CN111019960A

CN111019960A - 一种酶法制备亚精胺的方法

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Publication number: CN111019960A
Application number: CN201911171620.0A
Authority: CN
Inventors: 陈可泉; 刘逸; 王昕�; 郭兴; 乔荣梅; 高思远; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2039-11-26
Also published as: CN111019960B

Abstract

本发明公开了一种酶法制备亚精胺的方法，该方法以BL21DE3为出发菌株，在出发菌株基础上过分别过表达了来源于大肠杆菌K12中编码S‑腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因和编码亚精胺合成酶的speE基因，通过上述操作得到两株工程菌，通过细胞破碎得到的粗酶液进行反应后得到亚精胺的产量为1g/L。与现有技术相比，本发明方法生物合成法有着绿色，高产，条件温和等优点，尤其是副产物少，对环境友好度高。

Description

一种酶法制备亚精胺的方法

技术领域

本发明涉及亚精胺的生产领域，具体涉及一种酶法制备亚精胺的方法。

背景技术

亚精胺是一种广泛存在生物体内的多胺类物质，在抗衰老、保护心血管、改善代谢性疾病等领域有着巨大的潜力。最早的亚精胺是从精液中分离而被发现的，但实际上它是生物体内广泛存在的一种物质，全麦食物、海带、马齿苋、蘑菇、成熟奶酪、豆类和全谷类均富含这种成分。

目前市场上制备亚精胺的主要方法是化学制备法和提取法，如发明专利CN102659605公布了一种亚精胺的合成方法，该专利的制备方法是先制备Cbz单保护的 1,4-丁二胺，然后将其与丙烯腈进行加成反应，最后将氰基还原并脱除Cbz保护，最后得到亚精胺产品。如发明专利CN 109096122以氨基丙醇和丁内酯为原料反应后，经过还原、氨基保护等步骤，制备得到了亚精胺。化学合成法的耗能高，副反应多，污染大，而提取法制作繁琐，产物纯度低，导致亚精胺价格昂贵。

目前生物合成法有着绿色，高产，条件温和等优点，有望克服化学合成法和提取法的缺点。如发明专利CN 110257313通过在芽孢杆菌中构建表达相关基因并通过发酵的方式最终得到亚精胺产量为56.59 mg/L。然而发酵法反应过程具有不确定性、细胞膜对底物或酶的通透性、副产物导致的产物的降解及副产物的累积等，都阻碍了其在工业上的推广。与发酵法相比，酶法的优点在于反应的产物更加专一，过程易于控制，反应体系中不含有微生物、有毒的原料试剂等杂质，非常有利于后续的分离纯化。目前酶法生产亚精胺的报道较少，原因在于酶的制备复杂，不能很好的控制反应进程，因此，需要进一步的探索。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种酶法制备亚精胺的方法，该方法以

大肠杆菌BL21DE3为出发菌株，分别过表达了大肠杆菌speD基因和speE基因，利用粗酶液反应生产亚精胺的产量为1g/L。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种酶法制备亚精胺的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建质粒pcwj-speD和质粒petduet-speE

（1）构建质粒pcwj-speD：

设置上游引物带有EcoR I酶切位点，

序列1为CCGGAATTCTTGAAAAAACTGAAACTGCATGGC，

设置下游引物带有BamH I酶切位点，

序列2为CGCGGATCCTTAAACAGCTGGCATATTGCGC，

大肠杆菌KA30的基因组DNA（来自全式金公司的商业化大肠杆菌K系列菌株）作为模板扩增得到片段speD,将保在DH5α（商业化）中的pcwj质粒进行提取，选取酶切位点EcoR I和BamH I，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后，分别进行胶回收，完成后检测质粒浓度；使用T4 DNA Ligase(Takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化感受态,涂板于带有氯酶抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养8-12h，经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒pcwj-speD；

（2）构建质粒petduet-speE

设置上游引物带有BamH I酶切位点，

序列3为CGCGGATCCAATGGCCGAAAAAAAACAGTGG，

设置下游引物带有Sal I酶切位点，

序列4为ACGCGTCGACTTAGGACGGCTGTGAAGC，

大肠杆菌KA30的基因组DNA（来自全式金公司的商业化大肠杆菌K系列菌株）作为模板扩增得到片段speD，将保在DH5α（商业化）中的pcwj质粒进行提取，选取酶切位点BamH I和Sal I，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后分别进行胶回收，完成后检测下质粒浓度，使用T4 DNA Ligase(Takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化感受态,涂板于带有氨苄抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养12-16h。经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒petduet-speE；

步骤2，菌株的诱导表达

（1）将验证构建成功的质粒分别转化到大肠杆菌BL21DE3中，涂布于对应抗性的平板上。

（2）菌体的诱导表达：将菌株BL21DE3-pcwj-speD,BL21DE3-petduet-speE分别接种至5mlLB液体培养基，千分之2的抗性，37℃，200rpm条件下培养至OD≈0.8，按百分之一的接种量接至100mL LB液体培养基，2‰抗性，37℃，200rpm条件下培养至OD≈0.6-0.8之间进行诱导，诱导剂用量为度0.5‰~2‰；

步骤3，催化生产亚精胺

在50ml反应小瓶中进行如下体系：称取100mg S-腺苷甲硫氨酸，100mg丁二胺盐酸盐，加入适量Mg²⁺后加入10mlPBS缓冲液，另外加入5-20mlBL21DE3-pcwj-speD粗酶液，1-5mlBL21DE3-petduet-speE粗酶液，使用pH计将pH调至6.5-8，反应10-16h，完成催化反应，检测反应液上清中S-腺苷甲硫氨酸的消耗以及亚精胺的生成情况。

作为改进的是，步骤1中扩增时的PCR体系为95℃ 2-5min ，95℃ 10-20s，55℃10-20s，72℃ 10-20s，共30个循环；72℃ 5-10min。

作为改进的是，步骤1中酶切时的体系30-37℃，1-2h。

作为改进的是，步骤1中将胶回收之后的质粒和片段进行连接的体系为10×Ligase buffer1-2ul，T4 DNA Ligase(Takara) 1μl，基因片段5-7ul，载体1-2ul。

作为改进的是，步骤1中感受态为Trans1-T1或DH5α。

作为改进的是，步骤1中菌落PCR在平板上化线生长的时间为16h。

作为改进的是，步骤3中BL21DE3-pcwj-speD粗酶液和BL21DE3-petduet-speE粗酶液的体积比为10-20：1。

进一步改进的是，步骤3中BL21DE3-pcwj-speD粗酶液和BL21DE3-petduet-speE粗酶液的体积比为20：1。

作为改进的是，步骤3中检测S-腺苷甲硫氨酸采用Agilent TC-C18色谱柱，所用流动相由三氟乙酸溶于水和乙腈的混合溶液形成的浓度为0.1%的三氟乙酸溶液，流动相的流速为1ml/min；检测亚精胺需进行柱前衍生化，衍生化方法为：吸取 1 mL 的样品溶液于 10mL 离心管中，加入 200 μL NaOH,300 μL 饱和碳酸氢钠，使溶液呈碱性。涡旋振荡 10 s后，加入3ml 10 mg/mL 的丹磺酰氯。将混合液涡旋 20 s 后放入水浴锅中，避光衍生35min。衍生结束后，在混合液中加入 100 μL 氨水，混匀后，放入 25 ℃的水浴锅中进行终止反应。30 min 后取出，用乙腈定容至 5 mL,于 4 ℃冷冻离心机中离心（3 000 r/min,10 min）。离心结束后，用 2 mL 注射器吸取上清液，过 0.22 μm 滤膜，注入 1.5 mL 进样小瓶中，待检测。检测亚精胺生成的液相方法如下：采用的是Agilent HC-C18柱，流动相为A：超纯水，B:乙腈，流速1ml/min进行梯度洗脱，洗脱顺序如下：0-5min 35%A，65%B、5-10min30%A，70%B、10-20min 100%B、20-25min 30%A，70%B、25-30min 35%A，65%B。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种酶法制备亚精胺的方法克服化学合成法和提取法的缺点，具有生物合成法有着绿色，高产，条件温和等优点，具体优势如下：

1、反应的产物更加专一，无副产物生成；

2、过程易于控制，方便调整催化条件；

3、反应体系中不含有微生物、有毒的原料试剂等杂质；

4、有利于后续的分离纯化，一步离心即可得到产物；

5、与发酵法相比，利用粗酶液进行生产反应时间更短，产物量更多。

附图说明

图1为pcwj-speD菌落PCR的结果；

图2为petduet -speE菌落PCR的结果；

图3为亚精胺标品的液相图；

图4为反应液中亚精胺产量图；

图5为两种酶添加比例不同的产物量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1构建质粒pcwj-speD和质粒petduet-speE

通过查询BRENDA，NCBI，KEGG等生物学相关网站以及亚精胺合成代谢通路图，分析出能够合成亚精胺产物限速步骤的关键酶，分别是S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因和亚精胺合成酶的speE基因。

以大肠杆菌BL21DE3(来自昂羽生物公司的商业化感受态细胞)为出发菌株，分别过表达speD基因和speE基因，由此获得了两株大肠杆菌工程菌株。具体的构建方法如下：

