CN114774447B - 提高解脂耶氏酵母耐热性的方法及用于发酵合成甘露醇 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高解脂耶氏酵母耐热性的方法及用于发酵合成甘露醇。甘露醇为一种六元醇，具有重要的应用价值，即能作为药品也能作为食品，还能作为其它精细化工的原料。目前甘露醇的商业化生产方法主要为植物提取法以及化学合成法，生产成本较高，其中化学合成法不仅步骤工艺繁多，还具有较大的危险性(需要高温高压以及易燃易爆的氢气)。本发明通过对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)进行各种突变的改造，获得能耐受中温发酵(34‑38℃)的突变菌株，并提供使用该新菌株直接发酵葡萄糖等碳源合成甘露醇的方法，以及从发酵液中提取甘露醇的方法。
Description
技术领域
本发明专利属于食品或医药领域，涉及采用食品安全微生物(解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica)发酵葡萄糖等碳源，直接合成甘露醇，取代采用植物提取法或化学合成法制造甘露醇的方法，具体涉及一种提高解脂耶氏酵母耐热性的方法及用于发酵合成甘露醇。
背景技术
甘露醇(D-mannitol)是自然界天然存在的最广泛的一种多元醇，具有6个羟基，是山梨醇的2位羟基的同分异构体，分子量为182.19克/摩尔，是一种白色针状结晶体，熔点168摄氏度。甘露醇的饱和度低，在25℃下每100毫升水只能溶解21.6克，因此甘露醇容易从水溶液中结晶。甘露醇已经在食品、药品以及精细化工领域得到广泛的应用，如医药中作为利尿剂、高渗透降压药，还能诱导人多种癌细胞株细胞凋亡，在辅助治疗胰腺癌具有一定的作用(发明名称：甘露醇在制备抗胰腺癌药物中的应用，专利号：ZL201210590592.8)。早在1972年即被美国FDA批准为药物。甘露醇具有低热量同时具有一定的甜味的特性(甜度约为蔗糖的50％)，应用于各类食品中。甘露醇具有不吸湿的特性，还应用于食品或者饲料填充剂。国际市场每年有15-20万吨的甘露醇应用于医药、食品等领域。正是由于甘露醇具有重要的应用价值，研究开发高效率且经济可行的甘露醇合成方式具有重要的意义。
目前常见的甘露醇合成方法包括：
(1)提取法：从褐藻(如海带)中采用水提法提取甘露醇。将褐藻粉碎用热水提取，过滤、浓缩得到甘露醇粗结晶，再溶解、脱色、浓缩、二次结晶得到甘露醇。缺点是成本较高。
(2)化学合成法：目前甘露醇的主要生产方法为化学合成法，包括酶异构、化学异构、化学加氢、色谱分离、结晶过程。首先葡萄糖经过酶异构成为葡萄糖与果糖的混合物，再化学异构将部分葡萄糖异构为D-甘露糖。经过酶异构与化学异构得到含葡萄糖、 D-甘露糖与果糖的混合物，再化学高温高压加氢，葡萄糖得到山梨醇，果糖中的β-果糖转化为甘露醇，α-果糖得到山梨醇，甘露糖转化为甘露醇，因此加氢后得到含甘露醇与山梨醇的混合物(约40:60的比例含量)，由于甘露醇的溶解度比较低，先将部分甘露醇结晶出来，不能在结晶的甘露醇与山梨醇混合物再经过色谱分离分别得到甘露醇与山梨醇，再分别浓缩结晶。整个步骤比较复杂，而且具有一定的危险性(需要制备氢气，再高温高压下完成加氢)，而且色谱分离设备投入大，加氢过程还需要使用金属催化剂 (如镭镍催化剂等金属催化剂，Raney nickel)，在后续纯化过程中需要去除，增加了成本。催化剂的残留也是影响甘露醇品质的重要因素之一。酶法-化学法由葡萄糖合成甘露醇的过程详见说明书附图1。
基于植物提取法以及化学合成法的缺点，学术企业界迫切需要研究开发生物发酵合成甘露醇的方法。近十来年也取得了较大的进展。
由于甘露醇常用于食品添加剂，生产过程需要符合食品安全要求，其中包括使用的发酵合成的菌种也需要符合食品安全的要求。虽然有很多微生物能发酵合成甘露醇，但有的微生物尚不具备食品安全微生物的要求，未经过食品安全认证。如有的利用近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)发酵葡萄糖等碳源合成甘露醇(如发明专利CN201310081411.3，一株产甘露醇的菌株及用该菌株发酵生产甘露醇的方法)。有的利用短乳杆菌(Lactobacillus brevis)厌氧发酵含果糖的原料生成甘露醇(如中国发明专利201410161602.5，一株产甘露醇的短乳杆菌菌株及其生产甘露醇的方法)，有的利用明串珠菌(Leuconostoc sp.)厌氧发酵果糖合成甘露醇(如中国发明专利201711191671.0，高产甘露醇的柠檬明串珠菌HM1菌株及其发酵制备甘露醇的方法)。虽然乳杆菌或明串珠菌属于食品安全微生物，但是发酵原料为果糖，果糖相比葡萄糖其价值要高出很多，如结晶果糖需要12000元1000公斤，而葡萄糖仅需要3000元1000 公斤。而且乳杆菌生长慢，发酵时间长，果糖浓度低，如需要厌氧发酵一周以上，不耐受高糖果糖，也不能耐受中高温，如在高于200克/升果糖中则受到生长抑制，发酵一般在25-28度进行，这些因素决定了利用乳杆菌发酵合成甘露醇难以具备实际应用价值，因此尚未见发酵法合成甘露醇的工业化生产的成功例子。
而解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica或Candida lipolytica)是一种公认的食品安全微生物(Yarrowia lipolytica:Safety assessment of an oleaginous yeastwith a great industrial potential，Crit Rev Microbiol,2014,40(3):187– 206)，能作为多种天然化合物的合成底盘或者宿主，近年来受到学术界的密切关注(Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica:Past,present andfuture，Biotechnology Advances,2015,33:1522–1546)。解脂耶氏酵母也是合成赤藓糖醇的优秀底盘(Yarrowia lipolytica as an emerging biotechnologicalchassis forfunctional sugars biosynthesis.Critical Reviews in Food Science andNutrition,2021,61(4),535-552)，同时也能合成少量的甘露醇与阿拉伯糖醇，作为赤藓糖醇合成过程中的副产物(Highly efficient erythritol recovery from wasteerythritol mother liquid by yeast-mediated biopurification.Journal ofAgricultural Food and Chemistry,2017,65:11020-11028)。如Tomaszewska等在2012年就报道了采用解脂耶氏酵母(如Yarrowia lipolytica A-15strain or Wratislavia K1)发酵葡萄糖合成赤藓糖醇，在分批或者补料发酵条件下除了得到主产物赤藓糖醇外，还得到少量的甘露醇与阿拉伯糖醇(Production of erythritol and mannitol by Yarrowialipolytica yeast in media containing glycerol，J Ind MicrobiolBiotechnol.2012,39:1333– 1343)。
虽然解脂耶氏酵母具备天然合成甘露醇的能力，但是由于主要的产物是赤藓糖醇，甘露醇的产量只占少部分(如有的不足赤藓糖醇的十分之一)。虽然通过改变发酵条件如添加表面活性剂，增加细胞的通透性(Enhanced production of erythritol andmannitol by Yarrowia lipolytica in media containing surfactants,Braz.J.ofMicrobiol.2016,47:417–423)，甘露醇的含量有所提高，但赤藓糖醇仍然是主要产物，甘露醇的含量仍然远不及赤藓糖醇的含量，若要将甘露醇提取出来，就需要通过色谱分离，这将大幅提高分离成本，增加生产成本，并不具备实际应用的价值。但是本发明可以利用解脂耶氏酵母具备天然合成甘露醇的特性，对其进行基因工程的改良，使其能显著降低赤藓糖醇的合成能力，甚至完全抑制赤藓糖醇的合成，大幅提高合成甘露醇的能力，通过简单的分离步骤即能将甘露醇分离纯化出来，从而具备实际应用的潜力。
解脂耶氏酵母的生长与发酵生产温度在28-30°范围内，对中高温很敏感。目前也很少研究提高其热耐受性。上海交通大学程海荣研究小组对不合成甘露醇的解脂耶氏酵母进行了代谢工程的改良，将来自酿酒酵母的一种热激蛋白基因在合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母中进行过表达，使得能在34度生长。虽然能够在34度中温下生长，但是在34度发酵合成产物(生产赤藓糖醇)的能力显著降低(Metabolic engineering of Yarrowia lipolyticafor thermoresistance and enhanced erythritol productivity.Biotechnology forBiofuels,2020,13:176)。因此为了更好的提高其在中高温下的耐受性，尤其是提高在中高温下如在35度及以上合成产物的能力，仍然需要进一步研究，以达到即能耐受中高温，又能保持良好合成产物的性能。
本发明进一步通过基因工程的方法或者ARTP诱变的方法提高解脂耶氏酵母的热耐受性，通过提高发酵温度，降低由葡萄糖、果糖、甘油等碳源合成赤藓糖醇的代谢流量，提高合成甘露醇的代谢流量，从而实现由解脂耶氏酵母直接发酵高效合成甘露醇的目的。发酵结束后，菌液分离，澄清发酵液脱色、离子交换、浓缩、结晶干燥得到甘露醇结晶体，不需要再经过移动模拟色谱分离，从而大幅减低了生产成本，减少了整个操作步骤，具有实际应用的价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的生产甘露醇方法的不足之处，提供一种提高解脂耶氏酵母耐热性的方法及用于发酵合成甘露醇。
本发明通过基因工程的方法，包括利用解脂耶氏酵母本身的热休克蛋白基因以及外源基因随机整合到基因组，或者采用ARTP诱变随机突变的手段，对解脂耶氏酵母基因组进行分子操作，将原有的合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母进行改良，获得的工程菌株进行发酵葡萄糖、甘油等碳源一步发酵合成甘露醇，再从发酵液中提取纯化得到甘露醇粉末性结晶体。更具体来说，是以合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母为合成底盘，该酵母底盘英文名为Yarrowia lipolytica，之前也称为Candida lipolytica，根据翻译不同，中文翻译名可以为：解脂耶氏酵母、解脂酵母、解脂亚罗威酵母、亚罗威解脂酵母、解脂耶罗维亚酵母、解脂假丝酵母、假丝解脂酵母等，这些解脂酵母的基因组中含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5序列中的一种或一种以上序列，并与SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5这些序列具有90％及以上同源性。基因组经测序含有SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5序列的一种或一种以上且具有90％或以上同源性的酵母菌株均属于本发明使用的底盘微生物的保护范围。对这些酵母菌底盘进行分子操作如诱变，改变其基因组(如获得新的基因突变)，获得热耐受性的工程菌株，并进行优选，获得一株典型的Yarrowia lipolytica CGMCCNo.24239菌株，能够由葡萄糖直接发酵合成甘露醇。本发明还提供采用工程菌株由葡萄糖等碳源发酵合成与纯化甘露醇的方法。
本发明的目的是通过以下方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种提高解脂耶氏酵母热耐受性的方法，包括在解脂耶氏酵母中提高热激蛋白基因或热激蛋白基因调控因子的表达；或对解脂耶氏酵母进行诱变，获得热耐受性。
作为本发明的一个实施方案，所述热激蛋白基因选自内源性或外源性热激蛋白基因。
