CN104013954B - Isg20蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ISG20蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在制备抗流感病毒的药物中的应用。实验证明,本发明所提供的蛋白质具有核酸内切酶活性,能够抑制流感病毒的聚合酶活性,从mRNA转录水平和蛋白水平上抑制流感病毒的复制,达到清除病毒、治疗疾病的目的,非常适用于甲型H1N1流感病毒的预防,易于大范围推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种ISG20蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应用。
背景技术
流感病毒是一种能引起人类和其他动物患流行性感冒的负链RNA病毒,属于正粘病毒科流行性感冒病毒属。根据病毒的核衣壳蛋白(NP)和基质蛋白(M1)的抗原性的不同可以将流感病毒分为3类:A型、B型和C型流感病毒,又分别称为甲、乙、丙型。流感病毒的基因组有8个RNA片段,一共能够编码14个病毒蛋白。根据其血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)的不同,又可以将其分为不同的亚型。流感病毒能够通过空气传播,引起宿主的呼吸道感染,严重的甚至能危及生命,甲型H1N1流感病毒属于A型流感病毒,包含有禽流感、人流感和猪流感三种流感病毒的核糖核酸基因片段,容易发生变异,对人类致病性高,2009年3月在墨西哥暴发后迅速蔓延全球,近年来在我国呈现季节性流行趋势。
流感病毒感染宿主会引起宿主机体内大量干扰素诱导基因(interferonstimulatedgenes,ISGs)的转录的表达,ISGs是干扰素发挥生物学功能的真正效应分子,对干扰素打通机体免疫信号通路等方面发挥着重要作用,因此深度分析这些基因的表达水平及功能,对抗流感病毒药物的研发具有指导意义。近年来,高通量RNA深度测序即转录组测试技术(简称“RNA-seq”)是系统性地分析宿主转录组学最有利的方法,它能够把宿主或某个特定细胞转录水平的mRNA、smallRNA、NONcodingRNA通过高通量测序技术测出相应序列,从而反应各种基因表达水平的变化,RNA-seq不仅能从整体水平分析转录本各基因的功能和水平,而且能发现未知转录本和稀有转录本,因此对深入分析病毒感染后宿主体内基因的变化具有重要作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种ISG20蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应用。
本发明所提供的应用,具体为如下A或B:
A:蛋白质(命名为ISG20)在制备抗流感病毒的药物中的应用。
B:蛋白质的编码基因(命名为ISG20)在制备抗流感病毒的药物中的应用;
所述蛋白质为如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗流感病毒活性的由序列1衍生的蛋白质。
为了便于ISG20蛋白的纯化,可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表:标签的序列
标签 | 残基 | 序列 |
Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
FLAG | 8 | DYKDDDDK |
Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的蛋白质可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2或序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
在本发明中,所述蛋白质可为在序列1所示氨基酸序列的末端顺次连接c-myc标签和6个His标签后得到的融合蛋白;具体为将序列2所示DNA片段插入到pPICZαA载体的多克隆位点XhoI和XbaI之间后表达所得的融合蛋白。
再有,所述蛋白质或其编码基因在如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)中的应用也属于本发明的保护范围:
(a1)制备能够抑制流感病毒复制的药物;
(a2)制备能够抑制流感病毒mRNA转录的药物;
(a3)制备能够抑制流感病毒的聚合酶活性的药物。
在上述应用中,所述蛋白质的编码基因(ISG20基因)是如下1)至4)中任一所述的DNA分子:
1)序列表中序列2所示的DNA分子;
2)序列表中序列3所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子;
4)与1)-3)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC,0.5%SDS的溶液,在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
其中,序列2和序列3均由546个核苷酸组成,序列3为所述ISG20基因的野生型序列,序列2为按照酵母密码子偏好性经过密码子优化后的所述ISG20基因,序列2和序列3均编码序列1所示的蛋白质,序列1由181个氨基酸残基组成。
在上述应用中,所述流感病毒可为H1型流感病毒。所述H1型流感病毒可为H1N1型流感病毒。
在本发明的一个实施例中,所述H1N1型流感病毒具体为H1N1型流感病毒A/WSN/33株。
所述ISG20蛋白或其编码基因的抗流感病毒功能具体体现在如下:所述ISG20蛋白能够抑制流感病毒的聚合酶活性,从mRNA转录水平上以及蛋白水平上抑制流感病毒的复制。
本发明的另一个目的是提供一种DNA分子。
本发明所提供的DNA分子,具体为序列表中序列2所示的DNA分子(经过密码子优化的ISG2基因)。
含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体,也可为重组克隆载体。
在本发明的实施例中,所述重组表达载体中启动所述DNA分子转录的启动子具体为5'AOX1启动子。
更为具体的,所述重组载体为将所述DNA分子插入到pPICZαA载体的多克隆位点(如XhoI和XbaI)后得到的重组质粒。
所述表达盒由能够启动所述DNA分子表达的启动子,所述DNA分子,以及转录终止序列组成。
在本发明中,所述重组菌具体为将所述DNA分子导入毕赤酵母菌-X33后得到的重组菌。
其中,将所述DNA分子导入毕赤酵母菌-X33是通过所述重组载体导入的。
另外,扩增所述DNA分子的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明将ISG20蛋白的编码基因按照酵母密码子偏爱性进行了密码子优化,将其导入毕赤酵母菌-X33,表达得到大量的ISG20蛋白。经研究首次发现ISG20蛋白具有核酸内切酶活性,能够抑制流感病毒的聚合酶活性,从mRNA转录水平和蛋白水平上抑制流感病毒的复制,达到清除病毒、治疗疾病的目的,非常适用于甲型H1N1流感病毒的预防,易于大范围推广和应用。
附图说明
图1为毕赤酵母-X33转化子的PCR鉴定图。M:DNA分子量标准;1:重组毕赤酵母-X33阳性转化子;2:以水作为模板的阴性对照。
图2为毕赤酵母诱导表达ISG20蛋白的SDS-PAGE检测图。
图3为毕赤酵母诱导表达ISG20蛋白的Western-blot检测图。
图4为ISG20蛋白能够抑制流感病毒的复制(Western-blot检测流感病毒M1蛋白)。
图5为ISG20蛋白能够抑制流感病毒M1蛋白的mRNA转录(Real-timePCR检测结果)。
图6为ISG20蛋白能够抑制流感病毒的聚合酶活性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
H1N1型流感病毒A/WSN/33株:记载于“MaorongYu,XiaolingLiu,ShuaiCao,etal.IdentificationandCharacterizationofThreeNovelNuclearExportSignalsintheInfluenzaAVirusNucleoprotein.JournalofVirology,2012(86):4970-4980.”一文。公众可从中国科学院微生物研究所获得。
毕赤酵母菌-X33:购自美国Invitrogen公司,货号为C180-00。
293T细胞:购自上海博谷生物科技有限公司,货号为BG002。
pPICZαA载体:购自美国Invitrogen公司,货号:V195-20。
大肠杆菌DH5α:购自北京康为世纪生物科技有限公司,货号为CW0808。
pHH21-cNS-Luc和pcDNA-β-gal质粒:记载于“MaorongYu,XiaolingLiu,ShuaiCao,etal.IdentificationandCharacterizationofThreeNovelNuclearExportSignalsintheInfluenzaAVirusNucleoprotein.JournalofVirology,2012(86):4970-4980.”一文中。公众可从中国科学院微生物研究所获得。
