CN110257313A

CN110257313A - 一株高产亚精胺的解淀粉芽胞杆菌工程菌

Info

Publication number: CN110257313A
Application number: CN201910409349.3A
Authority: CN
Inventors: 魏雪团; 邹典; 闵钰; 李璐; 阮丽英
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-05-16
Also published as: CN110257313B

Abstract

本发明公开了一种高产亚精胺的解淀粉芽胞杆菌工程菌，该工程菌以解淀粉芽胞杆菌LX‑12为出发菌株，在出发菌株基础上叠加整合了酿酒酵母中编码S‑腺苷甲硫氨酸合成酶的SAM2基因和大肠杆菌中编码S‑腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因，游离表达了酿酒酵母中编码亚精胺合成酶的speE基因，通过上述基因操作得到高产亚精胺的解淀粉芽胞杆菌工程菌HSPM3，保藏编号为CCTCC NO：M2019326，该菌株在液态发酵培养中亚精胺的产量达到56.59 mg/L，比野生型菌株LX‑12提高了8.23倍。

Description

一株高产亚精胺的解淀粉芽胞杆菌工程菌

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种高产亚精胺的解淀粉芽胞杆菌基因工程菌。

背景技术

亚精胺是一种典型的芳香族多胺，在人类健康和疾病治疗方面具有重要的功能。亚精胺具有诱导细胞自噬、延缓衰老、提高记忆力、保护心血管、调节神经等多种生物活性，在心血管疾病和老年痴呆症的预防和治疗方面具有良好的应用潜力，在食品添加剂、保健品和医药领域具有潜在的应用价值(参见文献：Madeo,F.；Eisenberg,T.；Pietrocola,F.；Kroemer,G.,Spermidine in health and disease.Science 2018,359)。

亚精胺的应用潜力巨大，但目前亚精胺的产量过低，且合成亚精胺的手段主要为化学合成法，耗能高、副反应多、污染大，且亚精胺价格昂贵。生物合成法具有绿色、环保、安全、条件温和等优点，有望克服传统化学合成法的缺点。因此，本发明首次以解淀粉芽胞杆菌LX-12为出发菌株，通过基因工程手段对其进行改造，显著提高了亚精胺的产量。

发明内容

本发明的目的在于通过基因工程手段获得一株高产亚精胺的解淀粉芽胞杆菌基因工程菌HSPM3，该菌株以解淀粉芽胞杆菌LX-12为出发菌株，依次整合表达了酿酒酵母SAM2基因和大肠杆菌speD基因，游离表达了酿酒酵母speE基因，在液态发酵培养中亚精胺的产量达到56.59mg/L，比野生型菌株LX-12提高了8.23倍。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

采用冷冻保藏的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12(2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015234)为出发菌。通过查看相关文献以及亚精胺合成代谢通路图，分析出能够促进合成亚精胺的下游关键基因，从中选取了3个重要的基因，分别是酿酒酵母来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAM2)、大肠杆菌来源的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(speD)和酿酒酵母来源的亚精胺合成酶基因(speE)，其序列见SEQ ID NO.1-3。以解淀粉芽胞杆菌LX-12为出发菌株，依次整合表达了SAM2基因和speD基因，游离表达了酿酒酵母speE基因，由此获得高产亚精胺的解淀粉芽胞杆菌基因工程菌HSPM3，构建方法如下：

1、构建质粒T2-speD、T2-SAM2：以解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA作为模板扩增得到原噬菌体区整合位点的上下游同源臂(A，B)片段，序列如SEQ ID NO.4、5所示，以枯草芽胞杆菌168的基因组为模板扩增得到P43启动子，序列如SEQ ID NO.6所示，以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组为模板扩增得到终止子Tamly，序列如SEQ ID NO.7所示，以大肠杆菌DH5I基因组为模板扩增得到speD基因，序列如SEQ ID NO.2所示，上述扩增出来的片段进行SOE-PCR融合，融合后的片段序列如SEQ ID NO.8所示，将得到的SOE-PCR片段与温敏型质粒T2(ori)连接并转化到大肠杆菌DH5α，通过菌落PCR和测序确认插入序列正确无误的整合表达质粒T2-speD；用同样的方法还构建了T2-SAM2；

