控制碳源浓度在5-15g/L之间，以预灭菌的600g/L 的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5-1g/L之间。发酵持续168h(7d)，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε-PL浓度、菌体干重和残葡萄糖浓度。其中，实验组(添加有灰葡萄孢菌诱导子)发酵ε-PL最终产量为34.25g/L，菌体干重为32.54g/L；对照组(添加等体积水)发酵ε-PL最终产量为25.55g/L，菌体干重为21.57g/L；可知，相比对照组，实验组ε-PL产量为对照的1.34倍，微生物诱导子同样在ε-PL补料发酵中有着显著的促进效果。

Claims (4)

1.一种添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法，其特征在于：
采用外源添加微生物诱导子的方式促进ε-PL的合成，包括如下步骤：
步骤1：发酵种子培养
将小白链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于30℃恒温培养箱中培养10天，直至长出孢子；用接种环挑取2环孢子置于装液量80mL的500mL M3G培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε-PL发酵的成熟小白链霉菌种子液；
所述小白链霉菌购自中国工业微生物菌种保藏中，保藏编号CICC 11022；
步骤2：诱导微生物的培养、诱导子提取与保存
将灰葡萄孢菌接种于LB培养基或YPD培养基，在24℃、160rpm下培养5天，离心收集细胞；细胞用去离子水洗涤2遍后，加入75%乙醇进行搅拌研磨，研磨液4500rpm离心20min后取上层清液，旋转蒸发回收其中乙醇，并用丁醇进一步萃取，取有机相进行旋转蒸发，回收丁醇；蒸馏剩余液加水适当稀释即为微生物诱导子；诱导子溶液经过121℃、20min灭菌后，置于-20℃保存，有效期3天；
所述灰葡萄孢菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC3.4584；
步骤3：添加微生物诱导子的ε-PL发酵
在ε-聚赖氨酸的生物发酵过程中添加微生物诱导子，以促进ε-PL的合成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于
步骤3中，采用补料分批发酵的方法合成ε-聚赖氨酸，具体包括如下步骤：
将M3G液体培养基配好加入到5L发酵罐中，总装液量设置为3L，于115-121℃灭菌20-30min，结束冷却至室温后将以115-121℃单独灭菌20-30min的葡萄糖加入发酵罐；以8%的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子培养发酵，直至发酵液中葡萄糖消耗殆尽，发酵过程中添加微生物诱导子溶液；在碳源耗完后立即补充预灭菌的60%葡萄糖溶液，以控制碳源浓度在5-15g/L之间，并以预灭菌的600 g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5-1g/L之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤3中，培养发酵的条件为：初始pH值6.8、温度30℃、溶氧保持在30%以上。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
微生物诱导子溶液的添加量为36g细胞湿重/L，于发酵24h时添加进发酵体系。
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