CN104031959A - 一种通过调控基因表达来提高s-腺苷甲硫氨酸产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过调控基因表达来提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。首次揭示将透明颤菌血红蛋白(VHb)的编码基因转入S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，并敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因后，能够显著地提高S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸产量。

Description

一种通过调控基因表达来提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种通过调控基因表达来提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)由Cantoni等人于1952年发现，作为所有生物体内的重要甲基供体，并参考多种代谢反应，SAM在抑郁症、肝脏疾病和关节炎治疗领域都具有良好的临床应用价值。因此，越来越多的研究人员利用代谢工程改变细胞的代谢途径以获得高产SAM的菌株。

在生物体内，以L-Met和ATP为前体，可经SAM合成酶催化合成SAM(图1)。其反应过程为，ATP的腺苷部分与L-Met的硫原子部分发生撞击，使得腺苷结构与甲硫氨酸相结合，从而生成具有高能量的有机硫化物。

提高SAM合成酶活性是获得SAM高产菌的一个重要策略。经研究发现在生物体内存在两种SAM合成酶，它们是同工酶，编码基因分别为sam1和sam2，sam1编码SAM合成酶I是受产物抑制的，而sam2编码的SAM合成酶II不受产物抑制，所以提高sam2基因的表达可以提高SAM合成酶的含量。因此人们利用受甲醇诱导的强启动子PAOX或者组成型的PGAP调控sam2的表达，李东阳等将sam2基因导入pPIC3.5K转化毕赤酵母GS115使得SAM合成酶酶活提高了37倍，SAM最终产量达到了1.58g/L。Yu等(Yu ZL，Wu XJ，Li DY，et al.Enhancement of the production of SAM by overexpression of SAMsynthetase in Pichia pastoris.Acta Biochimica et Biophysica Sinica.2003，35:127–132)利用组成型的GAP启动子调控SAM合成酶，导入GS115使得SAM产量达到了2.49g/L。

除了提高SAM合成酶的表达量，还能对SAM合成酶进行体外进化，以获得高酶活的重组酶。本发明人以往的研究中(Hu H，Qian JC，Chu J，et al.DNAshuffling of methionine adenosyltransferase gene leads to improvedS-adenosyl-L-methionine production in Pichia pastoris.J Biotechnol.2009，141(3):97-103)，利用DNA Shuffling技术对SAM合成酶进行了体外进化，经过筛选获得高酶活重组SAM合成酶基因ds16和相应的高产菌株DS16。在摇瓶中，DS16的胞内SAM累积量为1.64g/L，SAM合成酶的酶活达到463U/g DCW，与表达酵母SAM合成酶的重组菌相比，分别提高了102％和201％，有效改善了胞内SAM合成酶活性对SAM合成的限制。

在强化SAM合成酶表达后，将SAM分解代谢途径进行阻断是增加细胞内SAM积累的另一有效策略。敲除β-胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)，阻断SAM和L-Met在细胞内转化为半胱氨酸的途径，可以实现胞内SAM积累的增加。鉴于此，He等(He J，Deng J，Zheng Y，et al.A synergistic effect on the productionof S-adenosyl-L-methionine in Pichia pastoris by knocking in ofS-adenosyl-L-methionine synthase and knocking out of cystathionine-beta synthase.J Biotechnol.2006,126：519-527)通过基因敲除的方法将过量表达SAM合成酶的毕赤酵母菌株的CBS合成基因缺失掉，结果SAM积累量提高了两倍多，效果相当明显；但是，将SAM分解代谢途径β-胱硫醚(CBS)完全阻断，重组菌成为营养缺陷型，培养基中需外源添加谷胱甘肽(GSH)。因此也导致发酵成本大大提高。

S-腺苷甲硫氨酸在毕赤酵母中的合成与分解途径如图2。

综上，鉴于S-腺苷甲硫氨酸的重要的临床应用价值，本领域仍然有必要进一步开发提高其产量的有效途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过调控基因表达来提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。

在本发明的第一方面，提供一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，所述方法包括：

(1)在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的基因组中引入外源的透明颤菌血红蛋白(VHb)表达盒，并敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因；

(2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生产S-腺苷甲硫氨酸。

在一个优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因中(较佳地，插入位点为spe2基因的起始位点ATG至终止子，为整段spe2基因敲除)，从而敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。

