CN110627893A - 一种鸡α-干扰素的后提取工艺 - Google Patents

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CN110627893A CN201911058799.9A CN201911058799A CN110627893A CN 110627893 A CN110627893 A CN 110627893A CN 201911058799 A CN201911058799 A CN 201911058799A CN 110627893 A CN110627893 A CN 110627893A
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Abstract

本发明涉及一种鸡α‑干扰素的后提取工艺，属于禽畜药物生产技术领域。该工艺包括：S1.将含有鸡α‑干扰素的发酵液离心，保留上清液；S2.将上清液通过50KDa陶瓷膜过滤，再将滤出液通过10KDa陶瓷膜过滤，收集截留液；S3.向步骤S2的截留液中加入等体积的Cu2+‑IDA‑葡聚糖载体和NaCl溶液，进行吸附反应，得到反应液；S4.向步骤S3的反应液中加入等体积的磷酸盐缓冲液，混匀后通过50KDa陶瓷膜过滤，收集截留液；S5.向步骤S4的截留液中加入洗脱液，然后通过30KDa陶瓷膜过滤，收集滤出液；S6.将步骤S5的滤出液通过10KDa陶瓷膜过滤脱盐，收集截留液，即得鸡α‑干扰素，得率为61％以上，纯度为98％以上，活性收率为96.73％以上。