2、构建双基因整合菌株LX12/MD：将整合质粒T2-SAM2转化到野生型菌株LX-12中，进行单双交换传代培养，双交换验证结果如图3所示，得到SAM2整合菌株LX12::SAM2，在此基础上叠加整合了speD基因得到了双整合菌株LX12/MD，其中整合了speD基因对宿主菌影响最大，亚精胺的产量提高最明显；

3、构建游离表达载体：根据NCBI公布的酿酒酵母的speE基因，对其进行密码子优化，以全基因合成的speE基因为模板进行扩增，按照步骤1所述方法扩增得到启动子P43、终止子Tamly，将启动子、目的基因片段和终止子进行SOE-PCR融合，融合后的片段如SEQ IDNO.9所示，将SOE-PCR融合片段和载体pHY300PLK同时进行双酶切(BamHI和XbaI)和酶连，酶连产物转化到大肠杆菌DH5大，通过菌落PCR和测序确认插入序列正确无误的表达质粒pHY300-speE；

4、构建游离表达菌株：将游离质粒载体pHY-speE电转到LX12/MD感受态细胞，涂布在带有四环素(Tet)抗性的平板，挑取转化子进行菌落PRC验证，获得了工程菌LX12/MD-pHY-speE，命名为HSPM3。

解淀粉芽胞杆菌工程菌HSPM3已于2019年5月5日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019326，分类命名：解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HSPM3。

解淀粉芽胞杆菌工程菌HSPM3在生产亚精胺中的应用：挑取菌落HSPM3接种于LB培养基中进行种子培养，按照一定的接种量接种到亚精胺高产培养基中(蔗糖40g/L，(NH₄)₂SO₄ 6.3g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆5g/L，NaCl 2.5g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，MgSO₄·7H₂O 4.2g/L，尿素2g/L，天冬氨酸3g/L，pH到6.5)，37℃，180r/min振荡培养60h。亚精胺的产量高达56.59mg/L，比出发菌LX-12提高了8.23倍。

本发明的有益效果：

(1)首次在解淀粉芽胞杆菌LX-12中叠加整合表达SAM2基因和speD基因及游离表达speE基因，得到工程菌株HSPM3；

(2)其中整合表达speD(编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因)基因，对亚精胺合成的促进效果最好；

(3)产物亚精胺是胞外产物，便于提取和利用；

(4)产物亚精胺在医药、食品、保健品领域具有潜在的应用价值。

附图说明

图1：整合载体T2-speD的构建过程。

图2：2个整合质粒的双酶切鉴定；泳道1：线性质粒T2(2)-ori(通过BamHI和XbaI酶切)；泳道M：DL5000DNA Maker；泳道2：整合载体T2-SAM2(BamHI和XbaI)酶切结果；泳道3：整合载体T2-speD(BamHI和XbaI)酶切结果。

图3：T2-speD双交换结果菌株PCR鉴定；泳道M：DL5000DNA Marker；泳道1-2：以菌株LX12/MD总DNA为模板的PCR结果(1：SAM2引物为Y-F和Y-R，目标长度约为3275bp)；以菌株LX-12总DNA为模板的PCR结果(2：SAM2引物为Y-F和Y-R，目标长度约为2093bp)；泳道3-4：以菌株LX12/MD总DNA为模板的PCR结果(3:speD引物Y2-F和Y2-R，目标片段长度约3083bp)；以菌株LX-12总DNA为模板的PCR结果(4：speD引物Y2-F和Y2-R，目标片段长度约2184bp)。

图4：游离表达载体pHY-speE的构建过程。

图5：speE游离表达质粒的双酶切鉴定；泳道M：DL5000DNA Maker；泳道1：speE片段SOE-PCR(通过BamHI和XbaI酶切)；泳道2：线性质粒pHY300(通过BamHI和XbaI酶切)；泳道3：游离表达质粒pHY-speE(BamHI和XbaI)酶切结果。

图6：pHY-speE游离表达菌株的PCR鉴定；泳道M：DL5000DNA Marker；泳道1：菌株LX12/MD/Phy-speE的PCR结果(speE引物pHY300-F和pHY300-R)。

图7：HSPM3和LX-12、LX12::SAM2、LX12/MD的发酵结果比较。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明构成任何限制。

实施例1高产亚精胺菌株HSPM3菌株的构建

1、整合载体的构建

以解淀粉芽胞杆菌LX-12(2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015234)的基因组DNA作为模板，以