在另一优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件：

AOX1启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因，转录终止序列(较佳地为TT，防止在vgb基因的终止子后还继续转录)；或

所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件：

ADH2启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因，转录终止序列(较佳地为TT)。

在另一优选例中，步骤(2)中，培养的方法包括：起始阶段采用分批发酵，通气量为3±2VVM，控制溶氧大于30％，在基础培养基中的甘油耗尽以后，溶氧出现反弹，进行限制性流加甘油，并通过调节甘油的补料速率使得DO在20-30％，促使菌体生长；在达到菌体OD_600nm为200±10时，停止甘油的补料，待甘油耗尽，开始以2±0.5g/L/h的流速流加甲醇，开始诱导阶段，逐渐提高甲醇的流加速率，使得DO维持在10-15％。

在另一优选例中，发酵过程中调节pH5.5±0.5。

在另一优选例中，S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是毕赤酵母菌株、较佳地是DS16菌株。

此外，经过进一步改造的，例如弱化了β-胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)的菌株也可作为本发明的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株。

在本发明的另一方面，提供一种改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，所述的菌株的基因组中引入了外源的透明颤菌血红蛋白(VHb)表达盒，并敲除了S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。

在一个优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因中，从而敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。

在另一优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件：

AOX1启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因转录终止序列(较佳地为TT，防止在vgb基因的终止子后还继续转录)。

在另一优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件：

ADH2启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因转录终止序列(较佳地为TT，防止在vgb基因的终止子后还继续转录)。

在另一优选例中，所述的改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株以毕赤酵母菌株、较佳地以DS16菌株为出发菌株进行改良。

在本发明的另一方面，提供透明颤菌血红蛋白的用途，用于促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株生产S-腺苷甲硫氨酸。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、S-腺苷甲硫氨酸的生物合成。

图2、S-腺苷甲硫氨酸在毕赤酵母中的合成与分解途径。

图3、质粒pDsmvA和pDsmvP构建过程。

图4、质粒pDspe z质粒构建过程。

图5、重组菌DS16/DsvP构建过程。

图6、PCR验证重组菌DS16/DsvP基因型。M：Marker2,000；Lane1、2：以DS16基因组DNA为模板；Lane3-Lane6：以DS16/DsmvP基因组DNA为模板；Lane7-Lane9：以DS16/DsvP基因组DNA为模板；Lane1、3：以speF1/speR1为引物；Lane2、5、7：以mazFF/mazFR为引物；Lane4：以G1F/CYCTTR5为引物；Lane6：以TTF2/G1R为引物；Lane8：以G1F/PADHR2为引物；Lane9：以PADHF3/G1R为引物。

图7、重组菌DS16/DsvA构建过程。

图8、PCR验证重组菌DS16/DsvA基因型。

M1：Marker2,000；M2：Marker5,000；Lane1、2：以DS16基因组DNA为模板；Lane3-Lane6：以DS16/DsmvA基因组DNA为模板；Lane7-Lane9：以DS16/DsvA基因组DNA为模板；Lane1、3：以speF1/speR1为引物；Lane2、5：以mazFF/mazFR为引物；Lane4、7：以G1F/CYCTTR5为引物；Lane6、8：以TTF2/G1R为引物；Lane9：以speF2/speR2为引物。

图9、重组菌正常条件下的生长(A)和存活率(B)。

图10、正常条件下四株菌的产量。

图11、重组菌低氧条件下的生长状况(A)和存活率(B)。

图12、低氧条件下四株菌的SAM产量。

图13、重组菌5-L罐中的生长状况(A)和存活率(B)。

图14、四株菌的比氧气吸收速率(SOUR)。

图15、5L罐中四株菌的SAM产量。

图16、5L罐中四株菌的SAM累积量。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示将透明颤菌血红蛋白(VHb)的编码基因转入S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，并敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因后，能够显著地提高S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸产量。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的活性变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为VHb多肽)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

NCBI已公开了VHb蛋白序列或vgb基因序列，因此，本领域人员易于获得和制备这些基因。作为本发明的优选方式，所述的vgb具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

发明还涉及vgb的多核苷酸变异体，其编码与野生型基因编码的氨基酸序列相同的多肽。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明的vgb的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

为了优化S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸的生产，本发明人作了广泛地研究，找到了适合于进行改良的基因vgb，并构建了相应的构建物；并且，同时敲除S-腺苷甲硫氨酸生产菌株内源存在的spe2基因。

