CN103194481B - 表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用 - Google Patents
表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103194481B CN103194481B CN201310078280.3A CN201310078280A CN103194481B CN 103194481 B CN103194481 B CN 103194481B CN 201310078280 A CN201310078280 A CN 201310078280A CN 103194481 B CN103194481 B CN 103194481B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- serum albumin
- human serum
- recombinant plasmid
- sequence table
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于表达人血清白蛋白的质粒及其应用。本发明提供的用于表达人血清白蛋白的质粒,包括表达盒甲和表达盒乙;表达盒甲依次包括:序列3所示的AOX1启动子、人血清白蛋白的编码基因、序列4所示的CYC1翻译终止子;表达盒乙依次包括序列5所示的GAP启动子、所述人血清白蛋白的编码基因、序列6所示的AOX1翻译终止子;所述人血清白蛋白为如下(1)或(2):(1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(2)将序列11的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列11衍生的蛋白质。本发明提供的重组酵母菌在生长和诱导阶段均能表达人血清白蛋白,表达量高且遗传稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用。
背景技术
天然人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)在肝脏中由肝实质细胞合成,在血浆中的半寿期约为15-19天,是非糖蛋白,等电点(PI)为4.7。人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的单链蛋白质,分子量为66.5kDa,为由α-螺旋组成的心形分子,包含三个结构域(1-195AA的结构域I、196-383A的结构域Ⅱ、384-585A的结构域Ⅲ)。
通过比对不同来源的白蛋白氨基酸序列发现,白蛋白中Gys位置十分保守,这就决定了它的三维结构的保守性。此外,白蛋白分子会因结合的分子大小不同,环境条件不同而使形状有所变化。在非变性条件下,白蛋白分子内部的二硫键又会使其恢复原状,所以白蛋白具有良好的弹性。
人血清白蛋白是血液系统的重要组成部分,其独特的三级空间结构,使其拥有了结合、运输内源性和外源性物质,维持血液胶体渗透压,清除自由基,抑制血小板功能,抗凝血及影响血管渗透性等多样的生化特性,成为现代医学中十分重要的生物制品。据统计,在美国有38%的白蛋白被用作治疗急性血容量减少以及其他原因造成的血容量减少等。另外,人血清白蛋白还可以抑制多核细胞产生自由基,对自由基进行清除,维持体系统的正常秩序。它还是许多内源性和外援性物质的重要载体,临床上广泛应用于高胆红素血症(新生儿)、白细胞增多症、人血清白蛋白过少症、以及呼吸窘迫综合征等多种疾病的治疗。因此,人血清白蛋白也逐渐成为了临床用量最大的蛋白制剂。
血浆来源的人血清白蛋白给人类带了各种疾病传播的危险,尤其是HIV、HBV病毒,为疾病的治疗带来了不安全的因素。而从生物工程和基因重组技术为基点出发得到的人血清白蛋白就在根源上避免了病毒的污染,成为了近年来越来越多的科研工作者的研究目标。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于表达人血清白蛋白的质粒及其应用。
本发明提供的用于表达人血清白蛋白的质粒,包括表达盒甲和表达盒乙;
所述表达盒甲自上游至下游依次包括:序列表的序列3所示的AOX1启动子、人血清白蛋白的编码基因、序列表的序列4所示的CYC1翻译终止子;
所述表达盒乙自上游至下游依次包括:序列表的序列5所示的GAP启动子、所述人血清白蛋白的编码基因、序列表的序列6所示的AOX1翻译终止子;
所述人血清白蛋白为如下(1)或(2):
(1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(2)将序列11的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列11衍生的蛋白质。
所述人血清白蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子:
1)编码区如序列表中序列2自5’末端第13至1842位核苷酸所示的DNA分子;
2)序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示的DNA分子;
3)序列表中序列2所示的DNA分子;
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子;
5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃条件下杂交并洗膜。
所述用于表达人血清白蛋白的质粒还包括可DNA片段丙;所述DNA片段丙包括序列表的序列7所示的ADE2启动子和序列表的序列8所示的ADE2基因,且由所述ADE2启动子启动所述ADE2基因的表达。
所述DNA片段丙中还可包括序列表的序列9所示的TRP2基因、序列表的序列10所示的氨苄青霉素抗性基因和pUC复制起点。
所述重组质粒的制备方法具体如下:将用限制性内切酶BglII和BamHI双酶切重组质粒pGAGZαA-HSA得到含有所述表达盒乙的片段(约2.8kb的片段)插入重组质粒pPink-HC-HSA的BamHI酶切位点,得到所述重组质粒(重组质粒pPGH-HX02);
所述重组质粒pPink-HC-HSA为在pPink-HC载体的EcoRI和KpnI酶切位点之间插入序列表的序列2自5’末端第7-1842位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒;
所述重组质粒pGAGZαA-HSA为在pGAGZαA载体的BstBI和KpnI酶切位点之间插入序列表的序列2自5’末端第10-1842位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
将以上任一所述的用于表达人血清白蛋白的质粒导入宿主菌得到的工程菌也属于本发明的保护范围。所述宿主菌可为毕赤酵母,具体可为PichiaPinkTM Strain1(ade2)。
以上任一所述的工程菌在生产人血清白蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中,用所述工程菌生产人血清白蛋白的方法具体如下:将所述工程菌的种子液接种至基础盐培养基进行发酵,发酵温度控制在25-28℃,pH=6,通过调节通气量(可为0-250L/h)和搅拌转速(可为300-700r/min)使溶解氧体积分数(DO)保持在20%;培养10小时后开始补加甘油,每小时补加一次,每次补加20mL,补加8-10次(具体可为9次);最后一次补加甘油4小时后开始补加甲醇溶液(每升甲醇中含有12mL PTM1溶液),每12小时补加一次,每次补加后甲醇在培养体系中的浓度为1%(体积比)。
发酵时间具体可为192小时。
基础盐培养基的制备方法(pH为6):取5g NH4H2PO4、0.093g CaSO4、1.82g K2SO4、1.49g MgSO4·7H2O、0.3g KOH、5g葡萄糖、0.5g KH2PO4和40ml甘油溶于水并用水定容至1L。
在重组酵母的筛选过程中,在筛选平板上可同时看到白色和粉色的菌落。菌落的颜色直接反应了人血清白蛋白的相对表达量,因为菌落的颜色与质粒的拷贝数有关,也反应了启动子的强弱。粉色克隆表达的ADE2蛋白较少,白色克隆代表了整合入基因组的拷贝数多,产生的ADE2蛋白较多,尽量挑取白斑菌落。
GAP启动子是组成型表达启动子,可使重组酵母菌在葡萄糖、甘油、油酸或甲醇存在下在生长阶段表达外源蛋白,控制的下游基因表达量比甲醇诱导下的AOX1启动子更高。AOXl启动子是受甲醇诱导的强效启动子,可用甲醇严格调控外源基因的表达。酵母表达系统具有易于培养、繁殖速度较快、便于工程化操作等优点,同时又能进行高密度发酵,且具有适于蛋白产物正确折叠的内环境和翻译后修饰加工系统,外源蛋白还可以分泌至胞外,更有利于下游纯化工艺的操作。毕赤酵母内源性蛋白少,最小生长培养基简单,产生的有毒物质少,外源蛋白表达能占培养液中蛋白的绝大部分。与酿酒酵母相比,毕赤酵母不存在过度糖基化问题,对蛋白产物的糖基化修饰方式更接近高等真核生物,不易产生免疫原性,因而在临床应用中更安全。PichiaPinkTMStrain1(ade2)不仅具有毕赤酵母菌的所有优点,由于菌体内部ade2基因部分启动子和完整的编码序列缺失,不会因为基因突变位点的偶然性突变而恢复成野生型,稳定性高。采用本发明提供的重组质粒构建重组酵母菌,利用ade2基因与缺陷型受体菌之间的互补特性进行阳性重组子筛选,安全、可靠。本发明提供的重组酵母菌在生长和诱导阶段均能表达人血清白蛋白,表达量高且遗传稳定性高。
附图说明
图1为重组质粒pPink-HC-HSA的结构示意图。
图2为重组质粒pGAGZαA-HSA的结构示意图。
图3为重组质粒pPGH-HX02的结构示意图。
图4为实施例3中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图5为实施例4中的western-blot结果。
