CN114941000B - 一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体及其应用，属于生物工程技术领域，包括突变体质粒KPHS‑H231Y，所述突变体质粒KPHS‑H231Y的氨基酸位点231位碱基gaa突变为tac，所述突变体质粒由实验室构建的KPHS质粒通过定点突变的方法制备，本发明的突变体质粒KPHS‑H231Y参与的原儿茶酸乙酯的合成反应显著提高了原儿茶酸乙酯产量，突变株的生产方式绿色环保且具有创新性。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体及其应用。
背景技术
原儿茶酸乙酯，白色或浅棕黄色结晶性粉末，属于酚酸类化合物，是一种食品添加剂，可用于油脂，奶油的防氧化，市场量较大。目前，原儿茶酸乙酯的生产方式是化学合成，但以生物合成的方式进行生产却很少报道，原因大多是原儿茶酸乙酯生物合成途径中的关键酶基因KPHS活性较低，使得产品产量较低。而定点突变目前是改造、优化基因的便捷方案，是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具。
发明内容
针对上述存在的技术不足，我们通过定点突变的方法发现了关键酶基因KPHS的氨基酸位点Glu231突变为Tyr231能够增强关键酶基因KPHS活性，基于该突变，本发明的目的是提供一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体，其特征在于，包括突变体质粒KPHS-E231Y，所述突变体质粒KPHS-E231Y的氨基酸位点231位碱基gaa突变为tac，所述突变体质粒KPHS-E231Y由实验室构建的KPHS质粒通过定点突变的方法制备。
优选的，所述突变体质粒KPHS-E231Y的核酸序列如SEQ NO.1所示。
优选的，所述定点突变方法具体为：
S1、以质粒KPHS为模板，进行聚合酶链式(PCR)反应，获得PCR产物；S2、采用消化酶Dpn1消化PCR产物并使用纯化试剂盒进行纯化，得到纯化的PCR产物；S3、取纯化的PCR产物以化学转化法导入大肠杆菌克隆菌株感受态细胞中，待长出菌落后挑取单菌落进行培养；S4、利用质粒提取试剂盒抽提质粒得到突变体质粒KPHS-E231Y。
优选的，所述质粒KPHS为实验室构建的质粒。
优选的，所述聚合酶链式反应的反应条件为：95℃变性，50-60℃退火，72℃延伸，循环35次。
优选的，取纯化的PCR产物0.1-10ul以化学转化法导入大肠杆菌克隆菌株感受态细胞中。
优选的，对所述突变体质粒KPHS-E231Y进行表达量检测包括：
将突变体KPHS-E231Y导入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得突变株KPHS-E231Y；
培养：利用LB液体培养基对突变株KPHS-E231Y进行培养，培养参数设定为温度30-37℃，转速200-225rpm；
诱导表达：当培养液中的细胞OD600为0.2-1.2时，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对培养完毕的突变株KPHS-E231Y进行诱导表达，其中，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为0.2mM，诱导表达参数设定为温度20-30℃，转速120-200rpm，稳定培养2小时后取样；
表达量检测：将取样的样品进行离心，弃培养基留菌体，加入缓冲液并使用细胞破碎仪破碎细胞，离心弃沉淀取上清，将上清蛋白置于100℃加热10分钟变性，获得上样蛋白，将上样蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，其中，设定电压120V，时间40分钟，得到的蛋白胶进行染色脱色后，进行突变体KPHS-E231Y的蛋白检测。
本发明通过将关键酶基因KPHS的氨基酸位点Glu231突变为Tyr231获得突变体质粒KPHS，促进原儿茶酸乙酯的生物合成，基于此，本发明的另一目的是提供一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体的应用，该突变体提高了原儿茶酸乙酯产量，其特征在于，所述突变体质粒KPHS-E231Y表达的蛋白用于参与以羟基苯甲酸乙酯为底物合成原儿茶酸甲酯的合成反应。
优选的，所述突变体质粒KPHS-E231Y表达的蛋白参与的合成反应具体步骤为：将所述突变体质粒KPHS-E231Y导入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中；
利用LBS培养基对所述大肠杆菌表达菌株进行恒温培养；
对培养结束的大肠杆菌表达菌株使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达；
往诱导结束反应液中加入对羟基苯甲酸乙酯底物，反应5-8小时，得产物原儿茶酸乙酯。
优选的，所述恒温培养条件为：温度30-37℃，转速200-225rpm。
优选的，所述诱导表达用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为0.2mM，诱导表达条件为温度20-30℃，转速120-200rpm，诱导时间为2小时。
优选的，所述突变体质粒KPHS-E231Y表达的蛋白参与的以羟基苯甲酸乙酯为底物合成原儿茶酸甲酯的合成反应，其产率高于98.26％。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种原儿茶酸乙酯生物合成途径中的关键酶KPHS定点突变蛋白编码基因，显著提高了原儿茶酸乙酯产量，突变株的生产方式绿色环保且具有创新性，具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中菌株的SDS-PAGE蛋白检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：突变体的构建：
