CN111500657B - 一种联产竹红菌甲素和竹黄胞外多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种联产竹红菌甲素和竹黄胞外多糖的方法，其包括如下步骤：步骤1）竹黄菌发酵培养，步骤2）竹黄菌诱导培养，步骤3）分离胞外多糖，步骤4）分离竹红菌甲素。本发明在竹黄菌液体发酵生产竹红菌素的同时，利用废弃物制备了竹黄多糖，实现了两种药用活性物质的联产，实现了变废为宝，提高了经济效益。

Description

一种联产竹红菌甲素和竹黄胞外多糖的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种联产竹红菌甲素和竹黄胞外多糖的方法。

背景技术

竹黄属子囊菌亚门，核菌纲，球壳目，肉座菌科真菌，其寄生于竹上, 主要分布于江苏、浙 江 、安徽等省, 是我国传统的名贵药用真菌。民间多以竹黄浸酒服用, 治疗风湿性关节炎, 坐骨神经痛等症。竹红菌素和竹黄多糖是竹黄菌中两种重要的活性组分。

竹红菌甲素(HypocrellinA，简称HA)具有光敏产生各种活性氧的能力。与目前已经商品化的光敏剂(如血卟啉类衍生物)相比，其具有易得、易纯化、化学修饰性好、三重态量子产率高、单重态氧量子产率高、光毒性高、体内代谢快等优点，在光动力抗艾滋病毒、治疗肿瘤和微血管类疾病等方面有广泛的潜在应用价值。

天然竹红菌甲素主要来自竹黄菌和竹红菌，但是其产量稀少且不稳定，季节性强，无法满足医药、食品等市场对色素日益增长的需求。竹红菌甲色素的生产方法还有人工化学合成法。化学从头合成一般要经历多步反应步骤，合成和分离的成本过高。药理和临床试验显示竹黄具有镇痛抗炎和保护心血管的作用, 其有效成分竹黄多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有清除作用, 并且对油脂的氧化具有抑制能力,在临床应用和功能性食品开发领域也具有很大的潜在价值。

微生物发酵法具有绿色、产物分离简单和不受季节影响等的优点，是生产竹红菌甲素和竹黄多糖最有前景的方法之一。目前，已有文献报道可以对竹红菌甲素和竹黄多糖同时生产，例如中国专利CN101186932A通过竹红菌液体发酵，分离提取获得了竹红菌甲素和竹黄多糖，但是存在产率低的技术缺陷。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种联产竹红菌甲素和竹黄胞外多糖的方法，通过对发酵培养条件进行改进，优化了竹红菌甲素的合成途径，从而达到了提高竹红菌甲素产率的目的，在生产甲素的同时，获得了竹黄胞外多糖，提高了经济效益，避免了原料的浪费。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种联产竹红菌甲素和竹黄胞外多糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）竹黄菌发酵培养，步骤2）竹黄菌诱导培养，步骤3）分离胞外多糖，步骤4）分离竹红菌甲素。

进一步地，所述步骤1）竹黄菌发酵培养，包括如下步骤：将竹黄菌种子液按照5-10%的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养36-60h，温度为27℃，转速为150rpm，通气为0.6VVM。

进一步地，所述步骤2）竹黄菌诱导培养，包括：往步骤1）的发酵培养基中添加诱导培养基，诱导培养24-48h，温度为30℃，转速为150rpm，通气为0.7VVM；停止发酵，收集发酵液。

进一步地，所述步骤3）分离胞外多糖，包括：将发酵液过滤，收集滤液和菌体；将滤液减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加2倍体积的无水乙醇，置于4℃条件下12h，然后4000rpm离心15min，收集沉淀物，再添加85%乙醇，搅拌均匀，置于4℃条件下6h，然后4000rpm离心10min，收集沉淀物，80℃烘干60min，得到胞外多糖粗提物。

进一步地，所述步骤4）分离竹红菌甲素，包括：将步骤3）所得菌体用蒸馏水洗涤后，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥至恒重，往干燥后的菌体中加入二氯甲烷，二者比例为1g：10ml，30℃超声处理30min，得到提取液，将提取液经减压浓缩干燥，再用氯仿溶解，然后用体积比为2:1的氯仿-水溶剂进行萃取，获得竹红菌素粗提物，再减压浓缩至原体积的五分之一，上样硅胶柱，洗脱，收集红色洗脱液，减压浓缩至有紫红色结晶物产生，静置6h，收集结晶物，干燥。

优选地，所述发酵培养基的组分为：可溶性淀粉50g/L,氯化铵7g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，pH自然。

优选地，所述诱导培养基的组分为：硝酸钙8-15g/L，甲醇75-125g/L。

更优选地，所述诱导培养基和发酵培养基的体积比例为1:5-10。

优选地，所述超声处理的参数为：超声功率为400W，超声工作时间为5s，间隔时间为10s。

更优选地，所述诱导培养基的组分为：硝酸钙14g/L，甲醇100g/L。

与现有技术进行比较，本发明取得的有益的技术效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明在竹黄菌液体发酵生产竹红菌素的同时，利用废弃物制备了竹黄多糖，实现了两种药用活性物质的联产，变废为宝，提高了经济效益。

本发明针对竹红菌甲素的合成途径，通过培养条件的优化来提升甲素的产量，可控性强，能耗降低。

目前，已有研究在发酵培养初期添加钙离子来促进甲素的合成，本发明针对竹红菌甲素的合成机制，通过试验进行验证钙离子的添加时机和浓度，研究表明，在发酵中后期添加钙离子，对甲素的正向调控效果更佳，明显优于发酵初期添加钙离子。

本发明采用二次添加诱导培养基的方式，甲醇会引起菌株对其的防御反应而产生胁迫，进而提高细胞内细胞色素过氧化物酶和活性氧的水平，从而诱导胞内次级代谢物的合成。与其他醇类相比较，甲醇的效果更佳，可能原因是甲醇还能够提供竹红菌甲素合成过程中所需的甲氧基。

发酵中后期，次级代谢物合成迅速，此时适当提升发酵温度，会对菌株产生胁迫，放缓增殖速率，但是能够引起竹黄菌的应激反应，从而有利于诱导竹红菌甲素等次级代谢物的生物合成。

附图说明

图1：硝酸钙的添加时机和添加量对甲素产量的影响；

图2：诱导培养基组分对甲素产量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法，其包括如下步骤：

将保存在 PDA 斜面培养基上的竹黄菌（以CGMCC No.11617为研究对象）置于27℃的培养箱中活化48h，取出三块均为1cm²左右的菌丝块，用匀浆器将菌丝块打碎，接入到装有500ml液体种子培养基的容积为1000ml的培养瓶中进行震荡培养72h，培养温度为27℃，收集种子液，取200ml种子液，接种到装有3L发酵培养基的5L不锈钢小型发酵罐中，发酵培养84h，温度为27℃，转速为150rpm，通气量为0.6VVM；收集发酵液。

所述液体种子培养基的组分为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，pH自然。

1、采用试验确定最佳的发酵培养基组分，组分浓度单位均为g/L，具体见表1：

表1

水平	葡萄糖	可溶性淀粉	氯化铵	磷酸二氢钾	氯化钠	七水硫酸镁	七水硫酸亚铁
								1	30		5	0.5	0.3	0.3	0.1
2	50		7	1	0.5	0.5	0.2
								3	70		9	2	0.7	0.7	0.3
4		30	5	0.5	0.3	0.3	0.1
								5		50	7	1	0.5	0.5	0.2
6		70	9	2	0.7	0.7	0.3

生物量（细胞干重）测定：将发酵液经200目筛过滤，去除滤液，收集菌体，用蒸馏水洗涤后，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥至恒重，称重。

甲素的测定：往菌体中加入二氯甲烷，二者比例为1g：10ml，30℃超声处理30min，超声处理的参数为：超声功率为400W，超声工作时间为5s，间隔时间为10s。提取物利用HPLC进行甲素含量的测定。

HPLC条件：安捷伦HC-C18液相色谱柱，柱温：30℃，流动相为甲醇：水=3:1，流速为1ml/min，检测波长为 465nm。

具体生物量和甲素的含量见表2：

表2

水平	生物量 g/L 发酵液	甲素 mg/g 生物量
			1	6.3	7.4
2	6.8	7.1
			3	7.6	7.3
4	5.9	8.5
			5	6.7	8.3
6	6.8	8.1

综合表2的生物量和甲素的实验结果，选择发酵培养基组分为：可溶性淀粉50g/L,氯化铵7g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，pH自然。

2、在优化的发酵培养基的条件下，硝酸钙的添加时机和添加量对甲素产量的影响，添加时机选择在发酵初期和发酵中期，添加浓度为0.25,0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4单位为g/L，如图1所示，发酵初期添加硝酸钙对甲素影响相对较小，而发酵中期添加硝酸钙能够明显提高甲素的产量，以浓度为1-1.5g/L时提升较快，当浓度增大到2g/L时，达到最大值，较未添加硝酸钙的组提高了0.94倍，继续增加钙离子浓度，对甲素没有明显影响，而且硝酸钙对菌体生物量没有较明显的影响（附图未显示）。

实施例2

在实施例1的基础上，通过优化发酵培养基，选择在发酵中期添加硝酸钙诱导剂，提出了一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法，其包括如下步骤：

将保存在 PDA 斜面培养基上的竹黄菌置于27℃的培养箱中活化48h，取出三块均为1cm²左右的菌丝块，用匀浆器将菌丝块打碎，接入到装有500ml液体种子培养基的容积为1000ml的培养瓶中进行震荡培养72h，培养温度为27℃，收集种子液，取200ml种子液，接种装有3L发酵培养基的5L不锈钢小型发酵罐中，发酵培养48h，温度为27℃，转速为150rpm，通气为0.6VVM；再添加500ml诱导培养基，继续发酵培养36h，温度为27℃，转速为150rpm，通气为0.7VVM；停止发酵，收集发酵液。

根据实施例1对硝酸钙添加浓度的实验情况，选择1.5-2.5g/L的添加量较为适宜。在发酵48h时通过流加包含硝酸钙的诱导培养基来达到提供钙离子的效果。设定诱导培养基中硝酸钙的浓度为14g/L，进一步验证醇类对甲素产量的影响，选择甲醇、乙醇为研究对象，二者在诱导培养基中的浓度分别为0,5,25,50,75,100,125,150,200，单位为ml/L，如图2所示，随着甲醇和乙醇添加量的增加，甲素的产量均有一定的提升，但是乙醇提升的幅度较小，较不添加组，最高能提升20%左右，而当甲醇在诱导培养基中的浓度达到100ml/L时，甲素的产量为29.1mg/g，较不添加组提高了76%，而各组别生物量差异并不大，仅仅在200ml/L的甲醇组生物量较不添加组下降了8%左右，可能是较大浓度的甲醇给菌体增殖带来了一定的阻滞作用。

通过上述试验结果，设定诱导培养基的组分为：硝酸钙14g/L，甲醇100g/L。在该试验条件下，验证诱导培养时的温度对生物量和甲素产量的影响，随着温度的升高，生物量有所下降，但是甲素含量有所提升，当升高到30℃时，生物量较27℃时降低了12.8%，但是甲素含量提高了19.5%，继续升高温度，生物量下降明显，但是甲素含量没有明显的增加，综合权衡生物量和甲素含量对甲素总产量的影响，选择30℃的诱导培养温度最为合适。

实施例3

一种联产竹红菌甲素和竹黄胞外多糖的方法，其包括如下步骤：

将保存在 PDA 斜面培养基上的竹黄菌置于27℃的培养箱中活化48h，取出三块均为1cm2左右的菌丝块，用匀浆器将菌丝块打碎，接入到装有500ml液体种子培养基的容积为1000ml的培养瓶中进行震荡培养72h，培养温度为27℃，收集种子液，取200ml种子液，接种装有3L发酵培养基的5L不锈钢小型发酵罐中，发酵培养48h，温度为27℃，转速为150rpm，通气为0.6VVM；再添加500ml诱导培养基，继续发酵培养36h，温度为30℃，转速为150rpm，通气为0.7VVM；停止发酵，收集发酵液；

将发酵液经200目筛过滤，收集滤液和菌体；将滤液减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加2倍体积的无水乙醇，置于4℃条件下12h，然后4000rpm离心15min，收集沉淀物，再添加到85%乙醇中，比例为1g：10ml；搅拌均匀，置于4℃条件下6h，然后4000rpm离心10min，收集沉淀物，80℃烘干60min，得到胞外多糖粗提物；每升发酵液中可获得胞外多糖粗提物309.3mg，采用硫酸-苯酚法分析藻多糖含量，计算粗提物中纯品的含量为82.1%。

将菌体用蒸馏水洗涤后，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥至恒重，往干燥后的菌体中加入二氯甲烷，二者比例为1g：10ml，30℃超声处理30min得到提取液，超声处理的参数为：超声功率为400W，超声工作时间为5s，间隔时间为10s；将提取液经减压浓缩干燥，再用氯仿溶解，然后用体积比为2:1的氯仿-水溶剂进行萃取，获得竹红菌素粗提物，再减压浓缩至原体积的五分之一，上样硅胶柱，用二氯甲烷/甲醇洗脱系统进行梯度洗脱，收集红色洗脱液，减压浓缩至有紫红色结晶物产生，静置6h，收集紫红色结晶物，干燥。每g菌体可获得提取物23.7mg，

经HPLC检测，甲素的纯度为80.4%。

需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种联产竹红菌甲素和竹黄胞外多糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1)竹黄菌发酵培养，包括如下步骤：将竹黄菌种子液按照5-10％的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养36-60h，温度为27℃，转速为150rpm，通气为0.6VVM；

步骤2)竹黄菌诱导培养，包括：往步骤1)的发酵培养基中添加诱导培养基，诱导培养24-48h，温度为30℃，转速为150rpm，通气为0.7VVM；停止发酵，收集发酵液；

所述诱导培养基的组分为：硝酸钙8-15g/L，甲醇75-125g/L；

步骤3)分离胞外多糖，包括：将发酵液过滤，收集滤液和菌体；将滤液减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加2倍体积的无水乙醇，置于4℃条件下12h，然后4000rpm离心15min，收集沉淀物，再添加85％乙醇，搅拌均匀，置于4℃条件下6h，然后4000rpm离心10min，收集沉淀物，80℃烘干60min，得到胞外多糖粗提物；

步骤4)分离竹红菌甲素，包括：将步骤3)所得菌体用蒸馏水洗涤后，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥至恒重，往干燥后的菌体中加入二氯甲烷，二者比例为1g：10ml，30℃超声处理30min，得到提取液，将提取液经减压浓缩干燥，再用氯仿溶解，然后用体积比为2:1的氯仿-水溶剂进行萃取，获得竹红菌素粗提物，再减压浓缩至原体积的五分之一，上样硅胶柱，洗脱，收集红色洗脱液，减压浓缩至有紫红色结晶物产生，静置6h，收集结晶物，干燥。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：可溶性淀粉50g/L,氯化铵7g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，pH自然。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基和发酵培养基的体积比例为1:5-10。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声处理的参数为：超声功率为400W，超声工作时间为5s，间隔时间为10s。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基的组分为：硝酸钙14g/L，甲醇100g/L。