因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括：vgb的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件(包括启动子、编码DNA以及终止子等)，从而可完整地表达出相应的VHb蛋白。

本领域已知的一些诱导型或组成型启动子均适用于本发明、进行表达盒的构建。作为本发明的优选方式，所述的启动子是甲醇诱导型启动子AOX1启动子或来自树干毕赤酵母的乙醇脱氢酶启动子ADH2启动子。受低氧诱导的启动子ADH2无需添加外源诱导物，可在发酵过程中响应溶氧的降低而被激活，适用于本发明中的毕赤酵母表达系统。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。为了实现在基因组上的基因定向敲除和基因定向重组，所述的表达载体还可设置合适的同源臂；同源臂的设置是本领域技术人员了解的。应理解，只要能够实现对于本发明的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的改造，任何表达载体均可选用的。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是S-腺苷甲硫氨酸生产菌株。作为本发明的优选方式，所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是酵母菌株，优选地是毕赤酵母菌株，包括各种经改造的毕赤酵母菌株；更优选的，S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是DS16菌株。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。

在本发明的优选实施例方式中，本发明人以高产菌DS16为出发菌，将vgb整合到重组菌DS16染色体的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的基因spe2位点，在引入vgb基因的同时，阻断SAM向精胺和亚精胺的转化，获得高的SAM产量。

当S-腺苷甲硫氨酸生产菌株为毕赤酵母细胞时，可以应用毕赤酵母细胞的一般培养方法，并结合所选择的启动子的类型，来进行培养。

作为本发明的优选方式，所述的培养方法包括：起始阶段采用分批发酵，通气量为3±2VVM，控制溶氧大于30％(一般在30-50％)，在基础培养基中的甘油耗尽以后，溶氧出现反弹(一般反弹至约80％)，进行限制性流加甘油，并通过调节甘油的补料速率使得DO在20-30％，促使菌体生长；在达到菌体OD_600nm为200±10时，停止甘油的补料，待甘油耗尽，开始以2±0.5g/L/h的流速流加甲醇，开始诱导阶段，逐渐提高甲醇的流加速率，使得DO维持在10-15％。较佳地，发酵过程中调节pH5.5±0.5。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

质粒、菌株和培养基

表1、质粒

表2、菌株

大肠杆菌生长培养基(g/L)：LB：酵母抽提物10，蛋白胨20，NaCl10。需要时可加适当浓度的抗生素。需要时加入Zeocin至其终浓度为25μg/mL。配制固体培养基时加琼脂粉(g/L)：20。

酵母生长培养基：

YPG(g/L)：甘油20，酵母提取物10，蛋白胨20。

YPD(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20。

YPDS(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20，山梨醇182。

需要时加入Zeocin至其终浓度为100μg/mL。

配制固体培养基时加琼脂粉20g/L。

酵母摇瓶发酵培养基：

BSM(g/L)：K₂SO₄9.1，CaSO₄0.46，PTM112mL/L，(NH₄)₂SO₄7，MgSO₄·7H₂O7.5，0.2M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(缓冲液pH5.5)。

PTM1(g/L)：CuSO₄·5H₂O6，KI0.08，ZnSO₄·7H₂O20，MnSO₄·H₂O3，Na₂MoO₄·2H₂O0.2，CoCl₂·6H₂O0.5，H₃BO₃0.02，FeSO₄·7H₂O65，生物素0.2，H₂SO₄5mL/L。

发酵基础培养基：K₂SO₄18.2g/L，CaSO₄0.93g/L，MgSO₄·7H₂O14.9g/L，KOH4.13g/L，85％H₃PO₄26.8mL/L，甘油40g/L，灭菌后用25％NH₃·H₂O调至pH6.0，另加入12mL/L的PTM1。

工具酶、试剂盒及引物

分子克隆所用限制性内切酶均购自Takara生物技术(大连)有限公司。质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、片段纯化试剂盒均购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。Zeocin购自Invitrogen公司。所用引物见表3。

表3、引物列表

培养方法

重组毕赤酵母的摇瓶培养

(1)种子培养

挑取平板上的单菌落至2mL YPG培养基中，220rpm，30℃条件下培养过夜，再取1mL种子液至含有100mL YPG培养基的500mL摇瓶中，培养20h左右至OD₆₀₀为15-20。