(1)利用软件Primer Premier 5.0进行引物设计，得到引物KPHS-E231Y-F和KPHS-E231Y-R，以实验室构建的质粒KPHS为模板，进行聚合酶链式反应，聚合酶链式反应的反应条件为：95℃变性，50-60℃退火，72℃延伸，循环35次，获得PCR产物；
(2)采用消化酶Dpn1消化PCR产物并使用纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，得到纯化的PCR产物；
(3)取纯化的PCR产物0.1-10ul，以化学转化法导入大肠杆菌克隆菌株感受态细胞中，待长出菌落后挑取单菌落进行培养，利用质粒提取试剂盒抽提质粒得到突变体质粒KPHS-E231Y；
(4)测试验证：经测序验证，经历上述步骤成功获得突变体质粒KPHS-E231Y，测试结果为突变体质粒KPHS-E231Y的氨基酸位点231位碱基gaa突变为tac，突变体质粒KPHS-E231Y的核酸序列测试结果如SEQ NO.1所示。
实施例2：突变体质粒KPHS-E231Y在不同菌株中的的蛋白表达检测：
(1)将实施例1中获得的突变体质粒KPHS-E231Y和未突变的质粒KPHS以相同的方法导入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得突变株KPHS-E231Y和菌株sHG11；
(2)培养：利用LB液体培养基对突变株KPHS-E231Y和菌株sHG11进行恒温培养，设定培养参数为温度30-37℃，转速200-225rpm；
(3)诱导表达：当反应液中细胞OD600为0.2-1.2时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，诱导表达设定参数为：温度20-30℃，转速120-200rpm，诱导培养2小时后取样；
(4)表达量测试：将取样的样品进行离心，弃培养基留菌体，加入缓冲液并使用细胞破碎仪破碎细胞，离心弃沉淀取上清蛋白，将上清蛋白置于100℃10分钟进行加热变性，获得上样蛋白，将上样蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，电泳设定电压120V，时间40分钟，得到的蛋白胶进行染色脱色后，进行突变株KPHS-E231Y和菌株sHG11的蛋白表达检测，检测数据如表1所示，SDS-PAGE蛋白检测图如图1所示。
表1：突变株KPHS-E231Y和菌株sHG11的蛋白表达量
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 灰度值 | 52361 | 160243 | 48152 | 191059 |
| 序号 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 灰度值 | 50217 | 182154 | 53778 | 178323 |
注：编号1、3、5、7是菌株sHG11(突变前)的蛋白表达条带，编号2、4、6、8是突变株KPHS-E231Y的蛋白表达条带。
实施例3：突变体质粒KPHS-E231Y表达的蛋白参与的合成反应
(1)将实施例1中获得的突变体质粒KPHS-E231Y和未突变的质粒KPHS分别以相同的方法导入不同的大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得不同的突变株KPHS-E231Y和菌株sHG11，并进行编号；
(2)培养：利用50mL LB液体培养基对不同的突变株KPHS-E231Y和菌株sHG11进行恒温培养，设定培养参数为温度30-37℃，转速200-225rpm；
(3)诱导表达：当OD600为0.2-1.2时，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对相应的已经培养的菌株进行诱导表达，使其终浓度为0.2mM，诱导表达设定参数为温度20-30℃，转速120-200rpm；
(4)生物合成反应：诱导表达2小时后分别往已经诱导完毕的菌株中投加等量的1g/L的底物对羟基苯甲酸乙酯，合成反应设定参数温度15-25℃，转速120-150rpm，反应进行5-8小时，反应结束，使用液相色谱仪检测产物原儿茶酸乙酯的浓度。
(a)液相检测色谱条件为：流动相A：0.1％乙酸水，流动相B：乙腈，流速：1ml/L，柱温：35℃，波长：260nm，进样体积：5μL，保留时间：25min；流动相A：流动相B＝70：30；
(b)测试步骤为：
标准曲线制作：对照品：98％级别3，4-二羟基苯甲酸乙酯；99％级别尼泊金乙酯甲醇；称取3，4-二羟基苯甲酸乙酯，尼泊金乙酯甲醇各100mg，移至50ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度；准备6个10ml容量瓶，精密移取1ml、2ml、4ml、6ml、8ml本实施例步骤(a)中的溶液至容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，定容，分别获得浓度为0.02g/L、0.04g/L、0.08g/L、0.12g/L、0.16g/L的标准溶液，用一次性无菌注射器配合0.22μm滤头过滤进样，对上述标准溶液进行液相色谱检测，以浓度(g/L)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制原儿茶酸乙酯的浓度-峰面积标准曲线；
取反应液稀释，液相色谱检测并依据浓度-峰面积标准曲线计算不同菌株的反应液中原儿茶酸乙酯的含量，测试结果见表2。
表2：不同菌株中突变株KPHS-E231Y和菌株sHG11的参与的合成反应的最终产物浓度
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 菌株编号 | W3110 | BL21 | MG1655 | BL21 | MG1655 |
| 未突变(sHG11)产量(g/L) | 0.524 | 0.436 | 0.489 | 0.516 | 0.493 |
