CN102978234B

CN102978234B - 中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法

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Publication number: CN102978234B
Application number: CN201210438435.5A
Authority: CN
Inventors: 殷文莉; 戴建华; 周开亚
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2012-11-06
Filing date: 2012-11-06
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2032-11-06
Also published as: CN102978234A

Abstract

本发明公开了了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法，其步骤为中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达载体的构建和中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达；本发明成功表达了MIH蛋白，为进一步了解早熟蟹性腺提早发育的内在机理，了解蟹类蜕皮腺的功能机制并为进一步制定控制河蟹性早熟的技术措施提供理论基础，获得实现生长发育和繁殖的人工调控的基础。

Description

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法

技术领域

本发明涉及基因的表达方法，特别涉及到中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法。

背景技术

蜕皮是甲壳动物生长和发育的标志特征，它贯穿甲壳动物个体发育的始终，它受神经系统和内分泌系统共同调节。这个调节过程表现为两种互为拮抗的激素作用。蜕皮激素的刺激作用和M IH的抑制作用。蟹类眼柄中所产生的MIH含量极微，并且家族其它神经肽在大小以及一级结构上的相似性限制了直接从动物体内分离并纯化MIH蛋白。因此，常常用原核及真核蛋白表达系统来生产较大量的重组MIH（Yodmuang et al.，2004；Lee and Watson，2002；Ohira et al.，1999；Sun，1997）。宋霞等（2003，2004）先后报道了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因Ers-MHII的部分cDNA序列及基因组DNA全序列（GeBnank检索号：AY310313）。Ers-MIHI成熟肽包括75个氨基酸，相对分子质量(M)r约为7.8kD，属于小分子多肽。本实验室的郭豫杰和姚燕曾将Ers-MIHI基因成熟肽的cDNA片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1载体和pET-28a(+)载体上，在大肠杆菌中进行了融合表达（郭豫杰等，2004；姚燕等，2006），成功获得融合蛋白。但以pGEX-4T-1为载体获得的融合蛋白N端带有26kD的GST，庞大的标签蛋白可能导致目的蛋白的空间构象不正确，因此需要在纯化后用酶切去除标签蛋白部分。但经凝血酶切除GST后获得的目的蛋白一般N端残留两个氨基酸，而且切割后目的蛋白损失量较大，切割效率不高，从而导致融合蛋白往往检测不出活性，影响了目的蛋白活性及功能的研究。而以pET-28a(+)为载体的融合蛋白没有庞大的标签蛋白，以6His-tag为标签，不仅便于纯化而且分子量小，无免疫原性，不会影响被修饰蛋白质的生理pH值，对目的蛋白的分泌、构象或胞内折叠及纯化后的功能活性几乎无影响，不用设法切除（王华等，2002）。但由于目的蛋白在原核细胞内表达不稳定，易被细菌蛋白酶降解。

基因工程的发展使许多微量蛋白大量表达，也使许多以前难以制备的蛋白得到表达成为可能。大肠杆菌E.coli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达。但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；真核蛋白在E.coli的表达会有更多的问题：由于真核基因通常含有内含子，在E.coli中不能进行正确的剪切和拼接，因此必须表达它的cDNA序列。另外，真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。

发明内容

1、发明要解决的技术问题

针对现有对中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达上的缺陷和不足，特别毕赤酵母表达系统对许多蛋白表达不理想，甚至不表达，要实现中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核在毕赤酵母中的成功表达并兼顾其实用性和安全性。必须充分考虑影响表达和应用的以下因素（1）目的基因特性的改造；（2）启动子的选择；（3）糖基化的消除；（4）提高产物的稳定性，本发明提供了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（Ers-MIH1）基因的真核表达方法，获得实现生长发育和繁殖的人工调控奠定重要的基础。

2、技术内容

（1）发明原理：

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前应用最为广泛的酵母表达系统。由于该系统比原核生物及其它真核生物表达系统具有以下优点，已被广泛地用于外源蛋白的表达。

①具有强有力的乙醇氧化酶（Alochol Oxidase，AOX1）基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；

②作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；

③营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产；

④具有强烈的好氧生长偏爱性，使得它既能高密度发酵生长，亦有利于工业放大生产，可进行细胞高密度培养，此外，Pichia pastoris能够忍耐较宽的pH范围（3.0-7.0），利于在发酵过程中通过调节pH来抑制蛋白水解酶的活性，防止表达的外源蛋白的降解；

⑤在P.Pastori中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外；

⑥糖基化程度低，其糖基化位点与哺乳类细胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，而且表达产物不含有毒物质和致热原；

⑦胞内表达的分选和区域化。.

毕赤酵母的表达载体为整合型质粒，质粒载体与酵母染色体具有同源序列，线性化的质粒通过同源序列而整合到酵母染色体上。质粒pPIC9上带有编码组氨酸脱氢酶的基因HIS4，而宿主菌GS115为HIS4缺陷型，因此只有质粒转化菌才能在缺少组氨酸的MD平板上生长。毕赤酵母一般先在含有甘油的培养基中生长，培养至高密度后，再以甲醇为唯一碳源，诱导表达外源蛋白，这样可以提高表达产量(Cregg et al，1993；Romanos et al，1992)。

上述特点使得巴斯德毕赤酵母表达系统为中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH)1基因的表达提供了一个良好条件，利用酵母表达载体合成重组多肽的方法获得具有生物活性的多肽，对于研究甲壳类眼柄神经激素的结构、功能和作用方式起到重大的作用。为进一步认识中华绒螯蟹生长蜕皮调控机制，最终实现生长发育和繁殖的人工调控奠定重要的基础。

（2）技术方案

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（Ers-MIH1）基因的真核表达方法，其步骤包括为：

步骤一：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（Ers-MIH1）基因的真核表达载体的构建：

（1）引物的设计；

（2）PCR反应；

（3）TA克隆；

（4）质粒提取；

（5）酶切连接转化；

（6）阳性克隆的鉴定；

（7）重组质粒的鉴定；

步骤二：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（Ers-MIH1）基因的真核表达。

（1）贮存液的配制；

（2）培养基的配制；

（3）菌种的复苏;

（4）质粒的提取;

（5）重组质粒pPIC9-MIH1和pPIC9的线性化;

（6）酵母感受态细胞的制备；

（7）MIH1基因的电转化；

（8）酵母转化菌的鉴定；

（9）MIH1表达阳性克隆的筛选；

（10）最佳诱导时间的确定；

（11）筛选菌株的SDS-PAGE检测；

（12）重组MIH1的大规模诱导表达。

3.有益效果

（1）本发明选择较常用的pPIC9作为真核表达载体，毕赤酵母表达载体的多克隆位点位于醇氧化酶基因-1(alcohol oxidase1，AOX1)的启动子(PAOX1)的下游，外源基因MIH1克隆至多克隆位点后，P_AOX1可启动外源基因的表达。