图6为实施例4的质谱鉴定中一级肽段裂解离子峰图。
图7为实施例4的质谱鉴定中二级肽段裂解离子峰图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
大肠杆菌TOP10购自Invitrogen公司。PichiaPinkTM Strain1(ade2),即缺失ade2基因的毕赤酵母菌株,购自Invitrogen公司。pPink-HC载体(酵母表达载体)、pPink-LC载体(酵母表达载体)和pGAPZαA载体(酵母表达载体)均购自Invitrogen公司。氨苄青霉素和博来霉素均购自北京全式金生物技术有限公司。酵母选择性营养缺陷培养基PAD(不含腺嘌呤的筛选培养基):北京泛基诺公司。实施例中所用的商购的HSA蛋白标准品:北京鼎国DH017。
PTM1溶液:五水合硫酸铜6.0g、碘化钠0.08g、一水硫酸锰3.1g、硼酸0.02g、氯化钴0.5g、硫酸锌20.0g、硫酸亚铁(FeSO4·7H20)65.0g和VH(生物素)0.2g,用蒸馏水定容至1000mL。
5’AOX1primer:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’;
3’CYC1primer:5’-GTTACATGCGTACACGCGTTTGTACAG-3’。
5’GAP primer:5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’;
3’AOX1primer:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。
实施例1、优化基因的获得
NCBI中的人血清白蛋白基因如序列表的序列1所示(GENBANK ACCESSION NO.NM_000477),由1830个核苷酸组成。序列1中,自5’末端第1至72位核苷酸为信号肽,第73至1827位核苷酸为成熟蛋白的编码区,第1828至1830位核苷酸为终止密码子。将序列1所示DNA命名为HSA野生基因。
根据毕赤酵母密码子的偏好性将序列表的序列1进行优化,同时去除序列1中具有的两个限制性内切酶BglII识别序列,同时在起始密码子前增加Kozak序列(GAAACG),优化后的序列如序列表的序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示。因为优化后的序列同样具有人血清白蛋白的功能,所以将该优化后的序列命名为HSA优化基因。
序列表的序列1所示的DNA分子和序列表的序列2所示的DNA分子均编码序列表的序列11所示的HSA蛋白。
实施例2、重组质粒pPGH-HX02的构建
一、重组质粒pPink-HC-HSA的构建
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切步骤1得到的双链DNA分子,回收酶切产物。
3、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切pPink-HC载体,回收约7.7kb的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接,得到重组质粒pPink-HC-HSA。根据测序结果,对重组质粒pPink-HC-HSA进行结构描述如下:在pPink-HC载体的EcoRI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第7-1842位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒pPink-HC-HSA的结构示意图见图1。
二、重组质粒pGAGZαA-HSA的构建
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、用限制性内切酶BstBI和KpnI双酶切步骤1得到的双链DNA分子,回收酶切产物。
3、用限制性内切酶BstBI和KpnI双酶切pGAGZαA载体,回收约3.1kb的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接,得到重组质粒pGAGZαA-HSA。根据测序结果,对重组质粒pGAGZαA-HSA进行结构描述如下:在pGAGZαA载体的BstBI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第10-1842位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒pGAGZαA-HSA的结构示意图见图2。
三、重组质粒pPGH-HX02的构建
1、用限制性内切酶BglII和BamHI双酶切重组质粒pGAGZαA-HSA,回收约2.8kb的片段。
2、用限制性内切酶BamHI酶切重组质粒pPink-HC-HSA,回收约9.4kb的片段(线性化载体)。
3、将步骤1回收的片段和步骤2回收的片段连接,得到重组质粒pPGH-HX02。重组质粒pPGH-HX02的结构示意图见图3。
