CN1854155B - 一种纯化rHSA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纯化rHAS的方法。本发明所提供的纯化rHSA的方法，是将含rHSA的发酵上清依次经过高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层析，得到纯化rHSA，其中，所述含rHSA的发酵上清在经过高盐阳离子交换层析前还经过在稳定剂、脱色剂和蛋白酶抑制剂存在下在60-75℃加热处理，然后将加热处理后的溶液调节pH4.0-5.5的步骤；经过所述阳离子交换层析的溶液或经过所述疏水交换层析的溶液还经过硼酸盐处理。本发明方法实验周期短，产品纯度高，具有良好的应用前景。

Description

一种纯化rHSA的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质的纯化方法，特别是涉及一种纯化rHSA的方法。

背景技术

人血白蛋白(Human Sorum Albuman，HSA)是血浆中最丰富的蛋白成分，有助于维持血液渗透压，能结合小分子营养物质和药物，起着运输作用。临床上用于治疗低蛋白血症，蛋白缺乏综合症，创伤及手术后休克及烧伤，肝硬化，肾病综合症等。还作为其他药物赋形剂、医药器械中管路的涂层、体外授精培养基等。

最早获得的HSA一直通过血浆分离方法所得。然而该方法具有原材料供应不足，常出现周期性短缺以及携带肝炎病毒、HIV病毒的重大缺陷，不仅在生产过程中对操作人员带来严重的危害，而且对广大患者也存在潜在的危险。

利用重组DNA方法生产重组人血清白蛋白(rHSA)已经得到了开发应用。由于HSA临床使用剂量高达10克，相对大多数毫克、微克和纳克级生物药物来说，其纯度要求高得多，必须充分去除源于宿主细胞的组分。EP0612761、EP0570916和EP0699687均公开了纯化rHSA的方法，但这些方法存在周期长，去除异源杂质能力差，收率低等缺陷。

中国发明专利申请(03123502.6)公开了一种纯化rHSA的方法，该方法主要包括如下步骤：

1)将含rHSA的发酵上清在稳定剂或稳定剂、还原剂存在条件下加热，调节溶液pH4.5；

2)将上述溶液直接上样高盐阳离子柱吸附，洗脱，进行阳离子交换层析；

3)将阳柱洗脱液加热；

4)将上述溶液进行疏水交换层析；

5)将经过疏水交换层析的溶液进行弱阴离子交换层析；

6)将阴柱洗脱液浓缩、分装，得到rHSA产品。

其中，在上述方法中常用的高盐阳离子柱为CST-II FF，疏水层析柱为PhenylSepharose FF，弱阴离子柱为Butyl Sepharose，这些介质均可以购于AMERSHAMBIOSCIENCES公司。与其他方法相比，该方法所纯化的重组HSA特征的显色物质水平A350/280比值最低可降到0.02—0.04，但其他杂质水平偏高，需要进行进一步优化处理。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯化rHSA的方法。

本发明所提供的纯化rHSA的方法，是将含rHSA的发酵上清依次经过高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层析，得到纯化rHSA，其中，所述含rHSA的发酵上清在经过高盐阳离子交换层析前还经过在稳定剂、脱色剂和蛋白酶抑制剂存在下在60—75℃加热处理，然后将加热处理后的溶液调节pH4.0—5.5的步骤；经过所述阳离子交换层析的溶液或经过所述疏水交换层析的溶液还经过硼酸盐处理。

所述稳定剂为棕榈酸或辛酸钠；所述脱色剂为大孔树脂、硅藻土或活性碳，优选为活性碳；所述蛋白酶抑制剂为PMF、EDTA或EGTA，优选为EDTA。在发酵上清液中，所述稳定剂的加入量为1—10mmol/L，所述脱色剂的加入量为0.1—10g/100ml，所述蛋白酶抑制剂的加入量为0.1—10mmol/L。