(2)摇瓶培养

将种子培养液转移至50mL离心管于4,000rpm条件下离心5min，然后弃上清。重悬于含25mL BSM培养基的250mL的摇瓶中，30℃，220rpm条件下进行诱导培养。每隔12h补入一定量的甲醇，至其终浓度为1.2％(V/V)。每隔24h补加L-Met。培养过程中用5mol/L KOH调节使发酵液pH维持在5.5-6.0，共诱导96h。

重组毕赤酵母的发酵培养

整个发酵过程采用毕赤酵母发酵常用的三段式发酵，在发酵的起始阶段采用分批发酵，通气量为大致为3VVM，通过调节搅拌桨的旋转速率来控制溶氧(DO)大于30％(溶氧约在30-50％)，等发酵罐中起始加入的基础培养基中的甘油(40g/L)耗尽以后，溶氧出现反弹(反弹至约80％)，进行限制性流加50％的甘油，并通过调节甘油的补料速率使得DO在20-30％，进一步促使菌体生长。在达到一定的菌体密度后(OD₆₀₀约为200)，停止甘油的补料，饥饿30min，待甘油耗尽，开始以2g/L/h的流速流加甲醇，开始诱导阶段，在诱导过程中逐渐提高甲醇的流加速率，使得DO维持在10-15％，在整个发酵过程中用25％的氨水调节pH在5.5左右。

分析方法

菌体干重的测定

取一定量菌液，稀释合适倍数，以无菌的培养基做空白对照，置于分光光度计中测定菌液在波长600nm处的吸光值，OD₆₀₀＝读数×稀释倍数，通过标准曲线计算菌体干重。菌体干重(Dry cell weight，DCW)和OD₆₀₀之间的关系为：DCW＝0.24×OD₆₀₀+1.23(R²＝0.994，OD₆₀₀∈[50，500])。

用HPLC测定胞内SAM浓度

(1)样品处理

取1mL发酵液，4℃，12,000rpm，离心10min。弃上清，将菌体重悬于10％的三氯乙酸中，4℃条件下抽提2h。然后4℃，12,000rpm，离心10min，取上清，使用0.22μm滤膜过滤，4℃保存待检测。如果是罐上的菌体则需经稀释五倍。

(2)测定方法

色谱柱为强阳离子型离子交换柱Thermo-BioBasic SCX(型号为4.6mm×250mm，5μm)。流动相A为pH＝4.0的5mM甲酸铵；流动相B为pH＝4.0的500mM甲酸铵。洗脱过程为：0-5.00min：A；5.01-9.00min：A/B(10/90)；9.01-12min：B；12.01-14.00min：A。流速1mL/min，进样量10μL，检测波长254nm。SAM的保留时间约为10.1min。

菌体存活率的测定

取样，将待测样品稀释至OD₆₀₀＝20-30，加入等量的亚甲基蓝溶液(0.1g亚甲基蓝，20g柠檬酸钠溶于1L去离子水)孵育一分钟，血球板上计数，死细胞呈现蓝色，活细胞呈现透明。

实施例1、重组菌的构建

1、pDsmvA、pDsmvP质粒构建

如图3所示，以pCmG为出发质粒，先替换同源臂，连接vgb基因，分别由PADH2(SEQ ID NO:3)和PAOX(SEQ ID NO:2)调控，其中PADH2是来自树干毕赤酵母的低氧诱导的启动子，PAOX为毕赤酵母中受甲醇诱导的启动子，构建了两个质粒pDsmvA和pDsmvP。具体构建流程如下：

以spe2 5’F和spe2 5’R为引物、以毕赤酵母基因组DNA为模板扩增获得Spe2 5’(SEQ ID NO:4)，将之插入到pCmG的XhoI和SpeI位点内，替换原CBS5；以spe2 3’F和spe2 3’R为引物、以毕赤酵母基因组DNA为模板扩增获得Spe2 3’(SEQ IDNO:5)，将之插入到pCmG的XhoI和SpeI位点内，替换原CBSORF；将AOX1-vgb-TT插入到其BamHI和PstI位点内，获得质粒pDsmvA。其中AOX1-vgb-TT如下构建：以pPIC3.5K为模板，PAOX1F/PAOX1R-O为引物，扩增AOX1启动子片段，与vgb以及ADHTT经重叠PCR连接在一起，得到两端酶切位点为PstI/BamHI的AOX1-vgb-TT片段。