重组质粒pPGH-HX02中包括两个HSA表达盒,分别命名为表达盒甲和表达盒乙。表达盒甲自上游至下游依次包括:序列表的序列3所示的AOX1启动子、序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示的HSA优化基因、序列表的序列4所示的CYC1翻译终止子。表达盒乙自上游至下游依次包括:序列表的序列5所示的GAP启动子、序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示的HSA优化基因、序列表的序列6所示的AOX1翻译终止子。重组质粒pPGH-HX01中还包括序列表的序列7所示的ADE2启动子、序列表的序列8所示的ADE2基因(报告基因)、序列表的序列9所示的TRP2基因(色氨酸合成酶基因)、序列表的序列10所示的Amp抗性基因(氨苄青霉素抗性基因)和pUC复制起点。
实施例3、制备重组工程菌并表达HSA蛋白
一、制备重组菌-Ⅰ
1、用限制性内切酶PmeI酶切重组质粒pPGH-HX02,回收线性化的质粒。
2、制备酵母感受态细胞
(1)挑取PichiaPinkTM Strain1(ade2)的单菌落,接种至5mL YPD液体培养基,28℃、300rpm振荡培养24h。
(2)将步骤(1)得到的培养物接种至YPD液体培养基,28℃、300rpm振荡培养,直至OD600nm=1.3-1.5。
(3)取步骤(2)得到的培养物,4℃、1500g离心5min,收集菌体。
(4)用冰预冷的无菌水重悬步骤(3)得到的菌体,4℃、1500g离心5min,收集菌体。
(5)用预冷的无菌水重悬步骤(4)得到的菌体,4℃、1500g离心5min,收集菌体。
(6)用预冷的1M山梨醇水溶液重悬菌体,4℃、1500g离心5min,收集沉淀。
(7)用预冷的1M山梨醇水溶液重悬菌体,冰上放置。
3、制备重组菌
(1)将步骤1得到的线性化质粒和步骤2得到的菌体悬液混合后吸至0.1cm电转杯中,冰浴5min,然后660v100Ω电击一次,立即加入1mL预冷的YPDS培养基,吹打均匀,28℃孵育3h;然后吸取300μL涂布于酵母选择性营养缺陷培养基PAD上,将平板倒置于培养箱中,28℃培养,直至单个菌落出现。
在重组酵母的筛选过程中,在筛选平板上可同时看到白色和粉色的菌落。菌落的颜色直接反应了人血清白蛋白的相对表达量,因为菌落的颜色与质粒的拷贝数有关,也反应了启动子的强弱。粉色克隆表达的ADE2蛋白较少,白色克隆代表了整合入基因组的拷贝数多,产生的ADE2蛋白较多,挑取白斑菌落。
(2)挑取单克隆,接种至YPD液体培养基中,28℃、300rpm振荡培养,然后12000rpm离心2min,收集菌体沉淀。
(3)取步骤(2)得到的菌体沉淀,提取基因组DNA,采用5’AOX1primer和3’CYC1primer组成的引物对进行PCR鉴定,或采用5’GAP primer和3’AOX1primer组成的引物对进行PCR鉴定。
如果采用5’AOX1primer和3’CYC1primer组成的引物对进行PCR鉴定显示2.2bp条带,且采用5’GAP primer和3’AOX1primer组成的引物对进行PCR鉴定显示2.0bp条带,待测菌株即为目的菌株(重组菌-Ⅰ)。
二、制备重组菌-Ⅱ
1、用限制性内切酶PmeI酶切重组质粒pPink-HC-HSA,回收线性化的质粒。
2、制备酵母感受态细胞
同步骤一的2。
3、制备重组菌
(1)同步骤一的3的(1)。
(2)同步骤一的3的(2)。
(3)提取步骤(2)得到的菌体沉淀的基因组DNA,采用5’AOX1primer和3’CYC1primer组成的引物对进行PCR鉴定。
如果采用5’AOX1primer和3’CYC1primer组成的引物对进行PCR鉴定显示2.2bp条带,待测菌株即为目的菌株(重组菌-Ⅱ)。
三、制备重组菌-Ⅲ
1、用限制性内切酶MunI酶切重组质粒pGAGZαA-HSA,回收线性化的质粒。
2、制备酵母感受态细胞
用毕赤酵母GS115代替PichiaPinkTM Strain1(ade2),其它同步骤一的2。
3、制备重组菌
(1)将步骤1得到的线性化质粒和步骤2得到的菌体悬液混合后吸至0.1cm电转杯中,冰浴5min,然后660v100Ω电击一次,立即加入1mL1M山梨醇,吹打均匀,28℃孵育3h;然后吸取300μL涂布于含有50μg/ml博来霉素的YPD培养基平板上,将平板倒置于培养箱中,28℃培养,直至单个菌落出现。
(2)同步骤一的3的(2)。
(3)提取步骤(2)得到的菌体沉淀的基因组DNA,采用5’GAP primer和3’AOX1primer组成的引物对进行PCR鉴定。
如果采用5’GAP primer和3’AOX1primer组成的引物对进行PCR鉴定显示2.0bp条带,待测菌株即为目的菌株(重组菌-Ⅲ)。
四、表达HSA