（2）为了使表达的蜕皮抑制激素与天然蛋白质氨基酸序列一致，本研究设计了一对引物，直接将目的基因连接在信号肽编码序列下面，除掉了信号肽切割位点与多克隆位点之间一段序列，使酵母表达的外源蛋白质MIH1经KEX2蛋白酶切割信号肽后得到成熟的中华绒螯蟹蜕皮抑制激素蛋白；同时为了便于利用Ni-NATHis.Bind树脂(Novagen)纯化表达的MIH1重组蛋白，在下游引物的终止密码子前加了1个6-His编码区段。重组质粒pPIC9-MIH1的成功构建为进一步的酵母真核表达MIH蛋白，确定MHI的生理活性和作用机制奠定了重要基础。

（3）克服了过度糖基化、表达周期过长及一些中华绒螯蟹蜕皮抑制激素难以在该系统获得有效表达。

（4）成功表达了MIH蛋白，为进一步了解早熟蟹性腺提早发育的内在机理，了解蟹类蜕皮腺的功能机制并为进一步制定控制河蟹性早熟的技术措施提供理论基础

附图说明

图1为PCR产物琼脂糖凝胶电泳（M：DNA分子量标记DL2000；l-5：PCR产物）；

图2为重组克隆载体的酶切鉴定（M：DNA分子量标记DL2000；1：NotI和XhoI双酶切后载体pPIC9-MIH1）；

图3为重组质粒pPIC9-MIH1接头处顺序；

图4酵母基因组DNA（M：T14marker；1-10及13-21为Gs115-pPIC9-MIH1的基因组）；

图5-1能表达重组蛋白的MIH1重组子的筛选（以Pichia克隆的基因组为模板，用引物5，AOX1primer和3，AOX1primer进行PCR的产物。M：DNA分子量标记；lane1：以GS115的基因组为模板进行PCR的产物；lane2，3，4：以GS115-pPIC9的基因组为模板进行PCR的产物；lane5-16：以His+GS115-pPIC9-MIH1克隆的基因组为模板进行PCR的产物；lane9，10，12，16表示这4个克隆为His+Muts（slow methanol utilization）基因型的重组子，而lane6，7，13，14这4个为假阳性His+克隆，lane2，5，8，11，15没有PCR成功）；

图5-2能表达重组蛋白的MIH1重组子的筛选（以Pichia克隆的基因组为模板，用引物5，AOX1primer和3，AOX1primer进行PCR的产物。M：DNA分子量标记；lane1：以GS115的基因组为模板进行PCR的产物；lane2，3，4：以GS115-pPIC9的基因组为模板进行PCR的产物,为假阳性His+克隆；lane5-24：以His+GS115-pPIC9-MIH1克隆的基因组为模板进行PCR的产物；lane5，6，10，13，14，17，19，24表示这8个克隆为His+Muts（slow methanol utilization）基因型的重组子，而lane7，8，9，11，12，15，16，18，20-23这12个为假阳性His+克隆。）；

图6能表达重组蛋白MIH1重组子的PCR鉴定（以Pichia克隆的基因组为模板，利用目的蛋白的特异性引物MIH1-primer和引物5，AOX1primer和3，AOX1primer进行PCR的产物。M：DNA分子量标记；lane1，2：以His+GS115-pPIC9-MIH1克隆的基因组为模板，引物5，AOX1primer和3，AOX1primer进行PCR的产物；lane3：以pPIC9-MIH1的线性化基因组为模板，用引物5，AOX1primer和3，AOX1primer进行PCR的产物作为阳性对照；lane4：为上述反应的阴性对照；lane5：以GS115的基因组为模板，特异性引物MIH1-primer进行PCR的产物，以下扩增反应均用此引物；lane6：以GS115-pPIC9的基因组为模板进行PCR的产物；lane7-23：以His+GS115-pPIC9-MIH1克隆的基因组为模板进行PCR的产物；lane7，8，12，16，17，19，21表示这7个克隆为His+Muts（slow methanol utilization）基因型的重组子，都含有目的基因MIH1片段，而lane9，10，11，13，14，15，18，20，22，23这10个为假阳性His+克隆）；

图7高效分泌表达MIH1酵母菌株的Tricine-SDS-PAGE分析（M：蛋白质分子量标准；lane1：GS115/pPIC9的表达产物；lane2：刚加入甲醇诱导时（0h）所得的分泌蛋白；lane3：24h所得的分泌重组蛋白；lane4：48h所得的分泌重组蛋白；lane5：72h所得的分泌重组蛋白；lane6：96h所得的分泌重组蛋白；lane7：不加甲醇诱导培养96h时所得的分泌蛋白）；

图8Pichia重组子表达产物的Tricine-SDS-PAGE分析（M：蛋白质分子量标准；lane1：GS115的表达产物；lane2：GS115/pPIC9的表达产物；lane3-6：阳性HIS+Muts克隆的表达产物能表达重组MIH1蛋白；lane7，8：不加甲醇诱导的阳性HIS+Muts克隆的表达产物）。

具体实施方式

实施例一

步骤一：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（Ers-MIH1）基因的真核表达载体的构建

1.1准备实验材料

1.1.1菌株、质粒和试剂

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5-α菌株为本实验室保存。毕赤酵母（Pichia pastoris）GSl15菌株及质粒pPIC9。

1.1.2酶与实验试剂

Plasmid Mini Kit（50）和DNA回收试剂盒（上海华舜），Taq DNA聚合酶和T4DNA连接酶（Promega），Not I、Xho I限制性内切酶，DNA marker DL2000（Takara）。其它分子生物学试剂购自Sigma公司和华美生物工程公司等。

1.1.3设备

15417R型高速离心机（Eppendorf）；TH2-95H恒温振荡器（江苏太仓市医疗器械厂）；Multi TempⅢ水浴锅（Pharmacia）；H-3560自动高压灭菌锅（TsaoHisn）；DS7500UVP凝胶成像系统（Upland）；SW-CJ-10超净工作台（苏州净化设备厂）；SW-CJ-1F净化工作台（苏净集团苏州泰安空气技术有限公司）；

PYX-DHS-35X40-BS型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；

DG30/7-IAHG202-1A型电热干燥箱（南京实验仪器厂）；纯水仪（PharmaciaBiotech）。

2.2中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因（Ers-MIH1）的表达载体构建步骤

2.2.1中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因（Ers-MIH1）的表达载体构建

本试验选择pPIC9作为真核表达载体，该质粒中带有组氨酸脱氢酶的基因HIS₄，而宿主菌GS115为HIS₄缺陷型。因此只有质粒转化菌才能在缺少组氨酸的MD平板上生长。

根据已知的中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因（Ers-MIH1）序列合成引物（上游引物含有Xho I位点，下游引物含有Not I位点），以重组质粒pGEX-4T-MIH1为模板，PCR扩增Ers-MIH1成熟肽片段（引物中加入Not I，Xho I及其他酶切识别位点）后，再切胶纯化成熟肽得到目的基因MIH1。与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α菌株。将阳性克隆测序鉴定后，将阳性克隆含MIH1-pMD18-T的菌株稀释扩增，抽提质粒。并用Xho I和Not I进行双酶切，同时与毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9空载体也用Xho I和Not I进行双酶切，酶切产物分别进行回收纯化。再用T4DNA连接酶将两者连接，得到pPIC9-MIH1重组质粒，用常规CaCl₂法转化大肠杆菌JM109菌株，将阳性克隆进行鉴定。包括菌落PCR鉴定，抽提质粒后进行双酶切鉴定，出现阳性条带的克隆再进行基因测序验证。

2.2.2表达载体的构建

2.2.2.1引物的设计

根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因（Ers-MIHI）的成熟肽编码区cDNA序列和质粒pPIC9的多克隆位点（MCS）设计一对特异性PCR引物：

PIC-MIH-L：5，-GCA CGA CTC GAG AAA AGA↓GGA ATC ATC AAC GCC-3，PIC-MIH-R：5，-TGT AAT GCG GCC GC TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG

TTG CCC GAG GAT GCT-3，

其中上游引物包含1个Xho I、l个KEX2蛋白酶识别位点和MIH基因的前15个核苷酸序列，箭头位置为酵母α因子信号肽的切割位点。下游引物包含MIH基因编码区的最后15个核苷酸序列、1个6-His编码区段（便于后续的纯化工作）、1个Not I识别位点及一个翻译终止密码子。

2.2.2.2PCR反应

PCR反应体系30μl：10×PCR Buffer3μl，浓度为10mM的两条引物各1μl，2mM的dNTPs2μl，MgCl₂2μl，5U/μl的Taq酶0.2μl，模板为pGEX-4T-MIH1质粒0.2μl（此重组质粒为本实验室构建，郭豫杰等，2004），加水补足到30μl。获得的扩增产物切胶纯化后进行TA克隆并测序鉴定。

PCR循环条件：94℃先预变性4min，按以下循环参数进行30个循环：95℃变性40s，62℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃保温10min。取3μl PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统上紫外扫描，拍照。产物用PCR产物凝胶纯化试剂盒纯化。

2.2.2.3TA克隆

PCR凝胶纯化产物已经加A尾，将之插入pMD18-Teasy载体，克隆测序。按照摩尔比约为3-5：1的比例关系将纯化后的PCR产物与pMD18-Teasy载体连接。反应体系：pMD18-T vector0.5μl，纯化产物4.5μl，solutionI5.0μl，总体系10μl，16℃过夜（长于12h）。

将连接好的载体用CaCl₂法转化入克隆菌DH5-α中，平铺于含Amp的LB固体培养板上，37℃培养过夜。挑取培养板上大而圆的单菌落，于含有Amp抗生素的液体LB培养基中，220-240rpm，37℃培养过夜。

以菌液为模板，用通用引物M13和Rev进行PCR扩增，做初步鉴定。

反应条件：菌液0.2μl，M13（10μmol/L）1.0μl，Rev（10μmol/L）)1.0μl，10×Buerfr2.0μl，Mg²⁺（25mM）2.0μl，dNTP（2mM）2.0μl，Taq DNA polymerase0.2μl，加灭菌超纯水至总体积为20μl。

反应参数：95℃先预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min。阳性克隆送联合基因公司测序鉴定。2.2.2.4质粒提取

用质粒提取试剂盒Takara的Mini BEST Plasmid Purification Kit，分别抽提DH5-α中保存的真核表达载体pPIC9的质粒和TA克隆装入目的片段的pMD18-T-MIH1的质粒。2.2.2.5酶切连接转化

（1）将获得正确序列的阳性克隆pMD18T-MIH1提取质粒，并用Xho I和Not I进行双酶切。同时pPIC9也用Xho I和Not I进行双酶切。酶切体系如下：

加水至总体积为20μl

反应条件：16℃恒温水浴过夜16hr。

（3）将连接好的重组质粒用CaCl₂法转入感受态大肠杆菌（Escherichia coli）JM109中。取4.5μl连接产物加入到100μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴热休克90s，快速置于冰中，放置2min。加入900μl SOC，37℃140rpm振荡培养l h。1000g离心2min收集细胞，然后用200μl SOC重悬细胞，取100μl涂于Amp⁺的LB平板上。37℃平放30min，待菌液完全吸收，倒置培养12-16h。

2.2.2.6阳性克隆的鉴定

用特异性引物PIC-MIH-L和PIC-MIH-R进行菌落PCR筛选阳性克隆。

随机挑取8个单克隆于500μl的含100μg/ml的Amp⁺的LB培养液中，37℃250rpm振荡6-8hr。以挑取的单克隆菌液为模板做菌落PCR，筛选出阳性克隆。取0.5μl细菌培养液作PCR反应的模板，以插入片段两侧载体上的序列作引物，PCR扩增。

反应体系：10×Bueffr2.0μl，引物各1.0μl，dNTPMix（2mmol/L）1.8μl，Mg²⁺（25mmol/L）1.0μl，Taq酶0.2μl，菌液0.2μl，加水至总体系20μl。

反应条件：94℃预变性5min，然后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min，产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

随机挑选抗氨苄青霉素的克隆并扩大培养，

2.2.2.7重组质粒的鉴定

PCR产物电泳出现阳性条带的克隆按照1：100的比例稀释扩增，抽提质粒，按照引物设计的酶切位点做Xho I和Not I双酶切鉴定；挑选双酶切能出现阳性条带的克隆，并送测序验证。阳性菌落置于-20℃保种备用。

3实验结果

3.1PCR扩增和TA克隆：根据表达载体pPIC9的多克隆位点（MCS）设计了一对引物，其5’端和3’端分别引入Xho I和Not I酶切位点，KEX2蛋白酶识别位点以及6-His编码区段，在3’端还引入了终止密码子的编码序列。以质粒pGEX-4T-MIH1作为模板，扩增编码MIH1成熟肽的序列。得到的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小与原公开报道的序列大小278bp一致。TA克隆用Amp抗性筛选，重组质粒在抗性LB培养板上布满菌落。用MIH基因的特异性引物进行PCR鉴定，电泳检测条带大小和预计的一致。摇菌培养后用Plasmid Mini Kit质粒抽提试剂盒抽提质粒，电泳检测。阳性菌液测序结果与报道的Ers-MIH1基因序列一致，基因两端设计的酶切位点序列正确。

3.2质粒pMD18-T-MIH1和质粒pPIC9的双酶切：根据载体pPIC9的酶切位点的要求，分别双酶切质粒pMD18-T-MIH1和空载体ppIC9（图1）。用Agarose GelDNA Exrtaction Kit纯化得到带有Xho I和Not I酶切位点粘性末端的Ers-MIH1基因片段和载体pPIC9片段，电泳后用凝胶成像系统粗略定量。

3.3表达载体的构建和鉴定将纯化后的Ers-MIH1基因片段和载体pPCI9片段，按比例连接转化入克隆菌JM109后，在抗性LB培养板上挑单克隆菌落，摇菌扩大培养，用按基因片段序列设计的特异引物对菌落进行PCR鉴定，双酶切鉴定，结果和预计的一致（图2）。测序结果表明插入片段为目的基因Ers-MIH1，整个开放阅读框和载体的融合序列同框，未发生框移，获得了拥有正确读码框架的重组表达载体pPIC9-MIH1(图3)。

从构建的重组质粒pPIC9-MIH1的原理可以推导出重组质粒pPIC9-MIH1接头处顺序，如图3所示。

3.4测序结果：重组质粒以载体上的5’AOX1为引物进行测序，测序结果相同。步骤二：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（Ers-MIH1）基因的真核表达：

1材料与方法

1.1主要实验材料、仪器和试剂

1.1.1实验菌株与质粒

实验重组质粒pPIC9-MIH1，酵母表达菌株GS115。

1.1.2酶与实验试剂

限制性内切酶BglⅡ（Takara）、酵母消解酶、RNase、蛋白酶K、蛋白质分子量标准（上海生物工程公司）、DNA marker DL2000（Takara）。

Plasmid Mini Kit（50）、DNA回收试剂盒（上海华舜）、Yeast DNA Mini Kit（Watson）、Tryptone、Yeast Exartctoin（OXIOD）、SDS（Promgea）、丙稀酞胺、甲叉双丙烯酞胺、N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED）、APS（过硫酸胺），山梨醇、右旋糖（Dextrose）、生物素、无氨基酸酵母氮源（YNB）、Ni-NTA His-BindResin（Novagen）、β-巯基乙醇、无水乙醇、甲醇、尿素、三（羟甲基）甲基甘氨酸（Tricine）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二硫苏糖醇（DTT）、浓盐酸、透析袋、硝酸纤维素膜。其他试剂均为国产分析纯，其它分子生物学试剂购自Sigma公司和华美生物工程公司等。

1.1.3实验器材

15417R型高速离心机（Eppendorf）；TH2-95H恒温振荡器（江苏太仓市医疗器械厂）；Multi TempⅢ水浴锅（Pharmacia）；H-3560自动高压灭菌锅（TsaoHisn）；DS7500UVP凝胶成像系统（Upland）；SW-CJ-10超净工作台（苏州净化设备厂）；SW-CJ-1F净化工作台（苏净集团苏州泰安空气技术有限公司）；PYX一DHS一35X40-BS型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；DG30/7-IAHG202-1A型电热干燥箱（南京实验仪器厂）；纯水仪（PharmaciaBiotech）；蛋白质电泳槽（Bio-Rad）；Hoefer mini VE型垂直电泳槽；电泳仪（Bio-Rad）；UV-2100紫外分光光度计(Unico)；ZD-88-1型多用脱色摇床(太仓市光明实验分析仪器厂)；磁力搅拌器；电穿孔仪（Bio-Rad）

1.2主要试剂配制

1.2.1贮存液的配制

（1）10×YNB贮存液（13.4%的YNB）：称取26.8g无氨基酸酵母氮源（YNB）溶于200ml的双蒸水中，用一次性滤器过滤除菌后，4℃保存。

（2）10×D贮存液（20%右旋糖）：称取50g右旋糖（Dextrose）溶于250ml的双蒸水中，用一次性滤器过滤除菌后，4℃保存。

（3）10×GY贮存液（10%甘油）：量取20ml甘油与180ml的双蒸水混合，高压灭菌，室温保存。

（4）500×B贮存液（0.02%）生物素：称取20mg生物素溶于100ml的双蒸水中，用一次性滤器过滤除菌后，4℃保存。

（5）10×M贮存液（5%甲醇）：量取5ml甲醇与95ml的双蒸水混合，用一次性滤器过滤除菌，4℃保存。

（6）1mol/L磷酸盐缓冲液：将33ml1mol/LK₂HPO₄与217ml1mol/LKH₂PO₄混合，用KOH或H₃PO₄调PH值至6.0，高压灭菌，室温保存。

(7)3C储备胶溶液：丙烯酞胺（Acr）48g，亚甲双丙烯酞胺（Bis）1.59，混匀后加双蒸水，37℃溶解，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存。

5C储备胶溶液：丙烯酞胺（Acr）47g，亚甲双丙烯酞胺（Bis）2.59，混匀后加双蒸水，37℃溶解，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存。

（8）1mol/L盐酸（PH6.8）：取8.62g浓盐酸，加双蒸水91.38ml溶解，定容至100ml。

（9）凝胶缓冲液（3×）：Tris碱90.75g，SDS0.75g，加ddH₂O200ml溶解，用1mol/L盐酸滴定至PH8.45，再加双蒸水稀释至250ml。

（10）10%SDS：电泳级SDS10.0g，加双蒸水68℃助溶，定容至100ml，常温保存。

（11）10×电泳正极缓冲液（pH8.9）：Tris碱121.14g，加400ml双蒸水溶解，用1mol/L盐酸滴定至PH8.9，再加双蒸水定容至500ml。

（12）10×电泳负极缓冲液：Tris碱60.55g，Tricine89.58g及5g SDS溶于400ml双蒸水，再加双蒸水定容至500ml。

（13）10%过硫酸胺（APS）：1g AP加双蒸水至10ml。

（14）酵母消解酶工作液：1mol/L D-Sorbitol，100mM EDTA,PH7.4，4℃保存，用时加入β-巯基乙醇使之浓度为0.1%。

（15）20%SDS：SDS20g，加入双蒸水68℃助溶，定容至100ml，常温保存。

（16）1.5mol/LTris盐酸（pH8.8）：Tris碱18.17g，加双蒸水溶解，IN盐酸调pH至8.8，定容至100ml。

（17）1mol/LTris盐酸（pH6.8）：Tris碱12.11g，加双蒸水溶解，IN盐酸调pH至6.8，定容至100ml。

（18）30%储备胶溶液：丙烯酞胺（Acr）29g，亚甲双丙烯酞胺（Bis）1.09g，混匀后加双蒸水，37℃溶解，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存。

1.2.2培养基的配制

培养基YPD、MD、MM、BMGY、BMMY均按《Invitrogen公司操作手册》（2003）推荐配制。

（1）YPD液体培养基：称取2g酵母提取物，4g Peptone溶于180ml双蒸水中，高压灭菌。冷却后，加入20ml10×D和200μl100mg/ml氨苄青霉素。

（2）YPD固体培养基：称取2g酵母提取物，4g Peptone和4g琼脂溶于180ml双蒸水中，高压灭菌。冷却至60℃，加入20ml10×D和200μl100mg/ml氨苄青霉素，立即铺平板。

（3）MD固体培养基：在160ml双蒸水中加入3g琼脂，高压灭菌，冷却至60℃后，依次加入20ml10×YNB、20ml10×D、0.4ml500×B、200μl100mg/ml氨苄青霉素，立即铺平板。

（4）MM固体培养基：在160ml双蒸水中加入3g琼脂，高压灭菌，冷却至60℃后，依次加入20ml10×YNB、20ml10×M、0.4ml500×B、200μl100mg/ml氨苄青霉素，立即铺平板。

（5）BMGY液体培养基：称取2g酵母提取物，4g Peptone溶于140ml双蒸水中，高压灭菌，冷却至室温。然后依次加入20ml10×YNB、20ml1mol/L磷酸盐缓冲液、20ml10×GY、0.4ml500×B和200μl100mg/ml氨苄青霉素。4℃保存