作为本发明的一个实施方案，所述内源性热激蛋白基因包括ylhsp12、ylhsp72、ylhsp75、ylhsp90或ylhsp104；所述外源性热激蛋白基因包括Schsp90、Blhsp90。
作为本发明的一个实施方案，所述热激蛋白基因调控因子包括内源性或外源性热激蛋白基因调控因子。
作为本发明的一个实施方案，所述内源性热激蛋白基因调控因子包括ylmsn5、yltps2、yltah1、ylhsf12或yltps1；所述外源性热激蛋白基因调控因子包括酿酒酵母的tah1热激蛋白调控因子、枯草芽孢杆菌热激蛋白调控因子或嗜热链球菌来源的转录调控因子。
作为本发明的一个实施方案，获得的热激蛋白基因或热激蛋白基因调控因子过表达菌株，经34-37℃耐热筛选，获得高热耐受性解脂耶氏酵母。
作为本发明的一个实施方案，耐热筛选选用的培养基为固体丰富培养基。该培养基含有酵母浸粉(质量体积百分比：0.2-2％)，蛋白胨(质量体积百分比：0.2-2％)，葡萄糖(质量体积百分比：1-5％)，琼脂(质量体积百分比1.5％)，其余为水，pH5-7。
作为本发明的一个实施方案，热激蛋白基因过表达菌株的构建包括如下步骤：
S1、构建热激蛋白hsp基因表达盒，含解脂酵母的启动子序列、hsp基因序列和终止子序列；
S2、构建hsp基因的表达载体序列，含上游同源臂序列、所述hsp基因表达盒和下游同源臂序列；
S3、合成的全序列连接到克隆载体，转化到大肠杆菌中扩增质粒；
S4、酶切质粒，转化出发菌株；34-37度培养筛选能长出单菌落。
作为本发明的一个实施方案，含hsp基因的表达载体为pUC57-yl.hsp90；出发菌株为Yarrowia lipolytica CGMCC NO.7326。
作为本发明的一个实施方案，含hsp基因的表达载体还可以为pUC57-yl.hsp12、pUC57-yl.hsp72、pUC57-yl.hsp75、pUC57-yl.hsp104或pUC57-sc.hsp90；分别将优化后并体外合成的yl.hsp12、yl.hsp72、yl.hsp75、yl.hsp104、sc.hsp90序列用SacI 与XhoI双切，克隆到SacI与XhoI双切载体pUC57-yl.hsp90中，分别构成pUC57- yl.hsp12、pUC57-yl.hsp72、pUC57-yl.hsp75、pUC57-yl.hsp104和pUC57-sc.hsp90。
作为本发明的一个实施方案，所述酶切为用EcoRI单切线性化。
作为本发明的一个实施方案，热激蛋白基因调控因子过表达菌株的构建包括如下步骤：全序列合成热激蛋白基因调控因子，以SacI与XhoI双切，克隆到SacI与XhoI双切的步骤S3获得的载体中。
在一些实施例中，热激蛋白基因调控因子过表达菌株的构建包括如下步骤：
全序列合成热激蛋白基因调控因子，以SacI与XhoI双切，克隆到SacI与XhoI双切载体pUC57-yl.hsp90中，分别构成载体pUC57-yl.msn5、pUC57-yltps2、pUC57-yltah1、pUC57-ylhsf12、pUC57-yltps1、pUC57-Sctah1、pUC57-Spx、pUC57-rgg0182。
作为本发明的一个实施方案，所述诱变包括ARTP常温等离子体诱变；诱变后的菌株经34-37度高温培养，筛选有单菌落长出的突变株；经34-37℃耐热筛选，获得高热耐受性解脂耶氏酵母。
第二方面，本发明还涉及一种前述的方法获得的高热耐受性解脂耶氏酵母菌株。该菌株能够耐受34-38℃。
第三方面，本发明还涉及一种耐热菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.24239。
第四方面，本发明还涉及一种利用所述的菌株发酵合成甘露醇的方法。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵采用的碳源包括葡萄糖、甘油、果糖。
作为本发明的一个实施方案，所述方法包括菌株的活化、摇瓶种子的培养、种子的逐级扩培和生产发酵罐的发酵。
作为本发明的一个实施方案，所述活化具体为将-80度低温保存的所述菌株于固体丰富培养基如YPD培养基中，35度培养20-30小时。
作为本发明的一个实施方案，所述方法还包括从菌株发酵液中提取纯化甘露醇的步骤。
作为本发明的一个实施方案，所述提取纯化包括：菌液的分离、含甘露醇清液的浓缩、甘露醇的结晶、结晶体的离心分离、结晶体的重溶与脱色、再次浓缩与重结晶和结晶体的离心与干燥。
本发明的解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica MAN-9，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2022年01月04日，保藏号为CGMCC No.24239。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对解脂耶氏酵母进行代谢工程的改造或对其进行诱变处理，提高其耐热性，降低由葡萄糖等碳源合成赤藓糖醇的代谢流量，提高合成甘露醇的代谢流量，从而能够直接发酵葡萄糖、甘油等单一或复合碳源一步发酵生产甘露醇，而不通过化学合成法或植物提取法生产甘露醇。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为酶法-化学法由葡萄糖合成甘露醇流程图；
图2为解脂耶氏酵母直接发酵法合成甘露醇的流程图；
图3为构建的含热休克蛋白基因(yl.hsp90)的解脂耶氏酵母质粒载体示意图；
图4为转化有热休克蛋白基因(yl.hsp90)的解脂耶氏酵母(A)与对比菌株(B) 在35度培养7天的对比图；
图5为将35度能良好生长的单菌落和对比菌落置于37度培养的对比图；
图6为构建的含热休克蛋白基因调控因子(hspR)的解脂耶氏酵母质粒载体示意图；
图7为ARTP诱变后在35度长出的单菌落示意图，单菌落如箭头所示；
图8为3台5升发酵罐发酵合成甘露醇的实物图；
图9为从发酵液中分离纯化的甘露醇结晶及其解剖镜下的形态(20倍放大)；
图10为甘露醇结晶体色谱纯度检测示意图；由图10可知，只有甘露醇一种峰，纯度99.9％及以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明中利用解脂酵母本身的热激蛋白基因，过表达自身的热激蛋白基因，也就是激活其自身的热激蛋白基因。还包括过表达其它的热激蛋白基因。另外，本发明还过表达热激蛋白基因的调控因子，达到体内激活热激蛋白基因表达的功能，从而实现解脂酵母的耐热性。并且，通过提高耐热性进而提高该酵母合成甘露醇的产量是本发明独有的发现。
第一方面，本发明涉及提高解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica或Candidalipolytica)热耐受性的方法。截止本发明申请日，未检索到解脂耶氏酵母能够耐受 38℃中温的报道。本发明采用如下的方法，将解脂耶氏酵母耐热性最高提高到38 ℃：
1、构建含解脂耶氏酵母自身的热休克蛋白基因(heat shock protein gene,hsp)的酵母表达载体。热休克蛋白基因包括但不限于以下种类：
(1)热休克蛋白12(heat shock protein 12,ylhsp12)，基因序列为SEQ ID No.6；
(2)热休克蛋白72(heat shock protein 72,ylhsp72)，基因序列为SEQ ID No.7；
(3)热休克蛋白75(heat shock protein 75,ylhsp75)，基因序列为SEQ ID No.8；
(4)热休克蛋白90(heat shock protein 90,ylhsp90)，基因序列为SEQ ID No.9；
(5)热休克蛋白104(heat shock protein 104,ylhsp104)，基因序列为SEQ IDNo.10；
除了来自解脂耶氏酵母本身的热休克蛋白基因外，还能利用来自其它生物的热休克蛋白基因，如酿酒酵母的hsp90(Saccharomyces cerevisiae hsp90,Schsp90,SEQ IDNo.11)、地衣芽孢杆菌的hsp90(Bacillus licheniformis hsp90,Blhsp90,SEQ ID No.12)等生物来源的热激蛋白基因。含热休克蛋白基因的整合表达载体的构建、转化到酵母细胞的转化方法、耐热菌株的筛选等方法详见实施例1。
2、构建含解脂耶氏酵母自身的热休克蛋白基因调控因子(heat shock proteingene regulator,hspr)的酵母表达载体。热休克蛋白基因调控因子包括但不限于以下种类：
(1)调控因子msn5(ylmsn5)，其DNA序列为SEQ ID No.13；
(2)调控因子tps2(yltps2)，其DNA序列为SEQ ID No.14；
(3)调控因子tah1(yltah1)，其DNA序列为SEQ ID No.15；
(4)调控因子hsf12(ylhsf12)，其DNA序列为SEQ ID No.16；
(5)调控因子tps1(yltps1)，其DNA序列为SEQ ID No.17；
除了来自解脂耶氏酵母本身的调控因子外，还能利用来自其它生物的调控因子，如酿酒酵母的tah1热激蛋白调控因子(Sctah1，SEQ ID No.18,序列SEQ ID No.6-18首尾位置分别带有SacI与XhoI酶切位点)、枯草芽孢杆菌热激蛋白调控因子(如Spx调控因子，详见参考文献：HeinrichTurgay.Spx,a versatile regulator of theBacillus subtilis stress response，Curr Genet.2019,65:871-876)、嗜热链球菌来源的转录调控因子(如rgg0182调控因子，详见参考文献：Henry et al.The rgg0182 geneencodes a transcriptional regulator required for the full Streptococcusthermophilus LMG18311 thermal adaptation.BMC Microbiol. 2011,11:223)。将这些调控因子基因及其调控序列(如启动子序列与终止子序列)整合到解脂耶氏酵母基因组中，能起到一定程度的参与解脂耶氏酵母的耐热性调控的作用。含调控基因的整合表达载体的构建、转化酵母细胞的方法、耐热筛选等方法详见实施例 2。
3、通过诱变随机突变解脂耶氏酵母基因组，从而获得热耐受性。本发明采用诱变专用仪器ARTP(常温常压等离子体，Atmospheric and Room Temperature Plasma，无锡应用技术研究院研制)，以氦气为诱变工作气体，在常压室温下产生等离子体源，其中含有多种化学活性粒子成分，如OH、氮分子二正系统、氮分子一负系统、激发态氦原子、氢原子和氧原子等。ARTP产生富含活性能量的粒子会对解脂耶氏酵母的遗传物质造成损伤，并诱发酵母细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。诱变后将细胞涂布在培养基上，在37度筛选培养一定时间，长出单菌落。对单菌落进一步耐高温试验以及甘露醇合成性能的测试。具体诱变操作过程详见实施例3。
对上述1-3获得的耐热解脂酵母进行筛选，获得一株典型的具有代表性的耐热解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.24239，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所所内。
第二方面，本发明涉及典型解脂耶氏酵母耐热菌株CGMCC No.24239发酵葡萄糖等碳源合成甘露醇的方法。以下以典型解脂耶氏酵母耐热菌株CGMCC No.24239为例，说明采用微生物发酵法直接由葡萄糖、果糖、甘油等碳源合成甘露醇的方法。由于获得耐热突变菌株数量众多，本发明不做一一保存，而是保存耐热性得到提高，同时合成甘露醇的产量显著提高，但是细胞量并没有显著提高的典型菌株。采用本发明获得的其它耐热突变菌株发酵葡萄糖等碳源直接合成甘露醇的方法与采用典型耐热菌株CGMCC No.24239的方法相同。
