CN116042548A - CYP76AD1-α分支蛋白及其在甜菜苷生物合成中的应用 - Google Patents

CYP76AD1-α分支蛋白及其在甜菜苷生物合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及CYP76AD1‑α分支蛋白及其在甜菜苷生物合成中的应用。本发明提供的CYP76AD1‑α分支蛋白包括：火龙果HuCYP76AD1‑1、仙人掌果OfCYP76AD8和/或鸡冠花CcCYP76AD4W13L，有效提高了酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中甜菜苷的生物合成量，为甜菜苷的工业化生产奠定了基础。

Description

CYP76AD1-α分支蛋白及其在甜菜苷生物合成中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及CYP76AD1-α分支蛋白及其在甜菜苷生物合成中的应用。
背景技术
甜菜苷(Betanin)是由L-酪氨酸衍生的水溶性天然色素，属于甜菜红素(Betacyanins)类化合物，主要存在于石竹目(Caryophyllale)植物和一些高等真菌中。甜菜苷易溶于水，在自然光下呈鲜艳的紫红色，具有染色能力强、安全无毒害的优点。因此，甜菜苷逐渐受到公众的喜爱，成为认可度较高的天然食品着色剂，并被我国食品安全国家标准、欧盟以及美国食品药品监督管理局列为安全性食品添加剂，主要用于人造肉、水果酸奶、冰淇淋、口香糖、罐头等食品的着色，也可用于化妆品和药品中。此外，甜菜苷在无损观察植物遗传转化和基因表达等领域也有潜在应用价值。
目前市售的甜菜苷产品名为“甜菜红”，通常是用水抽提红甜菜根，再经浓缩、喷雾干燥后所得。然而在实际应用中，人们发现红甜菜根作为食品添加剂的主要来源存在以下几个缺点：(1)由于土臭素和各种吡嗪的存在，使其具有土腥味；(2)市售甜菜苷来源于红甜菜的根部，有携带土壤微生物的风险；(3)与微生物相比，红甜菜的生长周期较长，且甜菜苷的产量容易受地理位置和气候变化等环境因素的影响。显然，从天然植物中提取甜菜苷不足以满足人们对高质量产品的需求，因此，开发用于商业化生产甜菜苷的其他替代来源是非常有意义的。
在微生物中表达植物源CYP76AD1-α分支蛋白、DODA以及cDOPA5GT，可实现甜菜苷的途径重构。然而，目前发现的具有催化合成L-多巴和环多巴双功能活性的CYP76AD1-α分支蛋白数量非常少，且活性低，严重限制了微生物异源合成甜菜苷的产量。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了CYP76AD1-α分支的多种蛋白及其在甜菜苷生物合成中的应用，通过采用所述的CYP76AD1-α分支蛋白可以提高生物合成甜菜苷的产量。
本发明所述的CYP76AD1-α分支蛋白包括：火龙果HuCYP76AD1-1、仙人掌果OfCYP76AD8和/或鸡冠花CcCYP76AD4W13L，显著提高了甜菜苷的生物合成量。
在本发明的一些实施方案中，上述CYP76AD1-α分支蛋白中所述火龙果HuCYP76AD1-1具有：
(I)、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
(II)、在如(I)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列；和
所述仙人掌果OfCYP76AD8具有：
(i)、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
(ii)、在如(i)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(iii)、与(i)或(ii)所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
所述鸡冠花CcCYP76AD4W13L具有：
(A)、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或
(B)、在如(A)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(C)、与(A)或(B)所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
具体的，在本发明的一些实施方案中，所述的火龙果HuCYP76AD1-1氨基酸序列为：MDSPTLWLFIFASIFYIITFQIVKLGFNVVMTSKKTKRRRPPLPPGPKPLPIIGNVLELGQKPHRSFADLAKVHGPLMSLRLGSVTTIIVSSSDVAKEMFLKNDQPLSSSRTIPNSVTAGDHHMLTMSWLPVSPKWRSFRKITTFHLLSPQRLDACSSLRQAKVQQLFEYVLECSRTGQAVDIGKAAFTTSLNLLSKLFFSLELAHHRSSKCQEFKDLIWDIMEDIGKPNYADYFPCLKYFDPCGIRRRLANSFEKLIEVFQGIIRQRLSLSSGSHTHNDVLDVLLQLYNQEELTMDEINHLLVDIFDAGTDTTSSTFEWAMAELIKNRTMMEKAQAEIKVVLGKQSHIQESDIPKLPYLRAIIKETLRLHPPTVFLLPRKAETDVELYGYTVPKNAQILVNLWALGRDPKVWENPEVFLPERFLTCDIDVKGRDFGLLPFGAGRRICPGMNLAYRMLTLMLATLLQSFDWKLPNEMNSKNLDMDEKFGIALQKTKPLEIIPVCKD(如SEQ ID NO:2所示)。