（6）BMMY液体培养基：称取2g酵母提取物，4g Peptone溶于140ml双蒸水中，高压灭菌，冷却至室温。然后依次加入20ml10×YNB、20ml1mol/L磷酸盐缓冲液、20ml10×M、0.4ml500×B和200μl100mg/ml氨苄青霉素。4℃保存。

（7）LB液体培养基：称取Tryptone10g，Yeast extraction5g，NaCI10g，溶于950ml双蒸水中，用NaOH调pH至7.0，加双蒸水至1L。高压灭菌，冷却至50℃时加入1ml100mg/ml的氨苄青霉素至终浓度为100μg/ml。置于4℃保存。

（8）LB固体培养基：配制1L的LB液体培养基中，加入15g琼脂粉。高压灭菌，冷却至60℃后，加入600μl100mg/ml的氨苄青霉素至终浓度为60μg/ml，立即铺平板，静置20min后，用保鲜膜包裹置于置于4℃保存。

1.3实验方法

1.3.1菌种的复苏

把已经鉴定为含阳性克隆重组质粒pPIC9-MIH1的保种克隆菌JM109及空载体pPIC9的保种菌株DH5α按照1：100转入新的含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养液中37℃恒温，22orpm摇床过夜。

1.3.2质粒的提取

把过夜培养的菌液1000g离心5min收集细胞，用mini BEST PlasmidPurification kit（Takara）试剂盒抽提重组质粒pPIC9-MIH1和pPIC9，-20℃保存备用。取2μl质粒用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3重组质粒pPIC9-MIH1和pPIC9的线性化

用限制性内切酶BglⅡ分别对质粒pPIC9-MIH1和pPIC9进行单酶切反应，使其线性化。酶切反应体系为：10×Buffer D10μl，BglⅡ1μl，质粒40μl，补双蒸水至100μl，37℃水浴反应2小时。酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，同时用未酶切的质粒pPIC9-MIH1和pPIC9做对照。将已经线性化的pPIC9-MIH1和pPIC9用1%的琼脂糖凝胶电泳后，分别用凝胶回收试剂盒回收纯化。

1.3.4酵母感受态细胞的制备

（1）接种酵母菌种：将菌种GS115划线接种YPD平板，30℃培养3天。

（2）挑取单个菌落接种于10mlYPD液体培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养过夜。

（3）取100μl的菌液接种于100mlYPD液体培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养至OD₆₀₀为1.5时，大约需要20小时。

（4）将菌液平均倒入2支50ml离心管，4℃，5000rpm离心8min，弃上清。

（5）在沉淀中加入20ml0℃、灭菌的去离子水，混悬细胞，然后加水至40ml，4℃，5000rpm离心8min，弃上清。重复水洗一次，弃上清。

（6）在洗好的沉淀中加入4ml预冷的1mol/L山梨醇溶液，振荡混匀。然后将两管中的细胞合并到一管，4℃，5000rpm离心8min，弃上清。

（7）在细胞沉淀中加入200μl预冷的1mol/L山梨醇溶液，振荡混匀。即制成了酵母感受态细胞。将其放在冰上当天使用。

1.3.5MIH1基因的电转化

1.3.5.1电转仪参数的设置

因电转时电压的设置对电转化的效率影响很大，所以需要摸索电转化的条件。参考部分文献，本实验采用以下3组电转参数：

电压：1500V、2000V、2500V；电容：25μF；电阻：200Ω、400Ω。

1.3.5.1电转操作

电穿孔操作方法如下：把pPIC9-MIH1用BglⅡ作线性化处理后，取线性DNA15μl与80μl感受态细胞混合，注入预冷的0.2cm电击杯（Bio Rad）中，轻敲电击杯，使混合物落入电击杯底部。在电击仪（Bio Rad）上设定电压为1.5kV，电容为25μF，电阻为400Ω，进行电穿孔操作。具体操作方法如下：

（1）将预先制备好的线性化的pPIC9-MIH1和pPIC9各15μl分别加入到两管80μl酵母感受态细胞中，混匀后移入预冷至0℃的0.2cm的电转化杯中。

（2）将电转化杯放置冰上5分钟，电击细胞、质粒混合液（电击参数为：电压1500V、电阻400Ω，电容为25μF）。电击时间有5.04毫秒，5.06毫秒，5.08毫秒几种。

（3）电击后立即向电转化杯中加入800μl预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀。

（4）分别取400μl酵母菌液涂布于MD平板，当涂布的电转液被完全吸收后，将平板倒置放于30℃培养箱中培养3-6天。直至平板上出现菌落。约1周后计数并计算转化效率。

1.3.6酵母转化菌的鉴定

酵母基因组DNA的提取方法有如下两种，相对来说用Yeast DNA Mini Kit（Watson）抽提酵母基因组DNA效果更好。

1.3.6.1酵母基因组DNA提取-用试剂盒提取

从pPIC9-MIH1转化的MD平板上挑取10个菌落，同时挑取1个pPIC9转化菌作为对照。挑取新鲜菌落于10mlYPD液体培养液中扩大培养，用Yeast DNA MiniKit（Watson）抽提酵母基因组DNA。

1.3.6.2酵母基因组DNA提取-用酵母消解酶（lyticase）提取

（1）从pPIC9-MIH1转化的MD平板上挑取10个菌落，同时挑取1个pPIC9转化菌作为对照。挑取新鲜菌落于10mlYPD液体培养液中扩大培养。

（2）称取1mg酵母消解酶加入1ml酵母消解酶工作液，用前加入1μlβ-巯基乙醇。

（3）从扩大培养的YPD液体培养液中各取1ml酵母菌液共10管放入1.5ml的Eppendorf管中，12000rpm，4℃离心5min，吸出YPD培养液，在每管酵母细胞沉淀中加入已经配好的酵母消解酶工作液60μl，用枪头吹打至重悬，置摇床37℃，250rpm振荡培养1.5hr。

（4）取出菌液加入20%SDS每管10μl，用枪头混匀，或高速振荡器振荡1min，再放-70℃冰冻15min以上，37℃水浴融化，看是否清亮，可重复冰冻一次。

（5）每管样加入TE buffer（PH8.0）200μl，加入20μl RNase（25mg/ml），37℃保温2hr，再加蛋白酶K（20mg/ml），37℃保温2hr。

（6）再加200μl苯酚-氯仿-异戊醇，高速振荡器振荡1min混匀，12000rpm，4℃离心5-10min。取出上清到新的1.5ml的Eppendorf管中，再加200μl苯酚-氯仿-异戊醇抽提，12000rpm，4℃离心5-10min。取出上清到新的1.5ml的Eppendorf管中，再加氯仿-异戊醇去酚。12000rpm，4℃离心5-10min。

（7）上清取出到新的1.5ml的Eppendorf管中，加入8μl10M的醋酸铵及2倍体积的无水乙醇（500μl）-70℃冻存1hr，12000rpm，4℃离心5-10min，得到沉淀。沉淀用70%的无水乙醇洗涤，12000rpm，4℃离心5min。沉淀吹干（先枪头吸干净，后放室温晾干20min。用30μl灭菌双蒸水或TE溶解即得到了酵母基因组DNA。1.3.6.3PCR鉴定