将重组菌-Ⅰ、重组菌-Ⅱ或重组菌-Ⅲ的单菌落接种于100mL BMGY培养基中,28℃、300rpm振荡培养24h,然后加入甲醇使甲醇浓度为1%(体积比),之后每隔24h补加甲醇使甲醇浓度为1%(体积比)。从第一次加入甲醇开始计时,144小时后,4℃、1500g离心10min,收集上清。
将上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,目标蛋白的分子量为66.5kD。照片见图4(泳道1为重组菌Ⅲ,泳道2为重组菌Ⅱ,泳道3为重组菌Ⅰ,泳道4为浓度为0.25g/L的商购的HSA蛋白标准品溶液,泳道5为浓度为0.5g/L的商购的HSA蛋白标准品溶液,泳道6为浓度为1g/L的商购的HSA蛋白标准品溶液,泳道7为浓度为2g/L的商购的HSA蛋白标准品溶液,泳道M为分子量标准品)。可以观察到,各个重组菌得到的上清中均具有预期蛋白条带,且重组菌-Ⅰ中预期蛋白的表达量高于重组菌-Ⅱ和重组菌-Ⅲ。
实施例4、western blot鉴定和质谱鉴定
一、摇瓶培养
1、将重组菌-Ⅰ的单克隆接种于10mL BMGY培养基,28℃、300rpm振荡培养24h。
2、取1mL步骤(1)的培养物,接种至100mL BMGY培养基,28℃、300rpm振荡培养,24h后加入甲醇使培养体系中的甲醇浓度为1%(体积比),之后每隔24h补加甲醇并使培养体系中的甲醇浓度为1%(体积比)。
二、western blot鉴定
步骤一的2中,分别于振荡培养的初始时刻(0h)、振荡培养24小时后(24h)、振荡培养48小时后(48h)、振荡培养72小时后(72h)、振荡培养96小时后(96h)、振荡培养120小时后(120h)、振荡培养144小时后(144h)取样,采用白蛋白一抗(购自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,SC46293)进行western blot。
western-blot结果见图5。可以观察到,重组菌-Ⅰ表达的66.5kD条带确实为人血清白蛋白条带,且随着培养时间的延长,表达量逐渐增多。
三、质谱鉴定
步骤一的2中,振荡培养144小时后,取发酵上清,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。挖取SDS-PAGE凝胶上的蛋白点,采用胶内胰蛋白酶酶切蛋白样品获得多肽段,然后取1μL样品和1μL基质混匀后点于MTP AnchorChipTM800/384靶板,并用多肽标准品(Bruker Dalton,Peptide calibration standard II)作为校正内标,用AutoflexⅢMALDI-TOF-TOF(Bruker Dalton)质谱仪进行鉴定,一级肽段裂解离子峰图见图6。二级肽段裂解离子峰图见图7。通过MASCOT搜索引擎检索,参数设置,与理论序列比对,数据分析与运算,一级结构比对结果得分为167,二级结构比对结果得分为248,均在在可信范围之内,可以判断表达的重组人血清白蛋白氨基酸序列正确。
实施例5、重组菌-Ⅰ的批式发酵表达
1、制备培养基
YPD种子培养基由溶剂和溶质组成,自然pH;所述溶剂为水;所述溶质及其浓度如下:2g/100mL蛋白胨,1g/100mL酵母提取物,2g/100mL葡萄糖。
基础盐培养基的制备方法(pH为6):取5g NH4H2PO4、0.093g CaSO4、1.82g K2SO4、1.49g MgSO4·7H2O、0.3g KOH、5g葡萄糖、0.5g KH2PO4和40ml甘油溶于水并用水定容至1L。
1、挑取重组菌-Ⅰ的单菌落至YPD种子培养基,28℃300rpm振荡培养24h,得到种子液。
2、将步骤1得到的种子液以10%(体积比)的接种量接入基础盐培养基,培养温度控制在25-28℃,pH=6,通过调节通气量0-250L/h和搅拌转速(300-700r/min)使溶解氧体积分数(DO)保持在20%左右;培养10小时后开始补加甘油,每小时补加一次,每次补加20mL,共补加9次(实际应用中补加8-10次均可);最后一次补加甘油4小时后开始补加甲醇溶液(每升甲醇中含有12mL PTM1溶液),每12小时补加一次,每次补加后甲醇在培养体系中的浓度为1%(体积比);温度、pH、溶氧、甲醇浓度分别由温度电极、pH电极、溶氧电极、甲醇电极在线监测控制;发酵全过程由发酵罐控制系统软件进行在线控制和数据采集;发酵192小时后取发酵上清。
通过高效液相层析系统检测发酵上清中的HSA蛋白浓度。高效液相层析的参数如下:柱子型号TSK-GEL3000SW,长度30cm,内径7.8mm;填充介质为5μm硅胶;具体洗脱过程、试剂配方和流速参考药典三附录ⅥQ。目标峰的峰值对应的保留时间位置为17.6±0.2min。
用商购的HSA蛋白标准品制作的标准曲线方程为:y=1.2×10-6x,R2=0.998,y为白蛋白浓度(g/L),x为峰面积。
通过对照标准曲线方程,发酵192小时后,每升发酵上清中的HSA蛋白浓度为10g/L(三次重复实验的平均值)。
Claims (4)
1.一种重组质粒,包括表达盒甲和表达盒乙;
所述表达盒甲自上游至下游依次包括:序列表的序列3所示的AOX1启动子、人血清白蛋白的编码基因、序列表的序列4所示的CYC1翻译终止子;