典型的发酵合成甘露醇的方法包括：(1)菌株的活化、(2)摇瓶种子的培养、(3) 种子的逐级扩培、(4)生产发酵罐的发酵。活化一般指从冻存管中取出，使其从休眠状态恢复生长的过程。从冻存管中取出50-200微升划线接种到固体培养基表面，在30-35 度培养，直至恢复生长。再从中刮取一定量的菌泥接种到摇瓶中培养直到菌体密度达到 5-10，再接种到扩培罐中逐级扩大培养，一直到生产发酵罐中发酵培养。在发酵罐中的发酵温度控制在34-38度，优选35度。通气量为0.2-0.6vvm，优选0.4vvm。在100- 500升的扩培罐中搅拌转速100-300转/分钟，优选250转/分钟。在1000-10000升的扩培罐转速为80-200转/分钟，优选120转/分钟。在30立方米及以上的发酵罐中搅拌转速为80-200转/分钟，优选120转/分钟。
(1)耐热突变菌株的活化
将典型解脂耶氏酵母耐热菌株CGMCC No.24239(含有热激蛋白基因hsp90基因)从-80度低温保存柜中取出，划线于固体YPD平板上(成分为：20克/升葡萄糖、10克/升酵母浸粉、5克/升胰蛋白胨，15克/升琼脂粉，pH6.0，121度灭菌20分钟后)，在35 度培养36小时，以活化耐热突变株。此处仅以此培养基成分为例，依据需要可以进行任何形式的成分优化。
(2)摇瓶种子的培养
在250毫升的摇瓶中接入30毫升种子培养基，种子培养基成分为：200克/升葡萄糖、8克/升酵母浸粉、2克/升胰蛋白胨，2克/升柠檬酸三铵，2克/升磷酸氢二铵， pH6.0，碳源与氮源单独于121度灭菌20分钟再混合，以免发生美拉德反应使得培养基颜色变深。将活化的耐热突变株接入摇瓶中，加入20微升灭菌消泡剂以防止培养过程泡沫产生，在180-250转/分钟，30-35度培养10-20小时，当细胞密度达到5±0.5时全部转入2升摇瓶中，含300毫升灭菌种子培养基，在180-250转/分钟，30-35度培养 10-20小时，当细胞密度达到5±0.5时全部转入5升发酵罐中。此处仅以此培养基成分为例，依据需要可以进行任何形式的成分优化。
(3)5升发酵罐的发酵
5升发酵罐中含3升发酵培养基，成分为：150-350克/升葡萄糖、4-15克/升酵母浸粉、1-5克/升胰蛋白胨，1-5克/升柠檬酸三铵，1-5克/升磷酸氢二铵，起始pH6.0- 7.5，碳源与氮源单独于121度灭菌20分钟再混合。葡萄糖浓度优选200-300克/升，酵母浸粉浓度优选6-10克/升，胰蛋白胨浓度优选2-4克/升，其它无机氮源浓度分别优选2-4克/升。最优选浓度分别为：葡萄糖浓度280克/升，酵母浸粉浓度8克/升，胰蛋白胨浓度优选2克/升，其它无机氮源浓度分别优选2克/升，起始pH6.5。在含3 升发酵培养基的5升发酵罐中接入耐热酵母种子液，在350-800转/分钟，34-38度，通气量0.3-1.5vvm条件下发酵。优选条件为650转/分钟，35度，通气量1vvm。每个12 小时取样HPLC测定产物与底物的浓度变化。碳源还可以是果糖，甘油或者它们的混合物。
依据需要，还可以进一步放大发酵，如在30升发酵罐中，100升发酵罐中以及更大体积的发酵罐中(如30立方、100立方等)直接发酵合成甘露醇，搅拌转速100-150转 /分钟，通气量0.30-0.60vvm，温度34-37度。
第三方面，本发明涉及从发酵液中分离提取甘露醇的方法。
发酵结束后，从发酵液中提取分离甘露醇。常用的方法包括：(1)菌液的分离，将酵母细胞与发酵液分离，得到澄清透明的含甘露醇的清液；(2)含甘露醇清液的浓缩； (3)甘露醇的结晶；(4)结晶体的离心分离；(5)结晶体的重溶与脱色；(6)再次浓缩与重结晶；(7)结晶体的离心与干燥。
菌液分离可以采用陶瓷膜分离或者板框压滤。陶瓷膜分离的孔径可以为100纳米及以上孔径.板框压滤可以采用硅藻土助滤剂。菌液分离后得到澄清透明的含甘露醇的清液。对该清液进行蒸发浓缩至固形物含量450±20克/升。等度降温，每小时降温2-5 度，甘露醇晶体逐渐析出。离心分离晶体，再将晶体重溶，加入活性炭，加入量为溶液的0.5％-3％(质量体积百分比)，在50-80度脱色，优选70度。板框过滤脱除活性炭，对清液再次蒸发浓缩结晶，干燥得到白色针状结晶性颗粒或者粉末性结晶体。
当发酵液中的底物原料的含量低于10克/升时，可以停止发酵，放出发酵液，进行分离纯化，得到白色甘露醇粉末性结晶体。详细步骤如下：
(1)菌液分离，将酵母细胞与发酵液分离，得到澄清透明的发酵液。分离的方法可以是过滤或者压滤。过滤可以采用陶瓷膜过滤，采用孔径10纳米或以上的陶瓷膜在加压的条件下，实现菌液分离。还可以采用板框压滤的方式实现菌液分离，得到澄清透明的含甘露醇的发酵液。
(2)将澄清透明的发酵液浓缩，可以采用多效蒸发(如三效或四效蒸发，MVR蒸发)，80-95℃真空浓缩到固形物含量450±20克/升。
(3)等度降温，由于甘露醇的溶解度较低，在25度下100毫升水只能溶解18克的甘露醇，而对于其它的多元醇如山梨醇，100毫升能溶解235克山梨醇，是甘露醇的 13倍。对于赤藓糖醇，在25度条件下100毫升水能溶解37克赤藓糖醇，是甘露醇的2 倍。正是由于甘露醇的溶解度低，在降温的过程中甘露醇很容易析出。等度降温，结晶器搅拌转速30-150转/分钟，优选50转/分钟，从80度降到10度，降温梯度每小时降温1-10度，优选3度。还可以采用非等度降温的方法，如从80度到50度每小时降低 3度，50度到10度每小时降低2度。随着温度的降低，甘露醇大量析出。
(4)甘露醇结晶体的分离，采用离心的方法，将甘露醇结晶体与母液分离，得到的结晶体用冷水洗晶，洗晶水进入母液。
(5)重结晶，晶体重新溶解，70-80度浓缩到固形物含量450±20克/升，加入粉末性活性炭吸附(活性炭加入量为浓缩液质量的0.5％-5％，优选2％的加入量)，板框压滤分离活性炭得到无色的甘露醇溶液，再次等度降温，结晶，离心，干燥，得到甘露醇精制品。
本发明采用的由解脂耶氏酵母直接发酵法合成甘露醇的流程如图2所示。
具体示例如下：
实施例1
本实施例涉及含解脂耶氏酵母自身的热休克蛋白基因(yl.hsp)表达载体的构建、转化与筛选，以yl.hsp90为例。
首先设计含解脂耶氏酵母自身的热休克蛋白基因(hsp)的表达载体序列，该序列含有如下DNA元件：上游同源臂序列、hsp基因表达盒(含解脂酵母的启动子序列、hsp基因序列、终止子序列)、下游同源臂序列。全序列如SEQ ID No.19。合成的全序列连接到克隆载体如pUC57中(该载体是克隆常用载体，序列在NCBI等数据库均能检索得到)，得到pUC57-yl.hsp90并转化到大肠杆菌中扩增质粒。构建的含hsp90基因的整合表达载体示意图如图3所示。用EcoRI酶切该质粒以线性化该载体，转化出发菌株CGMCC 7326，转化方法详见发明人发表的论文(如Journal of Functional Foods,2017,32： 208～217)。转化后全部涂布在固体YPD平板上，在35度培养4-7天，同时用不转化的出发菌株CGMCC7326做对比，同样在35度培养。经过4-7天的培养，转化了yl.hsp90 基因的解脂耶氏酵母菌在35度培养能长出单菌落，而对比菌株则不能生长(如图4所示)。将长出的单菌落逐一转接到新鲜的YPD固体平板上，置于37度培养3-5天，大部分能耐受35度的单菌落不能在37度生长，少数单菌落能在37度继续良好生长，图 5显示挑取5个能在35度生长的只有1个能在37度良好生长；CK为对比菌，不能生长。转化与过表达yl.hsp90基因后，一共获得14个单菌落能在37度良好生长。对这 14个单菌落在35，36，37度逐一发酵葡萄糖合成甘露醇的试验。
其它含热激蛋白基因(yl.hsp12,yl.hsp72,yl.hsp75,yl.hsp104,sc.hsp90等)表达载体的构建与上述含yl.hsp90基因的构建方法类似。用SacI与XhoI双切载体 pUC57-yl.hsp90，将优化后并体外合成的yl.hsp12,yl.hsp72,yl.hsp75,yl.hsp104, sc.hsp90等DNA用SacI与XhoI双切，克隆到SacI与XhoI双切载体pUC57-yl.hsp90载体中，分别构成pUC57-yl.hsp12，pUC57-yl.hsp72，pUC57-yl.hsp75，pUC57- yl.hsp104，pUC57-sc.hsp90，用EcoRI单切线性化分别转化解脂酵母CGMCC7326，在 35度培养。得到的耐高温菌株分别进行发酵合成甘露醇试验。
实施例2
本实施例涉及构建含解脂耶氏酵母自身的热休克蛋白调控因子(hspR)的酵母表达载体，以yl.msn5为例。
优化并全序列合成yl.msn5基因，以SacI与XhoI双切，克隆到SacI与XhoI双切载体pUC57-yl.hsp90载体中，构成新载体pUC57-yl.msn5，示意图如图6所示。用EcoRI 单切线性化分别转化解脂酵母CGMCC 7326或其它种类的解脂耶氏酵母，在35度培养。将得到的单菌落再转接到新的YPD固体培养基上，在37度继续培养，筛选能在37度良好生长的转化子，并进行发酵试验。对于其它的热休克蛋白调控因子(如yltps2,yltah1, ylhsf12,yltps1,Sctah1,Spx,rgg0182等)的表达载体构建与转化子的筛选，方法同上。一共获得12个在35度良好生长的转化子(含有ylmsn5,yltps1，yltah1或 ylhsf12)，其中2个仍能在37度良好生长(含ylmsn5)，初步说明过表达ylmsn5调控因子的效果较好。
实施例3
本实施例涉及通过ARTP诱变获得耐高温解脂耶氏酵母菌株。
除了通过过表达热激蛋白基因或者其调控因子基因来提高解脂酵母的耐热性外，还可以通过ARTP常温等离子体诱变来获得耐高温突变株。诱变前打开ARTP诱变仪，内腔用紫外线杀菌30分钟，在同一功率下设置8种诱变时间，第一个设置成10秒，每5秒增加梯度。将待诱变的出发菌株用无菌水进行稀释并取10微升点在诱变小铁片中央(灭菌处理后)，涂开，一共8个圆形小铁片(直径约6mm)。将8个圆形小铁片放在诱变台上，开始诱变。诱变结束后将圆形小铁片置于含600微升无菌水的1.5毫升离心管中，振荡使铁片表面的菌充分洗涤下来，全部涂布在固体YPD平板上，置于35度培养5-8 天，观察是否有单菌落长出。经过8天的培养，发现有单菌落长出，其中一个平板上长出的菌落如图7所示。将获得的单菌落转接到新鲜的固体培养基上，在37度培养，只有2个单菌落能继续生长。
实施例4
本实施例涉及获得的耐高温解脂酵母发酵合成甘露醇的初步筛选。
耐高温发酵合成甘露醇的初步筛选试验在250毫升摇瓶中进行。将获得的能在35度良好生长的单菌落接入含有30毫升发酵培养基的250毫升摇瓶中，共随机选取30个单菌落进行初步筛选。发酵培养基成分为(克/升)：一水葡萄糖280，酵母浸粉8，胰蛋白胨2，磷酸氢二胺2，柠檬酸铵2，用自来水配置，起始pH6.0-6.7，灭菌。每瓶加入20微升消泡剂，置于摇床中，35度220转/分钟发酵，定时取样，并补充挥发减少的水分至初始重量，液相色谱检测甘露醇的产量。经过检测，发现含有yl.hsp90的转化子单菌落合成甘露醇的产量相对较高，达到102克/升。其余的单菌落甘露醇的产量在 70-85克/升之间。接着将温度提高到37度，其它条件一致，经过发酵，液相检测，含 yl.hsp90的转化子甘露醇的含量达到108克/升。所有摇瓶中菌的细胞密度(OD600值) 在35±5之间。发酵时间方面，含yl.hsp90的转化子的发酵时间最短，95小时底物葡萄糖消耗完全，发酵结束。而其它转化子发酵时间均超过100小时，发酵时间长，细胞呼吸时间增加，则会消耗更多的底物葡萄糖，导致甘露醇的产量偏低。以下的实施例均以含yl.hsp90基因的转化子作为研究对象。
实施例5
本实施例涉及发酵果糖合成甘露醇的试验，分别在35与37度进行。
试验在250毫升摇瓶中进行。将含yl.hsp90的转化子单菌落接入含有30毫升发酵培养基的250毫升摇瓶中。发酵培养基成分为(克/升)：果糖280，酵母浸粉8，胰蛋白胨2，磷酸氢二胺2，柠檬酸铵2，用自来水配置，起始pH6.0-6.7，灭菌。每瓶加入 20微升消泡剂，置于摇床中，分别在35与37度220转/分钟发酵，定时取样，并补充挥发减少的水分至初始重量，液相色谱检测甘露醇的产量。经过检测，在35度与37度条件下合成甘露醇的产量分别达到105克/升与109克/升。说明该转化子能利用果糖发酵合成甘露醇。
实施例6
本实施例涉及发酵甘油合成甘露醇的试验，分别在35与37度进行。
试验在250毫升摇瓶中进行。将含yl.hsp90的转化子单菌落接入含有30毫升发酵培养基的250毫升摇瓶中。发酵培养基成分为(克/升)：甘油150，酵母浸粉5，胰蛋白胨1，磷酸氢二胺1，柠檬酸铵2，用自来水配置，起始pH6.0-6.7，灭菌。每瓶加入 20微升消泡剂，置于摇床中，分别在35与37度220转/分钟发酵，定时取样，并补充挥发减少的水分至初始重量，液相色谱检测甘露醇的产量。经过检测，在35度与37度条件下合成甘露醇的产量分别达到65克/升与70克/升。说明该转化子能利用甘油发酵合成甘露醇。由于同等浓度甘油的渗透压比葡萄糖或者果糖要大，因此将甘油浓度降低为150克/升，超过200克/升甘油浓度酵母生长缓慢。