以酵母基因组DNA为模板，用Pichia Expression Kit（Invitrogen）提供的引物5，AOX1primer（5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，）和3，AOX1primer（5，-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3，）及MIH1基因特异性引物进行PCR扩增，根据PCR产物琼脂糖电泳结果筛选MIH1基因已插入酵母基因组DNA的克隆。

PCR反应体系为：

PCR循环条件及检测：

（1）以AOX1primer引物进行PCR扩增：

94℃预变性5min；按以下循环参数进行30个循环：95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃保温5min。

取3μlPCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统紫外扫描、拍照。

（2）以MIH1基因特异性引物进行PCR扩增：

94℃预变性4min；按以下循环参数进行30个循环：95℃变性40sec，62℃退火40sec，72℃延伸40sec；最后72℃保温10min。

阳性克隆酵母菌的基因组DNA送上海生物工程公司测序。

1.3.7MIH1表达阳性克隆的筛选

经过对毕赤酵母电穿孔转化、菌落PCR方法筛选及外源基因多拷贝克隆的筛选，我们共获得8个克隆。随机挑选其中的重组克隆（His⁺Mut^s）作诱导表达，具体操作按Pichia Expression Kit（Invitrogen，USA）进行。Tricine-SDS-PAGE见文献（Schagger，1987）。

1.3.7.1重组酵母菌株的表达阳性克隆的筛选

在BMGY/BMMY培养基诱导重组酵母菌株：

（1）将GS115/pPIC9-MIH1及GS115/pPIC9的PCR阳性克隆接种至50mlBMGY培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养36hr后，至OD₆₀₀为3.0。

（2）将培养物倒入50ml离心管，5000rpm离心5min，弃上清。在沉淀中加入10mlBMMY培养基，振荡混匀。

（3）用含0.5%甲醇的BMMY培养基诱导重组蛋白的表达。每间隔24hr，添加甲醇至终浓度为0.5%，共诱导3天。

（4）培养物经离心去除沉淀后，上清液用硫酸铵沉淀。

（5）去上清液后，沉淀与SDS样品缓冲液（100mM PH值为6.8的Tris-HCl；200Mm DTT；4%SDS；0.2%溴酚兰；20%甘油）混合。

（6）可将此混合液储存4℃以备聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白印迹分析。菌体于-20℃保存备用。

1.3.7.2SDS-PAGE凝胶的配制

因MIH1重组蛋白分子量比较小，因此一般的SDS-PAGE电泳不够理想，故后来采用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳方法（王旭等，2003）来检测分析。结果比较好，条带很清楚。

A.SDS-PAGE凝胶配方

分离胶灌注好后加重蒸水，30min后吸去重蒸水再加浓缩胶，30min胶凝好，洗加样孔。上样量为15μl，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V。溴酚蓝跑尽后染色和脱色。

B.Tricine-SDS-PAGE凝胶配方

Tricine-SDS-PAGE的凝胶由不同分子组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成。其中浓缩胶由3C丙烯酰胺储存液配成4％的丙烯酰胺溶液聚合而成，夹层胶由3C丙烯酰胺储存液配成10％的丙烯酰胺溶液聚合而成，致密胶由5C丙烯酰胺储存液或6C丙烯酰胺储存液配成16.5％的丙烯酰胺溶液（添加或不添加36.5％尿素）聚合而成。

凝胶制作采用三层不连续胶的结构，由致密胶+夹层胶+浓缩胶构成。灌胶前，各种丙烯酰胺溶液分别加入15μl的过硫酸氨和3μl的TEMED，灌胶时先灌下层的致密胶，再覆盖以中间的夹层胶，然后铺浓缩胶。静置以聚合形成三明治式的不连续梯度凝胶。凝胶配方如下：

C.染色

染色液R250配方:

染色2-3小时。

D.脱色

E.多肽固定液

1.3.7.3Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳

取10μl的蛋白质标准品及待检测的样，煮沸5min使蛋白质与SDS结合变性，小心点入凝胶的点样孔中。Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳时，内槽加入负极电泳缓冲液，外槽加入正极电泳缓冲液，形成Trcine-SDS-PAGE电泳系统，用20mA恒流电泳3h。在冰浴中进行。初始电压50V，待溴酚蓝进入分离胶后，电压改为80-100V，溴酚蓝到达电泳槽下沿时结束电泳。先把胶放在多肽固定液中固定30min，再考马斯亮兰染色1hr。然后在脱色摇床上振荡脱色。并用凝胶成像仪摄像。

1.3.8最佳诱导时间的确定

取BMGY/BMMY培养基诱导的一株重组酵母菌不同时段所取的诱导菌液1.5ml，4℃,12000rpm离心10min。上清液用0.75g硫酸铵沉淀，去上清液后，将沉淀与30μl SDS样品缓冲液混合，100℃煮沸5min。各取20μl上样。Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色显带后，用凝胶成像系统分析，以确定最佳诱导时间。

1.3.9筛选菌株的SDS-PAGE检测

将筛选出来的8株GS115-pPIC9-MIH1His⁺Mut^s（slow methanol utilization）)基因型的重组菌分别用BMGY/BMMY培养基加甲醇诱导表达3天，将重组分泌的MIH1蛋白诱导菌液各取1.5ml，4℃,12000rpm离心10min。上清液用0.75g硫酸铵沉淀，去上清液后与SDS样品缓冲液混合，100℃煮沸5min。各取20μl上样。Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色显带后，用凝胶成像系统分析。

1.3.10重组MIH1的大规模诱导表达

（1）接种GS115/pPIC9-MIH1表达阳性克隆菌于10ml BMGY培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养36hr后，至OD₆₀₀>3.0。

（2）按1%接种于1000ml BMGY培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养36hr后，无菌条件下5000rpm离心10min，弃上清。

（3）在菌体沉淀中加入200ml BMMY培养基，振荡混匀。继续30℃，250rpm摇床振荡培养培养。

（4）每隔24hr，取诱导菌液1.5ml，4℃，12000rpm离心10min保存上清液于-20℃待用。然后添加甲醇至终浓度为0.5%，共诱导4天。

（5）诱导结束时，分别取各菌株的诱导菌液1.5ml，4℃，12000rpm离心10min保存上清液于-20℃以备聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）分析和蛋白印迹分析。将菌液4℃，8500rpm，离心10min，收集上清液。

2实验结果

2.1重组质粒pPIC9-MIH1的线性化的鉴定：MIH1基因的编码区通过PCR的方法在侧翼加上几个特殊核苷酸位点如XhoI和NotI识别位点、6-His编码区段和翻译终止子后，被亚克隆进真核表达质粒pPIC9中。用BglⅡ分别对质粒pPIC9-MIH1和pPIC9进行单酶切反应2小时，使其线性化。为了检测酶切反应是否完全，分别取2μl酶切反应液与未经BglⅡ消化的质粒pPIC9-MIH1和pPIC9同时进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