具体的，在本发明的一些实施方案中，所述的仙人掌果OfCYP76AD8的氨基酸序列为：MDTPTLSYFISAITFYYIAFQIVKLGFNVIMTSKKTKRRRLPLPPGPKPLPIIGNVFELGPKPHRSFASLAKVYGPLMSLRLGSVTTIIVSSSDVAKEMFLKNDQPLSSTRTIPNSVTAGDHHKLTMSWLPVSPKWRSFRKITTFHLLSPQRLDACSGLRQAKVQQLYEYVLECSRTGQAVDIGKAAFTTSLNLLSKLFFSLELANHTSDKSQEFKELIWNIMEDIGKPNYADYFPCLKYFDPSGIRRRLACSFEKLIEVFQVIIRQRLSLSSSGTNDHNNDVLDVLLDLYQQKELSMEEINHLLVDIFDAGTDTTSSTFEWAMAELIKNPRMMETAQAEIKLILGKDLHIQESDIPKLPYLRAIIKETLRLHPPTVFLLPRKADADVELYGYTVPKNAQILVNLWALGRDPKVWENPDVFSPERFLGCDIDVKGRNFGLLPFGAGRRICPGMNLAYRMLTLMLATLLQSFDWKLPNEMNPQNLDMDEKFGIALQKTKPLQIIPLSKD(如SEQ ID NO:3所示)。
具体的，在本发明的一些实施方案中，所述的鸡冠花CcCYP76AD4W13L氨基酸序列为：MDNATLAMLLAILFISFHFIKMLFTNQSTKLLPPGPKPLPIIGNILEVGKKPHRSFANLAKIHGPLISLKLGSVTTIVVSSAEVAKEMFLKKDQPLSNRTVPNSVTAGDHHKLTMSWLPVSPKWRNFRKITAVHLLSPLRLDACQSLRHAKVQQLFQYVQECAQKGQAVDIGKAAFTTSLNLLSKLFFSKELASHKSRESQEFKQLIWNIMEDIGKPNYADYFPILGCVDPSGIRRRLASNFDKLIEVFQCIIRQRLERNPSTPPTNDVLDVLLELYKQNELSMGEINHLLVDIFDAGTDTTSSTFEWVMAELIRNPEMMAKAQDEIEQVLGKDRQIQESDIIKLPYLQAIIKETLRLHPPTVFLLPRKADTDVELYGYIVPKDAQILVNLWAIGRDSQAWENPKVFSPDRFLGCEIDVKGRDFGLLPFGAGKRICPGMNLAIRMLTLMLATLLQFFNWKLQDGMSLEDLDMEEKFGIALQKTKPLRIIPVSRY(如SEQ ID NO:4所示)。
本发明还提供了编码上述CYP76AD1-α分支蛋白的核酸分子。
在本发明的一些实施方案中，编码所述火龙果HuCYP76AD1-1的核酸分子具有：
(I)、如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；或
(II)、如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)或(II)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(IV)、与(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列编码蛋白功能相同或相似的核苷酸序列；或
(V)、与(I)、(II)、(III)或(IV)所述核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列。和
编码所述仙人掌果OfCYP76AD8的核酸分子具有：
(i)、如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；或
(ii)、如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(iii)、与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(iv)、与(i)、(ii)或(iii)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)、(ii)或(iii)所示的核苷酸序列编码蛋白功能相同或相似的核苷酸序列；或
(v)、与(i)、(ii)、(iii)或(iv)所述核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列。
编码所述鸡冠花CcCYP76AD4W13L的核酸分子具有：
(A)、如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；或
(B)、如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(C)、与(A)或(B)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(A)或(ii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(D)、与(A)、(B)或(C)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(A)、(B)或(C)所示的核苷酸序列编码蛋白功能相同或相似的核苷酸序列；或
(E)、与(A)、(B)、(C)或(D)所述核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列。
具体的，在本发明的一些实施方案中，上述编码HuCYP76AD1-1的核酸序列为:atggactctccaactttgtggttgttcatcttcgcttctatcttctacatcatcaccttccagatcgtcaagttgggtttcaacgttgttatgacttctaagaagactaagagaaggagaccaccattgccaccaggtccaaagccattgccaatcatcggtaacgttttggaattgggtcagaagccacacagatcgttcgctgacttggctaaggttcacggtccattgatgtctttgagattgggttctgttactaccatcatcgtttcttcatctgacgttgctaaggagatgttcttgaagaacgaccaaccattgtcttcttctaggaccatcccaaactctgttactgctggtgaccaccacatgttgaccatgtcttggttgccagtttctccaaagtggagatcgttcaggaagatcactaccttccacttgttgtctccacagaggttggacgcttgctcttctttgagacaagctaaggttcaacagttgttcgagtacgtcttggaatgttctcgtactggtcaagctgttgacatcggtaaggctgccttcactacctctttgaacttgttgtctaagttgttcttctctttggaattggctcaccacagatcgtctaagtgtcaagagttcaaggacttgatctgggacatcatggaagacatcggtaagccaaactacgctgactacttcccatgcttgaagtacttcgacccatgtggtatcagaaggagattggctaactctttcgaaaagttgatcgaagtcttccaaggtatcatcagacaaagattgtctttgtcttctggttctcacactcacaacgacgtcttggacgttttgttgcagttgtacaaccaagaagaattgactatggacgaaatcaaccacttgttggttgacatcttcgacgctggtactgacactacctcttctaccttcgagtgggctatggctgaattgatcaagaacagaactatgatggaaaaggctcaagctgaaatcaaggttgttttgggtaagcaatctcacatccaggaatctgacatcccaaagttgccatacttgagagccatcatcaaggaaactttgagattgcacccaccaactgttttcttgttgccaagaaaggctgaaactgacgttgaattgtacggttacactgttccaaagaacgctcaaatcttggttaacttgtgggctttgggtagagacccaaaggtttgggagaacccagaagtcttcttgccagaaagattcttgacctgtgacatcgacgttaagggtagagacttcggtttgttgccattcggtgctggtagaaggatctgtccaggtatgaacttggcttacagaatgttgaccttgatgttggctactttgttgcagtctttcgactggaagttgccaaacgaaatgaactctaagaacttggacatggacgagaagttcggtatcgctttgcagaagaccaagccattggaaatcatcccagtttgtaaggactaa(如SEQ ID NO:12所示)。
具体的，在本发明的一些实施方案中，上述编码OfCYP76AD8的核酸序列为:atggacactccaaccttgtcttacttcatctctgccatcactttctactacatcgctttccagatcgttaagttgggtttcaacgtcatcatgacttctaagaagactaagagaaggagattgccattgccaccaggtccaaagccattgccaatcatcggtaacgttttcgagttgggtccaaagccacacagatcgttcgcttctttggctaaggtctacggtccattgatgtctttgagattgggttctgttactaccatcatcgtttcttcttctgacgttgccaaggaaatgttcttgaagaacgaccaaccattgtcttctaccagaaccatcccaaactctgtcactgctggtgaccaccacaagttgactatgtcttggttgccagtttctccaaagtggagatcgttcagaaagatcaccaccttccacttgttgtctccacagagattggacgcttgctctggtttgagacaagccaaggtccaacagttgtacgaatacgttttggaatgttctcgtactggtcaagctgtcgacatcggtaaggctgctttcaccacttctttgaacttgttgtctaagttgttcttctctttggaattggctaaccacacttctgacaagtctcaagaatttaaggagttgatctggaacatcatggaagacatcggtaagccaaactacgctgactacttcccatgcttgaagtacttcgacccatctggtatcagaaggagattggcttgctctttcgaaaagttgatcgaagttttccaagttatcatcagacaaagattgtctttgtcttcttctggtactaacgaccacaacaacgacgtcttggacgtcttgttggacttgtaccaacagaaggaattgtctatggaagaaatcaaccacttgttggtcgacatcttcgacgctggtactgacactacttcttctactttcgaatgggctatggctgaattgatcaagaacccaaggatgatggaaactgctcaagctgaaatcaagttgatcttgggtaaggacttgcacatccaagaatctgacatcccaaagttgccatacttgagagctatcatcaaggagaccttgagattgcacccaccaaccgtcttcttgttgccaagaaaggctgacgctgacgttgaattgtacggttacactgttccaaagaacgctcaaatcttggttaacttgtgggctttgggtagagacccaaaggtctgggaaaacccagacgttttctctccagagagattcttgggttgcgacatcgacgtcaagggtagaaacttcggtttgttgccattcggtgctggtagaagaatctgtccaggtatgaacttggcttacagaatgttgaccttgatgttggctactttgttgcagtctttcgactggaagttgccaaacgaaatgaacccacagaacttggacatggacgagaagttcggtatcgctttgcaaaagaccaagccattgcaaatcatcccattgtctaaggactaa(如SEQ ID NO:13所示)。
具体的，在本发明的一些实施方案中，上述编码CcCYP76AD4W13L的核酸序列为:atggacaacgccacattggctatgttgttggctatcttgttcatctccttccacttcatcaagatgttgttcaccaaccaatccaccaagttgttgccaccaggtccaaaaccattgccaatcatcggtaacatcttggaagtcggtaagaagccacacagatccttcgcaaacttggcaaagatccacggtccattgatctccttgaagttgggttccgtcaccacaatcgtcgtctcttccgcagaagttgctaaggaaatgttcttgaagaaggaccaaccattgtccaacagaaccgtcccaaactccgttactgccggtgatcatcataagttgaccatgtcctggttgccagtctctccaaaatggagaaacttcagaaagatcaccgctgtccacttgttgtccccattgagattggacgcttgccaatctttgagacacgctaaggtccaacaattgttccaatacgtccaagaatgcgctcaaaagggtcaagctgtcgacattggtaaggctgctttcactacctccttgaacttgttgtccaagttgttcttctccaaggaattggcttcccacaagtccagagaatcccaagaatttaagcaattgatctggaacatcatggaagacatcggtaagccaaactacgccgattacttcccaatcttgggttgcgtcgacccatctggtataagaagaagattggcttccaacttcgacaagttgatcgaagtcttccaatgcatcatcagacaaagattggaaagaaacccatccaccccacctactaacgatgttttggacgtcttgttggaattgtacaagcaaaacgaattgtctatgggtgaaatcaaccacttgttggtcgacatcttcgacgctggtacagacactacttcctctactttcgaatgggtcatggccgaattgatcagaaacccagaaatgatggctaaggctcaagacgaaatcgaacaagtcttgggtaaggacagacaaatccaagaatccgacatcatcaagttgccatacttgcaagctatcatcaaggaaaccttgagattgcacccaccaaccgtattcttgttgccaagaaaggccgacaccgatgtagaattgtacggttacatcgtcccaaaggacgctcaaatcttggtcaacttgtgggctatcggtagagactcccaagcatgggaaaaccctaaggttttctccccagacagattcttgggttgcgaaatcgacgtcaagggtagagatttcggtttgttgccattcggtgccggtaaaagaatctgcccaggtatgaacttggctatcagaatgttgaccttgatgttggctaccttgttgcaattcttcaactggaagttgcaagacggtatgtccttggaagacttggacatggaagaaaagttcggtatcgctttgcaaaagaccaagccattgagaatcatcccagtctccagatactaa(如SEQ ID NO:14所示)。
本发明还提供了其他物种来源的CYP76AD1-α分支蛋白包括：甜菜BvCYP76AD1W13L、藜麦CqCYP76AD1、非洲菊CbCYP76AD12和/或鸡冠花CcCYP76AD4；
编码所述甜菜BvCYP76AD1W13L的核酸分子具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
编码所述藜麦CqCYP76AD1的核酸分子具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
编码所述非洲菊CbCYP76AD12的核酸分子具有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
编码所述鸡冠花CcCYP76AD4的核酸分子具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。
本发明还提供了紫茉莉(Mirabilis jalapa)来源的多巴双加氧酶MjDODA和环多巴5-O-葡糖基转移酶MjcDOPA5GT，拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的还原酶AtR1；
编码所述紫茉莉MjDODA的核酸分子，具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
编码所述紫茉莉MjcDOPA5GT的核酸分子，具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
编码所述拟南芥AtR1的核酸分子，具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
本发明还提供了基因表达模块，其包括上述核酸分子。
本发明还提供了重组菌株，包括所述蛋白、所述酶、所述的核酸分子或所述的基因表达模块。
在本发明的一些实施方案中上述重组菌株包括：酿酒酵母。
本发明还提供了所述蛋白、所述酶、所述的核酸分子、所述的基因表达模块或所述的重组菌株在合成甜菜苷中的应用。
本发明还提供了合成甜菜苷的方法，包括取所述的重组菌株培养、发酵，获得所述甜菜苷。
本发明的有益效果包括：以文献报道的甜菜BvCYP76AD1W13L作为对照，本发明提供的HuCYP76AD1-1、OfCYP76AD8和CcCYP76AD4W13L利用L-酪氨酸分别合成了3.08mg/L、5.66mg/L和6.48mg/L甜菜苷，产量比BvCYP76AD1W13L分别提高了4.92倍、9.88倍和11.46倍。
附图说明
图1示重组菌株BTN1～BTN9的染色体整合示意图；
图2示不同CYP76AD1-α分支蛋白利用L-酪氨酸合成甜菜苷的发酵液HPLC色谱图；
图3示不同CYP76AD1-α分支蛋白利用L-酪氨酸合成甜菜苷的发酵上清液；
图4示不同CYP76AD1-α分支蛋白利用L-酪氨酸合成甜菜苷的发酵上清液吸收光谱图。
具体实施方式
本发明提供了CYP76AD1-α分支蛋白及其在甜菜苷生物合成中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
下述实施例中所用培养基配方：
酿酒酵母SC选择性培养基：葡萄糖20.0g/L，无氨基酵母氮源6.7g/L，氨基酸缺省混合粉末2.0g/L(配方如表1所示)。配制完成后用10M NaOH溶液调节pH值为6.5。SC固体培养基再额外添加1.5％(w/v)的琼脂粉。灭菌条件：0.1Mpa，115℃，灭菌15min。在使用前根据具体情况添加所需的氨基酸，氨基酸工作浓度分别为：尿嘧啶：20.0mg/L；L-色氨酸：20.0mg/L；L-组氨酸盐酸盐：20.0mg/L；L-亮氨酸：100.0mg/L。氨基酸预先配置成母液，然后在0.1Mpa，121℃条件下灭菌20min，常温储存即可。
表1氨基酸缺省粉的组成
成分 质量(g) 成分 质量(g)
腺嘌呤 0.5 缬氨酸 2.0
肌醇 2.0 赖氨酸 2.0
精氨酸 2.0 甲硫氨酸 2.0
脯氨酸 2.0 异亮氨酸 2.0
丝氨酸 2.0 苯丙氨酸 2.0
苏氨酸 2.0 天冬氨酸 2.0
酪氨酸 2.0 天冬酰胺 2.0
谷氨酸 2.0 半胱氨酸 2.0
丙氨酸 2.0 谷氨酰胺 2.0
甘氨酸 2.0 对氨基苯甲酸 2.0
酿酒酵母发酵培养基：葡萄糖20.0g/L，无氨基酵母氮源7.6g/L，肌醇2.0g/L，盐酸硫胺素400.0mg/L，盐酸吡哆醇400.0mg/L，D-泛酸钙400.0mg/L，生物素2.0mg/L，L-抗坏血酸1.76g/L。发酵培养基配制过程：将葡萄糖和无氨基酵母氮源按比例配制完成后，用10MNaOH溶液调节pH值为6.5，在0.1Mpa，115℃条件下，灭菌15min；在发酵前根据具体情况添加所需的维生素以及氨基酸。由于维生素或生长因子等物质在高温灭菌时易发生变性或失去功能，因此，维生素需预先配置成母液(现用现配)，用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤除菌后添加至培养基中。氨基酸工作浓度分别为：尿嘧啶：76.0mg/L；L-色氨酸：76.0mg/L；L-组氨酸盐酸盐：76.0mg/L；L-亮氨酸：380.0mg/L。氨基酸预先配置成母液，然后在0.1Mpa，121℃条件下灭菌20min，常温储存。
下述实施例中涉及的甜菜苷检测方法：
发酵液样品处理过程：取适量发酵液于1.5mL棕色离心管中，12,000rpm离心10min，上清液用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤用于液质联用、液相检测或光谱扫描。HPLC检测条件：紫外检测器，波长535nm；色谱柱4.6×250mmC18；流动相成分20％甲醇-80％水-0.1％三氟乙酸，流速1mL/min；进样量10μL；柱温25℃。光谱扫描条件：波长范围350-650nm，扫描间隔为1nm。
目前没有市售的纯甜菜苷标准品。本发明首先利用液质联用仪分析鉴定了市售红甜菜根提取物中的甜菜苷，然后利用HPLC测定了市售红甜菜根提取物系列稀释物，得到甜菜苷峰面积与浓度的标准曲线，再通过HPLC测定了发酵液中的甜菜苷，根据标准曲线计算出发酵液对应的红甜菜根提取物浓度；最后利用朗伯-比尔定律(Beer-Lambert Law)，测定了红甜菜根提取物系列稀释物在波长为535nm处的吸光度，根据甜菜苷在535nm下的摩尔消光系数为65,000M-1cm-1以及甜菜苷的相对分子质量为550.48g/mol，计算出红甜菜根提取物中甜菜苷分子的含量，进而得出发酵液所含甜菜苷的量。
朗伯-比尔定律的数学表达式：
C＝A/ε535×L
其中，A为535nm下的吸光度，ε535＝65,000M-1cm-1，L＝1cm
本发明提供的CYP76AD1-α分支蛋白及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下述实施例中涉及的基因如下：
表2.本发明涉及的基因
名称 物种来源 氨基酸序列 核酸序列
MjDODA 紫茉莉(Mirabilis jalapa) Genbank BAG80686.1 SEQ ID NO:5
MjcDOPA5GT 紫茉莉(Mirabilis jalapa) Genbank BAD91803.1 SEQ ID NO:6
AtR1 拟南芥(Arabidopsis thaliana) Genbank CAA46814.1 SEQ ID NO:7
<![CDATA[BvCYP76AD1<sup>W13L</sup>]]> 甜菜(Beta vulgaris) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:8
CqCYP76AD1 藜麦(Chenopodium quinoa) Genbank XP_021769302.1 SEQ ID NO:9
CbCYP76AD12 非洲菊(Cleretum bellidiforme) Genbank AJD87468.1 SEQ ID NO:10
CcCYP76AD4 鸡冠花(Celosia cristata) Genbank AGI78466.1 SEQ ID NO:11
HuCYP76AD1-1 火龙果(Hylocereus undatus) SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:12
OfCYP76AD8 仙人掌果(Opuntia ficus-indica) SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:13
<![CDATA[CcCYP76AD4<sup>W13L</sup>]]> 鸡冠花(Celosia cristata) SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:14
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1构建表达CYP76AD1-α分支蛋白的重组菌株