以spe2 5’F和spe2 5’R为引物、以毕赤酵母基因组DNA为模板扩增获得Spe5’，将之插入到pCmG的XhoI和SpeI位点内，替换原CBS5；以spe2 3’F和spe2 3’R为引物、以毕赤酵母基因组DNA为模板扩增获得Spe2 3’，将之插入到pCmG的XhoI和SpeI位点内，替换原CBSORF；将PADH2-vgb-TT插入到其BamHI和PstI位点内，获得质粒pDsmvP。其中PADH2-vgb-TT如下构建：以树干毕赤酵母的基因组DNA为模板，PADH2F/PADH2R-O为引物，扩增PADH2启动子片段；以pIOK-vgb(参考文献Chen H.X.Intracellular expression of Vitreoscillahemoglobin improves S-adenosyl-L-methionine production in a recombinant Pichiapastoris[J].Applied Microbiology and Biotechnology.2007,74:1205-1212)为模板，以O-vgbF/vgbR为引物，扩增vgb片段；以树干毕赤酵母的基因组DNA为模板，ADHTTF-O/ADHTTR为引物，扩增终止序列ADHTT片段。将上述得到的三个片段经重叠PCR连接在一起，得到两端酶切位点为PstI/BamHI的PADH2-vgb-TT片段。

4、pDspe z质粒构建

用于只单独敲除spe2基因的质粒为pDspe z，其构建方法如下：以重组毕赤酵母DS16基因组DNA为模板，用引物spe5-F/spe5-R扩增spe2基因5’端基因起始密码子前688bp到前27bp位的661bp同源片段，以引物spe3-F/spe3-R扩增3’端基因起始密码子后746bp到终止子后69bp位的513bp同源片段。在spe2基因5’端片段引入酶切位点Spe I和Not I/Sac I，3’端片段引入BamH I和Sac I/Sal I酶切位点，回收PCR得到的spe2基因上游和下游片段，测序验证。

经Sac I酶切的spe2基因5’端和3’端PCR产物连接后，用引物spe5-F和spe3-R进行PCR扩增获得spe2基因5’端和3’端连接片段。经Spe I和BamH I双酶切的spe2基因5’端和3’端连接片段和pGAPZ A质粒(购自invitrogen公司)连接，即获得pDspe z质粒，如说明书中图4所示。

3、重组菌的筛选

以上述的三个质粒(pDsmvA、pDsmvP、pDspe z)分别电转DS16得到三株菌DS16/DsvA、DS16/DsvP和G/Dspe。具体地，将所构建的插入载体pDsvP和pDsvA经XhoI/EcoRI进行双酶切线性化，回收含有vgb基因的spe2位点整合片段，电击转化SAM高产菌DS16。由于整合片段通过两端的同源臂与DS16的基因组在spe2位点发生同源交换，从而在spe2基因编码序列中插入了整合片段，使得重组菌的spe2基因失活，并获得了ZeoR和mazF基因。在含有Zeocin抗生素的平板中进行筛选，得到过渡重组菌，命名为DS16/DsmvP以及DS16/DsmvA。将过渡重组菌在不含Zeocin的培养基中进行培养，在无选择压力的条件下，重组菌在增殖的过程MazF-ZeoR两端的正向重复序列之间发生重组，使得该标记有一定的几率脱落，涂布甲醇平板，没有该标记的菌能够生长，从而得到不含筛选标记的VHb表达载体DS16/DsvP和DS16/DsvA。

菌株DS16/DsvP构建示意图如图5所示。挑取过渡菌DS16/DsmvP以及最终菌DS16/DsvP单克隆，提取其基因组DNA，PCR验证重组菌的基因型，并通过测序确定重组的正确性。结果见图6。

菌株DS16/DsvA构建过程如图7所示。挑取过渡菌DS16/DsmvA以及最终菌DS16/DsvA单菌落，提取基因组DNA，通过PCR验证重组菌的基因型，并通过测序确定重组菌的正确性。结果如图8所示。

重组质粒pDspeZ通过Spe I/BamH I位点酶切线性化，回收基因替换单元，分别电击转化DS16，经同源重组后，替换原染色体上的spe2基因，得到重组菌G/Dspe。