实施例1、ISG20基因的密码子优化
本实施例根据酵母密码子的偏爱性在保证蛋白质氨基酸序列不变的前提下,将ISG20基因的野生型序列(序列3)进行了密码子优化,得到了序列表中序列2所示的优化后ISG20基因序列,序列2和序列3均编码序列表中序列1所示的蛋白质。
实施例2、ISG20蛋白的表达及其表达产物的纯化
一、重组质粒和重组酵母的构建
1、目的基因的扩增
以优化后的ISG20基因(序列2)为模板,用F1和F2组成的引物对进行PCR扩增。
F1:5’-CTGCTCGAGAAAAGA-ATGGCCGGCAGCAGGGA-3’(下划线部分为XhoI的识别序列,-后的序列为序列2的第1-17位);
F2:5’-CGCTCTAGAAA-GTCGGACACTGCCAGCCTGG-3’(下划线部分为XbaI的识别序列,其后的序列为524-543位的反向互补序列)。
PCR条件:94℃5min;94℃30s,56℃30s,72℃50s,30个循环;72℃10min。
反应结束后,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
2、重组表达载体pPICZαA-ISG20的构建
(1)切胶回收步骤1的PCR扩增产物,用限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切后,回收酶切产物。
(2)用限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切pPICZαA载体,回收载体骨架(约3.6kb)。
(3)用T4DNA连接酶将步骤(1)的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接,得到连接产物。
(4)将步骤(3)的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑单克隆进行PCR鉴定(采用F1和F2组成的引物对,目标片段为550bp左右),阳性克隆提质粒进行测序鉴定,测序结果表明,得到了重组质粒pPICZαA-ISG20。重组表达载体pPICZαA-ISG20的结构描述:在载体pPICZαA的XhoI和XbaI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA片段。
在重组表达载体pPICZαA-ISG20中,启动所述ISG20基因转录的启动子为5'AOX1启动子。在重组表达载体pPICZαA-ISG20中,在所述ISG20基因(不含终止密码子)的下游紧密顺次连接有pPICZαA载体上自带的c-myc和6个His标签基因,形成了可表达“ISG20-c-myc-6×His”融合蛋白的融合基因。
3、重组酵母的构建
(1)用限制性内切酶Bg1Ⅱ单酶切步骤2获得的重组表达载体pPICZαA-ISG20,得到线性化的质粒。
(2)将步骤(1)得到的线性化质粒电转化毕赤酵母菌-X33感受态细胞(电转化的参数为1.5kv、25μF、200Ω),得到电转化产物。
(3)取200μL步骤(2)得到的电转化产物,均匀涂布于YPDS选择平板上,30℃孵育3-5天,观察转化子的生长。其中,YPDS选择平板的溶剂为水,溶质及其浓度如下:酵母提取物1%(质量百分含量),蛋白胨2%(质量百分含量),D-山梨醇1mol/L,琼脂粉1.5%(质量百分含量),葡萄糖2%(质量百分含量),ZeocinTM(博莱霉素)100μg/mL。
(4)挑取YPDS选择平板上的单克隆,接种在高抗性YPDS平板(ZeocinTM浓度为1000μg/mL,其它同YPDS选择平板)上,30℃孵育2-3天。
(5)挑取高抗性YPDS平板的单克隆,扩大培养后提取基因组DNA进行PCR鉴定(采用F1和F2组成的引物对,目标片段为550bp左右)。
PCR鉴定结果(图1)表明,序列表中序列2所示的ISG20基因已整合进入毕赤酵母菌-X33的基因组(图1中泳道2),得到了重组毕赤酵母-X33。
二、重组酵母的诱导表达
1、将上述步骤一得到的重组毕赤酵母菌液接种于BMGY培养基(配方:溶剂为水,含有质量百分含量为1%的酵母提取物,质量百分含量为2%的酵母培养用胰化蛋白胨,100mM磷酸钾,质量百分含量为1.34%的YNB(购于上海浩然生物技术有限公司,货号:291920),质量百分含量为0.00004%的生物素,体积百分含量为1%的甘油)中,于28~30℃、280~300rpm培养至OD600=4.0左右。
2、将步骤1培养后得到的菌液室温下2000~3000rpm离心5~10min,收集菌体,用适量体积的BMMY培养基(配方:溶剂为水,含有质量百分含量为1%的酵母提取物,质量百分含量为2%的酵母培养用胰化蛋白胨,100mM磷酸钾,质量百分含量为1.34%的YNB,质量百分含量为0.00004%的生物素,体积百分含量为0.5%甲醇)重悬菌体,使OD600=1.0左右。