A-F:5’-CGGGATCC CGGGCTCAAGACTTCAGT-3’(下划线为BamHI酶切位点)

A-R:5’-CGAAAACATACCACCTATCA CCTTTTTAGACGGTGAGCA-3’

B-F:5’-AGTGCGACGGCATTATTGCG CATTACGCCCGTGTCTGT-3’

B-R:5’-GCTCTAGA CGCCTTATCGACATAGCTC-3’(下划线为XbaI酶切位点)为引物分别得到原噬菌体区整合位点的上下游同源臂(A，B)片段分别为537bp和545bp，序列如SEQID NO.4、5所示。

以枯草芽胞杆菌168的基因组为模板，以

P43-F:5’-TGCTCACCGTCTAAAAAGG TGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’

P43-R:5’-CATTGCAGTTTCAGTTTTTTCAA TTCATGTGTACATTCCTCTC-3’为引物扩增得到P43启动子，大小为305bp，序列如SEQ ID NO.6所示。

以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组为模板，以

Tamyl-F:5’-GCAATATGCCAGCTGTTTAA AAGAGCAGAGAGGACGGATT-3’

Tamyl-R:5’-ACAGACACGGGCGTAATG CGCAATAATGCCGTCGCACT-3’

为引物扩增得到终止子Tamly，大小分别为501bp，序列如SEQ ID NO.7所示。

以大肠杆菌DH5α基因组为模板，以

speD-F:5’-TGCTCACCGTCTAAAAAGG TGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’

speD-R:5’-ACAGACACGGGCGTAATG CGCAATAATGCCGTCGCACT-3’

为引物直接扩增得到speD基因，大小为795bp，序列如SEQ ID NO.2所示。

上述扩增出来的片段进行SOE-PCR融合，融合后的片段大小为2683bp，序列如SEQID NO.8所示。用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切(如图2所示)，得到的SOE-PCR片段与经同样BamHI和XbaI双酶切处理过的温敏型质粒T2(ori)进行酶连，酶连产物转化到大肠杆菌DH5α涂布于带有卡那抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后划线培养于相同抗性的平板上培养8h左右，使用质粒通用引物进行菌落PCR验证。经电泳验证后挑选验证正确的阳性克隆子培养，抽提质粒并经公司测序，在NCBI上比对结果，确认插入序列正确无误即成功构建整合表达质粒T2-speD。

采用同样的方法还构建了T2-SAM2，引物序列如下所示：

SAM2-A-F:5’-CGGGATCC CTTCGGAACTGACACCGT-3’

SAM2-A-R:5’-CGAAAACATACCACCTATCA AAGCGCCAAAATCGTAAAC-3’

SAM2-P43-F:5’-GTTTACGATTTTGGCGCTT TGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’

SAM2-P43-R:5’-AAGTTTTGCTCTTGGACAT TTCATGTGTACATTCCTCTC-3’

SAM2-F:5’-GAGAGGAATGTACACATGAA ATGTCCAAGAGCAAAACTT-3’

SAM2-R:5’-AATCCGTCCTCTCTGCTCTT TTAAAATTCCAATTTCT-3’

SAM2-Tamly-F:5’-AGAAATTGGAATTTTAAAAGAGCAGAGAGGACGGATT-3’

SAM2-Tamly-R:5’-AACACGCCGACCATTTTCAAGAGCAGAGAGGACGGATT-3’

SAM2-B-F:5’-AATCCGTCCTCTCTGCTCTT GAAAATGGTCGGCGTGTT-3’

SAM2-B-R:5’-GCTCTAGA GGCGCAGTCAAGCAATTT-3’。

2、整合表达菌株的构建

吸取10μL左右的整合质粒T2-SAM2(50ng/μL)加入解淀粉芽胞杆菌LX-12感受态细胞，重悬混匀后转移到提前预冷的2mm电转化杯中，冰浴10min，通过电脉冲转化仪2.4KV电压电击一次，迅速加入800μL恢复培养基，放置在37℃恒温摇床中以100-120r/min恢复培养3h左右，涂布至含相应抗生素的抗性平板，37℃培养16-18h。挑取单菌落进行菌落PCR验证，验证正确的阳性转化子接种于含20μg/mL卡那抗生素的LB液体培养基中，于45℃、180r/min振荡培养12h左右。