所述表达盒乙自上游至下游依次包括:序列表的序列5所示的GAP启动子、所述人血清白蛋白的编码基因、序列表的序列6所示的AOX1翻译终止子;
所述人血清白蛋白为由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
所述人血清白蛋白的编码基因为如序列表中序列2自5’末端第13至1842位核苷酸所示的DNA分子;
所述重组质粒还包括DNA片段丙;所述DNA片段丙包括序列表的序列7所示的ADE2启动子和序列表的序列8所示的ADE2基因,且由所述ADE2启动子启动所述ADE2基因的表达;
所述重组质粒的制备方法具体如下:将用限制性内切酶BglII和BamHI双酶切重组质粒pGAGZαA-HSA得到含有所述表达盒乙的片段插入重组质粒pPink-HC-HSA的BamHI酶切位点,得到所述重组质粒;所述重组质粒pPink-HC-HSA为在pPink-HC载体的EcoRI和KpnI酶切位点之间插入序列表的序列2自5’末端第7-1842位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒;所述重组质粒pGAGZαA-HSA为在pGAGZαA载体的BstBI和KpnI酶切位点之间插入序列表的序列2自5’末端第10-1842位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
2.将权利要求1所述的重组质粒导入宿主菌得到的工程菌;所述宿主菌为毕赤酵母。
3.如权利要求2所述的工程菌,其特征在于:所述毕赤酵母为PichiaPinkTMStrain1(ade2)。
4.权利要求2或3所述的工程菌在生产人血清白蛋白中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310078280.3A CN103194481B (zh) | 2013-03-12 | 2013-03-12 | 表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310078280.3A CN103194481B (zh) | 2013-03-12 | 2013-03-12 | 表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103194481A CN103194481A (zh) | 2013-07-10 |
CN103194481B true CN103194481B (zh) | 2015-04-29 |
Family
ID=48717296
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310078280.3A Active CN103194481B (zh) | 2013-03-12 | 2013-03-12 | 表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103194481B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108315344A (zh) * | 2018-02-14 | 2018-07-24 | 武汉博沃生物科技有限公司 | Vzv糖蛋白e基因表达载体及其重组酵母菌株与应用 |
CN111088282B (zh) * | 2020-03-23 | 2020-08-28 | 上海安民生物技术有限公司 | Aavs1和h11安全港位点在重组表达蛋白中的应用 |
CN116134050A (zh) * | 2022-09-02 | 2023-05-16 | 通化安睿特生物制药股份有限公司 | 一种提高重组人白蛋白表达量的方法和细胞和蛋白 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1854301A (zh) * | 2005-04-29 | 2006-11-01 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种表达人血清白蛋白的载体和工程菌 |
CN101974587A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-02-16 | 上海安睿特生物医药科技有限公司 | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 |
-
2013
- 2013-03-12 CN CN201310078280.3A patent/CN103194481B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1854301A (zh) * | 2005-04-29 | 2006-11-01 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种表达人血清白蛋白的载体和工程菌 |
CN101974587A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-02-16 | 上海安睿特生物医药科技有限公司 | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Baizhi Li et al.A novel protein expression system-PichiaPink-and a protocol for fast and efficient recombinant protein expression.《African Journal of Biotechnology》.2011,第10卷(第83期), * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103194481A (zh) | 2013-07-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2024002149A1 (zh) | 一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法 | |
CN103343113B (zh) | 一种热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E及其基因和应用 | |
CN104524564B (zh) | 一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂及制备方法和应用 | |
CN103194481B (zh) | 表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用 | |
CN101974587A (zh) | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 | |
CN103468595B (zh) | 表达重组人血白蛋白的酵母菌、其构建方法及应用和表达重组人血白蛋白的方法 | |
CN103194482B (zh) | 一种表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用 | |
CN106699872A (zh) | 一种提高胰岛素前体产量的方法 | |
CN104278017A (zh) | 一种重组表达人溶菌酶的方法 | |
CN112522125B (zh) | 一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用 | |
CN105039310A (zh) | 一种提取农杆菌质粒dna的试剂盒 | |
CN102559730B (zh) | 一种提高cp4-epsps在汉逊酵母中表达量的方法 | |
CN107778365A (zh) | 一种多点整合的重组蛋白表达方法 | |
CN103589769B (zh) | 一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法 | |
CN104013954B (zh) | Isg20蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应用 | |
CN101285045B (zh) | 一种重组克鲁维酵母菌及其构建方法和应用 | |
CN103710364B (zh) | 一种漆酶基因Lac7及其表达蛋白和应用 | |
CN103773793B (zh) | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 | |
CN102978234B (zh) | 中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法 | |
CN102718856B (zh) | 一种重组染色质修饰蛋白1a及其编码基因和应用 | |
CN101560518A (zh) | 一种鸡传染性支气管炎病毒膜蛋白基因及其克隆方法 | |
CN102925463B (zh) | 一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因及其应用 | |
CN104031959A (zh) | 一种通过调控基因表达来提高s-腺苷甲硫氨酸产量的方法 | |
CN110527690A (zh) | 一种耐热型单宁酶及其应用 | |
CN103451171A (zh) | 一种热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体D185P/S186E及其基因和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |