CN116790529A - P450 bm3蛋白突变体及其应用 - Google Patents

P450 bm3蛋白突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116790529A
CN116790529A CN202310601987.1A CN202310601987A CN116790529A CN 116790529 A CN116790529 A CN 116790529A CN 202310601987 A CN202310601987 A CN 202310601987A CN 116790529 A CN116790529 A CN 116790529A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide sequence
p450bm3
protein
sequence shown
iii
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310601987.1A
Other languages
English (en)
Inventor
罗云孜
刘振宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN202310601987.1A priority Critical patent/CN116790529A/zh
Publication of CN116790529A publication Critical patent/CN116790529A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
    • B01J31/18—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes containing nitrogen, phosphorus, arsenic or antimony as complexing atoms, e.g. in pyridine ligands, or in resonance therewith, e.g. in isocyanide ligands C=N-R or as complexed central atoms
    • B01J31/1805—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes containing nitrogen, phosphorus, arsenic or antimony as complexing atoms, e.g. in pyridine ligands, or in resonance therewith, e.g. in isocyanide ligands C=N-R or as complexed central atoms the ligands containing nitrogen
    • B01J31/181—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, comprising at least one complexing nitrogen atom as ring member, e.g. pyridine
    • B01J31/1825—Ligands comprising condensed ring systems, e.g. acridine, carbazole
    • B01J31/183—Ligands comprising condensed ring systems, e.g. acridine, carbazole with more than one complexing nitrogen atom, e.g. phenanthroline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2531/00—Additional information regarding catalytic systems classified in B01J31/00
    • B01J2531/70—Complexes comprising metals of Group VII (VIIB) as the central metal
    • B01J2531/72—Manganese
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及P450BM3蛋白突变体及其应用。本发明公开了两种P450BM3蛋白突变体，其中P450BM3‑mut1氨基酸序列具有13个突变位点，具体为K70A/L72G/G86A/L87G/F88A/W91A/E94A/W97A/I154A/F262A/F332A/I358A/R399A。P450BM3‑mut2氨基酸序列具有15个突变位点，具体为K70A/L72G/G86A/L87G/F88A/W91A/E94A/W97A/I154A/F332A/R399A/F108S/L234S/F262S/I358S。P450BM3蛋白突变体能够结合大框架卟啉，在酶催化方面应用前景良好。

Description

P450 BM3蛋白突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及P450 BM3蛋白突变体及其应用。
背景技术
酶分子的定向进化技术就是人为的创造特殊的进化条件，模拟天然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个人工突变酶库通过一定筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。与自然进化相比。酶分子的定向进化过程完全是在人为控制下进化的，使酶分子朝向人们期望的特定目标进行。近年来随着诸如易错PCR，DNA改组等技术的应用，在对目的基因表达有高效检测筛选体统的条件下，尽管尚不清楚酶分子的结构等特性，采用酶分子的定向策略能获得具有预期特性的新酶，实现酶分子的人为的快速进化。诸多的研究表明，在目前对酶分子认识还不成熟的情况下通过DNA水平上适当修饰来改变酶的氨基酸顺序，进而改变酶的性能是可能在重组生物中产生新的酶类，并获得比天然酶活力更高，稳定性和催化性能更好的进化酶，以满足研究和应用的需要。