由电泳结果可知，质粒pPIC9-MIH1和pPIC9经BglⅡ消化后，各形成两条带，其中较大的一条为目的条带。因为从pPIC9的整体框架图来看，BglⅡ在其上有两个酶切位点，把pPIC9切成两个大小不同的片段，一个约为2087bp，另一个为5936bp，而MIH1基因是插入较大的那个片段。如果加上MIH1基因及引物的长度，目的条带应该在6200bp附近，这与电泳结果一致，说明酶切线性化成功。将线性化的质粒pPIC9-MIH1和pPIC9进行切胶纯化。

2.2电转化：在1500V、400Ω、25μF条件下电转化的效率最高，酵母克隆数最多。

2.3酵母基因组DNA提取：用Yeast DNA Mini Kit（Watson）试剂盒抽提酵母基因组DNA，如图4所示。表明酵母基因组DNA提取成功，条带很清楚。

2.4MIH1表达阳性克隆的鉴定：重组质粒pPIC9-MIH1的转化和筛选方法均按本文所建立的方法进行。其中的菌落PCR筛选方法所用的引物除了MIH1基因特异性引物以外，还合成了AOX1引物5,AOX1primer和3,AOX1primer。用MIH1引物作PCR分析与上述用AOX1作引物进行PCR分析时的反应条件略有不同，用AOX1引物扩增时改为95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸反应1min，其他条件一样。因为没有外源基因的整合，GS115的AOX1基因保持完整，以GS115菌落作为底物进行扩增应该产生大小为2.2kb的片段，该片段大小对应于原5,AOX1基因和3,AOX1之间的长度；但在重组克隆GS115-pPIC9-MIH的染色体上，5,AOX1primer和3,AOX1primer识别位点之间的AOX1基因序列已被重组质粒pPIC9-MIH1中相应的序列所置换，若无MIH1基因插入，则GS115-pPIC9空载体质粒的5,AOX1primer和3,AOX1primer这对引物识别位点之间的AOX1基因的大小为492bp，此结果根据图2-1的5,AOX1和3,AOX1引物位点的大小测算出。GS115-pPIC9-MIH的PCR产物为0.77kb。用MIH1引物作PCR时，GS115-pPIC9-MIH的PCR产物为0.278kb。图3.2与图3.3结果与此结果相符。以酵母基因组DNA为模板，分别用Pichia ExpressionKit（Invitrogen）提供的引物5，AOX1primer和3，AOX1primer及MIH1基因特异性引物进行PCR扩增，根据PCR产物琼脂糖电泳的结果筛选MIH1基因已插入酵母基因组DNA的克隆。

2.4.1用Pichia Expression Kit(Invitrogen)提供的引物5，AOX1primer和3，AOX1primer进行PCR扩增反应结果：

（1）以随机挑选的16个Pichia克隆的基因组为模板，用引物5，AOX1primer和3，AOX1primer进行扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测（图5-1），显示有4个GS115-pPIC9-MIH1阳性克隆（lane9，10，12，16）和2个GS115-pPIC9的阳性克隆（lane3，4）。

（2）另外随机挑选的24个Pichia克隆的基因组用引物5，AOX1primer和3，AOX1primer进行扩增后的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测（图5-2），结果显示有8个GS115-pPIC9-MIH1His⁺Mut^s（slow methanol utilization）基因型的重组子（lane5，6，10，13，14，17，19，24）和12个GS115-pPIC9-MIH1的假阳性His⁺克隆（lane7，8，9，11，12，15，16，18，20-23）。GS115-pPIC9的3个克隆也是假阳性His⁺克隆。

2.4.2用MIH1基因特异性引物进行PCR扩增反应的结果

将上面用引物5，AOX1primer和3，AOX1primer进行扩增后获得阳性克隆鉴定的7个GS115-pPIC9-MIH1His⁺Mut^s（slow methanol utilization）基因型的重组子（lane5，6，10，13，14，17，19）再分别用MIH1基因特异性引物进行扩增。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图6。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，这7个GS115-pPIC9-MIH1His⁺Mut^s基因型的重组子在每个克隆对应的泳道中都有大小约250bp的条带（lane7，8，12，16，17，19，21），片段大小与MIH1基因的长度相一致，说明这7个克隆中的GS115-pPIC9-MIH1His⁺Mut^s（slow methanol utilization）基因型的重组子都含有目的基因片段。

将这些阳性克隆重组子送上海生物工程公司进行插入片段的序列测定，测序的结果与GenBank中的Ers-MIH1成熟肽部分的核苷酸序列完全一致，表明获得了拥有正确读码框架的GS115-pPIC9-MIH1重组表达阳性克隆。

2.5MIH1表达阳性克隆的诱导表达筛选

2.5.1BMGY/BMMY诱导表达与最佳诱导时间的确定

从已经筛选出来的8株重组菌中选取1株用BMGY/BMMY培养基进行培养,用甲醇进行诱导表达。以空载体GS115/pPIC9转化的细胞培养上清作对照。

从开始诱导起，每隔24小时取诱导菌液1.5ml，12000rpm，4℃离心5-10min，弃菌体保存上清液。分别取各个时间段的上清液用0.75g硫酸铵沉淀，去上清液后，将沉淀与30μl SDS样品缓冲液混合，100℃煮沸5min。取20μl样品利用Tricine-SDS-PAGE凝胶进行电泳检测，用考马斯亮蓝染色显带后，用凝胶成像系统进行分析，确定最佳诱导时间。

电泳结果如图7所示。结果表明，重组菌株从诱导第24小时起开始有重组蛋白的表达，随着诱导时间的延长，表达量逐渐增加，至诱导第72-96小时表达量最高。然后再延长诱导时间，重组蛋白的表达量开始下降。因此可以确定72-96小时为最佳诱导时间。

从图中可以看出，空载体质粒GS115/pPIC9加入甲醇诱导后，在8.5kD处没有出现新的重组蛋白的表达。而在转入MIH1基因的重组菌总蛋白提取物中加入甲醇诱导后，在相对分子量约8.3kD处出现了一条新的蛋白带，其大小与推测的MIH1重组蛋白的分子量相一致。

分泌于酵母细胞外的MIH1重组蛋白的分子量比MIH1蛋白的理论值7.8kD分子量稍大，估计是糖基化的原因。糖基化有利于维持和稳定蛋白的天然构象和生物学活性。

2.5.2高分泌表达菌株的筛选

在MD平板上随机挑取10个HIS⁺GS115-pPIC9-MIH1菌落，以5，AOX1primer、3，AOX1primer及MIH1特异性引物进行PCR，鉴定分析后确定其中8个为阳性HIS⁺Mut^s（slow methanol utilization）克隆（图5），这些阳性克隆可进一步用BMGY/BMMY培养基、甲醇进行诱导表达筛选。

取同一时间的不同重组菌株所分泌的上清液200μl，按上述硫酸铵沉淀方法处理样品后，溶于20μl SDS样品缓冲液中，全部上样进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色显带后，用凝胶成像系统分析，结果见图8。