实施例7
本实施例涉及发酵葡萄糖与果糖的混合物合成甘露醇的试验，分别在35与37度进行。
试验在250毫升摇瓶中进行。将含yl.hsp90的转化子单菌落接入含有30毫升发酵培养基的250毫升摇瓶中。发酵培养基成分为(克/升)：一水葡萄糖150，果糖150，酵母浸粉8，胰蛋白胨2，磷酸氢二胺2，柠檬酸铵2，用自来水配置，起始pH6.0-6.7，灭菌。每瓶加入20微升消泡剂，置于摇床中，分别在35与37度220转/分钟发酵，定时取样，并补充挥发减少的水分至初始重量，液相色谱检测甘露醇的产量。经过检测，在35度与37度条件下合成甘露醇的产量分别达到107克/升与113克/升。说明该转化子能利用葡萄糖与果糖的混合物发酵合成甘露醇，但是优先利用葡萄糖，然后再利用果糖。
实施例8
本实施例涉及发酵葡萄糖合成甘露醇的试验，在34度进行。
试验在250毫升摇瓶中进行。将含yl.hsp90的转化子单菌落接入含有30毫升发酵培养基的250毫升摇瓶中。发酵培养基成分为(克/升)：葡萄糖280，酵母浸粉8，胰蛋白胨2，磷酸氢二胺2，柠檬酸铵2，用自来水配置，起始pH6.0-6.7，灭菌。每瓶加入20微升消泡剂，置于摇床中，在34度220转/分钟发酵，定时取样，并补充挥发减少的水分至初始重量，液相色谱检测甘露醇的产量。经过检测，在34度条件下合成甘露醇的产量为94克/升。
实施例9
本实施例涉及发酵葡萄糖合成甘露醇的试验，在38度进行。
试验在250毫升摇瓶中进行。将含yl.hsp90的转化子单菌落接入含有30毫升发酵培养基的250毫升摇瓶中。发酵培养基成分为(克/升)：葡萄糖280，酵母浸粉8，胰蛋白胨2，磷酸氢二胺2，柠檬酸铵2，用自来水配置，起始pH6.0-6.7，灭菌。每瓶加入20微升消泡剂，置于摇床中，在38度220转/分钟发酵，定时取样，并补充挥发减少的水分至初始重量，液相色谱检测甘露醇的产量。经过检测，在38度条件下合成甘露醇的产量为64克/升，比在34,35,36,37度要大幅降低，原因是在38度条件下细胞虽然能生长，但其生长受到明显抑制，细胞密度对数生长期仅为19，显著低于其它温度条件下的35±5，葡萄糖到170小时时仍未利用完毕。
根据实施例5-9的初步结果，在37度温度下合成甘露醇的产量要略高于在35度下的产量，35度发酵产量又高于在34度条件下的产量，其原因可能是随着温度的提高，细胞要合成更多的甘露醇来抵抗逆境条件来保护细胞。但是超过37度合成甘露醇的产量就显著降低，细胞的生长也受到抑制。已知甘露醇是一种在逆境条件下产生的多元醇，其它生物如植物、藻类在干旱、高温、高盐的环境下会积累更多的甘露醇，如生活在海水中的藻类一般含有较多的甘露醇。
实施例10
本实施例涉及发酵葡萄糖合成甘露醇的试验，在5升发酵罐分别于35，36，37度进行。
5升发酵罐中含3升发酵培养基，成分为：300克/升一水葡萄糖、8克/升酵母浸粉、2克/升胰蛋白胨，2克/升柠檬酸三铵，2克/升磷酸氢二铵，起始pH6.5，碳源与氮源单独于115度灭菌30分钟再混合。冷却后接入300毫升酵母种子液(含yl.hsp90 基因的转化子单菌落)，在600转/分钟，35,36,37度，通气量1vvm条件下发酵。从第 48小时开始，不定时取样HPLC测定产物与底物的浓度变化。35度条件下92小时发酵结束，甘露醇产量为135克/升。36度条件下98小时发酵结束，甘露醇产量为146克/ 升。37度条件下发酵107小时结束，甘露醇产量为155克/升。随温度的升高发酵结束时间要延长，甘露醇的产量有所增加。3台5升的发酵罐发酵合成甘露醇的实物图如图 8所示。
实施例11
本实施例涉及从发酵液中分离提取甘露醇
5升发酵罐发酵结束后，菌液分离可以采用离心的方法，在5000转/分钟下菌液离心10分钟。菌液分离后得到澄清透明的含甘露醇的清液。对该清液进行蒸发浓缩至固形物含量450克/升，折光46。置于4度冰箱，甘露醇晶体逐渐析出。离心分离晶体，再将晶体重溶，加入活性炭，加入量为溶液的0.5％(质量体积百分比)，在70度脱色 60分钟。过滤脱除活性炭，对清液再次蒸发浓缩，结晶，得到针状晶体，置于放大镜下观察呈针状，如图9所示。取一颗干燥的晶体溶解，液相色谱测定纯度，结果为99.9％以上，只显示一个甘露醇的峰，如图10所示。
将实施例5-10使用的过表达yl.hsp90基因的解脂耶氏酵母转化子保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所所内)，保藏号为CGMCC No.24239。
上面对本发明进行了详细的说明，从耐高温解脂耶氏酵母突变株的获得，到利用获得的耐高温菌株在高温条件下合成甘露醇，再到从发酵液中分离提取甘露醇整个过程进行了说明。发明人还可以对本发明说明书的内容进一步完善补充，以取得更好的实施效果，这些完善补充都属于本发明的技术范畴。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 提高解脂耶氏酵母耐热性的方法及用于发酵合成甘露醇
<130> KAG48063
<141> 2022-02-11
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1397
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 1
cagatcttgg tggtagtagc aaatattcaa atgagaactt tgaagactga agtggggaaa 60
ggttccgtgt gaacagcagt tggacacggg taagtcgatc ctaaggggtg gcataactgt 120
cgcgtacggc ccgataaggg ccttctccaa aagggaagcc ggttgaaatt ccggcacttg 180
gatgtggatt ctccacggca acgtaactga atgtggggac ggtggcacaa gtcttggaag 240
gagttatctt ttctttttaa cggagtcaac accctggaat tagtttgtct agagataggg 300
tatcgttccg gaagaggggg gcagctttgt cccctccgat gcacttgtga cgccccttga 360
aaacccgcag gaaggaatag ttttcacgcc aagtcgtact gataaccgca gcaggtctcc 420
aaggtgaaca gcctctagtt gatagaataa tgtagataag ggaagtcggc aaaatagatc 480
cgtaacttcg ggataaggat tggctctggg ggttggtgga tggaagcgtg ggagacccca 540
agggactggc agctgggcaa ctggcagccg gacccgcggc agacactgcg tcgctccgtc 600
cacatcatca accgccccag aactggtacg gacaagggga atctgactgt ctaattaaaa 660
catagctttg cgatggttgt aaaacaatgt tgacgcaaag tgatttctgc ccagtgctct 720
gaatgtcaaa gtgaagaaat tcaaccaagc gcgcgggtaa acggcgggag taactatgct 780
ctcttaaggt agccaaatgc ctcgtcatct aattagtgac gcgcatgaat ggattaacga 840
gattcccact gtccctatct actatgtagc gaaaccacag ccaagggaac gggcttggca 900
gaatcagcgg ggaaagaaga ccctgttgag cttgactcta gtttgacatt gtgaagagac 960
atagggggtg tagaataagt gggagcttcg gcgccggtga aataccacta cccttatcgt 1020
ttctttactt atttagtaag tggaagtggt ttaacaacca ttttctagca ttcctttcca 1080
ggctgaagac attgtcaggt ggggagtttg gctggggcgg cacatctgtt aaaagataac 1140
gcagatgtcc taagggggac tcaatgagaa cagaaatctc atgtagaaca aaagggtaaa 1200
agtccccttg attttgattt tcagtgtgaa tacaaaccat gaaagtgtgg cctatcgatc 1260
ctttagttgt tcggagtttg aacctagagg tgccagaaaa gttaccacag ggataactgg 1320
cttgtggcag tcaagcgttc atagcgacat tgctttttga tccttcgatg tcggctcttc 1380
ctatcatacc gaagcag 1397
<210> 2
<211> 837
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 2
atgtctggac cttccaccct cgccacggga ctgcaccctc tccccacaga gaccccaaag 60
ttccccacca acatcatgga ccgattctcc ctcaagggta aggttgcctc cgtcaccggc 120
tcctcgtcag gtatcggcta ctgcgtggcc gaggcctacg cccaggccgg tgccgacgtg 180
gccatctggt acaactccca ccccgccgac gcaaaggctg agcacctcgc taagacctac 240
ggcgtcaagg ccaaggccta caagtgccct gtcaccgacg ccgccgccgt ggagtccacc 300
atccagcaga tcgagaagga ctttggcacc attgacatct tcgtcgccaa cgctggtgtc 360
ccctggaccg ccggccccat gatcgacgtg cccgacaaca aggagtggga caaggtcatc 420
aacctggatc tcaacggtgc ctactactgc gccaagtacg ccggccagat cttcaagaag 480
aagggcaagg gatccttcat cttcaccgcc tccatgtccg gccacattgt caacatcccc 540
cagatgcagg cctgctacaa cgccgccaag gccgctctgc tgcacctgtc tcgatcgctg 600
gccgtcgagt gggccggctt tgcccgatgc aacacagtct cccctggcta catggccacc 660
gagatctccg actttgtccc caaggagacc aaggagaagt ggtggcagct cattcccatg 720
ggccgagagg gagacccctc cgagctctgc ggagcctacc tctaccttgc ctctgatgct 780
gccacctaca ccactggtgc cgacattatc gtcgatggtg gctactgcgc tccttag 837
<210> 3
<211> 837
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 3
atgcctgcac cagcaaccta cgctactggc ttgacgcccc ttcccacccc cgtccctaag 60
gtatccaaga acatcatgga gcgattctct ctgaagggaa aggttgcctc tatcaccggt 120
tcttcttctg gaatcggatt cgctgttgct gaggcatttg cccaggctgg tgccgatgtc 180
gcgatctggt acaactccaa gccttccgat gagaaggctg agtatctgtc caagacatac 240
ggagtccgat ctaaggctta caaatgtgct gtgaccaacg ccaagcaggt cgagaccact 300
atccaaacca tcgaaaagga ctttggaaag attgacatct tcatcgccaa cgcgggtatc 360
ccatggactg ctggtccaat gatcgatgtc cctaacaacg aggagtggga caaggttgtt 420
gacctggatc tcaacggtgc ctattattgc gccaagtacg ccggccagat cttcaagaag 480
cagggctacg gctccttcat cttcaccgcc tccatgtctg gccatattgt caatatcccc 540
cagatgcagg cctgctacaa cgcagctaag tgtgctgtcc tccatctgtc ccgatctctg 600
gccgtggagt gggctggatt cgctcgatgt aatacagtgt cccctggtta catggctacc 660
gagatttctg acttcatccc acgagacaca aaggagaagt ggtggcagct catccccatg 720
ggccgagagg gagatccttc tgagcttgct ggagcctata tttacctggc ttcggatgcc 780
tcaacttata ccactggtgc agacattctg gttgatggcg gctactgttg tccttag 837
<210> 4
<211> 1408
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 4
ggccggcatg gctgctgcca tcgagcaggc caagaagtcc aaggacaagc ccacttgtat 60
ccgactcacc accatcattg gttacggctc tctgcagcag ggtacccacg gtgttcacgg 120
ctctcctctc aagcctgatg atatcaagca gttcaaggag aaggttggct tcaaccccga 180
ggagaccttt gccgtcccca aggagaccac tgatctctac gccaagacta ttgaccgagg 240
cgccaacgcc gagaaggagt ggaacgagct cttcgccaag tacggtaagg agtatcccaa 300
ggagcactct gagatcatcc gacgattcaa gcgagagctg cccgagggat gggagaaggc 360
tctgcctacc tacacccccg ccgacaatgc cgttgcttct cgaaagctgt ccgagattgt 420
cctcaccaag atccacgagg tcctccccga gcttgttggt ggttccgccg atctgaccgg 480
ctcaaacctg acccgatgga aggacgctgt tgatttccag cctcctgtca cccaccttgg 540
tgactactcc ggccgataca tccgatacgg tgttcgagag cacggcatgg gcgctatcat 600
gaacggtatg aacgcttacg gaggtatcat cccctacgga ggtactttcc ttaacttcgt 660
ctcctacgcc gctggtgccg tccgactgtc tgccctgtct ggccaccacg ttatctgggt 720
tgctacccat gactccattg gtctgggtga ggatggccct acccatcagc ccattgagac 780
tgtcgcctgg ctccgagcca cccccaacct ctctgtgtgg cgacctgccg acggtaacga 840
gacctccgct gcttactaca aggccatcac caactaccac actccctctg tcctgtctct 900
gacccgacag aacctgcctc agcttgaggg ctcttccatc gagaaggcct ccaagggtgg 960
ttaccagctc atctccgagg acaagggtga catctacctt gtgtccactg gttctgaggt 1020
tgccatctgt gttgctgccg ccaagctcct caaggagaag aagggtatca ctgccggtgt 1080
catctctctg cccgactggt tcaccttcga gcagcagtct ctcgagtacc gaaagtctgt 1140
tttccccgat ggcatcccca tgctttccgt cgaggtctac tccgactttg gctggtctcg 1200
atactctcac cagcagtttg gtctggaccg attcggtgct tctgctccct tccagcaggt 1260
ctacgatgcc tttgagttca atgccgaggg tgtcgccaag cgagctgagg ccaccattaa 1320
ctactacaag ggccagactg tcaagtctcc tattcagcga gccttcgacc ccattgacgt 1380
caacacccga cccggccacg gtgtctaa 1408
<210> 5
<211> 978
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 5
atgtcttcca actctcttga acagcttaag gccgccggca ccaccgttgt caccgacact 60
ggtgaattcg agtccatcgc caagtacaag ccccaggacg ccaccaccaa cccctctctg 120
atcctggccg cttccaagaa gcccgagtac gccaagctca ttgacgaggc cgtttctttc 180
gccaagacca agtcctccga ccccaaggag caggtcaaca ttgctctgga ccagctgctc 240
atcgagttcg gctccgagat tctcaagatt gtccccggtc gagtctccac cgaggtcgac 300
gcccgactct ctttcgacaa ggacgccacc atcaagaagg ctctgcagct cattgacctc 360
tacaaggcca agggcatttc ttctgaccga atcctcatca agatcgcctc cacctatgag 420
ggtatccagg ctgccaagga gctcgagtcc aagcacggta tccactgtaa cctgactctt 480
ctcttctcct tcgtccaggc cgttgcctgt gctgaggcca aggtcaccct catctctccc 540
tttgttggcc gaatcctcga ctggcacaag gccgccaccg gcaagaccta cgacgctgcc 600
gaggaccccg gtgtcatctc cgtcaagaac attttcgact actacaagaa gttcgactac 660
aagaccattg tcatgggtgc ttctttccga aacaccggtg agatcaagga gcttgctggc 720
tgtgacttcc tgaccatctc ccccggtctg cttgaggagc tgctcaactc caccgacccc 780
gtcccccaga agctgttcgc cgacaaggcc aagtctctgg acattgagaa gaaggcctac 840
ctcgacgagg agcccatctt ccgacgagac tttaacgagg accagatggc caccgagaag 900
ctctccgacg gtatccgaaa gttcgctgct gacgccgtca ccctttccaa gctcattgag 960
accaagctct ccgcttag 978
<210> 6
<211> 408
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 6
aacgagctca tgtctcaagc tggtagaaag gacttcactg acaagttgtc tgaaggtgtt 60
actccagact ctcaaaagtc tactggtgaa aagttgtctg aaaaggctac tgacgcttac 120
gacaaggttg ctaacgctgt tgaaccagaa tctcaaaagt ctactactca aaaggttggt 180
gacaagttcg aatctgacac ttctaaggct aagtctgaca tctctgacga aaagaacaag 240
ttggaaaagg aaggtgaatc ttacatcgac caagctaagg acttcatcaa ctctggtaag 300
ccacaagaat acgttgacca agctaaggaa tctatcaaca acttcttggg tggtaactct 360
ggttctactg gttctactgg tactggtgct actaagtaac tcgagaac 408
<210> 7
<211> 1950
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 7
aacgagctca tgtctaaggc tgttggtatc gacttgggta ctacttactc ttgtgttgct 60
cacttcgcta acgacagagt tgaaatcatc gctaacgacc aaggtaacag aactactcca 120
tctttcgttg ctttcactga cactgaaaga ttgatcggtg acgctgctaa gaaccaagct 180
gctatgaacc cagctaacac tgttttcgac gctaagagat tgatcggtag aaagttcgac 240
gacccagaag ttcaaaacga cgctaagcac ttcccattca agatcatcga caaggctggt 300
aagccaaaca tcgaagttga attcaagggt gaaactaagg ttttcactcc agaagaaatc 360
tcttctatga tcttgactaa gatgaaggaa actgctgaag gttacttggg tactaaggtt 420
aacgacgctg ttatcactgt tccagcttac ttcaacgact ctcaaagaca agctactaag 480
gacgctggtt tgatcgctgg tttgaacgtt caaagaatca tcaacgaacc aactgctgct 540
gctatcgctt acggtttgga caagaaggaa actggtgaaa gaaacgtttt gatcttcgac 600
ttgggtggtg gtactttcga cgtttctttg ttgtctatcg aagacggtat cttcgaagtt 660
aaggctactg ctggtgacac tcacttgggt ggtgaagact tcgacaacag attggttaac 720
cacttcgttc aagaattcaa gagaaagcac aagaaggaca tctctactaa ccaaagagct 780
ttgagaagat tgagaactgc ttgtgaaaga gctaagagaa ctttgtcttc ttctgctcaa 840
acttctatcg aaatcgactc tttgtacgaa ggtatcgact tctacacttc tatcactaga 900
gctagattcg aagaattgtg tcaagacttg ttcagaggta ctttggaacc agttgaaaag 960
gttttgaagg acgctaagat ggacaaggct tctgttaacg aaatcgtttt ggttggtggt 1020
tctactagaa tcccaaaggt tcaaaagttg gtttctgact tcttcaacgg taaggaattg 1080
aacagatcta tcaacccaga cgaagctgtt gcttacggtg ctgctgttca agctgctatc 1140
ttgtctggtg acacttcttc ttctactcaa gacatcttgt tgttggacgt tgctccattg 1200
tctttgggta tcgaaactgc tggtggtgtt atgactaagt tgatcccaag aaactctact 1260
atcccaacta agaagtctga aactttctct acttacgctg acaaccaacc aggtgttttg 1320
atccaagttt tcgaaggtga aagagctcaa actaaggaca acaacatctt gggtaagttc 1380
gaattgtctg gtatcccacc agctccaaga ggtgttccac aaatcgaagt tactttcgac 1440
gttgacgcta acggtatctt gaacgtttct gctgttgaaa agggtactgg taagactcaa 1500
caaatcacta tcactaacga caagggtaga ttgtctaagg aagaaatcga aagaatggtt 1560
aacgacgctg aaaagtacaa ggacgaagac gaaaaggaag ctgctagaat cgctgctaag 1620
aacggtttgg aatcttacac ttactctttg aagaacactt tgtctgaaga aaagttcaag 1680
gaaaaggttg acgaagctga aagagaaaag ttgaagaagg ctatcgacga aactatcgaa 1740
ttcttggacg ctactcaatc tggtactact gaagaatact ctgacaagca aaaggaattg 1800
gaaggtatcg ctaacccaat cttgatgaag ttctacggtg ctgaaggtgg tgctccaggt 1860
ggtatgccag gtggtggtat gccaggttct ggtgctgctc caggtggtgg tgaaggtcca 1920
actgttgaag aagttgacta actcgagaac 1950
<210> 8
<211> 1854
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 8
aacgagctca tgtctgaagg tactttcgct ggtgctgttg gtatcgactt gggtactact 60
tactcttgtg ttgctactta cgactctgct gttgaaatca tcgctaacga acaaggtaac 120
agagttactc catctttcgt tgctttcact gaagaagaaa gattgatcgg tgacgctgct 180
aagaaccaag ctgctttgaa cccagttaac actgttttcg acgctaagag attgatcggt 240
agaagattcg acgacgaatc tgttcaaaag gacatccaaa cttggccatt caaggttgtt 300
gacaacgctg gtgctccatt gatcgaagtt gactacttgg gtgaaaagaa gactttctct 360
ccacaagaaa tctcttctat ggttttgact aagatgaagg aaatcgctga agctaagttg 420
ggtcaagctg ttgacaaggc tgttgttact gttccagctt acttcaacga cgctcaaaga 480
caagctacta aggacgctgg tgctatcgct ggtttgaacg ttttgagaat catcaacgaa 540
ccaactgctg ctgctatcgc ttacggtttg ggtgctggta agcaagaagc tgaaagacac 600
gttttgatct tcgacttggg tggtggtact ttcgacgttt ctttgttgtc tatccaaggt 660
ggtgttttca ctgttaaggc tactgctggt gacactcact tgggtggtca agacttcgac 720
actaacttgt tggaacactt caaggctgaa ttcaagagaa agactggtca cgacatctct 780
gctgacccaa gagctttgag aagattgaga tctgcttgtg aaagagctaa gagaactttg 840
tcttctgtta ctcaaactac tgttgaagtt gactctttgt tcgaaggtga agacttctct 900
gctaacatca ctagagctag attcgaagac atcaacgctg ctttgttcaa gtctactttg 960
gaaccagttg aaaaggtttt gaaggactct aagatcgaca agtctaaggt taacgaagtt 1020
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<211> 2133
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<213> Yarrowia lipolytica
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<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
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<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
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<210> 12
<211> 1899
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 12
aacgagctca tggctaagag agaattcaag gctgaatcta agagattgtt ggacatcatg 60
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<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 13
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<210> 14
<211> 2421
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 14
aacgagctca tgttgccaga aatcatcact ccaactgctg ctagagcttt gaacgttcca 60
atctctggta gagttatcaa ctgtgttact actttgccat acgaaatcta cagagaaggt 120
gctacttaca agatcagacc aagaagaggt aactctgctt tgtactctgc tttggactac 180
atgcaatctg gtgacggtga cactacttgg acttcttctt tggttgcttg gactggtgaa 240
atcgctttgc cagctgctac ttctttgcca gacttggaat tgtaccaaaa gttgactgaa 300
caagacaagc acatgttgga aagagaattg actgaagctc aaggtggtac tccaactcac 360
ccaatctgga ctgactctgg tgacactgtt tctactggtt acaacgaaca attgtctcca 420
actagaagat acgctgaaaa catcttgtgg ccaatcttgc actacatcca aggtgaacca 480
actgacggta gagacgaaaa gaagtggtgg tctgactacg aagacttgaa cagaaagtac 540
tgtgacaagg ttttggacat ctacaacgaa ggtgacgtta tctggatcca cgactactac 600
ttgttcttgt tgccaaagat gatcagagaa aagttgccag acgctagaat cggtttcttc 660
atgcacgctc cattcccatc ttctgaatac ttcagatgtt tggctaagag acaagaattg 720
ttgcaaggtg ttttggcttc taacttgatc tctactcaat ctgaagctca caagagacac 780
ttcatgtctg cttgttctag aatcgttggt gctgaaactg ctactccaac ttctgtttac 840
gcttacggtc aatctgtttc tgttgttgct ttgccaatcg gtatcgacac tgctaaggtt 900
gaagctgacg ctttcactga cgaaatcact gaaaaggtta gagctatcag acaattgtac 960
ccagacaaga agatcatcgt tggtagagac agattggact ctgttagagg tgttgttcaa 1020
aagttgtacg ctttcgacgt tttcttgaag agatacccag aatggagaga cagagttgtt 1080
ttggttcaag ttacttctca cactgctact ggtactagaa aggttgaaaa gaaggttgct 1140
gaattggttt cttctatcaa cggtagatac ggtgctatcc acttctctcc agttcaccac 1200
tacactaagc acatcgctag agaagaatac ttggctttgt tgagagttgc tgacttgtgt 1260
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aacggtaaca actctccatt gatcttgtct gaattcactg gttctgctgg taacttgcca 1380
ggtgctatct tggttaaccc atgggacgct gttggtgttg ctgaacaaat caacagaact 1440
ttcagaatgg gtcaagacga aaagttggct atcgaacaac cattgtacca aagagttact 1500
gctaacactg ttcaacactg ggttaacaga ttcgtttctc aagttatctc taacactttc 1560
agaactgacc aatctcactt gactccaatc ttggacaacc acaagttggt tgaaagattc 1620
aagatggcta agaagagagt tttcttgttc gactacgacg gtactttgac tccaatcgtt 1680
actgacccag ctgctgctac tccatctgac ggtttgaaga gagacttgag agctttggct 1740
aaggacccaa gaaacgctat ctggatcatc tctggtagag actctacttt cttggacaag 1800
tggttgggtg acatcgctga attgggtatg tctgctgaac acggttgttt catgaagaac 1860