本发明以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK2-1C为出发菌株，利用酿酒酵母自组装技术，将紫茉莉(Mirabilis jalapa)来源的多巴双加氧酶MjDODA和环多巴5-O-葡糖基转移酶MjcDOPA5GT的基因表达盒整合在出发菌株染色体1622b位点上，得到底盘菌株BTN1。
利用同样的方式，将甜菜(Beta vulgaris)来源的BvCYP76AD1W13L和拟南芥来源的(Arabidopsis thaliana)还原酶AtR1的基因表达盒整合到底盘菌株染色体308a位点上，得到对照菌株BTN2。
利用同样的方式，将藜麦(Chenopodium quinoa)来源的CqCYP76AD1和AtR1的基因表达盒整合到底盘菌株染色体308a位点上，得到重组菌株BTN3。
利用同样的方式，将非洲菊(Cleretum bellidiforme)来源的CbCYP76AD12和AtR1的基因表达盒整合到底盘菌株染色体308a位点上，得到重组菌株BTN4。
利用同样的方式，将鸡冠花(Celosia cristata)来源的CcCYP76AD4和AtR1的基因表达盒整合到底盘菌株染色体308a位点上，得到重组菌株BTN5。
利用同样的方式，将火龙果(Hylocereus undatus)来源的HuCYP76AD1-1和AtR1的基因表达盒整合到底盘菌株染色体308a位点上，得到重组菌株BTN6。
利用同样的方式，将仙人掌果(Opuntia ficus-indica)来源的OfCYP76AD8和AtR1的基因表达盒整合到底盘菌株染色体308a位点上，得到重组菌株BTN7。
利用同样的方式，将鸡冠花(Celosia cristata)来源的CcCYP76AD4W13L和AtR1的基因表达盒整合到底盘菌株染色体308a位点上，得到重组菌株BTN8。
利用同样的方式，将鸡冠花(Celosia cristata)来源的CcCYP76AD4W13L和MjcDOPA5GT的基因表达盒整合到BTN8菌株染色体delta位点上，得到重组菌株BTN9。
重组菌株BTN1～BTN9染色体整合基因表达模块的示意图见图1。
实施例2重组菌株利用L-酪氨酸合成甜菜苷
(1)一级种子。挑取新鲜活化的重组菌株BTN1～BTN9的单菌落，分别接种于对应的SC-HIS-TRP或SC-HIS-TRP-URA液体培养基中，30℃，250rpm，震荡过夜培养；
(2)二级种子。将一级种子转接于新鲜的含相同营养缺陷型的SC液体培养基中，初始OD为0.2，30℃，250rpm，震荡过夜培养；
(3)发酵。将二级种子接种到含相同营养缺陷型的酵母发酵培养基中，控制初始OD为0.1，添加500mg/L L-酪氨酸，30℃，250rpm，震荡发酵72h。发酵结束后，取发酵上清液进行检测分析。
重组菌株HPLC检测结果如图2所示，7种CYP76AD1-α分支蛋白均产生了与甜菜苷标品相同的色谱峰，表明这7种CYP76AD1-α分支蛋白均具有催化合成甜菜苷的能力。
重组菌株发酵上清液如图3所示，7种CYP76AD1-α分支蛋白均产生了同甜菜苷标品类似的紫红色发酵上清液，并且HuCYP76AD1-1、OfCYP76AD8和CcCYP76AD4W13L的颜色更加鲜艳。
重组菌株发酵上清液的吸收光谱图如图4所示，7种CYP76AD1-α分支蛋白发酵上清液的光谱扫描曲线与标准品类似，均在535nm处表现出最大光吸收。
甜菜苷的产量如表3所示，BvCYP76AD1W13L利用L-酪氨酸合成了0.52mg/L甜菜苷，相比之下，CqCYP76AD1和CbCYP76AD12的产量分别降低了12％和27％，而HuCYP76AD1-1、OfCYP76AD8和CcCYP76AD4W13L的产量分别比BvCYP76AD1W13L提高了4.92倍、9.88倍和11.46倍，表明HuCYP76AD1-1、OfCYP76AD8和CcCYP76AD4W13L在酵母体内利用L-酪氨酸合成甜菜苷的能力优于BvCYP76AD1W13L。在染色体多拷贝整合后，CcCYP76AD4W13L的产量比对照菌株提高了339.85倍。
表3不同CYP76AD1-α分支蛋白利用L-酪氨酸合成甜菜苷
Figure BDA0003764850260000071
Figure BDA0003764850260000081
实施例3重组菌株利用葡萄糖合成甜菜苷
(1)一级种子。挑取新鲜活化的重组菌株BTN9的单菌落，接种于SC-HIS-TRP-URA液体培养基中，30℃，250rpm，震荡过夜培养；
(2)二级种子。将一级种子转接于新鲜的含相同营养缺陷型的SC液体培养基中，初始OD为0.2，30℃，250rpm，震荡过夜培养；
(3)发酵。将二级种子接种到含相同营养缺陷型的酵母发酵培养基中，控制初始OD为0.1，20℃或25℃或30℃或35℃，250rpm，震荡发酵72h。发酵结束后，取发酵上清液进行检测分析。
菌株BTN9在20℃、25℃、30℃、35℃条件下发酵的甜菜苷产量分别为2.62mg/L、15.98mg/L、11.95mg/L、9.64mg/L，其中25℃下发酵分别比20℃、30℃、35℃下提高了510％、34％和66％，表明优化的发酵工艺提高了重组菌株利用葡萄糖合成甜菜苷的能力。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.CYP76AD1-α分支蛋白，其特征在于，包括：火龙果HuCYP76AD1-1、仙人掌果OfCYP76AD8和/或鸡冠花CcCYP76AD4W13L。