对发酵上清液进行加热处理的时间为10—100分钟。优选的加热处理的温度为72℃，加热处理的时间为20分钟。

对发酵液加热处理结束后，为方便溶液在阳离子交换柱的吸附，加热处理后的溶液调节pH4.5—5.3；优选为pH5.2。

所述硼酸盐处理按如下过程进行：在溶液中加入氯化钙和硼酸盐，调节pH9.0—10，处理5—40小时；所述硼酸盐为原硼酸或四硼酸钠，浓度为0.01—1mol/L。

其中，所述硼酸盐为四硼酸钠，浓度为0.1mol/L；所述处理时间为12—16小时。

本发明中常用高盐阳离子交换层析介质为CST-II FF；疏水交换层析介质为PhenylSepharose FF或蓝胶Blue Sepharose FF；弱阴离子交换层析介质为AminobutylSepharose FF。这些介质均为Amersham Biosciences公司产品，可以从该公司购买得到。

本发明方法在对rHSA发酵上清液进行加热处理过程中加入稳定剂、脱色介质和蛋白酶抑制剂，能有效脱除色素，使得纯化产品的色素比值(A₃₅₀/A₂₈₀)大幅降低，低于0.0015，并保证蛋白在纯化过程中的稳定性；在纯化过程中增加硼酸盐脱糖处理步骤，使异源杂质水平降低，产品内毒素水平以鲎试剂检测低于1.5EU(产品浓度为200mg/ml时)，宿主蛋白含量低于1ng/ml。本发明方法实验周期短，产品纯度高，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明方法与对照方法各个分离步骤样品的电泳图；

图2为纯化rHSA的TSK3000柱纯度分析图谱；

图3为本发明方法各步分离样品的SDS-PAGE梯度电泳图；

图4为血源HSA和rHSA的ES-MS图谱；

图5为发酵上清液的Superdex200(XK26/700)分析图谱。

具体实施方式

本发明rHSA的纯化过程如下：

为减少热原物质产生，将rHSA发酵液采用0.22um膜(MILLIPORE公司生产)过滤，然后对其及时加热以灭活蛋白酶。为了抑制外源色素与目标蛋白的结合，保证蛋白的稳定性，并抑制耐高温蛋白酶的活性，加热时加入脱色介质、稳定剂以及酶抑制剂，脱色介质如大孔树脂、硅藻土、活性炭等，优选活性炭；稳定剂如棕榈酸、辛酸钠等，酶抑制剂如PMF、EDTA、EGTA等，优选EDTA。在稳定剂、脱色介质和酶抑制剂同时存在下，调发酵上清液pH6.0-7.0，然后开始加热，加热温度60-75℃，时间10—100分钟，优选为72℃、20分钟，在此过程中蛋白酶被灭活或被抑制。经过加热的样品，快速冷却后，调pH4.0-5.5，优选4.5-5.3，更优为5.2。

上述样品无需稀释可以直接进入高盐阳离子(HSL型)介质CST-II FF(AMERSHAM BIOSCIENCES公司)进行纯化。为更好地去除异源杂质，在进行洗脱前采用高浓度氯化钠洗涤，盐浓度为0.5-3mol/L，优选采用含2mol/L氯化钠的25mol/L的醋酸钠溶液，然后采用洗脱剂洗脱得到经过阳柱分离的溶液。采用该步CST-II FF纯化，可以从上清液中去除了大量的游离色素、糖、核酸、宿主蛋白等外源杂质。

经过阳柱分离的溶液加入稳定剂如辛酸盐和还原剂如半胱氨酸、谷光肝肽等，在50-80℃加热处理10-100分钟，优选为60分钟。冷却后用于疏水交换层析。

将上述经过处理的溶液采用Phenyl Sepharose FF或蓝胶Blue Sepharose FF(发玛西亚公司产品)进行疏水交换层析，目标蛋白在层析柱上流穿，而外源色素的45kd降解片段被吸附，从而得到分离。

为了进一步降低糖含量，对上述经过疏水交换层析分离的溶液用硼酸盐处理：可采用原硼酸或四硼酸钠，优选四硼酸钠和氯化钙，浓度在0.01-1mol/L，优选0.1mol/L，pH9.0-10，作用时间为5-40小时，优选为12-16小时。该步硼酸盐处理也可以用于处理经过阳柱分离的溶液，从而提前到疏水交换层析之前进行，也能达到相同的效果。

将经过疏水交换层析的样品经0.22um膜过滤后进入一种弱阴离子介质Aminobutyl Sepharose FF(AMERSHAM BIOSCIENCES公司)中进行精制分离，可使外源杂质成分得到更大幅度减少。

最后，弱阴离子层析的洗脱组分用已知方法，如超滤浓缩方法、冷冻干燥方法等制成各种成品。

具体的，rHSA的生产和纯化操作如下：

一、rHSA的发酵生产

所用的培养菌株为：巴斯德毕式酵母HSA75-10(菌种保藏号CGMCC NO.1360)

所用培养基的组成：

1、种子培养基

含有2％的细菌胨、1％的酵母抽提物、2％的甘油，其余为水。

2、批次发酵培养基

成分                        /L

甘油                        50.0g

H₃PO₄(85％)                 14.0ml

CaSO₄.2H₂O                  0.6g

K₂SO₄                       9.5g

MgSO₄.7H₂O                  7.8g

KOH                        2.6g

0.2g/l生物素(Biotin)溶液   1.6ml

YTB溶液                    2ml

(YTB溶液：每升中含FeSO₄.7H₂O65.0g，CuSO₄.5H₂O6.0g，ZnSO₄.7H₂O20.0g，MnSO₄.5H₂O3.0g，H₂SO₄5.0ml)

所用补料：甘油或甲醇(甲醇作为诱导剂)，补加补料用量根据发酵过程中溶氧情况确定。

1)种子培养

从冷冻管中取出1ml含生产细胞的菌液HSA75-10(菌种保藏号CGMCCNO.1360)，接入含200ml种子培养基的1000ml带挡板的摇瓶中，在30℃条件下，摇床培养24小时。培养24小时后，取全部培养液接入5L批次发酵培养基中。

2)发酵培养

把200ml种子培养液接入含5L批次发酵培养基的10L发酵罐中，通气搅拌培养，通气量为0.5-0.8WWM。发酵第一阶段为菌体生长期，于30℃下进行培养，搅拌转速的低限与高限分别为200与1000rpm，该阶段通过溶氧电极监控溶氧量，控制溶养量在饱和溶氧的50％左右，当溶氧值迅速升到100％时，说明批次发酵培养基中的甘油消耗完，此时开始补料过程，流加补料甘油，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之间，同时检测发酵液中细胞浓度，取发酵液用分光光度计在600纳米下测吸光值即OD₆₀₀值(如果发酵液的细胞浓度超过仪器测定范围，则精密稀释发酵液后再用仪器测定)，当得到的发酵液的OD600值约为200时降低培养温度，同时停止补加甘油；第二阶段诱导期在21℃进行，当发酵罐的温度降低至设定温度时，监控溶氧值，当溶氧值回升至100％时，开始流加甲醇(浓度100％)，起始流速5ml/h，持续恒速流加直至溶氧值下降至80％，然后增加甲醇流加速度，通过调节流加甲醇的速度，使溶氧值控制在30％，直至发酵过程结束。在整个发酵培养过程中，发酵液的pH控制在5.5，当发酵液泡沫过大的时候加入泡敌消泡，总发酵培养360小时。

将所得发酵液采用压滤方法得发酵上清(简称CCS)，发酵上清液在Superdex200(XK26/700)的分析图谱如图5所示。

二、rHSA的纯化

在纯化过程中所用的各种缓冲液如表1所示。

表1.缓冲液一览表

 

名称	缓冲液配方
		溶液A	pH4.5的25mM/L的醋酸钠
溶液B	pH7.0的50mM/L磷酸纳，0.1M/L氯化钠，10mM/L的辛酸钠.
		溶液C	pH6.0的50mM/L磷酸纳，0.1M/L氯化钠。
溶液D	pH6.0的50mM/L磷酸纳，0.2M/L氯化钠。

1、发酵液的加热处理

取上面得到的发酵上清液60L用0.22um膜(MILLIPORE公司生产)过滤，然后加入1.2kg活性碳，在5mM辛酸钠、5mM EDTA存在下，调pH值5.8-7.0，在72℃下加热20分钟，快速冷却，然后用乙酸调pH值4.5。

2、高盐阳离子层析分离

将上述经过处理的样品经膜过滤后直接以150cm/h流速上样高盐阳离子CST-IIFF柱(XK50/60，Vt＝300ml，Amersham Biosciences公司，预先用溶液A平衡)。上样结束后，用溶液A洗涤2柱体积；然后用pH值4.5，含2M氯化钠的25mM乙酸钠溶液洗涤2柱体积；再用溶液A洗涤2柱体积；最后用溶液B洗脱，得CST-II BD组分。

3、加热处理

向所得CST-II BD组分中加入辛酸钠和半胱氨酸，至最终浓度分别为5mM和10mM，在60℃加热60分钟，迅速冷却。

4、疏水层析分离和浓缩

加热后样品经0.45和0.22um的膜过滤，进入Phenyl Sepharose ^TM Fast Flow(highsub)介质(XK50/60，Vt＝500ml，Amersham Biosciences公司，预先用溶液C平衡)。在此条件下，rHSA未被吸附，在流出部分，收集上样流出液，用截留分子量3万的浓缩膜包(Millipore公司生产)进行浓缩至rHSA100mg/ml左右。

5、硼酸/硼酸盐脱糖处理

向浓缩组分中加入四硼酸钠和氯化钙，使最终浓度为50—100Mm，调pH值9.0，静置过夜。离心分离，用截留分子量30000的超滤膜浓缩，然后用溶液C换液。

6、弱阴离子层析分离

将上述浓缩组分直接进入Aminobutyl Sepharose^TMFast Flow柱(XK50/60，Vt＝500ml，Amersham Biosciences公司，用溶液C预平衡)，上样结束后，用溶液C洗涤2柱体积，然后用溶液D进行洗脱，得Amino-BD组分。

7、浓缩换液

将Amino-BD组分用截留分子量30000的超滤膜浓缩，然后用含辛酸钠的氯化钠溶液换液，得到最终含rHSA20％的终产品。

三、产品的比较与鉴定

1、加热方法比较

以中国发明专利申请(03123502.6)纯化方法作为对照，该方法纯化各步骤和本发明方法纯化各步骤样品的还原SDS-PAGE和非还原SDS-PAGE电泳图如图1所示，图中1—4依次为对照方法上柱前样品、经阳柱分离的样品、经疏水柱分离的样品和经阴柱分离的样品，5—8依次为本发明方法的上柱前样品、经阳柱分离的样品、经疏水柱分离的样品和经阴柱分离的样品。

在酵母表达系统中，除目的蛋白外，同时表达各种各样的蛋白酶，其中含有耐高温的蛋白酶。图1结果表明，采用本发明的上清液处理方法能够更好抑制蛋白酶活性。

2、本发明各步纯化rHSA显色程度、产率和收率

采用本发明方法进行纯化rHSA时，各个分离步骤样品中rHSA浓度、产率、糖含量以及显色程度结果如表2所示。其中，用bradford方法测定蛋白浓度，计算总蛋白量，从而计算各步收率；糖含量用苯酚-硫酸法测定；显色程度A350/A280比值采用紫外分光光度计测定(Ultrospec^TM3300pro，发玛西亚公司生产)。

表2.本发明各步rHSA浓度、产率、糖含量以及显色程度

3、纯化rHSA产品性质分析

1)TSK3000柱纯度分析

将含rHSA的溶液注入用0.3％氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)平衡的TSK3000柱(日本Tosol公司生产)，然后用此平衡液洗脱，流速1ml/min，通过A280进行检测，结果如图2所示，呈单峰，纯度为99.71％。

2)Native-PAGE和SDS-PAGE电泳分析

采用Phastsystem电泳系统(安玛西亚公司)，用8-25％梯度胶进行Native-PAGE电泳分析，考玛斯亮蓝染色，10ug呈单带。10-15％的梯度胶进行SDS非还原和还原电泳分析，考玛斯亮蓝染色，上样量2ug呈单带。电泳结果如图3所示，图中泳道1为发酵上清液样品，2为经阳柱分离样品，3为经疏水柱分离样品，4为经阴柱分离样品10μg，5为商品HSA10μg，6为经阴柱分离样品(非还原电泳)2μg，7为经阴柱分离样品(还原电泳)2μg，8为商品HAS(还原电泳)2μg。

3)用ES-MS测定分子量

对血源白蛋白产品(pHSA)和重组白蛋白(rHSA)产品用G-25柱(5ml，Pharmacia公司产品)进行脱盐处理，然后用电喷雾质谱方法测定分子量，发现所分离得到的rHSA分子量为66503Da，血源白蛋白产品分子量为66606Da，所得rHSA与人血清白蛋白的理论分子量66472Da更接近，结果如图4所示。

4)等电点测定

用聚丙烯酰氨凝胶IEF3-9测定rHSA等电点为4.7-5.2，与血源白蛋白相同。

5)内毒素水平检测

将产品用内毒素检测用水稀释至40mg/ml，按照内毒素检测方法，0.25EU鲎试剂检测(中国湛江海洋生物制品厂生产)，呈阴性。

6)其他测试

rHSA蛋白浓度20％，宿主蛋白含量低于1ng/ml，多糖含量测定低于血源产品。

Claims (8)

1.一种纯化rHSA的方法，是将含rHSA的发酵上清依次经过高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层析，得到纯化rHSA，其特征在于：

所述含rHSA的发酵上清在经过高盐阳离子交换层析前还经过在稳定剂、脱色剂和蛋白酶抑制剂存在下在60-75℃加热处理，然后将加热处理后的溶液调节pH4.0-5.5的步骤；经过所述阳离子交换层析的溶液或经过所述疏水交换层析的溶液还经过硼酸盐处理；

所述硼酸盐处理按如下过程进行：在溶液中加入氯化钙和硼酸盐，调节pH9.0-10，处理5-40小时；所述硼酸盐为原硼酸或四硼酸钠，浓度为0.01-1mol/L；

所述稳定剂为棕榈酸或辛酸钠；所述脱色剂为大孔树脂、硅藻土或活性碳；所述蛋白酶抑制剂为EDTA或EGTA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脱色剂为活性碳；所述蛋白酶抑制剂为EDTA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述稳定剂的加入量为1-10mmol/L，所述脱色剂的加入量为0.1-10g/100ml，所述蛋白酶抑制剂的加入量为0.1-10mmol/L。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述加热处理的时间为10-100分钟。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述加热处理的温度为72℃，加热处理的时间为20分钟。

6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述加热处理后的溶液调节pH4.5-5.3。

7.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述硼酸盐为四硼酸钠，浓度为0.1mol/L；所述处理时间为12-16小时。

8.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述高盐阳离子交换层析介质为CST-II FF；所述疏水交换层析介质为Phenyl Sepharose FF或蓝胶Blue Sepharose FF；所述弱阴离子交换层析介质为Aminobutyl Sepharose FF。

Images