1、构建质粒pcwj-speD：

设置上游引物带有EcoR I酶切位点，序列1为CCGGAATTCTTGAAAAAACTGAAACTGCATGGC，

设置下游引物带有BamH I酶切位点，序列2为CGCGGATCCTTAAACAGCTGGCATATTGCGC，

大肠杆菌KA30的基因组DNA（来自全式金公司的商业化大肠杆菌K系列菌株）作为模板扩增得到片段speD,反应条件为：95℃ 2min ，95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 20s，共30个循环；72℃ 5min。将保在DH5α中的pcwj质粒进行提取，选取酶切位点EcoR I和 BamH I，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切时间为30℃1h，37℃1h。

酶切完成后分别进行胶回收，完成后检测下质粒浓度。使用T4 DNA Ligase(Takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接，连接体系为：10×Ligase buffer 1μl，T4DNA Ligase(Takara) 1μl，基因片段7μl，载体1μl。连接于25℃反应3小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂板于带有氯酶抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养8-12h。经核酸胶验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒pcwj-speD。

2、构建质粒petduet-speE

设置上游引物带有BamH I酶切位点，序列3为CGCGGATCCAATGGCCGAAAAAAAACAGTGG，

设置下游引物带有Sal I酶切位点，序列4为ACGCGTCGACTTAGGACGGCTGTGAAGC。

大肠杆菌KA30(来自全式金公司的商业化大肠杆菌K系列菌株)的基因组DNA作为模板扩增得到片段speD,反应条件为： 95℃ 2min ，95℃ 20s，55℃20s，72℃ 20s，共30个循环；72℃ 5min。将保在DH5α中的pcwj质粒进行提取，选取酶切位点BamH I和 Sal I，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切时间为30℃1h，37℃1h。酶切完成后分别进行胶回收，完成后检测下质粒浓度。使用T4 DNA Ligase(Takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接，连接体系为：10×Ligase buffer 1μl，T4 DNA Ligase(Takara) 1μl，基因片段7μl，载体1μl。连接于25℃反应3小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂板于带有氨苄抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养8-12h。经核酸胶验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒petduet-speE。

实施例2 菌株的诱导表达

1、将验证构建成功的质粒分别转化到大肠杆菌BL21DE3中，涂布于对应抗性的平板上。

2、菌体的诱导表达

将菌株BL21DE3-pcwj-speD,BL21DE3-petduet-speE分别接种至5mlLB液体培养基，千分之2的抗性，37℃，200rpm条件下培养至OD≈0.8，按百分之一的接种量接至100mL LB液体培养基，2‰抗性，37℃，200rpm条件下培养至OD≈0.6-0.8之间进行诱导，诱导剂用量为度0.5‰~2‰。

3、菌体破碎

将菌体离心收集后用PBS（Ph=7.0）重悬，用超声破碎仪进行破碎10min，4℃4000rpm离心10min，收集的上清液即为粗酶液，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

实施例3 催化生成亚精胺

检测S-腺苷甲硫氨酸消耗的流动相由三氟乙酸溶于乙腈与水的溶液，形成三氟乙酸浓度为0.1%的混合溶液，其中，水与乙腈的体积比为960：40，检测亚精胺生成的流动相为A：超纯水，B:乙腈，流速均为1ml/min，检测亚精胺需进行柱前衍生化，衍生化方法为：吸取 1 mL的样品溶液于 10 mL 离心管中，加入 200 μL NaOH,300 μL 饱和碳酸氢钠，使溶液呈碱性。涡旋振荡 10 s 后，加入3ml 10 mg/mL 的丹磺酰氯。将混合液涡旋 20 s 后放入水浴锅中，避光衍生35min。衍生结束后，在混合液中加入 100 μL 氨水，混匀后，放入 25 ℃的水浴锅中进行终止反应。30 min 后取出，用乙腈定容至 5 mL,于 4 ℃冷冻离心机中离心（3 000 r/min,10 min）。离心结束后，用 2 mL 注射器吸取上清液，过 0.22 μm 滤膜，注入1.5 mL 进样小瓶中，待检测。检测亚精胺的液相条件需梯度洗脱，洗脱顺序如下：0-5min35%A，65%B、5-10min 30%A，70%B、10-20min 100%B、20-25min 30%A，70%B、25-30min 35%A，65%B（均为体积分数）。

在50ml反应小瓶中进行如下体系：称取100mg S-腺苷甲硫氨酸，100mg丁二胺盐酸盐，加入适量Mg²⁺和PLP后加入10ml PBS缓冲液，另外加入5-9mlBL21DE3-pcwj-speD粗酶液，1-5ml BL21DE3-petduet-speE粗酶液，使用pH计将pH调至6.5-8，反应10-16h，完成催化反应。用Agilent TC-C18色谱柱，Agilent HC-C18柱分别检测反应液上清中S-腺苷甲硫氨酸的消耗以及亚精胺的生成情况。

