CN106591332A

CN106591332A - 茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS及其在提高抗青枯病能力方面的应用

Info

Publication number: CN106591332A
Application number: CN201610989619.9A
Authority: CN
Inventors: 曹必好; 雷建军; 陈长明; 陈国菊; 夏斌; 陈娜; 扶京龙; 余炳伟; 周火燕; 董日月
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2016-11-10
Filing date: 2016-11-10
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-11-10
Also published as: CN106591332B

Abstract

本发明首次公开了一种茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS及其在提高茄子抗青枯病能力方面的应用。所述基因SmSPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次克隆分离出茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS，并通过构建该基因的重组载体以及表达量分析对该基因调控茄子青枯病的抗性机理进行了研究，结果表明，亚精胺合成酶基因SmSPDS具有正向调控茄子抗青枯病的能力，本发明对阐明茄子对青枯病抗性调控的分子机理有重要作用，同时在茄子抗病基因工程育种上具有较大的应用前景。

Description

茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS及其在提高抗青枯病能力方面的应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种技术领域，具体地，涉及一种茄子抗青枯病抗性相关的亚精胺合成酶基因SmSPDS及其应用。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)为茄科、茄属的一年生或多年生植物，是中国广泛栽培的主要蔬菜之一(汪文兴，2014)。但在生产过程中茄子易遭受多种病虫害的侵袭，其中青枯病是世界范围内危害最为严重的病害之一。特别是在我国华南地区终年气温高，雨水多，其气候条件对茄子青枯病的发生与流行十分有利，已成为茄子生产的主要障碍(佘小漫等，2011)。目前尚无有效的药剂对茄子青枯病进行防治，选育抗性品种无疑是最根本的解决方法。但是到目前为止，有关茄子调控青枯病抗性的分子机理仍然不清楚，因此，分离和鉴定茄子调控青枯病抗性相关的基因对茄子的抗青枯病育种具有重要意义。

亚精胺是植物组织中存在的一种主要多胺，参与细胞增殖、分化以及程序性凋亡等多种生理过程，并且还在植物的抗逆反应中起着重要的作用。研究表明：亚精胺与植物的生长发育密切相关。如细胞的分裂和胚胎建成(胡忠，2001)、调节气孔关闭(Liu et al.,2000)、花器官的诱发和形成、果实的发育(钟晓红，2000)和种子的萌发(Sood et al.,2005；黄雪梅等，1995)等，且与乙烯相拮抗，能延缓植物衰老(阳成伟等，2001；柏素花，2008)。在各种逆境胁迫下，植物体内亚精胺水平及其合成酶活性大大增加(张军锋等，2000；任红旭等，2001)，亚精胺能有效缓解各种环境胁迫如温度胁迫(Cheng et al.,2012；Yamamoto et al.,2012；田婧等，2009)、渗透胁迫(Duan et al.,2008；Parvin et al.,2014；Zhang et al.,2014；Zhu et al.,2014)、干旱胁迫(张春梅等，2009；闫刚等，2012)、以及重金属胁迫(周晨楠等，2012)等对植物的伤害。另外，有研究表明，亚精胺还能够诱导植物对番茄斑萎病et al.,2014)、大麦白粉病(Walters et al.,2002)和烟草花叶病毒(Lazzarato et al.,2009)的抗性。

目前为止，还未见有亚精胺能否诱导茄子产生对青枯病的抗性的相关研究和报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有茄子青枯病防治技术和抗性机理的不足和缺陷，提供一种茄子抗青枯病相关的亚精胺合成酶基因SmSPDS，该基因及其编码的蛋白在选育茄子青枯病抗病品种上具有较大的应用前景。

本发明的目的是提供一种茄子亚精胺合成酶基因。

本发明的另一目的是提供一种茄子亚精胺合成酶。

本发明的另一目的是提供含有上述基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供上述基因的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的。

一种茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地，所述基因的长度为1132bp，其开放读码框为32bp～901bp的片段，编码289个氨基酸的蛋白。分析显示该基因与番茄、马铃薯和烟草等茄科植物亚精胺合成酶基因具有较高的同源性。

一种茄子亚精胺合成酶SmSPDS，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述茄子亚精胺合成酶由上述茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS编码翻译得到。

具体地，所述茄子亚精胺合成酶的相对分子质量为32065.4，理论等电点值为4.72。

一种茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS的荧光定量检测引物组，包括上游引物qSmSPDS-F和下游引物qSmSPDS-R，序列分别如SEQ ID NO.3～4所示。