实施例2、重组菌特性研究

1、正常条件的摇瓶发酵

在正常条件下(250mL摇瓶装液量为50mL，转速220rpm)，不采取人为的氧限制措施，分别培养DS16/DsvA、DS16/DsvP和G/Dspe，以DS16为对照，考察vgb表达对菌体生长和存活率的影响。结果如图9A所示，DS16的最大比生长速率是在诱导12小时后(0.018h^-1)，G/Dspe的最大比生长速率在24小时(0.016h^-1)，而导入vgb基因的两株菌(DS16/DsvA、DS16/DsvP)，它们的最大比生长速率都在诱导12小时之后，DS16/DsvA为0.021h^-1，DS16/DsvP为0.023h^-1。由此可见导入vgb基因后，依据图中数值计算，得到结果表明菌体的最大比生长速率明显提高。

导入vgb基因不仅能促进菌体生长，在提高菌体存活率上也有很明显的效果，如图9B所示，在发酵后期无论是ADH2(DS16/DsvP)还是AOX(DS16/DsvA调控vgb表达的菌株，其存活率均高于无vgb的菌株，DS16的存活率为83％，G/Dspe的存活率为82％，而DS16/DsvA的存活率达到了94％，DS16/DsvP为87％，可见用AOX调控vgb更利于重组菌维持较高的存活率。

为了考察导入vgb基因并且敲除spe2基因对毕赤酵母产SAM的影响，96小时测定各重组菌的SAM积累量。结果如图10所示，相比出发菌DS16，三株改造后的菌SAM产量都有增加，单敲除spe基因的菌G/Dspe产量最高，达到了135mg/gDCW，同时插入vgb基因使得SAM产量略有下降，DS16/DsvA产量为133mg/gDCW，DS16/DsvP为124mg/gDCW。

除了考察单位菌体产量，菌体过表达vgb基因促进了菌体生长，这对总SAM累计是有促进的。单独敲除spe2基因的G/Dspe的体积产量为1.54g/L，而DS16/DsvA和DS16/DsvP的体积产量分别达到了1.76g/L和1.61g/L，与之相比分别提高了14.3％和4.5％。

综上所述，在正常条件下培养菌株，具有vgb基因的菌株不论在生长还是体积产量上均比无vgb基因的菌株有优势。

2、低氧摇瓶条件下的发酵

将四株菌接种至含有YPG液体培养基的摇瓶中培养两天，然后将此高菌浓的培养液转移至250mL摇瓶，装液量为100mL，转速为130rpm，以此来限制供氧，并进行诱导表达和SAM合成，考察限氧条件对重组菌特性的影响。如图11所示，在开始诱导的2天内，菌浓会持续上升，此后随着氧限制加剧，菌体生长受抑制，随着不断补加甲醇和甲硫氨酸，菌浓有所下降，但插入vgb基因的重组菌仍比另两株菌高。在存活率方面，四株菌的情况与正常培养条件下相似，依然是DS16/DsvA最高为92％，G/Dspe最低为75％。

相比于正常条件的发酵培养，在低氧条件下，未导入vgb基因的菌株在合成SAM方面受到很大的影响，如图12所示，至发酵终点，DS16/DsvP的单位菌体产量最高，达到123mg/gDCW。就体积产量而言，DS16/DsvA和DS16/DsvP的SAM体积产量分别达到了1.831g/L和1.686g/L，分别比出发菌DS16(1.404g/L)提高了30.5％和20.1％，G/Dspe为1.538g/L，与出发菌相比仅仅提高了9.5％。

结果表明，在氧限制条件下，与单敲除spe2基因相比，敲除spe2基因并且导入vgb基因更利于重组菌生长和SAM合成。为全面考察DS16/DsvA和DS16/DsvP的生理特性需在罐上进行发酵验证。

3、5-L罐发酵培养

为了更全面地考察氧限制条件对重组菌生理特性的影响，在5L发酵罐中，通过控制甲醇诱导阶段的补料速率，使溶氧维持在10-15％之间。

在整个发酵过程中，DS16/DsvP中VHb含量逐渐积累从0.085nmol/g上升至2.071nmol/g，DS16/DsvA中VHb含量明显高于DS16/DsvP，浓度从36小时的1.495nmol/g升高至9.441nmol/g，表明受甲醇诱导的AOX1启动子强度高于低氧诱导的PsADH2，因而蛋白表达水平较高。