P450酶系是广泛分布于动物，植物和微生物等不同的生物体内的一类代谢酶系，因其主要成分中P450蛋白与CO结合后，在450nm处有特征光吸收峰而得名。研究表明，它可以催化成千上万的化学反应，参与的主要反应有烷基的羟基化，烷基的环氧化，羟基的氧化。氨，氧，硫部位上脱烷基化，氨部位上羟基化和氧化，硫部位上的氧化，氧化性脱氨，脱氢和脱卤素，氧化性的C-C键断裂以及其它一些还原催化反应。有专著甚至指出它可能是自然界中最具有催化多样性的生物催化剂。由于该酶系的性质和功能以及在生命活动过程中的作用，P450酶系受到广大研究者的极度重视。P450酶系的作用的重要性已经成为当代生物学研究中一个值得注意的领域。国外的研究工作主要分布在该酶系在生物体系中的作用以及利用该酶系的催化作用大规模生产手性药物等方面。而在国内。虽然有大量关于该酶系的综述性和研究性的报道。但研究工作却只限于该酶系在生物机体中的作用。目前尚未见有该酶系的催化作用制备手性药物的报道。有学者指出，主要原因是国内目前尚未能获得适量的酶。
在P450酶系中，P450BM-3是从巨大芽孢杆菌中发现的具有脂肪酸羟基化活性的酶，现在已作为哺乳动物微粒体p450单加氧酶重要的模型。
P450BM-3是一种可溶解的单加氧酶，分子量117,641Da，不像其它P450酶催化需要额外的蛋白，P450BM-3在NADPH和O2的存在下，它具有快速催化链长为C12～C18的饱和脂肪酸的加单氧酶活性。
细胞色素P450 BM3是一种原核生物细胞色素P450酶，其中，血红素(铁原卟啉)在P450 BM3蛋白发挥功能时扮演重要角色。近年来，研究者利用多种方法对含有血红素蛋白的辅因子进行替换，生成人工金属卟啉蛋白，用于催化高价值反应。目前能够实现将血红蛋白的铁原卟啉替换为其他金属原卟啉或具有类似大小的金属卟啉框架，但无法高效实现大卟啉框架的替换，限制了人工金属卟啉蛋白的发展与应用。
目前尚未找到能够结合大框架卟啉的P450 BM3蛋白突变体。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了P450 BM3蛋白突变体及其应用。本发明提供了两种P450BM3蛋白突变体，分别为P450 BM3-mut1和P450 BM3-mut2。本发明通过实验发现两种P450BM3蛋白突变体能够结合大框架卟啉。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了P450 BM3蛋白突变体，其包括P450 BM3-mut1和/或P450BM3-mut2；
所述P450 BM3-mut1包括以下任意一个或多个位点突变：
K70A；和/或
L72G；和/或
G86A；和/或
L87G；和/或
F88A；和/或
W91A；和/或
E94A；和/或
W97A；和/或
I154A；和/或
F262A；和/或
F332A；和/或
I358A；和/或
R399A；
所述P450 BM3-mut2包括以下任意一个或多个位点突变：
K70A；和/或
L72G；和/或
G86A；和/或
L87G；和/或
F88A；和/或
W91A；和/或
E94A；和/或
W97A；和/或
I154A；和/或
F332A；和/或
R399A；和/或
F108S；和/或
L234S；和/或
F262S；和/或
I358S。
本发明还提供了编码所述P450 BM3蛋白突变体的核酸分子，
编码所述P450 BM3-mut1的核酸分子具有：
(I)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
(II)、与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(IV)、与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
编码所述P450 BM3-mut2的核酸分子具有：
(I)、如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或
(II)、与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(IV)、与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了重组载体，其包括所述核酸分子及骨架载体。
本发明还提供了宿主，其包括所述重组载体。
本发明还提供了引物组，所述引物组具有：
(I)如SEQ ID No:2n-1所示核苷酸序列的上游引物；和
如SEQ ID No:2n所示核苷酸序列的下游引物；或
(II)、具有与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(III)、具有与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(IV)、具有与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；
所述n包括3～11之间的任意整数。
本发明还提供了以下任意项在制备P450 BM3蛋白突变体中的应用：
(I)、所述核酸分子；和/或
(II)、所述重组载体；和/或
(III)、所述宿主；和/或
(IV)、所述引物组。
本发明还提供了所述P450 BM3蛋白突变体的制备方法，其包括，基于以下任意项制得P450 BM3蛋白突变体：
(I)、所述核酸分子；和/或
(II)、所述重组载体；和/或
(III)、所述宿主；和/或
(IV)、所述引物组。
本发明还提供了以下任意项在制备金属卟啉蛋白和/或人工酶中的应用：
(I)、所述P450 BM3蛋白突变体；和/或
(II)、所述核酸分子；和/或
(III)、所述重组载体；和/或
(IV)、所述宿主；和/或
(V)、所述引物组；和/或
(VI)、所述制备方法制得的P450 BM3蛋白突变体。
所述金属卟啉蛋白和/或人工酶包括所述P450 BM3蛋白突变体和金属卟啉；所述金属卟啉包括四苯基卟啉氯化锰(III)和/或5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(III)。
本发明还提供了金属卟啉蛋白和/或人工酶，所述金属卟啉蛋白和/或人工酶包括以下任意项以及金属卟啉：
(I)、所述P450 BM3蛋白突变体；和/或
(II)、所述核酸分子；和/或
(III)、所述重组载体；和/或
(IV)、所述宿主；和/或
(V)、所述引物组；和/或
(VI)、所述制备方法制得的P450 BM3蛋白突变体。
本发明所述金属卟啉蛋白和/或人工酶包括但不限于在其基础上经添加，减少或替换支链，离子等而产生的结构，所述结构的聚合体，异构体，螯合物等不同形式，以及上述任意结构或形式的混合物。
本发明还提供了所述的金属卟啉蛋白和/或人工酶在酶催化中的应用。
本发明包括且不限于取得如下有益效果：
本发明制得的P450 BM3蛋白突变体P450 BM3-mut1或P450 BM3-mut2，失去了对血红素(铁原卟啉)的结合能力，能够结合大框架卟啉，在酶催化方面应用前景良好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示P450 BM3-mut1蛋白突变体能够结合四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)和P450BM3-mut1蛋白突变体不能结合血红素的光谱表征图；
图2示P450 BM3-mut2蛋白质突变体结合5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)和P450 BM3-mut2蛋白质突变体不能结合血红素的光谱表征图。
具体实施方式
本发明公开了一种P450 BM3蛋白突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了两种P450 BM3蛋白突变体，其氨基酸序列如表1所示，其核酸序列如表2所示：
表1P450 BM3蛋白突变体氨基酸序列
表2P450 BM3蛋白突变体核酸序列
如无特殊说明，本发明提供的P450 BM3蛋白突变体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
制备例1P450 BM3蛋白突变体表达菌株的构建及菌体制备
本发明合成了P450 BM3基因，利用蛋白可视化软件进行突变位点分析，P450 BM3-mut1选择了12个突变位点，P450 BM3-mut2选择了14个突变位点。以大肠杆菌密码子优化的野生型P450 BM3基因为模板，利用定点突变技术引入突变。P450 BM3-mut2以P450 BM3-mut1基因为模板，利用定点突变技术引入突变。
1、P450 BM3-mut1蛋白突变体表达质粒的构建
(1)P450 BM3-mut1引物设计如表3所示：
表3P450 BM3-mut1引物设计
进行PCR扩增，引物组合如下：
片段1(长度为232bp)：BM3-1-for与BM3-1-rev；
片段2(长度为357bp)：BM3-2-for与BM3-2-rev；
片段3(长度为256bp)：BM3-3-for与BM3-3-rev；
片段4(长度为98bp)：BM3-4-for与BM3-4-rev；
片段5(长度为149bp)：BM3-5-for与BM3-5-rev；
片段6(长度为7528bp)：pET28-BM3-for与pET28-BM3-rev。
PCR扩增条件如下：
片段1、片段2、片段3、片段4、片段5：先95℃预变性10min，然后98℃30s，60℃15s，72℃15s，共25个循环；最后72℃延伸5min。
片段6：先95℃预变性10min，然后98℃30s，58℃15s，72℃4min30s，共25个循环；最后72℃延伸5min。
在PCR结束后加入10U DpnⅠ，37℃消化模板2h。
胶回收上述PCR产物，获得相应大小的片段。测量各片段浓度，Gibson Assembly时按照载体PET28a：片段＝1:10的摩尔比添加各片段量。50℃反应1h。
(2)GibsonAssembly结束后，将其转入DH5а中，冰上放置30min，42℃热激1min，再次放于冰上3min，加入900μL复苏液，37℃复苏1h，涂布到含卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。
(3)挑取平板上的单克隆过夜培养提取质粒，测序验证，得到正确的P450BM3-mut1蛋白突变体表达质粒。
2、P450 BM3-mut2蛋白突变体表达质粒的构建
(1)P450 BM3-mut2引物设计如表4所示：
表4P450 BM3-mut2引物设计
进行PCR扩增，引物组合如下：
片段1(长度为8449bp)：BM3-F108S-for与BM3-F108S-rev；
片段2(长度为8449bp)：BM3-F262S-L234S-for与BM3-F262S-L234S-rev；
片段3(长度为8449bp)：BM3-I358S-for与BM3-I358S-rev。
PCR扩增条件如下：
A：片段1：先95℃预变性10min，然后98℃30s，60℃15s，72℃4min30s，共25个循环；最后72℃延伸5min。
B：片段1PCR结束后加入10U DpnⅠ，37℃消化模板2h。
C：胶回收上述PCR产物，获得相应大小的片段。测量片段浓度，将其转入DH5а中，冰上放置30min，42℃热激1min，再次放于冰上3min，加入900μL复苏液，37℃复苏1h，涂布到含卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。
D：挑取平板上的单克隆过夜培养提取质粒，进行测序验证，得到含有片段1突变位点的突变体。
E：在D中获得的正确质粒上继续用片段2引物进行扩增，重复A～D步骤。
F：在E中获得的正确质粒上继续用片段3引物进行扩增，重复B～D步骤，得到正确的P450 BM3-mut2蛋白突变体表达质粒。
3、大肠杆菌表达P450 BM3蛋白突变体的菌体制备
(1)将P450 BM3-mut1蛋白突变体表达质粒或P450 BM3-mut2蛋白突变体表达质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)将上述菌株接至4mL LB培养基(50μg/mL卡那抗生素)过夜培养。
(3)转接到1L的LB培养基(50μg/mL卡那抗生素)，养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG，18℃，220rpm过夜诱导表达，得到表达P450BM3-mut1蛋白突变体的菌体或表达P450 BM3-mut2蛋白突变体的菌体。制备例2构建含有大框架卟啉的P450 BM3蛋白突变体
收集制备例1得到的过夜诱导表达P450 BM3-mut1蛋白突变体的菌体或表达P450BM3-mut2蛋白突变体的菌体，用30mLpH＝7.5细胞悬浮液重悬菌体，将1mL四苯基卟啉氯化锰(III)加至30mL P450 BM3-mut1蛋白突变体细胞悬浮液中或将1mL 5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(III)卟啉溶液加至30mL P450 BM3-mut2蛋白突变体细胞悬浮液中(大框架卟啉溶于DMF中，浓度为5mg/mL)，然后利用超声破碎仪(Biosafer900-92)进行超声破碎，6号变幅杆，45％功率，3s开，6s关，破碎30min。破碎结束后，置于4℃孵育30min。之后高速离心12000rpm 60min收集上清，与镍胶孵育后利用低浓度咪唑(40mmol/L咪唑)的Tris-HCl缓冲液洗脱杂蛋白后再用带500mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液收集结合大框架卟啉的突变体蛋白。Tris-HCl缓冲液：50mmol/L Tris，200mmol/L氯化钠，1mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)，10％(v/v)甘油，pH为7.5～8.0。
将洗脱得到的结合大框架卟啉的突变体蛋白透析至缓冲液100mmol/LKPi，pH为7.5～8.0。
制备例3构建含有大框架卟啉的P450 BM3蛋白突变体
收集制备例1得到的过夜诱导表达P450 BM3-mut1蛋白突变体的菌体或表达P450BM3-mut2蛋白突变体的菌体，用30mLpH＝7.5细胞悬浮液重悬菌体，利用高压均质仪进行破碎，850bar，5min。破碎结束后，将1mL四苯基卟啉氯化锰(III)加至30mLP450 BM3-mut1蛋白突变体破碎液中或将1mL5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(III)卟啉溶液加至30mLP450 BM3-mut2蛋白突变体破碎液中(大框架卟啉溶于DMF中，浓度为5mg/mL)，置于4℃孵育30min。之后高速离心12000rpm 60min收集上清，与镍胶孵育后利用低浓度咪唑(40mmol/L咪唑)的Tris-HCl缓冲液洗脱杂蛋白后再用带500mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液收集结合大框架卟啉的突变体蛋白。Tris-HCl缓冲液：50mmol/L Tris，200mmol/L氯化钠，1mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)，10％(v/v)甘油，pH为7.5～8.0。
将洗脱得到的结合大框架卟啉的突变体蛋白透析至缓冲液100mmol/LKPi，pH为7.5～8.0。
制备例4构建含有大框架卟啉的P450 BM3蛋白突变体
收集制备例1得到的过夜诱导表达P450 BM3-mut1蛋白突变体的菌体或表达P450BM3-mut2蛋白突变体的菌体，用30mLpH＝7.5细胞悬浮液重悬菌体，利用高压均质仪进行破碎，850bar，5min。破碎结束后，高速离心12000rpm 60min收集上清，与镍胶孵育后利用低浓度咪唑(40mmol/L咪唑)的Tris-HCl缓冲液洗脱杂蛋白后再用30mL 500mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液收集突变体蛋白。将1mL四苯基卟啉氯化锰(III)加入30mL P450 BM3-mut1蛋白突变体洗脱液或将1mL 5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(III)加入30mL P450 BM3-mut2蛋白突变体洗脱液中(大框架卟啉溶于DMF中，浓度为5mg/mL)，置于4℃孵育30min，重复上述纯化步骤。Tris-HCl缓冲液：50mmol/L Tris，200mmol/L氯化钠，1mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)，10％(v/v)甘油，pH为7.5～8.0。
将洗脱得到的结合大框架的突变体蛋白透析至缓冲液100mmol/L KPi，pH为7.5～8.0。
效果例结合大框架卟啉的突变体蛋白的光谱测定
分别取100μL制备2得到的结合大框架卟啉的突变体蛋白、制备例3得到的结合大框架卟啉的突变体蛋白和制备例4得到的结合大框架卟啉的突变体蛋白进行光谱的测定(蛋白量约为500μg)，测定时采用酶标仪进行，测定范围为300～500nm，步长为1nm。
实验结果如图1、图2和表5所示：
表5光谱表征结果
/>
/>
/>
/>
本发明的实验证明，利用酶标仪进行光谱测定，由于肌红蛋白结合血红素时会在450nm处出现最高吸收，而P450 BM3-mut1和P450 BM3-mut2突变体在450nm处无吸收，故失去结合血红素的能力。当在P450 BM3-mut1加入四苯基卟啉氯化锰(III)或在P450 BM3-mut2突变体中加入5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(III)卟啉时，突变体在特定的位置出现相应吸收峰(表5)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.P450BM3蛋白突变体，其特征在于，其包括P450BM3-mut1和/或P450BM3-mut2；
所述P450BM3-mut1包括以下任意一个或多个位点突变：
K70A；和/或
L72G；和/或
G86A；和/或
L87G；和/或
F88A；和/或
W91A；和/或
E94A；和/或
W97A；和/或
I154A；和/或
F262A；和/或
F332A；和/或
I358A；和/或
R399A；
所述P450BM3-mut2包括以下任意一个或多个位点突变：
K70A；和/或
L72G；和/或
G86A；和/或
L87G；和/或
F88A；和/或
W91A；和/或
E94A；和/或
W97A；和/或
I154A；和/或
F332A；和/或
R399A；和/或
F108S；和/或
L234S；和/或
F262S；和/或
I358S。
2.编码如权利要求1所述P450BM3蛋白突变体的核酸分子，其特征在于，
编码所述P450BM3-mut1的核酸分子具有：
(I)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
(II)、与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(IV)、与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
编码所述P450BM3-mut2的核酸分子具有：
(I)、如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或
(II)、与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(IV)、与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
3.重组载体，其特征在于，其包括如权利要求2所述核酸分子及骨架载体。
4.宿主，其特征在于，其包括如权利要求3所述重组载体。
5.引物组，其特征在于，所述引物组具有：
(I)如SEQ ID No:2n-1所示核苷酸序列的上游引物；和
如SEQ ID No:2n所示核苷酸序列的下游引物；或
(II)、具有与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(III)、具有与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(IV)、具有与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；
所述n包括3～11之间的任意整数。
6.以下任意项在制备P450BM3蛋白突变体中的应用：
(I)、如权利要求2所述的核酸分子；和/或
(II)、如权利要求3所述的重组载体；和/或
(III)、如权利要求4所述的宿主；和/或
(IV)、如权利要求5所述的引物组。
7.如权利要求1所述P450BM3蛋白突变体的制备方法，其特征在于，其包括，基于以下任意项制得P450BM3蛋白突变体：
(I)、如权利要求2所述的核酸分子；和/或
(II)、如权利要求3所述的重组载体；和/或
(III)、如权利要求4所述的宿主；和/或
(IV)、如权利要求5所述的引物组。
8.以下任意项在制备金属卟啉蛋白和/或人工酶中的应用：
(I)、如权利要求1所述的P450BM3蛋白突变体；和/或
(II)、如权利要求2所述的核酸分子；和/或
(III)、如权利要求3所述的重组载体；和/或
(IV)、如权利要求4所述的宿主；和/或
(V)、如权利要求5所述的引物组；和/或
(VI)、如权利要求7所述制备方法制得的P450BM3蛋白突变体。
9.金属卟啉蛋白和/或人工酶，其特征在于，所述金属卟啉蛋白和/或人工酶包括以下任意项以及金属卟啉：
(I)、如权利要求1所述的P450BM3蛋白突变体；和/或
(II)、如权利要求2所述的核酸分子；和/或
(III)、如权利要求3所述的重组载体；和/或
(IV)、如权利要求4所述的宿主；和/或
(V)、如权利要求5所述的引物组；和/或
(VI)、如权利要求7所述制备方法制得的P450BM3蛋白突变体。
10.如权利要求9所述的金属卟啉蛋白和/或人工酶在酶催化中的应用。
CN202310601987.1A 2023-05-24 2023-05-24 P450 bm3蛋白突变体及其应用 Pending CN116790529A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310601987.1A CN116790529A (zh) 2023-05-24 2023-05-24 P450 bm3蛋白突变体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310601987.1A CN116790529A (zh) 2023-05-24 2023-05-24 P450 bm3蛋白突变体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116790529A true CN116790529A (zh) 2023-09-22

Family

ID=88038951

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310601987.1A Pending CN116790529A (zh) 2023-05-24 2023-05-24 P450 bm3蛋白突变体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116790529A (zh)

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1376194A (zh) * 1999-07-27 2002-10-23 Basf公司 酶的电子供体系统及其在底物生物化学转化中的用途
US20030119145A1 (en) * 2001-10-12 2003-06-26 Mark Donnelly Production of a highly active, soluble form of the cytochrome P450 reductase (CPR A) from Candida tropicalis
CN1934261A (zh) * 2004-02-23 2007-03-21 Isis创新有限公司 过氧化氢驱动的氧化反应
WO2008115844A2 (en) * 2007-03-16 2008-09-25 The California Institute Of Technology Stable, functional chimeric cytochrome p450 holoenzymes
WO2012028709A2 (en) * 2010-09-03 2012-03-08 B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network Ag Novel monooxygenase variants
CN105378486A (zh) * 2013-06-14 2016-03-02 Reg生命科学有限责任公司 生产omega-羟基化的脂肪酸衍生物的方法
CN112359027A (zh) * 2021-01-13 2021-02-12 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 细胞色素p450酶突变体及其应用
CN113528472A (zh) * 2021-06-28 2021-10-22 湖北大学 一种细胞色素p450 bm3突变体及其在醋酸群勃龙合成中的应用
CN114507648A (zh) * 2022-03-23 2022-05-17 山东大学 一类p450酶突变体及其应用
CN114621934A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种p450还原酶及其应用
CN114672470A (zh) * 2022-04-11 2022-06-28 湖北中农华威生物工程有限公司 一种细胞色素p450 bm3突变酶及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用
CN116042548A (zh) * 2022-07-26 2023-05-02 天津大学佐治亚理工深圳学院 CYP76AD1-α分支蛋白及其在甜菜苷生物合成中的应用
CN116790395A (zh) * 2023-06-28 2023-09-22 江南大学 一种合成高活性血红素类蛋白毕赤酵母底盘菌株的构建及应用
CN117105745A (zh) * 2023-08-25 2023-11-24 北京理工大学 一种单萜环丙烷化衍生物及其制备方法
CN117106738A (zh) * 2023-08-28 2023-11-24 北京理工大学 一种可容纳非天然金属卟啉的细胞色素突变体、人工金属酶及应用

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1376194A (zh) * 1999-07-27 2002-10-23 Basf公司 酶的电子供体系统及其在底物生物化学转化中的用途
US20030119145A1 (en) * 2001-10-12 2003-06-26 Mark Donnelly Production of a highly active, soluble form of the cytochrome P450 reductase (CPR A) from Candida tropicalis
CN1934261A (zh) * 2004-02-23 2007-03-21 Isis创新有限公司 过氧化氢驱动的氧化反应
WO2008115844A2 (en) * 2007-03-16 2008-09-25 The California Institute Of Technology Stable, functional chimeric cytochrome p450 holoenzymes
WO2012028709A2 (en) * 2010-09-03 2012-03-08 B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network Ag Novel monooxygenase variants
CN105378486A (zh) * 2013-06-14 2016-03-02 Reg生命科学有限责任公司 生产omega-羟基化的脂肪酸衍生物的方法
CN114621934A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种p450还原酶及其应用
CN112359027A (zh) * 2021-01-13 2021-02-12 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 细胞色素p450酶突变体及其应用
CN113528472A (zh) * 2021-06-28 2021-10-22 湖北大学 一种细胞色素p450 bm3突变体及其在醋酸群勃龙合成中的应用
CN114507648A (zh) * 2022-03-23 2022-05-17 山东大学 一类p450酶突变体及其应用
CN114672470A (zh) * 2022-04-11 2022-06-28 湖北中农华威生物工程有限公司 一种细胞色素p450 bm3突变酶及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用
CN116042548A (zh) * 2022-07-26 2023-05-02 天津大学佐治亚理工深圳学院 CYP76AD1-α分支蛋白及其在甜菜苷生物合成中的应用
CN116790395A (zh) * 2023-06-28 2023-09-22 江南大学 一种合成高活性血红素类蛋白毕赤酵母底盘菌株的构建及应用
CN117105745A (zh) * 2023-08-25 2023-11-24 北京理工大学 一种单萜环丙烷化衍生物及其制备方法
CN117106738A (zh) * 2023-08-28 2023-11-24 北京理工大学 一种可容纳非天然金属卟啉的细胞色素突变体、人工金属酶及应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEIYAN YUAN等: "Synthesis of Trifluoromethylated Monoterpenes by an Engineered Cytochrome P450", CHEMISTRY, pages 1 - 12 *
M. GORDON JOYCE等: "A Single Mutation in Cytochrome P450 BM3 Induces the Conformational Rearrangement Seen upon Substrate Binding in the Wild-type Enzyme", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 292, no. 22, pages 23287 *
朱晨杰;付静雯;谭卓涛;应汉杰;: "天然烟酰胺辅因子再生体系及其人工类似物研究进展", 化工学报, no. 01, pages 267 - 279 *
王璇等: "松材线虫CYP450基因与松树蒎烯类物质代谢的相关性", 林业科学, vol. 53, no. 6, pages 105 - 110 *
白发红等: "金属卟啉在催化反应中的应用", 化工科技, vol. 27, no. 4, pages 55 - 64 *
蒋媛媛;李盛英;: "细胞色素P450酶在生物合成及有机合成中的催化功能及其应用", 有机化学, no. 09, pages 137 - 153 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108424900B (zh) 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用
CN108048417B (zh) 酮还原酶突变体及其应用
CN112210524B (zh) 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用
CN110573605B (zh) 一种慢生根瘤菌单加氧酶及其在制备手性亚砜中的应用
CN113151230B (zh) 一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用
CN112662638B (zh) 一种r-选择性苯乙烯单加氧酶的功能
CN113817703B (zh) 转氨酶突变体及其应用
Swain et al. Nitrogen fixation and its improvement through genetic engineering
CN108239618A (zh) 共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌及其应用
Nagy et al. Application of gene-shuffling for the rapid generation of novel [FeFe]-hydrogenase libraries
CN112877307B (zh) 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用
CN107686850A (zh) 一种利用共表达重组菌株转化生产α‑酮戊二酸的方法
CN111518783B (zh) 重组(R)-ω-转氨酶、突变体及其在制备西他列汀中的应用
English et al. Recombinant and in vitro expression systems for hydrogenases: new frontiers in basic and applied studies for biological and synthetic H 2 production
CN107794273A (zh) 一种合成dl‑丙氨酸的三基因共表达载体及应用
CN112746067B (zh) 用于制备d-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体
CN116790529A (zh) P450 bm3蛋白突变体及其应用
JP7498244B2 (ja) モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその使用
CN114214293B (zh) 一种恶臭假单胞菌细胞色素p450环氧酶突变体及其应用
CN113151131B (zh) 一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基及其应用
CN113430184B (zh) 转氨酶及其在制备西他列汀中的应用
CN112266905B (zh) 一种多肽修饰氨基酸脱氢酶及其制备和固定化方法
CN108277216A (zh) 高活性s-氰醇裂解酶及其应用
CN112760298A (zh) 一种细胞色素p450bm3氧化酶突变体及其制备方法和应用
CN112322597A (zh) 一种羰基还原酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination