CN108084017B - 一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，以当归、川芎为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术、中草药配伍应用技术，研制开发出高体外抗氧化能力的阿魏酸提取液，其中混菌好氧发酵菌种主要包括嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌；本申请方法既可以充分利用当归药材中的阿魏酸成分，增强药效，减少药材的浪费，提升药材的治疗效果；又通过中草药及混菌微生物间的协同作用显著提升阿魏酸提取液的抗氧化能力，满足保健、医疗、食品等领域对阿魏酸的应用需求；该工艺技术发酵工艺简单高效、所得产品抗氧化能力和自由基清除能力强，生产成本低，易于工业化规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，尤其是一种利用微生物协同发酵制备高抗氧化能力的阿魏酸提取液，属于生物技术领域。
背景技术
阿魏酸（ferulicacid，简称FA）具有含不饱和双键和羟基的酚酸结构，是阿魏、川芎、当归、升麻、木贼等多种活血化瘀中药的有效成分之一，被应用于心脑血管疾病的治疗。Kawabata等和Ogiwara等报道，阿魏酸能清除自由基，促进清除自由基的酶的产生，增加谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，来调节人体生理机能。廖长秀等也研究了阿魏酸钠对甘油致肾损伤的防治作用，认为其机制与增强肾脏抗氧化功能有关；此外，研究结果表明阿魏酸具有抗血栓、抗动脉粥样硬化、抗菌消炎、抗突变防癌、增强精子活力等一系列卓越的功能特性，越来越引起人们的重视。因此，建立高抗氧化能力的中草药阿魏酸提取技术体系对阿魏酸高值化利用，促进供给侧结构性改革，改善民生具有重要意义。
目前阿魏酸提取主要以麸皮、小麦秸秆等为原料，如专利201510387157.9公开了一种联合超声波辅助酶解和微生物发酵麸皮制备阿魏酸的工艺；专利201510396165.X公开了一种生物法提取小麦秸秆中阿魏酸的方法，并实现了高提取率规模化提取。但阿魏酸在种草药材中所占含量较小，存在提取困难、利用效率低等问题。因此，建立高效的中草药阿魏酸提取技术体系是推进中草药阿魏酸活性成分开发利用的最大技术弊端。
当归是中医常用药材，具有活血化瘀、调经止痛、保肝利胆等作用，它的主要化学成分包括苯酞类化合物、香豆素类、有机酸类、氨基酸、多糖等。川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的功能，临床上用于治疗胸痹心痛、月经不调等。阿魏酸是当归、川芎的主要有效成分，具有镇静安神、保护缺血心肌等作用。中医配伍是指在了解患者具体病情的基础上，配合使用两种及其以上的药物，对患者的病情采取针对性的治疗方案，增强了单味药物的疗效。当归和丹参是中医常用药对，具有活络舒筋、养血安神的功效；本申请探讨对当归、川芎进行配伍提升药物中的阿魏酸体外抗氧化能力的方法，以解决现有中草药中阿魏酸应用存在的技术弊端。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，满足中草药原料当归、川芎阿魏酸高效提取及高抗氧化能力应用，本申请提供一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术、中草药配伍应用技术，研制开发出高体外抗氧化能力的阿魏酸提取液，满足保健、医疗、食品等领域对阿魏酸的应用需求，该工艺技术发酵工艺简单高效、所得产品抗氧化能力和自由基清除能力强，生产成本低，易于工业化规模生产。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，其特征在于所述复方中草药原料为当归和川芎，其质量配伍比例为3:1-2。
上述中草药原料进行如下预提取处理：将当归和川芎原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡40～60min；加入中草药原料质量比1～2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400W，然后静置30min以上。
本申请提供一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，其特征为对预提取后的中草药进行混菌好氧发酵，其中好氧发酵菌种主要包括嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌。
上述混菌好氧发酵工艺具体包括以下步骤：
（1）发酵培养配制：向预提取后的中草药中加入90倍纯净水，然后加入发酵液质量比3～5%葡萄糖、0.3～0.5%硫酸铵、0.1～0.2%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁，搅拌均匀；
（2）好氧发酵：向发酵液中接种嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，接种量分别为发酵液体积比的2～3%、3～5%、5～8%；控温28～35℃进行好氧发酵，摇床转速100～150r/min,发酵时间12～24h；
（3）固液分离：发酵结束后固液分离，得到阿魏酸提取液。
进一步的，好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m3/m3.min，搅拌转速控制在30～60r/min。
优选的，固液分离后的残渣可进行回收利用，添加到下一轮发酵培养基。
优选的，发酵培养基配置过程中可添加1～2%的非淀粉多糖酶和0.5～1%的淀粉酶。
上述嗜热侧孢霉菌的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得嗜热侧孢霉菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
本发明提供一种提高中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，所得阿魏酸具有提取率和体外抗氧化能力显著提升，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药、保鲜等领域的高效利用。
本发明提供一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）本申请科学配伍当归和川芎，既可以充分利用当归药材中的阿魏酸成分，增强药效，减少药材的浪费，提升药材的治疗效果；又通过中草药间的协同作用显著提升阿魏酸提取液的抗氧化能力，起到了“1+1>2”的技术效果。此外，试验结果表明当归和川芎的配比不在本本清配伍比例时抗氧化能力显著下降，差异性显著；
（2）本申请利用好氧菌（嗜热侧孢霉菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌）共同发酵中草药原料提取阿魏酸，充分利用微生物间的协同作用，提升阿魏酸的提取率和体外抗氧化能力，其中：嗜热侧孢霉菌能在髙温下分解纤维素，打破纤维素对阿魏酸逸出的束缚；酵母菌在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的酚酸（包括阿魏酸）从细胞壁中释放出来，且酵母是产生能够释放结合态酚酸的酶类，有利于提升阿魏酸的体外抗氧化能力；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产淀粉酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用；此外，现有研究表明阿魏酸对枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用，但在本申请中，通过微生物协同发酵，辅以生物酶解等，克服了阿魏酸对枯草芽孢杆菌的抑制；
（3）采用液体发酵，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率，在本技术方案下，最长发酵时间为24h，显著低于行业内现有技术的发酵时间；
（4）发酵工艺条件温和，生产成本低，且易于规模化生产，对提升行业经济效益及规模化推广应用具有重要作用。
具体实施方式
实施例1
一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，具体工艺步骤包括：
（1）中草药配伍:按当归和川芎质量配伍比例3:1.6准确配伍；
（2）中草药预处理：将当归和川芎原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡40～60min；加入中草药原料质量比1.5%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400W，然后静置30min以上；
（3）发酵培养配制：向预提取后的中草药中加入90倍纯净水，然后加入发酵液质量比4%葡萄糖、0.45%硫酸铵、0.12%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁，搅拌均匀；
（4）发酵种子液制备：
嗜热侧孢霉菌的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得嗜热侧孢霉菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL;
酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL;
枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL;
（5）好氧发酵：向发酵液中接种嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，接种量分别为发酵液体积比的2.5%、4%、7%；控温28～35℃进行好氧发酵，摇床转速100～150r/min,发酵时间16h；
（6）固液分离：发酵结束后固液分离，得到阿魏酸提取液。
实施例2
一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，具体工艺步骤包括：
（1）中草药配伍:按当归和川芎质量配伍比例3:2准确配伍；
（2）中草药预处理：将当归和川芎原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡40～60min；加入中草药原料质量比2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400W，然后静置30min以上；
（3）发酵培养配制：向预提取后的中草药中加入90倍纯净水，然后加入发酵液质量比5%葡萄糖、0.5%硫酸铵、0.2%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁，搅拌均匀；
（4）发酵种子液制备：
嗜热侧孢霉菌的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得嗜热侧孢霉菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL;
酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL;
枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL;
（5）好氧发酵：向发酵液中接种嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，接种量分别为发酵液体积比的3%、5%、8%；控温28～35℃进行好氧发酵，摇床转速100～150r/min,发酵时间12h；
（6）固液分离：发酵结束后固液分离，得到阿魏酸提取液。
实施例3
一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，具体工艺步骤包括：
（1）中草药配伍:按当归和川芎质量配伍比例3:1准确配伍；
（2）中草药预处理：将当归和川芎原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡40～60min；加入中草药原料质量比1%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400W，然后静置30min以上；
（3）发酵培养配制：向预提取后的中草药中加入90倍纯净水，然后加入发酵液质量比3%葡萄糖、0.3%硫酸铵、0.1%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁，搅拌均匀；
（4）发酵种子液制备：
嗜热侧孢霉菌的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得嗜热侧孢霉菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL;
酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL;
枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL;
（5）好氧发酵：向发酵液中接种嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，接种量分别为发酵液体积比的2%、3%、5%；控温28～35℃进行好氧发酵，摇床转速100～150r/min,发酵时间24h；
（6）固液分离：发酵结束后固液分离，得到阿魏酸提取液。
实施例4 不同工艺条件对阿魏酸提取率的影响
试验分组：试验分为实施例1试验组、对照1组（中草药原料仅含当归，制备工艺同实施例1）、对照2组（中草药原料仅含川芎，制备工艺同实施例1）、对照3组（好氧菌中仅含嗜热侧孢霉菌，中草药配伍及其他制备工艺同实施例1）、对照4组（好氧菌中仅含酿酒酵母，中草药配伍及其他制备工艺同实施例1）、对照5组（好氧菌中仅含枯草芽孢杆菌，中草药配伍及其他制备工艺同实施例1）。
表1 不同工艺条件对阿魏酸提取率的影响
说明：对照5组枯草芽孢杆菌明显受到阿魏酸的抑菌作用。
实施例5 不同工艺条件对阿魏酸提取液体外抗氧化能力的影响
1、指标测定方法
（1）阿魏酸对·OH、O2 -·清除作用：按照·OH、O2 -·测定试剂盒说明书操作测定；
（2）阿魏酸对DPPH自由基的清除作用：精确称取DPPH9.7mg，加少量无水乙醇溶解后，以95%乙醇定容至250mL，制成浓度为0.2mmol/L的DPPH溶液。取2mL已配制的DPPH溶液，分别加入1mL不同浓度阿魏酸溶液，以95%乙醇补足到4mL，混匀，放置30min后，以95%乙醇为空白对照，在517nm处测定吸光值，计算抑制率；
（3）阿魏酸对Fe3+的还原作用：阿魏酸的还原力检测参考Oyaizu方法。依次加入0.75mL0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)、0.75mL1%亚铁氰化钾和0.75mL 1mg/mL的阿魏酸溶液，混匀，50℃水浴20min；冰浴快速冷却后，加入0.75mL10%三氯乙酸，于3000×g、4℃下离心10min；取上清1.5mL加入0.1% FeCl3 0.5mL及ddH2O 10mL混匀后，室温静置反应10min，在700nm处测定提取液吸光度为A1，以1mg/mLVC为对照A，并以零管为A0，计算阿魏酸的相对还原力；
2、试验分组
同实施例4试验分组；
3、试验结果
表2 不同工艺条件对阿魏酸提取液体外抗氧化能力的影响
实施例4和实施例5试验结果表明，中草药原料间的配伍及发酵菌种间的协同作用对复方中草药阿魏酸的提取及其体外抗氧化能力有着显著的影响。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1.一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，其特征在于所述复方中草药原料为当归和川芎，其质量配伍比例为3:1-2；上述中草药原料进行如下预提取处理：将当归和川芎原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡40～60min；加入中草药原料质量比1～2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400W，然后静置30min以上；所述预提取后的中草药进行混菌好氧发酵，其中好氧发酵菌种包含嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌；具体包括以下步骤：
（1）发酵培养配制：向预提取后的中草药中加入90倍纯净水，然后加入发酵液质量比3～5%葡萄糖、0.3～0.5%硫酸铵、0.1～0.2%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁，搅拌均匀；
（2）好氧发酵：向发酵液中接种嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，接种量分别为发酵液体积比的2～3%、3～5%、5～8%；控温28～35℃进行好氧发酵，摇床转速100～150r/min,发酵时间12～24h；
（3）固液分离：发酵结束后固液分离，得到阿魏酸提取液。
2.根据权利要求1所述的一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，其特征在于固液分离后的残渣进行回收利用，添加到下一轮发酵培养基。
3.根据权利要求1所述的一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，其特征在于发酵培养基配置过程中添加1～2%的非淀粉多糖酶和0.5～1%的淀粉酶。
4.根据权利要求1所述的一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，其特征在于嗜热侧孢霉菌的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得嗜热侧孢霉菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
5.根据权利要求1所述的一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，其特征在于酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述方法接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
6.根据权利要求1所述的一种提高复方中草药阿魏酸提取液抗氧化能力的方法，其特征在于枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
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Denomination of invention: A Method for Improving the Antioxidant Ability of Ferulic Acid Extract from Compound Chinese Herbs Effective date of registration: 20230905 Granted publication date: 20201124 Pledgee: China Co. truction Bank Corp Guangzhou Panyu branch Pledgor: Guangzhou kangmaigu Pharmaceutical Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2023980055369 |
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