从获得的单交换菌株中吸取100μL到5mL LB液体培养基进行双交换培养(不加抗)，置于37℃振荡培养12h。取5mL LB液体培养基连续稀释10⁶，从中吸取100μL涂布于LB平板上，同时将稀释10³的接着置于37℃恒温摇床中振荡培养12h，依次传代培养。同时对LB平板上长出的单菌落分别对应点种于LB平板和含卡那抗性(Kan)的平板上，置于37℃恒温培养箱中培养5-8h左右；选取在LB平板生长而在含Kan的平板不生长的单菌落进行PCR验证(如图3所示)，筛选出菌落验证正确的双交换菌株，即为LX12::SAM2。通过相同的方法将speD基因整合至LX12::SAM2中(如图3所示)，获得双基因整合菌株，即为LX12/MD。其中菌落验证引物分别为：

(SAM2)Y-F:5’—CGGAAAATGAACGAGAAAC—3’

(SAM2)Y-R:5’—GAAATCGGGAATGCTGTGA—3’

(speD)Y2-F:5’—AAGAGTCATACAATGCGGTC—3’

(speD)Y2-R:5’—GGCCTTTTCAATCTCTTCAG—3’

3、游离表达载体的构建

按照步骤1所述方法扩增得到P43启动子、P43启动子，根据NCBI公布的酿酒酵母的speE基因，对其进行密码子优化，以全基因合成的speE基因(序列如SEQ ID NO.3所示)为模板，以

speE-F:5’-GAGAGGAATGTACACATGAACATATGGCGCAGGAAATTAC-3’

speE-R:5’-AATCCGTCCTCTCTGCTCTTCTCGAGCTAATTCAGTTCTTTC-3’

为引物扩增得到speE基因，大小为882bp。

上述扩增出来的片段进行SOE-PCR融合，融合后的片段大小为1688bp，序列如SEQID NO.9所示。用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切(如图5所示)，得到的SOE-PCR片段与经同样BamHI和XbaI双酶切处理过的穿梭型质粒pHY300PLK进行酶连，酶连产物转化到Escherichia coli DH5α涂布于带有四环抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后划线培养于相同抗性的平板上培养8h左右，使用质粒通用引物进行菌落PCR验证。经电泳验证后挑选验证正确的阳性克隆子培养，抽提质粒并经公司测序，在NCBI上比对结果，确认插入序列正确无误即成功构建游离表达质粒pHY-speE。

4、游离表达菌株的构建

将游离质粒载体pHY-speE电转到LX12/MD感受态细胞，涂布带有四环素(Tet)抗性的平板，在37℃恒温培养箱中培养16-24h得到对应的转化子，挑取一定数量的转化子于对应平板划线培养8h左右进行菌落PCR验证(如图6所示)，将验证正确的菌落挑取于5mL液体LB培养基(适量带有千分之一四环抗生素)，置于37℃恒温摇床在180r/min中培养12h，吸取800μL保存在甘油管中，甘油管置于-80℃超低温冰箱保存。利用基因工程改造获得了工程菌LX12/MD-pHY-speE，命名为HSPM3。

实施例2解淀粉芽胞杆菌HSPM3的亚精胺发酵

分别挑取菌落解淀粉芽胞杆菌LX-12、LX12::SAM2、LX12/MD和HSPM3接种于5mL的LB培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜。再以4％的接种量转接到50mL的LB培养基中，直到OD₆₀₀为3.0-4.0左右时，以3％的接种量接种到25mL的亚精胺高产培养基中(蔗糖40g/L，(NH₄)₂SO₄ 6.3g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆5g/L，NaCl 2.5g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，MgSO₄·7H₂O4.2g/L，尿素2g/L，天冬氨酸3g/L，pH 6.5)。37℃，180r/min振荡培养60h。检测方法通过高效液相色谱法进行，将1.5mL 0.4mol/L的高氯酸添加到含有0.5mL发酵液中，每15min震荡一次，离心分离上清液，取250μL上清液，依次加入100μL内标溶液(100mg/L 1,7-二氨基庚烷)，75μL饱和NaHCO₃溶液，25μL 2mol/L NaOH溶液和500μL丹磺酰氯(5g/L)衍生化试剂，在避光条件下进行衍生化处理：50℃，45min；加入25μL氨水溶液，50℃，15min。加乙腈定溶到1.5mL，混合1min，2500×g离心5min，上清液经0.22μm有机过滤膜过滤，通过高效液相色谱法检测生物胺含量：安捷伦1100HPLC色谱仪，ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相采用超纯水和乙腈进行梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长254nm，柱温30℃，进样量10μL。根据出峰时间和峰面积大小判断生物胺种类和含量，检测结果如图7所示。其中整合表达speD基因后亚精胺的产量达到了34.44mg/L，游离表达speE之后，亚精胺的产量达到了最高产量能达到56.59mg/L，比出发菌LX-12提高了8.23倍。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株高产亚精胺的解淀粉芽胞杆菌工程菌

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> 酿酒酵母CICC 31001(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

atgtccaaga gcaaaacttt cttatttacc tctgaatccg tcggtgaagg tcacccagac 60

aagatttgtg accaagtttc tgatgctatt ttggacgctt gtttagaaca agatccattc 120

tccaaggttg cctgtgaaac agctgccaaa actggtatga ttatggtttt cggtgaaatt 180

accaccaaag ctagacttga ctaccaacaa atagtaagag ataccatcaa gaagattggt 240

tatgacgatt ctgccaaggg tttcgactac aagacatgta atgttttagt agctatcgaa 300

caacaatctc cagatatcgc tcaaggtctg cactatgaaa agagcttaga agacttaggt 360

gctggtgacc aaggtataat gtttggttac gctacagacg aaactccaga agggttacca 420

ttgaccattc ttttggctca caaattgaac atggctatgg cagatgctag aagagatggt 480

tctctcccat ggttgagacc agacacaaag actcaagtca ctgtcgaata cgaagacgac 540

aatggtagat gggttccaaa gaggatagat accgttgtta tttctgctca acatgctgat 600

gaaatttcca ccgctgactt gagaactcaa cttcaaaaag atattgttga aaaggtcata 660

ccaaaggata tgttagacga aaataccaaa tatttcatcc aaccatccgg tagattcgtc 720

atcggtggtc ctcaaggtga cgctggtttg accggtagaa agattattgt cgacgcttac 780

ggtggtgcct catccgtcgg tggtggtgcc ttctccggta aggactattc caaggtcgat 840

cgttccgctg cttacgctgc tagatgggtt gccaagtctc tagttgccgc tggtttgtgt 900

aagagagtcc aagtccaatt ttcatatgct attggtattg ctgaaccatt gtctttacat 960

gtggacacct atggtacagc tacaaaatca gatgacgaaa tcattgaaat tattaagaag 1020

aacttcgact tgagaccagg tgtgttagta aaggaattag atttggctag accaatttac 1080

ttaccaaccg cttcttatgg tcacttcact aatcaagagt actcatggga aaaaccaaag 1140

aaattggaat tttaa 1155

<210> 2

<211> 795

<212> DNA

<213> 大肠杆菌DH5α(Escherichia coli)

<400> 2

ttgaaaaaac tgaaactgca tggctttaat aatctgacca aaagtctgag tttttgtatt 60

tacgatatct gctacgccaa aactgccgaa gagcgcgacg gttatattgc ttatatcgat 120

gaactctata atgccaaccg tctgaccgaa atcctgtcag aaacctgttc cattatcggg 180

gctaatattc ttaacatcgc ccgccaggat tacgaaccac agggtgccag cgtcactatt 240

ctggtgagtg aagaaccggt tgacccgaaa ctcatcgaca aaacagaaca ccccggccca 300

ctgccagaaa cggtcgttgc ccatcttgat aaaagtcata tttgcgtaca tacctacccg 360

gaaagtcatc ctgaaggcgg tttatgtacc ttccgcgccg atattgaagt ctctacctgc 420

ggcgtgattt ctccgctgaa ggcgctgaat tacctgatcc accagcttga gtccgatatc 480

gtaaccattg attatcgcgt gcgcggtttt acccgcgaca ttaacggtat gaagcacttt 540

atcgaccatg agattaattc gattcagaac tttatgtctg acgatatgaa ggcgctgtat 600

gacatggtgg atgtgaacgt ctatcaggaa aatatcttcc ataccaagat gttgcttaaa 660

gagttcgacc ttaagcacta catgttccac accaaaccgg aagacttaac cgacagcgag 720

cgccaggaaa ttaccgctgc gctgtggaaa gaaatgcgcg agatttatta cgggcgcaat 780

atgccagctg tttaa 795

<210> 3

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catatggcgc aggaaattac acatccgaca attgtcgatg gctggtttag agaaattagc 60

gatacaatgt ggccgggcca ggcgatgaca ctgaaagtcg aaaaagtcct gcatcatgaa 120

aaaagcaaat atcaggatgt cctgattttt aaaagcacaa catatggcaa tgtcctggtc 180

ctggataatg tcattcaggc gacagaaaga gatgaatttg cgtatcagga aatgattgcg 240

catctggcgc tgaatagcca tccgaatccg aaaaaagtcc tggtcattgg cggcggcgat 300

ggcggcgtcc tgagagaagt cgtcaaacat gatagcgtcg aagaagcgtg gctgtgcgat 360

attgatgaag cggtcattag actgagcaaa gaatatctgc cggaaatggc ggcgagctat 420

agccatccga aagtcaaaac acatattggc gatggctttc agtttctgag agattatcag 480

aatacatttg atgtcattat tacagatagc agcgatccgg aaggcccggc ggaaacactg 540

tttcagaaag aatattttca gctgctgaat agcgcgctga cagaaaaagg cgtcattaca 600

acacaggcgg aaagcatgtg gattcatctg ccgattatta aagatctgaa aaaagcgtgc 660

agcgaagtct ttccggtcgc ggaatatagc tttgtcacaa ttccgacata tccgacaggc 720

acaattggct ttatggtctg cagcaaagat aaaacatgca atgtcaaaaa accgctgaga 780

gaaattagcg atgaaaaaga agcggaactg tatagatatt ataataaaaa aattcatgaa 840

gcgagctttg tcctgccgac atgggcggcg aaagaactga attagctcga g 891

<210> 4

<211> 537

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌LX-12(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 4

cgggctcaag acttcagtat acaaaaaagc tgaaacggtt caaacatatc tattgctcag 60

acagctgtga aaatacgatc cgcgaattgc agaacttaac gtacgcaaaa aacaaaaacg 120

gcgttctgtc ggaagatgag ttttcaattg atccccacac actttcagcc atttggtatg 180

cgctggatga ctatgacgcg gcggatctga aagatgcatc acaaaaacgg agacgtccga 240

atcgggaaag gaggagatag gcgttgccta actatcaaaa cgttagagcc accgtcttta 300

aatcaaaaat ggccgcgccg caggcaaggc agatgaacga agatcaattt gccgatctgt 360

acggcgaaga catcatttca ccgccctata atctcattga actgaaaaca atcgccgaat 420

actcgacgat tcttcagcag tgcattgacg cgtatcgggt caatattacg ggttttgggt 480

tcgatgtgga atataccttt gatgtaaata gcccagattg ctcaccgtct aaaaagg 537

<210> 5

<211> 545

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌LX-12(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 5

cattacgccc gtgtctgtgg aaattaaatc acttgcggaa attctgcagg atgatgcgct 60

gtttcttgaa tatgacgaca gaagcagaaa taaactccgt tccgctttcc gtctcccgcc 120

gctttatacg ggagaggcgc aggaatacaa caaagccaca gccgatacgg cacggaaaat 180

aacggaggag caggtgtttc agccggagcg gaaaacgctg attaataagc tcaacacgtt 240

atttttgcct gaactgggtc tccacgatgt acagctcaca ttaaaagggc ctgattttcg 300

cgatccgctt gaaattgcga aggtgcttac gccatttatt tccgccggcg cggtctctcc 360

taatgacctc cgtgatctgg cgggaagagt gctcggcaag acgcttgagg aatggcctga 420

agagtactac agccggccgg tgctgaaagg gaaataggag caatcctgaa agggggtgaa 480

aacatctcgt gccgagagaa ttgagaaatg ccgtcatcag ttttgtgagc tatgtcgata 540

aggcg 545

<210> 6

<211> 305

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌168(Bacillus subtilis)

<400> 6

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

tttgcgtttt taccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

atgaa 305

<210> 7

<211> 501

<212> DNA

<213> 地衣芽胞杆菌WX-02(Bacillus licheniformis)