2.如权利要求1所述的CYP76AD1-α分支蛋白，其特征在于，
所述火龙果HuCYP76AD1-1具有：
(I)、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列；和
所述仙人掌果OfCYP76AD8具有：
(i)、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
(ii)、如(i)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(iii)、与如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列；
所述鸡冠花CcCYP76AD4W13L具有：
(A)、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或
(B)、如(A)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(A)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(C)、与如(A)或(B)所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
3.编码如权利要求1或2所述CYP76AD1-α分支蛋白的核酸分子，其特征在于，
编码所述HuCYP76AD1-1的核酸分子包括：
(I)、核酸分子如SEQ ID NO:12所示；或
(II)、与如SEQ ID NO:12所示的核酸分子的互补核酸分子；或
(III)、与(I)或(II)的核酸分子编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)或(II)的核酸分子不同的核酸分子；或
(IV)、与(I)、(II)或(III)所示的核酸分子经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核酸分子，且与(I)、(II)或(III)所示的核酸分子功能相同或相似的核酸分子；或
(V)、与(I)、(II)、(III)或(IV)所述核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核酸分子；
编码所述OfCYP76AD8的核酸分子包括：
(i)、核酸分子如SEQ ID NO:13所示；或
(ii)、与如SEQ ID NO:13所示的核酸分子的互补核酸分子；或
(iii)、与(i)或(ii)的核酸分子编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核酸分子不同的核酸分子；或
(iv)、与(i)、(ii)或(iii)所示的核酸分子经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核酸分子，且与(i)、(ii)或(iii)所示的核酸分子功能相同或相似的核酸分子；或
(v)、与(i)、(ii)、(iii)或(iv)所述核酸分子具有至少80％序列一致性的核酸分子；
编码所述CcCYP76AD4W13L的核酸分子包括：
(A)、核酸分子如SEQ ID NO:14所示；或
(B)、与如SEQ ID NO:14所示的核酸分子的互补核酸分子；或
(C)、与(A)或(B)的核酸分子编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(A)或(B)的核酸分子不同的核酸分子；或
(D)、与(A)、(B)或(C)所示的核酸分子经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核酸分子，且与(A)、(B)或(C)所示的核酸分子功能相同或相似的核酸分子；或
(E)、与(A)、(B)、(C)或(D)所述核酸分子具有至少80％序列一致性的核酸分子。
4.基因表达模块，其特征在于，包括权利要求3所述的核酸分子和如下(a)～(b)所述核酸分子：
(a)、编码紫茉莉MjDODA的核酸分子，核酸分子如SEQ ID NO:5所示；
(b)、编码紫茉莉MjcDOPA5GT的核酸分子，核酸分子如SEQ ID NO:6所示；
(c)、编码拟南芥AtR1的核酸分子，核酸分子如SEQ ID NO:7所示。
5.表达，其特征在于，包括：
染色体整合同源臂和权利要求3所述的核酸分子，
或染色体同源臂和权利要求4所述的基因表达模块。
6.重组菌株，转化权利要求3所述的核酸分子，和/或权利要求4所述的基因表达模块。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
8.权利要求3所述的核酸分子，和/或权利要求4所述的基因表达模块，和/或权利要求5所述的表达特征，和/或权利要求6或7所述的菌株在合成甜菜苷中的应用。
9.合成甜菜苷的方法，其特征在于，将权利要求6所述的重组菌株经培养、发酵，获得所述甜菜苷。
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