一种重组载体，所述重组载体含有上述SmSPDS的核苷酸序列。

优选地，所述重组载体为瞬时表达载体pEZS-NL-GFP-SmSPDS或VIGS载体pTRV2-SmSPDS。

更优选地，所述瞬时表达载体pEZS-NL-GFP-SmSPDS中SmSPDS的特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.5～6所示。

更优选地，所述VIGS载体pTRV2-SmSPDS中SmSPDS的特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.7～8所示。

一种重组体，所述重组体含有上述重组载体。

优选地，所述重组体为将瞬时表达载体pEZS-NL-GFP-SmSPDS或VIGS载体pTRV2-SmSPDS转化到农杆菌GV3101中所形成的农杆菌重组菌株。

一种SmSPDS基因沉默植物，是将所述植物的SmSPDS基因沉默所得。优选地，是将上述带有pTRV2-SmSPD重组质粒的农杆菌侵染4片真叶的幼苗后获得。

一种提高茄子抗青枯病抗性的方法，所述方法为向茄子喷施亚精胺。

优选地，是向茄子叶片喷施亚精胺。

优选地，所述亚精胺的浓度为0.1～0.3mmol/L。

更优选地，所述亚精胺浓度为0.2mmol/L。

另外，下列所述应用亦在本发明保护范围内：

茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS或茄子亚精胺合成酶SmSPDS在提高茄子抗青枯病抗性中的应用。

茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS在茄子抗病育种中的应用。

优选地，所述应用为茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS在制备抗青枯病转基因茄子中的应用。

本发明从以半野生栽培茄子“E-31”构建的cDNA文库中，通过随机测序法分离出茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS，并且对该基因调控茄子青枯病的抗性机理进行了研究，结果表明该基因具有正向调控茄子抗青枯病的能力，对阐明茄子对青枯病抗性调控的分子机理及抗病基因工程育种有重要作用。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明首次克隆了茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS。

(2)本发明首次发现茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS具有正向调控茄子抗青枯病能力的作用。

(3)本发明为后续茄子对青枯病的抗性研究以及抗病遗传育种奠定了基础。

附图说明

图1为茄子叶片总RNA凝胶电泳图。

图2为cDNA文库平板鉴定库容量图。

图3为cDNA文库插入片段大小及重组率鉴定图。

图4为SmSPDS进化树分析图。

图5为SmSPDS亚细胞定位图。

图6为青枯菌对SmSPDS的表达量影响的荧光定量分析图；A为茄子不同部位SmSPDS的表达分析；B为青枯菌对SmSPDS的表达影响半定量分析；C为青枯菌对SmSPDS的表达影响荧光定量分析，其中R0，R1，R2分别表示抗病材料接种0，36，72小时后SmSPDS表达情况；S0，S1，S2分别表示感病材料接种0，36，72小时后SmSPDS表达情况；G、J、Y分别表示感病材料根、茎、叶的SmSPDS表达情况。

图7为亚精胺处理抗感植株后各信号基因的表达量分析图；A为亚精胺处理感病植株后各信号基因的表达分析；B为亚精胺处理抗病病植株后各信号基因的表达分析

图8为pTRV2-SmSPDS的VIGS载体构建凝胶电泳图；其中，M：DL2000，1为pTRV2-SmSPDS，2为pTRV-2空载体.

图9为SmSPDS基因沉默后茄子青枯病抗性检测；其中，a，c，e，f表示茄子抗感植株在SmSPDS基因沉默后，接种青枯病菌5天后的表现；b，d，表示SmSPDS基因在VIGS植株中的表达分析。

图10为抗感病材料VIGS沉默SmSPDS基因后各信号基因表达图；A为感病材料VIGS沉默SmSPDS基因后各信号基因表达图；B为抗病病材料VIGS沉默SmSPDS基因后各信号基因表达图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明以下实施例所用的材料和试剂如下：

茄子高抗青枯病自交系‘E-31’和高感青枯病自交系‘E-32’：华南农业大学园艺学院曹必好教授课题组提供。

烟草脆裂病毒(TRV)pTRV-1(RNA1)和pTRV-2(RNA2)、大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101：由发明人实验室保存。

pMD19-T，购自TAKARA公司。pDONR222，CloneMiner II cDNA LibraryConstruction Ki，TRIzol Reagent,FastTrack MAG mRNA isolation Kit，SuperScriptIII，Platinum Taq DNA Polymerase均购自Invitrogen公司

实施例1 茄子青枯病菌的分离和接种

以田间刚采集的发病茄子植株为材料分离青枯病菌。

采用伤根—灌根根法人工接种，菌液浓度调制成10⁸cfu/mL悬浊液，将50mL的菌液倒入种植茄子的营养钵，以后1～2天浇1次水以保持土壤湿润，保持温度白天(30±2)℃，夜间(20±2)℃，RH>95％。接种后7～10d观察发病状况。发病情况以0～4级标准进行记录。抗性划分标准为：抗病(R)：DI<10；中抗(MR)：DI在10～20；中感(MS)：DI在21～40；感病(S)：DI>40(曹必好等，2010)。

实施例2 亚精胺合成酶基因SmSPDS的克隆和序列分析

1.总RNA的提取及mRNA的分离

在茄子‘E-31’幼苗四叶期时，接种青枯菌，48h后采集叶片提RNA，取1g组织样品，采用Trizol提取样品的总RNA。取500ug提取的总RNA，冰上融化放置，加DEPC水至总体积500ul，参照MAG mRNA isolation Kit说明书进行mRNA的分离纯化。用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA及mRNA的纯度和质量。

结果显示，提取的总RNA进行1％的琼脂糖凝胶电泳，结果得到28S、18S、5S三条清晰的电泳条带(如图1所示)，28S与18S的亮度比接近2：1，A_260/280及A_260/230的比值在1.9～2.0之间，表明该样品总RNA基本上完整性良好，没有降解，且无蛋白质和多糖的污染。

2.cDNA的合成

cDNA第一链的合成参照CloneMiner说明书进行。将2μg mRNA溶于10ul DEPC水中，加入biotin-attB2-Oligo(dT)Primer(30pmol)1ul混匀，65℃5min，降温到45℃孵育2min，加入5×First Strand Buffer 4ul，DTT(0.1M)2ul，dNTPs(10mM each)1ul，45℃孵育2min；最后加入SuperScript II RT(200U/ul)2ul，混均，置于PCR仪上反应45℃20min，50℃20min，55℃20min。

cDNA第二链的合成。在上述溶液中加入DEPC水91ul，5X Second Strand Buffer30ul；dNTPs(10mM)3ul，E.coli.DNA Ligase(10U/ul)1ul，E.coli.DNA Polymerase I(10U/ul)4ul E.coli.RNaseH(2U/ul)1ul混均，16℃条件下反应2h。最后加入T4DNA Polymerase2ul，16℃，反应5min。将获得的双链cDNA纯化，溶解于DEPC水中。

3.cDNA与attB1重组接头连接

将下列组份加入到6ul双链cDNA中，使得cDNA双链加入attB1接头，5X AdapterBuffer，10ul；attB1 Adapter(1ug/ul)10ul；0.1M DTT 7ul；T4 DNA Ligase(1U/ul)5ul，DEPC水12ul混匀后16℃保温20h。

4.BP重组反应及文库的构建

取cDNA13μl，于20ul反应体系(pDONR222(250ng/ul)2ul，BPII enzymemix 5ul)混匀后置于25℃，反应20h进行BP重组。利用电转化法将重组质粒转入大肠杆菌DH10B中。将转化的大肠杆菌置于37℃，225-250rpm摇床培养1小时后，加入甘油至终浓度20％存于-80℃，此即为文库菌液。

5.cDNA文库质量鉴定

(1)库容量的鉴定

取转化后细菌原液10ul稀释1000倍后，从中取出50ul涂布LB平板(卡那霉素，工作浓度是50ug/mL)，第二天计数。CFU/ml＝平板上的克隆数/50ul×1000倍×1×10³ul，文库总CFU＝CFU/ml×文库菌液总体积(ml)。

结果显示，LB平板37℃过夜培养，在平板上长出75个单一克隆(如图2所示)。根据公式得到CFU/ml(平板稀释度1：1000)＝75/50ul×1000×1000＝1.5×10⁶/mL，文库总库容量CFU＝1.5×10⁶/mL×10mL＝1.5×10⁷。

(2)重组率和插入片段长度鉴定

随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，在Microtube中配制总体积为20μl的反应液(ddH2O 16.2μl，10×PCR Buffer2.0μl，dNTP(10mM)0.5μl，M13F(20uM)0.5μl，M13R(20uM)0.5μl，DNAPolymerase(5U/ul)0.3μl)，放置在Thermal Cycler PCR仪上按以下条件进行PCR反应。扩增程序为：94℃预变性5min，按94℃30s，58℃30s，72℃2min，进行35个循环，72℃保温5min。扩增结束后，扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。M13F：TGTAAAACGACGGCAGT，M13R：CAGGAAACAGCTATGACC。

结果显示，随机挑取的24个克隆PCR产物经凝胶电泳检测，平均插入片段长度在1.2kb以上，重组率为100％(如图3所示)。按照CloneMiner cDNA Library ConstructionKit的要求，一个高质量的文库，其滴度应大于1×10⁶CFU/mL，文库总容量大于5×10⁶CFU，阳性克隆率大于95％，平均插入片段大于或等于1.5kb。由此可见，本发明构建的茄子叶片cDNA文库是一个质量较高的文库。

6.生物信息学分析

通过文库扩增，随机挑取一个白斑菌落进行测序，运用表1中的生物信息学分析网站对克隆的茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS进行生物信息学分析。发现该基因的序列与其他茄科植物中已公布的亚精胺合成酶基因序列以及蛋白质的氨基酸序列同源相似性很大，将其命名为SmSPDS。该基因1132bp，其包含一个870bp开放阅读框，编码289个氨基酸的蛋白，相对分子质量为32065.4，理论等电点值为4.72。分析显示其与番茄、马铃薯和烟草等茄科植物亚精胺合成酶基因具有较高的同源性(如图4)。

表1 生物信息学分析网站

实施例3 SmSPDS亚细胞定位分析

1、将SmSPDS亚克隆到pEZS-NL-GFP载体上，并将重组质粒转化到农杆菌GV3101中，取新鲜的洋葱表皮进行侵染。引物序列如下：

上游引物序列：GGATTCGTGGTTATGGCAGATGAGTG

下游引物序列：CGGAATTCGTGGAGCTCAGCATGAAACC

上下游引物分别添加EcoR I和BamH I酶切位点，下游引物不包含SmSPDS终止密码子。

2、结果显示，SmSPDS定位于细胞核中，而GFP对照均匀的分布于细胞中(如图5所示)。

实施例4茄子中SmSPDS的表达特性分析

1、以抗、感病材料茄子的根、茎、叶为样品，提取RNA，反转录cDNA为模板，18s rRNA作为内参，以SmSPDS基因的一个218bp的片段为目标片段，同时对抗、感材料茄子接种青枯病菌后的0、36、72h分别采一次样，提取叶片RNA，反转成cDNA，以cDNA为模板利用RT-PCR及qRT-PCR技术测定SmSPDS表达量。

表2 qPCR引物序列

2、结果：得到的半定量结果如图6A-B所示：SmSPDS在茄子的根、茎、叶中均能表达，且在茎中表达量高于根和叶。接种青枯菌后，感病材料SmSPDS基因的表达量略有降低，而在抗病材料的表达量随着接种时间的增加而升高。荧光定量PCR的结果与半定量结果基本一致(如图6C)，抗病材料接种青枯菌后，表达量急剧上升；感病材料接种青枯病菌后该基因的表达量呈现下降再上升的趋势，但总体变化不大，含量也不高。而该基因在根茎叶中的表达含量没有很大差别，在茎中的含量略微高于其他组织。

实施例5 外源亚精胺处理茄子幼苗

1、施用外源亚精胺后茄子对青枯病抗性研究

(1)将四叶期‘E-31’和‘E-32’两个自交系的茄子共分为四组，每组30株，接种青枯病菌前两天对其分别进行不同的处理，方法参照周国贤(周国贤，2007)。感病对照组(CK-S)和抗病对照组(CK-R)叶面喷施清水，处理组(感病：SPD-S和抗病：SPD-R)叶面喷施0.2mmol/L的亚精胺。傍晚6点进行，喷施至叶面湿润刚产生液滴即可。处理一天后，然后接种青枯病菌，统计比较处理和对照之间的发病情况。

(2)结果显示，根据总体病情指数划分茄子的抗性标准，感病对照组(CK-S)表现为感病；感病植株经过亚精胺处理后(SPD-S)表现为中感，抗性有所提高。而抗性材料均表现抗病，抗性没有表现下降。因此，外源亚精胺的施用有利于提高茄子对青枯病的抗性。