ccaggtacta ctgactggga aaacttggct gctaacttcg acatgtcttg gcaaaaggac 1920
gttaacgaca tcttccaata ctacactgaa agaactcaag gttctcacat cgaaagaaag 1980
agagttgctt tgacttggca ctacagaaga gctgacccag aattcggttt gttccaagct 2040
agagaatgta gagctcactt ggaacaagct gttgttccaa agtgggacgt tgaagttatg 2100
tctggtaagg ctaacttgga agttagacca aagtctgtta acaagggtga aatcgttaag 2160
agattgatct ctgaatactc ttctgaaggt agaccaccac aattcgtttt gtgtatgggt 2220
gacgaccaaa ctgacgaaga catgttcaag gctttgaagg acgttccaga cttggactct 2280
gaatctatct tcccagttat gatcggtcca ccagaaaaga agactactgc ttcttggcac 2340
ttgttggaac caaagggtgt tttggaaact ttgaacgaat tggctaagtt ggaaggtgaa 2400
tctaagatgt aactcgagaa c 2421
<210> 15
<211> 963
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 15
aacgagctca tgtctgaaga attcaaggaa aagggtaacg ctttgttcaa ggctcaagac 60
tacgctcaag ctgctcaaaa gtactctttg gctatcgacg ctttgccaca cccagtttac 120
tactctaaca gagctgcttg ttacttgaag ttgggtgaat acgacaaggc tgctgctgac 180
tgtaaggctg gtttggacca cgttccagaa ttccaaaagc cacaaccaaa cgttccagaa 240
ttgaagccag acactccaat caagttgttc ttcagatggt ctcaagcttt ggaagaccaa 300
agaaactacg ctgctgctat ctacgtttgt aactctggtt tgaagactta cccaggtaac 360
gaatctttga ctactcaatt gaagaagttg caatgggttg aaaagaagga aaagagagac 420
atgaagcaaa aggctttcgc tccacaacca caaactcaag ctatcccaac tccagaagct 480
tctccaacta ctcaatacat cccaatccaa gttgttgact ctttgccaat cgacttgatg 540
tctatctaca acactccaga aactactgac ttgttggaat ctccaaagtt gtctactgct 600
gctccaactc accacgcttt cccaactcaa ttgccattga tgttgccagc ttgtttgaac 660
gcttacactt tggctcaatt gttgaagtct ccacaaaacc aaatgaagga agttagaact 720
tacttgtaca actacgacgt tgctcaatgg ccacacatct tcggtagagg tggtatcgac 780
gctgacttca tcgaagaaat gttgaaggct atcatcgaaa acgaagacaa ctctcaaaga 840
tctagagaca tcgttcaatc tatgaagaag tgtgaaagat tcaacatcgc taacactttc 900
gttccaaagg acttgaagac taaggttaac gaaatctgtg gtgaatcttt gtaactcgag 960
aac 963
<210> 16
<211> 1758
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 16
aacgagctca tgtctaacac tttggttaag aagggtcaag gtcaagctgc ttctaacgct 60
aagaagatcg gttacaacaa gaagaagggt tctggtcaaa ctaagggtag accagctttc 120
gttttcaagt tgtggaacat ggttaacgac ccagcttacg acgaatacat cagatggatg 180
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agattcttca agcacaacaa cttctcttct ttcgttagac aattgaacat gtacggttgg 300
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ggttctccaa gagaagaaaa caacaagact aacaacacta acaacacttc taacaactac 960
gacaagatca ctgcttacga cactgacact ggttctgaat tgccagacaa cttgcaagac 1020
ttgactgact tgtctgactt cactccatct atgttggacc cacaaactgt tcaacaatct 1080
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cactcttctc aaaacatgtc tcaccacaac tacaactacc aaccatctac tccaggtgct 1260
ttgttcccag aattggaagc tttccaaggt gctaacgacc aattgatcag atctgctgaa 1320
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ccaatgcaag ctccagctcc aactccagct tctactatct cttctgctcc aactccagac 1560
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gacatgccat tggttactga attggactct ccagctccaa gaccaaagaa gagaaaggct 1740
ggtgaataac tcgagaac 1758
<210> 17
<211> 1428
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 17
aacgagctca tgccaaacgt tttggttatc tctaacagat tgccagttac tatctctaga 60
gaagaagacg gtacttacaa gtacactatg tcttctggtg gtttggttac tgctttgtct 120
ggtttgaagc aatctactac tttccaatgg ttcggttggc caggtttgga aatcccagaa 180
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caagctaaca gattgttcgc taagaaggtt gcttctatcg ttaagccagg tgacatcgtt 420
tgggttcacg actaccactt gatgttgttg ccagaaatgt tgagagaaga atgtgaaaac 480
aactctgctt tggacggttt gaagatcggt ttcttcttgc acactccatt cccatcttct 540
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ttggacttgg aaactatgcc aaacggtact tactacaagg gtagacacgt tgttgttggt 720
gctttcccaa tcggtatcga cgttaacaag ttcttggaag gttgtaagag accagctgtt 780
caagaaagaa tcgctcaatt gcaagacaag ttcaagggta tcaaggttgt tgttggtgtt 840
gacagattgg actacatcaa gggtgttcca caaaagttgc acgctttcga agttttcttg 900
tctgaacacc cagaatggat cggtaaggtt gttttggttc aagttgctgt tccatctaga 960
ggtttggttg aagaatacca aaacttgaga gctgttgtta acgaattggt tggtagaatc 1020
aacggtatgt tcggtactgt tgaattcact ccaatccact tcatgcacag atctgttgac 1080
ttcaacgaat tgatcgcttt gtactctatc tctgacgttt gtttcgtttc ttctactaga 1140
gacggtatga acttggtttc ttacgaatac gttgcttgtc aaactgaaaa gcacggttct 1200
ttgatcttgt ctgaattcac tggtgctgct caatctttga acggtgcttt gatcgttaac 1260
ccatggaaca ctgaagacat ggctgaagct ttgtacgact ctttgacttt ctctccagaa 1320
aagaaggctg aaaaccacag aaagttgttc aagtacgttt ctaagtacac ttctcaacac 1380
tggggtgaag ctttcgtttc tgaattgaag agatgttaac tcgagaac 1428
<210> 18
<211> 354
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 18
aacgagctca tgagccaatt tgaaaagcag aaggaacagg gcaattcttt gttcaaacag 60
ggcctgtatc gcgaggctgt gcactgttat gaccaactaa ttactgctca accgcagaac 120
ccggtcgggt acagcaacaa agccatggcg ctgatcaaac tgggtgaata tacacaggct 180
attcaaatgt gccagcaagg actgcggtac acctcaacgg cagagcatgt agctatcaga 240
tccaaattgc aatatcgtct agagctggca cagggagcgg taggttcagt acagatccct 300
gttgtagagg ttgatgaact accggaggga tacgaccggt cctgactcga gaac 354
<210> 19
<211> 3672
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gtgagaaaat aaagtgcttt gtgcgtacca gggatagggt aggtagtgaa atctgagtta 60
gtacatcaac tcaagacgat gggcgtcgct gtgtagaaga acaataactc acccggtaac 120
taacactatt tctcggtggt caatgcgtca gaagatatca agacggtccg ttttgcgttt 180
aagccgagtg aatgttgcct gccgttagta aatttattat gaaaaacccc actatgaata 240
catcagccta tactgatata ccaagaagtg caagggaggt ggtcctgttc cacctgaacg 300