| 突变株(KPHS-E231Y)产量(g/L) | 1.623 | 1.549 | 1.534 | 1.597 | 1.618 |
| 未突变(sHG11)产率％ | 74.1 | 75.9 | 73.5 | 73.8 | 74.6 |
| 突变株(KPHS-E231Y)产率％ | 99.1 | 98.5 | 97.8 | 98.4 | 97.5 |
实施例中所用的液体LB培养基：LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，pH 7.0，纯水定容至1L。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京合谷生命生物科技有限公司
<120> 一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1563
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgaaacctg aagatttccg cgccgacgcg aaacgcccgt taactggcga agagtattta 60
aaaagcctgc aggatggccg cgaaatttat atctacggcg agcgcgtgaa agacgtcacc 120
acgcatccgg ccttccgtaa tgccgcggcc tccgtcgctc agctgtacga tgcgctgcac 180
aaaccggaga tgcaggattc cctgtgctgg ggcaccgata ccggcagcgg cggctacacc 240
cataaattct tccgcgtggc gaaaagcgcc gacgatctgc gccagcagcg cgacgccatc 300
gccgaatggt cgcgcttaag ctacggctgg atgggccgca ccccagacta caaagccgcc 360
ttcggctgcg cgctgggcgc caacccggcg ttttacggcc agttcgagca gaacgcccgc 420
aactggtaca cccgcattca ggaaaccggc ctgtacttta accacgctat cgtcaacccg 480
ccgattgacc gccacaagcc agctgatgaa gtgaaggatg tctacatcaa gctggaaaaa 540
gagactgatg ccgggatcat cgtcagcggc gcgaaagtgg tcgccaccaa ctcggcgctg 600
acccactaca acatgatcgg cttcggctcc gcacaggtga tgggcgagaa cccggacttc 660
gcgctgatgt tcgtcgcgcc gatggatgcc tacggcgtca agcttatctc ccgcgcctcc 720
tatgagatgg tcgccggcgc gaccggatcg ccgtacgact atccgctttc cagccgtttc 780
gacgagaacg acgcgattct ggtaatggat aaggtgctga tcccatggga gaacgtactg 840
atttatcgcg actttgaccg ctgccgccgc tggaccatgg aaggtggttt cgcccgcatg 900
tacccgctgc aggcctgcgt gcgcctggcg gtaaaactgg actttatcac cgccctgctg 960
aaacgctctc tggaatgtac cggcaccctc gaattccgcg gcgtgcaggc cgaccttggc 1020
gaagtggtgg cgtggcgcaa tatgttctgg gcgttaagcg attctatgtg ctcggaagcg 1080
acgccgtggg tcaacggcgc atggctgccg gatcacgccg cgctgcagac ctatcgcgtg 1140
atggccccga tggcctacgc caagatcaag aacatcatcg agcgcaacgt caccagcggc 1200
ctgatttatc tgccgtccag cgcccgcgat ctgaacaacc cgcagatcga ccagtatctg 1260
gcgaagtacg tgcgcggctc caacggtatg gaccacgttg aacgtatcaa aatcctcaaa 1320
ctgatgtggg acgccatcgg cagcgaattc ggcggccgcc atgaactgta tgagatcaac 1380
tactccggta gccaggatga aattcgcctg cagtgtctgc gccaggcgca gagctccggc 1440
aatatggaca aaatgatggc gatggtcgac cgctgcctgt ccgagtacga ccagaacggc 1500
tggacggtgc cgcatctgca caataatgct gatatcaaca tgttggataa gctgctgaag 1560
taa 1563
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1.一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体，其特征在于，所述突变体核酸序列如SEQ NO.1所示。
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| CN106434578A (zh) * | 2016-04-12 | 2017-02-22 | 山西大学 | 一种含有对羟基苯甲酸‑3‑羟化酶基因的红球菌及含有该基因的工程菌构建方法和应用 |
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