如图13所示，发酵结束时，DS16/DsvP的菌浓最高，且不同菌株存活率也有差异，携带vgb基因的菌株DS16/DsvP和DS16/DsvA存活率较高，与摇瓶试验结果一致，表明vgb基因的表达能促进菌体生长，提高菌体存活率。

通过计算单位菌体的耗氧速率SOUR，可以考察vgb基因导入对菌体呼吸的影响。如图14所示，诱导12h时4株菌的SOUR接近，DS16的SOUR最高。随后，DS16的SOUR不断下降，而DS16/DsvA的SOUR则持续上升，36h达到最高，为1.99molO₂/h/gDCW，DS16/DsvP为1.76molO₂/h/gDCW，而G/Dspe和DS16分别为1.65和1.45molO₂/h/g DCW。到发酵结束时，DS16和G/Dspe的SOUR均低于携带vgb基因的菌株。这表明在低溶氧时，vgb的表达能增强菌体对氧的利用。

比较4株菌的SAM产量，从图15可以看出，敲除spe2基因后，单位菌体的SAM产量都提高了。在诱导60h内，重组菌G/Dspe的SAM产量稍高。但随后，携带vgb基因的菌株产量不断上升并超过G/Dspe，，到发酵结束时，SAM累积量达到了最大值，DS16/DsvP最多为149.87mg/gDCW，DS16/DsvA为140.3mg/gDCW，而G/Dspe只有128.1mg/gDCW，对照菌DS16最低为95.6mg/gDCW。

对比各菌株的体积产量。从图16中看出，到发酵终点时，DS16/DsvP的体积产量最高，达到了13.13g/L，DS16/DsvA为9.27g/L，相比出发菌DS16(5.14g/L)，分别提高了155％和80％。比较各菌株的甲醇消耗，DS16/DsvP为1469.3g，得到SAM总量为48.59g，甲醇的转化率达到了0.32％；DS16/DsvA共消耗甲醇1465g，最终得到的SAM总量为33.35g，底物转化率0.22％；菌株G/Dspe添加甲醇量为1231.5g，SAM总量为30.83g，甲醇转化率为0.24％，出发菌DS16总共消耗甲醇1057.2g，SAM总量为18.00g，甲醇转化率仅为0.16％。

综合摇瓶和发酵罐的结果，vgb基因在毕赤酵母中表达不仅能促进菌体生长，提高其体存活率，还能进一步提高SAM产量。而且，通过发酵实验证明，在出现氧限制的情况时，用低氧诱导的启动子PsADH2调控vgb比甲醇诱导型启动子PAOX效果更好。这可能是由于PAOX为强启动子，过表达vgb基因会给菌体生长代谢带来负担，并造成底物原料的浪费，而低氧诱导启动子则是依靠外界环境的变化来调控vgb表达，随着溶氧的降低而增强vgb表达水平，这种自发动态调控能力对于毕赤酵母高密度培养尤其具有实际应用价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的基因组中引入外源的透明颤菌血红蛋白表达盒，并敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因；

(2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生产S-腺苷甲硫氨酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因中，从而敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件：

AOX1启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因，转录终止序列；或

所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件：

ADH2启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因，转录终止序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养的方法包括：起始阶段采用分批发酵，通气量为3±2VVM，控制溶氧大于30％，在基础培养基中的甘油耗尽以后，溶氧出现反弹，进行限制性流加甘油，并通过调节甘油的补料速率使得DO在20-30％，促使菌体生长；在达到菌体OD_600nm为200±10时，停止甘油的补料，待甘油耗尽，开始以2±0.5g/L/h的流速流加甲醇，开始诱导阶段，逐渐提高甲醇的流加速率，使得DO维持在10-15％。

5.一种改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，其特征在于，所述的菌株的基因组中引入了外源的透明颤菌血红蛋白表达盒，并敲除了S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。

6.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因中，从而敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。

7.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件：

AOX1启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因转录终止序列。

8.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件：

ADH2启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因转录终止序列。

9.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述的改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株以毕赤酵母菌株、较佳地以DS16菌株为出发菌株进行改良。

10.透明颤菌血红蛋白的用途，其特征在于，用于促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株生产S-腺苷甲硫氨酸。