cggttcccga caggcggcgg tactgaaggg ctttgtgaga gaggtaacgc cgattctctc 360
aagcttctga ggtgtctcac aagtgccgtg cagtcccgcc cccacttgct tctctttgtg 420
tgtagtgtac gtacattatc gagaccgttg ttcccgccca cctcgatccg gctgaggtgt 480
ctcacaagtg ccgtgcagtc ccgcccccac ttgcttctct ttgtgtgtag tgtacgtaca 540
ttatcgagac cgttgttccc gcccacctcg atccggctga ggtgtctcac aagtgccgtg 600
cagtcccgcc cccacttgct tctctttgtg tgtagtgtac gtacattatc gagaccgttg 660
ttcccgccca cctcgatccg gctgaggtgt ctcacaagtg ccgtgcagtc ccgcccccac 720
ttgcttctct ttgtgtgtag tgtacgtaca ttatcgagac cgttgttccc gcccacctcg 780
atccggcacg ggcaaaagtg cgtatatata caagagcgtt tgccagccac agattttcac 840
tccacacacc acatcacaca tacaaccaca cacatccaca atggaacccg aaactaagga 900
gctcatgtca gacgccgaca aaaagtccga atcctatgag ttcacagctg agatctctca 960
gctgatgtct ctcatcatca acaccgtcta ctccaacaag gagattttcc tgcgagagct 1020
catttccaac gcttccgatg ctctggacaa gatccgatac caggccctgt ccgaccccaa 1080
gcagctggag accgagcccg agctcttcat ccgactcacc cccaacaagg gcctcaagac 1140
ctttgagatt cgagataccg gtatcggtat gactaaggct gatctcgtca acaacctggg 1200
tacaattgcc aagtccggca ccaagtcctt catggaggct ctctccgctg gcgccgacgt 1260
gtccatgatt ggtcagtttg gtgttggttt ctactctctt ttcctggttg ctgaccgagt 1320
ccaggtcatc accaagcaca acgacgacga gcagtacatc tgggagtctt ccgccggtgg 1380
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caagcgacac tccgagttcg tctcttaccc catccagctt gttgtcacca aggaggttga 1560
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gaaccccaag attgaggagg tcaaggacga ggacgccaag gacgagaagc cccagaagat 1680
caaggagatg gtcaccgaga acgaggagct taacaaggtt aagcctctgt ggacccgaaa 1740
ccccgctgag gtcaagcccg aggagtacgc tgccttctac aagtctatct ctaacgactg 1800
ggaggaccac cttgctgtca agcacttctc cgtcgagggt cagctcgagt tccgagccat 1860
tctcttcatt cccaagcgag ctcccttcga tctctttgag tccaagaaga agaagtctaa 1920
catcaagctt tacgtcaagc gtgtcttcat cactgatgac gctgaggagc tgatccccga 1980
gtggatgggc ttcgtcaagg gtgttgttga ctccgaggac ctgcctctta acctgtcccg 2040
agaggttctg cagcagaaca agattctgaa ggtcatccga aagaacattg tcaagaagct 2100
gattgaggcc ttcaacgaga ttgctgagga ccgagagcag ttcgacaagt tctacactgc 2160
cttctccaag aacctcaagc tcggtgtcca cgaggactcc cagaaccgac aggctcttgc 2220
caagctcctg cgatacaact ccaccaagtc ttccgacgag cttacctcct tcgaggacta 2280
catcacccga atgcccgagc accagaagaa catttacttc atcaccggtg agtccatcaa 2340
gtccgttgag aagtctccct tcctcgacgc cctcaaggcc aagaactttg aggttctgta 2400
catggttgac cccattgacg agtacgccat ggcccagctc aaggagtttg ataaccgaaa 2460
gctggttgat atcaccaagg acttcgagct tgaggagacc gaggaggaga agaagcagcg 2520
agaggctgag gacaaggagt tcgagcccct tgccgccgcc ctcaaggaga ttcttggcga 2580
ccaggtcgag aaggttgttg tgtcccacaa gcttgtcgac gctcctgctg ccatccgaac 2640
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gcccgccagc tttgcttctc gaatcaaccg actcatttct ctcggtctca acattgacga 2940
ggctgagcac gaggcttttg ccgagcccac ccccagcact gaggacaact ctgccagtgt 3000
tatggaggag gttgactagc tcgaggcaat taacagatag tttgccggtg ataattctct 3060
taacctccca cactcctttg acataacgat ttatgtaacg aaactgaaat ttgaccagat 3120
attgttgtaa atagaaaatc tggcttgtag gtggcaaaat cccgtctttg ttcgtcggtt 3180
ccctctgtga ctgctcgtcg tccctttgtg ttcgactgtc gtgttttgtt ttccgtgcgt 3240
gcgcaagtga gatgcccgtg ttcgaatacg gtagtcgcac ggaatcgatc ctacgtatgg 3300
gcccggcgcc gcagtcgtaa gacccaggtg gtgtgtccga ggcagtatcg ctttcccaac 3360
tctagtaacc tcggtagtgt gagacacact acccctaacg gtaggacagc cggacgacga 3420
tggcgcagca atttggcgaa cgctgttata aaacaattca cttacgtgca atgaaagttg 3480
tttgggcaat aaacaataaa tgtattagag ccagacgata gacaacaatc cagcagatga 3540
tgagcaggaa aattgagtaa gatcgacgtg gcaagaagag ttacagttac gcagagttaa 3600
taaggtgttg ggagattaga gttaccctgt cggatgacta actctccaga gcgagtgtta 3660
cacgaattct ac 3672
Claims (6)
1.一种提高解脂耶氏酵母热耐受性的方法，其特征在于，包括在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中提高热激蛋白基因ylhsp90的表达，获得热耐受性；获得的热激蛋白基因ylhsp90过表达菌株，经34-37℃耐热筛选，获得高热耐受性解脂耶氏酵母；热激蛋白基因ylhsp90的基因序列为SEQ ID No.9。
2.根据权利要求1所述的提高解脂耶氏酵母热耐受性的方法，其特征在于，热激蛋白基因ylhsp90过表达菌株的构建包括如下步骤：
S1、构建ylhsp90基因表达盒，含解脂酵母的启动子序列、ylhsp90基因序列和终止子序列；
S2、构建ylhsp90基因的表达载体序列，含上游同源臂序列、所述ylhsp90基因表达盒和下游同源臂序列；
S3、合成的全序列连接到克隆载体，转化到大肠杆菌中扩增质粒；
S4、酶切质粒，转化出发菌株；34-37度培养筛选能长出单菌落。
3.一种根据权利要求1或2所述的方法获得的高热耐受性解脂耶氏酵母菌株。
4.一种耐热菌株解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica ，其保藏编号为CGMCCNo.24239。
5.一种利用权利要求3或4所述的菌株发酵合成甘露醇的方法。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从菌株发酵液中提取纯化甘露醇的步骤。
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Applications Claiming Priority (1)
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Citations (2)
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| CN110878261A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-03-13 | 上海交通大学 | 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株 |
| CN113755518A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-12-07 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用 |
-
2022
- 2022-02-21 CN CN202210157542.4A patent/CN114774447B/zh active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110878261A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-03-13 | 上海交通大学 | 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株 |
| CN113755518A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-12-07 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用 |
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| Title |
|---|
| 工业微生物解脂耶氏酵母及其应用研究;宋以梅;贾秀伟;李树标;高翠娟;;中国生物工程杂志(09);全文 * |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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