表3 亚精胺处理后茄子接种青枯菌7天的病情指数

2、外源亚精胺对茄子各信号基因的表影响

(1)外源亚精胺处理茄子后，通过荧光定量PCR分析EDS1、SGT1、GluA、PAD4、NPR1、TGA和MAPK6信号基因的表达变化，信号基因序列参照肖熙鸥(肖熙鸥，2014)。

2、结果显示，外源亚精胺处理茄子植株后，各信号基因的表达量呈总体上升趋势，但EDS1和PAD4有略微的下降趋势(如图7所示)。

实施例6 VIGS鉴定SmSPDS功能研究

1、VIGS载体构建

根据SmSPDS序列以及pTRV-2中MCS中的酶切位点设计含相应酶切位点的一对特异引物：上游引物：5’-CCGGAATTCGATGATAGATGCCGC-3’(包含EcoRI限制性酶切位点)；下游引物：5’-TAGTCTAGACAAAGGTCCAAAGGTC-3’(包含XbaI限制性酶切位点)。

以cDNA为模板扩增出目的片段，克隆到载体pTRV2中，构建茄子SmSPDS病毒沉默载体，并将重组质粒转化到农杆菌GV3101中，构建好的载体命名为pTRV2-SmSPDS。

电泳结果显示，目的片段大小为217bp，空载体片段大小为424bp(如图8所示)，说明pTRV2-SmSPDS烟草脆裂病毒沉默载体构建成功。

2、SmSPDS沉默植株青枯病抗性鉴定

利用VIGS把SmSPDS沉默后，再接种青枯菌(Ralstonia solanacearum)进行鉴定，在幼苗为4片真叶(苗龄约为4周)时对植物进行浸染。

结果显示：接种5d后，茄子抗病材料‘E-31’接种pTRV-2空载植株未出现萎焉症状，接种pTRV2-SmSPDS植株中，10株植株中6株叶片出现了萎焉症状(如图9-c、f所示)；感病材料‘E-32’中，接种pTRV-2空载植株10株植株中5株叶片出现了萎焉症状，接种pTRV2-SmSPDS植株中，10株中9株叶片出现了萎焉症状(如图9-a、e所示)；qRT–PCR结果表明，两种茄子材料中，SmSPDS表达量在pTRV2-SmSPDS植株中均低于pTRV-2空载植株(如图9-b、d所示)。这表明，SmSPDS基因对茄子的青枯病的抗性起着正调控作用。

3、SmSPDS基因沉默后对各信号基因的表达影响分析

通过VIGS沉默茄子SmSPDS基因后，通过荧光定量PCR测定各信号基因的表达变化。

结果显示，VIGS沉默SmSPDS基因后在两种材料中各信号基因的表达总体均处于下降趋势，但TGA含量略有上升(如图10所示)。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS及其在提高抗青枯病能力方面的应用

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1132

<212> DNA

<213> Solanum melongena L.

<400> 1

ttgggccttt aatagacaag gctttgtggt tatggcagat gagtgtgcta ttgtgaaggg 60

aactgaattg cctgtgaaga ggccaagaga ggaagaagaa gaagaagcag agatggaggc 120

agccaacaac aacggttgca gcgccaatga caaacaggag tcatctcctt atatctcttc 180

tgttctacct ggatggttct ctgagattag ccccctttgg cctggggaag cacactcgtt 240

gaaggttgag cagatattgt ttcaggggaa gtctgattac caaaatgttt tggtttttca 300

gtcttcaact tatggaaagg tgcttgtttt ggatggtgtg atccaactta ctgagaggga 360

tgaatgtgct taccaagaga tgatcactca tcttcctctt tgttcaattc ccaaccccaa 420

aaaggtactg gttattggag gaggagatgg tggtgtcttg cgtgaggtgt cccgtcattc 480

ttctgtcaaa cggatcgaca tatgcgagag tgacgagatg gtagttgatg ttgctaaaca 540

atttttccca gatgtagctg taggatatga ggatccacgt gtgaatctcc acattggtga 600

tggagttgca tttttgaaaa atgttcctgc aagaacttac gatgctgtca tagtggactc 660

atctgaccct atatgtccag cacaggagtt gttccaaaat gctttcttta aaagtgtagg 720

aaaggctctt cctccaggac gggttgtatc tacccaagct gagagcatat ggcttcgctt 780

gcacatgatt gaagaagttg atgatagatg ccgcctgatc ttcacggctc agtctcctat 840

gcatggacta ctgttcctac ttatccaagt gtttgattgg tttcatgctg agctccactg 900

agggaccggt agttgacttc aagaacacga ttatccgcat cgacgacgaa agccatggca 960

agacctttgg acctttgaag ttctacaatt ctgagatgca tcaagcatct ttctgtttgc 1020

catcatttgc caagagggtg attgaatcca aaggaaaatg atggggcaca ctacttaatc 1080

agttgttgta cgacgcccta tagttatcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1132

<210> 2

<211> 288

<212> PRT

<213> Solanum melongena L.

<400> 2

Met Ala Asp Glu Cys Ala Ile Val Lys Gly Thr Glu Leu Pro Val Lys

1 5 10 15

Arg Pro Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Met Glu Ala Ala Asn

20 25 30

Asn Asn Gly Cys Ser Ala Asn Asp Lys Gln Glu Ser Ser Pro Tyr Ile

35 40 45

Ser Ser Val Leu Pro Gly Trp Phe Ser Glu Ile Ser Pro Leu Trp Pro

50 55 60

Gly Glu Ala His Ser Leu Lys Val Glu Gln Ile Leu Phe Gln Gly Lys

65 70 75 80

Ser Asp Tyr Gln Asn Val Leu Val Phe Gln Ser Ser Thr Tyr Gly Lys

85 90 95

Val Leu Val Leu Asp Gly Val Ile Gln Leu Thr Glu Arg Asp Glu Cys

100 105 110

Ala Tyr Gln Glu Met Ile Thr His Leu Pro Leu Cys Ser Ile Pro Asn

115 120 125

Pro Lys Lys Val Leu Val Ile Gly Gly Gly Asp Gly Gly Val Leu Arg

130 135 140

Glu Val Ser Arg His Ser Ser Val Lys Arg Ile Asp Ile Cys Glu Ser

145 150 155 160

Asp Glu Met Val Val Asp Val Ala Lys Gln Phe Phe Pro Asp Val Ala

165 170 175

Val Gly Tyr Glu Asp Pro Arg Val Asn Leu His Ile Gly Asp Gly Val

180 185 190

Ala Phe Leu Lys Asn Val Pro Ala Arg Thr Tyr Asp Ala Val Ile Val

195 200 205

Asp Ser Ser Asp Pro Ile Cys Pro Ala Gln Glu Leu Phe Gln Asn Ala

210 215 220

Phe Phe Lys Ser Val Gly Lys Ala Leu Pro Pro Gly Arg Val Val Ser

225 230 235 240

Thr Gln Ala Glu Ser Ile Trp Leu Arg Leu His Met Ile Glu Glu Val

245 250 255

Asp Asp Arg Cys Arg Leu Ile Phe Thr Ala Gln Ser Pro Met His Gly

260 265 270

Leu Leu Phe Leu Leu Ile Gln Val Phe Asp Trp Phe His Ala Glu Leu

275 280 285

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cagcacagga gttgttccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctcagcatg aaaccaatca 20

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggattcgtgg ttatggcaga tgagtg 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggaattcgt ggagctcagc atgaaacc 28

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccggaattcg atgatagatg ccgc 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagtctagac aaaggtccaa aggtc 25

Claims

1.一种茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。

2.一种茄子亚精胺合成酶SmSPDS，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.一种权利要求1所述茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS的荧光定量检测引物组，其特征在于，包括上游引物qSmSPDS-F和下游引物qSmSPDS-R，序列分别如SEQ ID NO.3～4所示。

4.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述基因的核苷酸序列。

5.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为瞬时表达载体pEZS-NL-GFP-SmSPDS或VIGS载体pTRV2-SmSPDS。

6.一种重组体，其特征在于，所述重组体包含权利要求4或5所述的重组载体。

7.权利要求1所述茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS或权利要求2所述茄子亚精胺合成酶SmSPDS在提高抗青枯病能力方面的应用。

8.权利要求1所述茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS在茄子抗青枯病育种中的应用。

9.根据权利权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为亚精胺合成酶基因SmSPDS在制备抗青枯病转基因茄子中的应用。

10.一种提高茄子抗青枯病抗性的方法，其特征在于，向茄子喷施亚精胺。