不同的生产参数亚精胺的产量也有所不同，当添加的S-腺苷蛋氨酸脱羧酶的量增加时，亚精胺的产量也随之增加，具体情况如图5所示，从图中可以看出，当两种酶添加的比例为20：1时，亚精胺的产量达到最大为1g/l。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种酶法制备亚精胺的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial series)

<400> 1

ccggaattct tgaaaaaact gaaactgcat ggc 33

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial series)

<400> 2

cgcggatcct taaacagctg gcatattgcg c 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial series)

<400> 3

cgcggatcca atggccgaaa aaaaacagtg g 31

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial series)

<400> 4

acgcgtcgac ttaggacggc tgtgaagc 28

Claims

1.一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建质粒pcwj-speD和质粒petduet-speE

（1）构建质粒pcwj-speD：

大肠杆菌KA30的基因组DNA作为模板扩增得到片段speD,将保在DH5α中的pcwj质粒进行提取，选取酶切位点EcoR I和 BamH I，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后，分别进行胶回收，完成后检测质粒浓度；使用T4 DNA Ligase(Takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化感受态,涂板于带有氯霉抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养8-12h，经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒pcwj-speD；

（2）构建质粒petduet-speE

设置下游引物带有Sal I酶切位点，序列4为ACGCGTCGACTTAGGACGGCTGTGAAGC，

大肠杆菌KA30的基因组DNA作为模板扩增得到片段speD，将保在DH5α中的pcwj质粒进行提取，选取酶切位点BamH I和 Sal I，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后分别进行胶回收，完成后检测下质粒浓度，使用T4 DNA Ligase(Takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化感受态,涂板于带有氨苄抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养12-16h，经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒petduet-speE；

步骤2，菌株的诱导表达

（1）将验证构建成功的质粒分别转化到大肠杆菌BL21DE3中，涂布于对应抗性的平板上；

步骤3，催化生产亚精胺

在50ml反应小瓶中进行如下体系：称取100mg S-腺苷甲硫氨酸，100mg丁二胺盐酸盐，加入适量Mg²⁺和PLP后加入10mlPBS缓冲液，另外加入5-20ml BL21DE3-pcwj-speD粗酶液，1-5ml BL21DE3-petduet-speE粗酶液，使用pH计将pH调至6.5-8，反应10-16h，完成催化反应，检测反应液上清中S-腺苷甲硫氨酸的消耗以及亚精胺的生成情况。

2.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤1中扩增时的PCR体系为95℃ 2-5min ，95℃ 10-20s，55℃ 10-20s，72℃ 10-20s，共30个循环；72℃ 5-10min。

3.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤1中酶切时的体系30-37℃，1-2h。

4.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤1中将胶回收之后的质粒和片段进行连接的体系为10×Ligase buffer1-2ul，T4 DNA Ligase(Takara)1μl，基因片段5-7ul，载体1-2ul。

5.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤1中感受态为Trans1-T1或DH5α。

6.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤1中菌落PCR在平板上化线生长的时间为16 h。

7.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤3中BL21DE3-pcwj-speD粗酶液和BL21DE3-petduet-speE粗酶液的体积比为10-20：1。

8.根据权利要求7所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤3中BL21DE3-pcwj-speD粗酶液和BL21DE3-petduet-speE粗酶液的体积比为20：1。

9.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤3中检测S-腺苷甲硫氨酸采用Agilent TC-C18色谱柱，所用流动相由三氟乙酸溶于水和乙腈的混合溶液形成的浓度为0.1%的三氟乙酸溶液，流动相的流速为1ml/min；检测亚精胺采用的是Agilent HC-C18柱，需进行柱前衍生化，衍生化方法为：吸取 1 mL 的样品溶液于 10 mL离心管中，加入 200 μL NaOH,300 μL 饱和碳酸氢钠，使溶液呈碱性，涡旋振荡 10 s 后，加入3ml 10 mg/mL 的丹磺酰氯，将混合液涡旋 20 s 后放入水浴锅中，避光衍生35min，衍生结束后，在混合液中加入 100 μL 氨水，混匀后，放入 25 ℃的水浴锅中进行终止反应，30 min 后取出，用乙腈定容至 5 mL,于 4 ℃冷冻离心机中离心后，用 2 mL 注射器吸取上清液，过 0.22 μm 滤膜，注入 1.5 mL 进样小瓶中，待检测，液相检测方法如下：流动相为A：超纯水，B:乙腈，流速1ml/min进行梯度洗脱，洗脱顺序如下：0-5min 35%A，65%B、5-10min 30%A，70%B、10-20min 100%B、20-25min 30%A，70%B、25-30min 35%A，65%B。