<400> 7

aagagcagag aggacggatt tcctgaagga aatccgtttt tttattttgc ccgtcttata 60

aatttctttg attacatttt ataattaatt ttaacaaagt gtcatcagcc ctcaggaagg 120

acttgctgac agtttgaatc gcataggtaa ggcggggatg aaatggcaac gttatctgat 180

gtagcaaaga aagcaaatgt gtcgaaaatg acggtatcgc gggtgatcaa tcatcctgag 240

actgtgacgg atgaattgaa aaagcttgtt cattccgcaa tgaaggagct caattatata 300

ccgaactatg cagcaagagc gctcgttcaa aacagaacac aggtcgtcaa gctgctcata 360

ctggaagaaa tggatacaac agaaccttat tatatgaatc tgttaacggg aatcagccgc 420

gagctggacc gtcatcatta tgctttgcag cttgtcacaa ggaaatctct caatatcggc 480

cagtgcgacg gcattattgc g 501

<210> 8

<211> 2683

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgggctcaag acttcagtat acaaaaaagc tgaaacggtt caaacatatc tattgctcag 60

acagctgtga aaatacgatc cgcgaattgc agaacttaac gtacgcaaaa aacaaaaacg 120

gcgttctgtc ggaagatgag ttttcaattg atccccacac actttcagcc atttggtatg 180

cgctggatga ctatgacgcg gcggatctga aagatgcatc acaaaaacgg agacgtccga 240

atcgggaaag gaggagatag gcgttgccta actatcaaaa cgttagagcc accgtcttta 300

aatcaaaaat ggccgcgccg caggcaaggc agatgaacga agatcaattt gccgatctgt 360

acggcgaaga catcatttca ccgccctata atctcattga actgaaaaca atcgccgaat 420

actcgacgat tcttcagcag tgcattgacg cgtatcgggt caatattacg ggttttgggt 480

tcgatgtgga atataccttt gatgtaaata gcccagattg ctcaccgtct aaaaaggtga 540

taggtggtat gttttcgctt gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa 600

taactgacaa acatcaccct cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt 660

gcgtttttac cgtgatttcg tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat 720

ggctgaaaat tcttacattt attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg 780

attatgtaaa atataaagtg atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacacatg 840