3、在步骤2得到的菌液中加甲醇至终浓度为0.5~1.0%(体积百分含量),于28~30℃、280rpm培养,每24h定点取样并补充甲醇至终浓度为0.5~1.0%(体积百分含量)。步骤3中第一次加入甲醇前的菌液为0d的样品,加入甲醇后培养24小时的菌液为1d的样品,依次类推。
4、分别把0d、1d、2d、3d的样品离心后取上清;分别取10ml0d、1d、2d、3d的样本离心后取上清进行SDS-PAGE和Western-blot检测。其中,Western-blot采用的一抗为鼠源c-myc抗体(购买于美国SantaCruzBiotech公司,货号:sc-764);二抗为羊抗鼠HRP抗体(购买于上海申科生物科技有限公司,货号:MY0075)。
SDS-PAGE结果如图2,Western-blot验证结果如图3。结果表明,诱导后得到了约20kD的目的蛋白ISG20,且随诱导时间的增加,ISG20蛋白的表达量增加。
5、根据步骤4所得结果,将500ml步骤3中第一次加入甲醇后培养72h的重组毕赤酵母菌液离心取上清,浓缩,用PBS缓冲液透析,再浓缩至15ml,即为ISG20蛋白液。通过BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德)检测ISG20蛋白液中的蛋白浓度,为10mg/ml。
结果表明,500ml重组毕赤酵母菌液表达目的蛋白ISG20的量为150mg,即每毫升菌液表达0.3mg目的蛋白。
实施例3、验证ISG20蛋白具有抑制流感病毒复制的生物活性
1、ISG20在蛋白水平上抑制流感病毒的复制
提取H1N1型流感病毒WSN毒株的mRNA(浓度为0.5-1.0μg/mL),与实施例2获得的纯化后ISG20蛋白(浓度为2.0-10μg/mL)按照1mL:0.1mL的比例混合,37℃孵育16h,然后将混合物转染293T细胞,以未混合ISG20蛋白的病毒mRNA作对照。转染24h后收集细胞并裂解,采用Western-blot检测流感病毒M1蛋白在细胞中的表达量,一抗采用抗流感病毒WSN的M1蛋白的抗体(鼠源M1抗体,Sino-BiologicalInc.公司产品,产品编号为:11082-MM04),二抗采用羊抗鼠HRP-IgG抗体,购买于上海申科生物科技有限公司,货号:MY0075)。以β-actin为对照,一抗为鼠源anti-β-actin抗体,购买于美国SantaCruzBiotechnology公司,货号为:sc-1616-R;二抗为羊抗鼠HRPIgG抗体购买于上海申科生物科技有限公司,货号:MY0075)。
实验重复三次。
Western-blot检测结果如图4所示,与对照(Ctrl)相比,混合有ISG20蛋白的实验组中流感病毒WSN的M1蛋白在细胞中的水平明显下降。
2、ISG20蛋白能抑制流感病毒mRNA转录
提取H1N1型流感病毒WSN毒株的mRNA(浓度为0.5-1.0μg/mL),与实施例2获得的纯化后ISG20蛋白(浓度为2.0-10μg/mL)按照1mL:0.1mL的比例混合,37℃孵育16h,然后将混合物转染293T细胞,以未混合ISG20蛋白的病毒mRNA作对照。检测在病毒的第一个复制周期(转染后8h)和第二个复制周期(转染后16h)内细胞中流感病毒M1蛋白的mRNA水平的变化情况。具体如下:
提取总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板,用特异引物M1-F和M1-R对M1蛋白编码基因的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增,以β-actin为内参,引物为β-action-F和β-action-R。
M1-F:5’-TCTGATCCTCTCGTCATTGCAGCAA-3’;
M1-R:5’-AATGACCATCGTCAACATCCACAGC-3’。
β-action-F:5’-GTGATCACCATTGGCAACGA-3’;
β-action-R:5’-CCATACCCAGGAAGGAAGGC-3’。
Real-timePCR操作参见PremixExTaqTMkit(Takara,日本)说明书。
实时荧光定量PCR反应体系如下:PremixExTaqTM(2×)12.5μl;PCR正向引物(10μM)0.5μl;PCR反向引物(10μM)0.5μl;DNA模板2μl;dH2O(灭菌蒸馏水)补足至25μl。