从图8可以看出，这几个酵母重组阳性克隆菌株均在相对分子量约8.4kD处出现一条新的蛋白条带，其大小与推测的MIH1重组蛋白分子量相近，这与经过MALDI-TOF质谱分析仪分子量检测结果8.345kD相一致。同时可以看到空载体GS115和空载体质粒GS115-pPIC9在加入甲醇后均无重组MIH1蛋白的表达。

将PCR产物送上海生物工程公司测序，结果证明其DNA序列中含有的MIH1基因完全正确。因此，所获得的8个阳性HIS⁺Mut^s（slow methanol utilization）克隆可以作为进行大规模诱导表达的菌种。

Claims

1.中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法，其步骤包括为：

步骤一：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达载体的构建：

(1)引物的设计，根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的成熟肽编码区cDNA序列和质粒pPIC9的多克隆位点设计一对PCR引物，

PIC-MIH-L：5′-GCA CGA CTC GAG AAA AGA^↓GGA ATC ATC AAC GCC-3

PIC-MIH-R：5′-TGT AAT GCG GCC GC TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG

TTG CCC GAG GAT GCT-3

其中上游引物包含1个Xho I、1个KEX2蛋白酶识别位点和MIH1基因的前15个核苷酸序列，箭头位置为酵母α因子信号肽的切割位点，下游引物包含MIH1基因编码区的最后15个核苷酸序列、1个6-His编码区段、1个Not I识别位点及一个翻译终止密码子；

(2)PCR反应；

(3)TA克隆；

(4)质粒提取；

(5)酶切连接转化；

(6)阳性克隆的鉴定，用PIC-MIH-L和PIC-MIH-R进行菌落PCR筛选阳性克隆；所述阳性克隆的鉴定中用PIC-MIH-L和PIC-MIH-R进行菌落PCR筛选阳性克隆，随机挑取单克隆于500μl的含100μg/ml的Amp+的LB培养液中，37℃250rpm振荡6-8hr，以挑取的单克隆菌液为模板做菌落PCR，筛选出阳性克隆，取0.5μl细菌培养液作PCR反应的模板，以插入片段两侧载体上的序列作引物，PCR扩增；

(7)重组质粒的鉴定，将步骤(6)所得的PCR产物电泳出现阳性条带的克隆按照1：100的比例稀释扩增，抽提质粒，按照引物设计的酶切位点做Xho I和Not I双酶切鉴定；挑选双酶切能出现阳性条带的克隆，并送测序验证，阳性菌落置于-20℃保种备用；

步骤二：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达：

(1)贮存液的配制；

(2)培养基的配制；

(3)菌种的复苏，把已经鉴定为含阳性克隆重组质粒pPIC9-MIH1的保种克隆菌JM109及空载体pPIC9的保种菌株DH5α按照1：100转入新的含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养液中37℃恒温，220rpm摇床过夜；

(4)质粒的提取，把过夜培养的菌液1000g离心5min收集细胞，用mini BEST Plasmid Purification kit试剂盒抽提重组质粒pPIC9-MIH1和pPIC9，-20℃保存备用，取2μl质粒用1％琼脂糖凝胶电泳检测；

(5)重组质粒pPIC9-MIH1和pPIC9的线性化，用限制性内切酶BglⅡ分别对质粒pPIC9-MIH1和pPIC9进行单酶切反应，使其线性化，酶切反应体系为：10×Buffer D10μl，BglⅡ1μl，质粒40μl，补双蒸水至100μl，37℃水浴反应2小时，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，同时用未酶切的质粒pPIC9-MIH1和pPIC9做对照，将已经线性化的pPIC9-MIH1和pPIC9用1％的琼脂糖凝胶电泳后，分别用凝胶回收试剂盒回收纯化；

(6)酵母感受态细胞的制备其制备步骤为：

(6-1)接种酵母菌种：将菌种GS115划线接种YPD平板，30℃培养3天；

(6-2)挑取单个菌落接种于10mlYPD液体培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养过夜；

(6-3)取100μl的菌液接种于100mlYPD液体培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养至OD600为1.5时，大约需要20小时；

(6-4)将菌液平均倒入2支50ml离心管，4℃，5000rpm离心8min，弃上清；

(6-5)在沉淀中加入20ml0℃、灭菌的去离子水，混悬细胞，然后加水至40ml，4℃，5000rpm离心8min，弃上清，重复水洗一次，弃上清；

(6-6)在洗好的沉淀中加入4ml预冷的1mol/L山梨醇溶液，振荡混匀，然后将两管中的细胞合并到一管，4℃，5000rpm离心8min，弃上清；

(6-7)在细胞沉淀中加入200μl预冷的1mol/L山梨醇溶液，振荡混匀，即制成了酵母感受态细胞，将其放在冰上当天使用；

(7)MIH1基因的电转化，电穿孔操作方法如下：把pPIC9-MIH1用BglⅡ作线性化处理后，取线性DNA15μl与80μl感受态细胞混合，注入预冷的0.2cm电击杯中，轻敲电击杯，使混合物落入电击杯底部，在电击仪上设定电压为1.5kV，电容为25μF，电阻为400Ω，进行电穿孔操作，具体操作方法如下：

(7-1)将预先制备好的线性化的pPIC9-MIH1和pPIC9各15μl分别加入到两管80μl酵母感受态细胞中，混匀后移入预冷至0℃的0.2cm的电转化杯中；

(7-2)将电转化杯放置冰上5分钟，电击细胞、质粒混合液，电击参数为：电压1500V、电阻400Ω，电容为25μF；电击时间有5.04毫秒，5.06毫秒，5.08毫秒三种；

(7-3)电击后立即向电转化杯中加入800μl预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀；

(7-4)分别取400μl酵母菌液涂布于MD平板，当涂布的电转液被完全吸收后，将平板倒置放于30℃培养箱中培养3-6天，直至平板上出现菌落，1周后计数并计算转化效率；

(8)酵母转化菌的鉴定；

(9)MIH1表达阳性克隆的筛选；

(10)最佳诱导时间的确定，取BMGY/BMMY培养基诱导的一株重组酵母菌不同时段所取的诱导菌液1.5ml，4℃,12000rpm离心10min，上清液用0.75g硫酸铵沉淀，去上清液后，将沉淀与30μlSDS样品缓冲液混合，100℃煮沸5min，各取20μl上样，Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色显带后，用凝胶成像系统分析，以确定最佳诱导时间；

(11)筛选菌株的SDS-PAGE检测；

(12)重组MIH1的大规模诱导表达，步骤包括接种GS115/pPIC9-MIH1表达阳性克隆菌于10ml BMGY培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养36hr后，至OD600>3.0；按1％接种于1000ml BMGY培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养36hr后，无菌条件下5000rpm离心10min，弃上清；在菌体沉淀中加入200ml BMMY培养基，振荡混匀，继续30℃，250rpm摇床振荡培养培养；每隔24hr，取诱导菌液1.5ml，4℃,12000rpm离心10min保存上清液于-20℃待用，然后添加甲醇至终浓度为0.5％，共诱导4天；诱导结束时，分别取各菌株的诱导菌液1.5ml，4℃，12000rpm离心10min保存上清液于-20℃以备聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和蛋白印迹分析，将菌液4℃，8500rpm，离心10min，收集上清液。