aattgaaaaa actgaaactg catggcttta ataatctgac caaaagtctg agtttttgta 900

tttacgatat ctgctacgcc aaaactgccg aagagcgcga cggttatatt gcttatatcg 960

atgaactcta taatgccaac cgtctgaccg aaatcctgtc agaaacctgt tccattatcg 1020

gggctaatat tcttaacatc gcccgccagg attacgaacc acagggtgcc agcgtcacta 1080

ttctggtgag tgaagaaccg gttgacccga aactcatcga caaaacagaa caccccggcc 1140

cactgccaga aacggtcgtt gcccatcttg ataaaagtca tatttgcgta catacctacc 1200

cggaaagtca tcctgaaggc ggtttatgta ccttccgcgc cgatattgaa gtctctacct 1260

gcggcgtgat ttctccgctg aaggcgctga attacctgat ccaccagctt gagtccgata 1320

tcgtaaccat tgattatcgc gtgcgcggtt ttacccgcga cattaacggt atgaagcact 1380

ttatcgacca tgagattaat tcgattcaga actttatgtc tgacgatatg aaggcgctgt 1440

atgacatggt ggatgtgaac gtctatcagg aaaatatctt ccataccaag atgttgctta 1500

aagagttcga ccttaagcac tacatgttcc acaccaaacc ggaagactta accgacagcg 1560

agcgccagga aattaccgct gcgctgtgga aagaaatgcg cgagatttat tacgggcgca 1620

atatgccagc tgtttaaaag agcagagagg acggatttcc tgaaggaaat ccgttttttt 1680

attttgcccg tcttataaat ttctttgatt acattttata attaatttta acaaagtgtc 1740

atcagccctc aggaaggact tgctgacagt ttgaatcgca taggtaaggc ggggatgaaa 1800

tggcaacgtt atctgatgta gcaaagaaag caaatgtgtc gaaaatgacg gtatcgcggg 1860

tgatcaatca tcctgagact gtgacggatg aattgaaaaa gcttgttcat tccgcaatga 1920

aggagctcaa ttatataccg aactatgcag caagagcgct cgttcaaaac agaacacagg 1980

tcgtcaagct gctcatactg gaagaaatgg atacaacaga accttattat atgaatctgt 2040

taacgggaat cagccgcgag ctggaccgtc atcattatgc tttgcagctt gtcacaagga 2100

aatctctcaa tatcggccag tgcgacggca ttattgcgca ttacgcccgt gtctgtggaa 2160

attaaatcac ttgcggaaat tctgcaggat gatgcgctgt ttcttgaata tgacgacaga 2220

agcagaaata aactccgttc cgctttccgt ctcccgccgc tttatacggg agaggcgcag 2280

gaatacaaca aagccacagc cgatacggca cggaaaataa cggaggagca ggtgtttcag 2340

ccggagcgga aaacgctgat taataagctc aacacgttat ttttgcctga actgggtctc 2400

cacgatgtac agctcacatt aaaagggcct gattttcgcg atccgcttga aattgcgaag 2460

gtgcttacgc catttatttc cgccggcgcg gtctctccta atgacctccg tgatctggcg 2520

ggaagagtgc tcggcaagac gcttgaggaa tggcctgaag agtactacag ccggccggtg 2580

ctgaaaggga aataggagca atcctgaaag ggggtgaaaa catctcgtgc cgagagaatt 2640

gagaaatgcc gtcatcagtt ttgtgagcta tgtcgataag gcg 2683

<210> 9

<211> 1697

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

tttgcgtttt taccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

atgaacatat ggcgcaggaa attacacatc cgacaattgt cgatggctgg tttagagaaa 360

ttagcgatac aatgtggccg ggccaggcga tgacactgaa agtcgaaaaa gtcctgcatc 420

atgaaaaaag caaatatcag gatgtcctga tttttaaaag cacaacatat ggcaatgtcc 480

tggtcctgga taatgtcatt caggcgacag aaagagatga atttgcgtat caggaaatga 540

ttgcgcatct ggcgctgaat agccatccga atccgaaaaa agtcctggtc attggcggcg 600

gcgatggcgg cgtcctgaga gaagtcgtca aacatgatag cgtcgaagaa gcgtggctgt 660

gcgatattga tgaagcggtc attagactga gcaaagaata tctgccggaa atggcggcga 720

gctatagcca tccgaaagtc aaaacacata ttggcgatgg ctttcagttt ctgagagatt 780

atcagaatac atttgatgtc attattacag atagcagcga tccggaaggc ccggcggaaa 840

cactgtttca gaaagaatat tttcagctgc tgaatagcgc gctgacagaa aaaggcgtca 900

ttacaacaca ggcggaaagc atgtggattc atctgccgat tattaaagat ctgaaaaaag 960

cgtgcagcga agtctttccg gtcgcggaat atagctttgt cacaattccg acatatccga 1020

caggcacaat tggctttatg gtctgcagca aagataaaac atgcaatgtc aaaaaaccgc 1080

tgagagaaat tagcgatgaa aaagaagcgg aactgtatag atattataat aaaaaaattc 1140

atgaagcgag ctttgtcctg ccgacatggg cggcgaaaga actgaattag ctcgagaaga 1200

gcagagagga cggatttcct gaaggaaatc cgttttttta ttttgcccgt cttataaatt 1260

tctttgatta cattttataa ttaattttaa caaagtgtca tcagccctca ggaaggactt 1320

gctgacagtt tgaatcgcat aggtaaggcg gggatgaaat ggcaacgtta tctgatgtag 1380

caaagaaagc aaatgtgtcg aaaatgacgg tatcgcgggt gatcaatcat cctgagactg 1440

tgacggatga attgaaaaag cttgttcatt ccgcaatgaa ggagctcaat tatataccga 1500

actatgcagc aagagcgctc gttcaaaaca gaacacaggt cgtcaagctg ctcatactgg 1560

aagaaatgga tacaacagaa ccttattata tgaatctgtt aacgggaatc agccgcgagc 1620

tggaccgtca tcattatgct ttgcagcttg tcacaaggaa atctctcaat atcggccagt 1680

gcgacggcat tattgcg 1697

Claims

1.一株高产亚精胺的解淀粉芽胞杆菌工程菌，其特征在于，该菌株的保藏编号为CCTCCNO：M2019326。

2.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌工程菌在生产亚精胺中的应用。