实时荧光定量PCR反应程序如下:95℃,30秒;95℃,5秒,60℃,30秒,荧光在60℃处收集;40个循环。β-actin作为内参。每个样品重复3次,real-timePCR在CorbettRotor-Gene6000(CorbettResearch,Australia)上完成,并用Rotor-gene6000seriessoftware(CorbettResearch,Australia)确定Ct值。
数据处理方法如下:采用公式2-ΔΔCt进行相对定量。
2-ΔΔCt法:
①应用内参基因对校准样本和待测样本进行校正
ΔCt(校准样本)=待测基因(MeanCt)-参照基因(MeanCt)
ΔCt(待测样本)=待测基因(MeanCt)-参照基因(MeanCt)
②校准样本和待测样本的ΔCt值进行归一化
ΔΔCt=ΔCt(待测样本)-ΔCt(校准样本)
③表达差异的计算(2-ΔΔCt)
实验重复三次,结果取平均值。
Real-timePCR结果如图5所示,与对照(Ctrl)相比,混合有ISG20蛋白的实验组中流感病毒WSN的M1蛋白在mRNA水平上的表达量显著降低(P<0.05)。可见,在流感病毒的两个复制周期内,ISG20蛋白均能在mRNA水平抑制M1蛋白的翻译,从而抑制流感病毒的复制。
3、ISG20蛋白能抑制流感病毒的聚合酶活性
流感病毒的转录是由病毒自身的聚合酶复合体(PA,PB1和PB2)发挥作用完成的,因此本发明又验证了ISG20蛋白对流感病毒聚合酶活性的影响。
将分别表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP蛋白的四个质粒(具体参见“MaorongYu,XiaolingLiu,ShuaiCao,etal.IdentificationandCharacterizationofThreeNovelNuclearExportSignalsintheInfluenzaAVirusNucleoprotein.JournalofVirology,2012(86):4970-4980.”一文中的“TheplasmidsforexpressionofthePA,PB1,PB2,andNP(wildtype[WT])”)、pHH21-cNS-Luc和pcDNA-β-gal质粒,以及实施例2构建得到的表达ISG20蛋白的质粒pPICZαA-ISG20,按照12孔板每孔各质粒转染0.5μg的比例共转染293T细胞(实验组),同时设置以pPICZαA空质粒替代pPICZαA-ISG20的对照组(Ctrl)。转染30h后,收获细胞并裂解,取裂解液,采用β-galactosidase检测试剂盒(南京碧云天公司产品,产品目录号为C0602)和luciferase检测试剂盒(南京碧云天公司产品,其产品目录号为RG005)测定不同处理的luciferase的相对活性。同一样品内luciferase活性值除以β-gal活性值即为luciferase相对活性,以luciferase相对活性反应流感病毒的聚合酶活性。实验重复三次,结果取平均值。
实验重复三次,结果取平均值。
结果如图6所示,经检测实验组与对照组(Ctrl)相比,流感病毒聚合酶活性均显著下降,ISG20蛋白的抑制效果高达80%。
Claims (7)
1.DNA分子,为序列表中序列2所示的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。
3.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。
4.含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系。
5.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。
6.根据权利要求2所述的重组载体,其特征在于:所述重组载体中启动所述DNA分子转录的启动子为5'AOX1启动子。
7.根据权利要求5所述的重组菌,其特征在于:所述重组菌为将所述DNA分子导入毕赤酵母菌-X33后得到的重组菌。
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Identification of Five Interferon-induced Cellular Proteins That Inhibit West Nile Virus and Dengue Virus Infection;Dong Jiang et al.;《J Virol.》;20100831;第84卷(第16期);第8339页右栏第2段 * |
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