Description

一种鸡α-干扰素的后提取工艺
技术领域
本发明涉及一种鸡α-干扰素的后提取工艺，属于禽畜药物生产技术领域。
背景技术
我国是世界养鸡大国，2018年出栏超39亿只，每年因病毒感染而造成的损失无法估量，急需寻求一种高效、安全以及无毒副作用的鸡病毒性疾病防治新产品。目前利用大肠杆菌和毕赤酵母成功地表达出重组干扰素，但是至今在我国未有重组的鸡干扰素获得新兽药证书，也未有进口的重组鸡干扰素获得进口注册证书。其中很大的障碍就是生产工艺复杂，尤其是后提取工艺。
后提取工艺的目的是为了获得纯度较高的干扰素，目前常用的方法分为两步，一是初步纯化，例如盐析、等电点、有机溶剂沉淀等；二是精度纯化常用的有液相色谱法、金属亲和层析、离子交换、疏水层析和凝胶过滤层析以及反相作用色谱法，要想获得理想的结果，通常需要将几个方法组合优化，最终导致提取分离纯化工艺复杂，技术繁多，收率低，成本高。目前还没有理想的后提取工艺用于获得高纯度的重组鸡α-干扰素。
发明内容
为弥补上述领域存在的不足，本发明以毕赤酵母为生产菌株，通过对发酵液进行离心、膜分离的初步纯化以及亲和-膜过滤的精度纯化，喷雾干燥，制得鸡α-干扰素干粉。两步法纯化后的鸡α-干扰素纯度达98.6％，蛋白得率为63.41％，鸡α-干扰素干粉活性收率为96.73％。
本发明提供一种鸡α-干扰素的后提取工艺，其特征在于，包括步骤：
S1.将含有鸡α-干扰素的发酵液离心，弃菌体，保留上清液；
S2.将上清液先通过50KDa分子量陶瓷膜过滤，收集滤出液；再将所述滤出液通过10KDa分子量陶瓷膜过滤，收集截留液；
S3.向步骤S2的截留液中加入等体积的Cu2+-IDA-葡聚糖载体和NaCl溶液，进行吸附反应，得到反应液；
S4.向步骤S3的反应液中加入等体积的磷酸盐缓冲液，混匀后通过50KDa分子量陶瓷膜过滤，收集截留液；
S5.向步骤S4的截留液中加入洗脱液，对鸡α-干扰素进行洗脱，然后通过30KDa分子量陶瓷膜过滤，收集滤出液；
S6.将步骤S5的滤出液通过10KDa分子量陶瓷膜过滤脱盐，收集截留液，即得鸡α-干扰素原液。
在一些实施例中，所述步骤S2中，所述通过50KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.2MPa，上清液流速为1m3/h；所述通过10KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.25MPa，滤出液流速为1.2m3/h。
在优选实施例中，所述步骤S3中，加入等体积的4mg/mL Cu2+-IDA-葡聚糖载体，加入NaCl溶液使反应体系中NaCl的终浓度为0.9mol/L，调节pH值为8.0，30℃恒温水浴，以500rpm/min的速度搅拌反应30min，得到反应液。
在优选实施例中，所述步骤S4中，所述磷酸盐缓冲液含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/LNa2HPO4、0.3mol/L NaCl，pH 8.0；所述通过50KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.2MPa，滤出液流速为1m3/h。
在优选实施例中，所述步骤S5中，依次用洗脱液A、B、C、D、E对截留液中吸附在所述Cu2+-IDA-葡聚糖载体上的鸡α-干扰素进行洗脱，分别收集各洗脱步骤的滤出液，其中：
洗脱液A含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.02mol/L咪唑，pH 8.0；
洗脱液B含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.1mol/L咪唑，pH 8.0；
洗脱液C含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.15mol/L咪唑，pH 8.0；
洗脱液D含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.2mol/L咪唑，pH 8.0；
洗脱液E含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.3mol/L咪唑，pH 8.0。
在一些实施例中，所述步骤S5中，所述通过30KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.2MPa，滤出液流速为1m3/h。
在一些实施例中，所述步骤S6中，所述通过10KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.25MPa，滤出液流速为1.2m3/h。
在一些实施例中，鸡α-干扰素的得率至少为63％，纯度至少为98％，活性收率至少为96％。
一种生产鸡α-干扰素的方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵培养能够表达鸡α-干扰素的工程菌，获得含有鸡α-干扰素的发酵液，然后采用任一所述的后提取工艺回收纯化发酵液中的鸡α-干扰素。
在优选实施例中，所述工程菌采用保藏编号为CCTCC M 2019748的毕赤酵母菌株。
与传统的工艺相比，本发明至少具有以下优势：
(1)本发明采用亲和-膜分离技术将生物亲和作用与膜分离技术相互耦合、相互集成，兼具了亲和分离和膜分离两种技术的优势，在初步纯化设备上就可以进行精度纯化，无需购买更多的设备，节省成本。
(2)本发明采用Cu2+亲和-膜过滤载体可以与带有组氨基酸标签重组干扰素在均相体系中反应，能够快速达到吸附或洗脱平衡的时间，使获得的重组鸡α-干扰素纯度高，且收率也高。
(3)本发明的洗脱条件温和，再生后配体恢复完全，Cu2+亲和-膜过滤载体可重复使用，环保且节省成本。
因此，本发明实现了简单、高收率、低成本的鸡α-干扰素提取。
本发明优选采用保藏编号为CCTCC M 2019748的菌株，该菌株是我们自己构建的。我们在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到红原鸡α-干扰素蛋白序列，删除了红原鸡α-干扰素原有的信号肽，并且对其具有简并密码子的氨基酸进行统计分析，选择使用频率高的密码子，得到新的重组鸡α-干扰素序列。通过基因合成，获得了新的重组鸡α-干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将新基因插入到分泌型多拷贝pPICZaA表达载体上并转染到毕赤酵母中，再采用含有高浓度的博来霉素平板进行筛选，获得了重组鸡α-干扰素分泌能力显著提高的毕赤酵母菌并进行了菌种保藏。采用本发明的保藏菌株和发酵工艺生产鸡α-干扰素，产量高达20.8g/L，发酵历时仅54～60h，具有极高的应用价值。
本发明提供的生产鸡α-干扰素的工程菌，保藏信息如下：
保藏名称：毕赤酵母X33/ChIFN-α
分类命名：Pichia sp.X33/ChIFN-α
保藏日期：2019年9月25日
保藏编号：CCTCC M 2019748
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编：430072，E-mail:cctcc@whu.edu.cn。
附图说明
图1.本发明的工艺流程图。
图2.重组鸡α-干扰素SDS-PAGE分析，其中第1个泳道为蛋白marker，第2个泳道为发酵液总蛋白，第3个泳道为纯化的重组鸡α-干扰素。
图3.Cu2+-IDA-葡聚糖载体使用次数对重组鸡α-干扰素吸附及洗脱的影响。
图4.本发明构建的pPICZαA-鸡α干扰素质粒图谱；
图5.筛选含有本发明重组鸡α-干扰素基因的毕赤酵母的电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何形式限制本发明的范围。
实验试剂：
DNA纯化回收试剂盒、2×PCR Master Mix、限制性内切酶EcoR I和Not I、10×buffer、T4-DNA连接酶、D-山梨醇、酵母膏、酵母提取物、酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、YNB(不含硫酸铵及氨基酸)、磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、NaH2PO4、Na2HPO4、生物素、博来霉素、甘油、氯化钠、硫酸铵、葡萄糖均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
pPICZαA质粒：购自上海信裕生物技术有限公司，货号：XY0216；
甲醇：购自青岛锦鹏化工有限公司；
DH5α感受态细胞：购自Invitrogen公司，货号18265017；
X-33酵母感受态细胞：购自Invitrogen公司，货号C18000；
溶细胞酶：购自美国sigma公司；
质粒提取纯化试剂盒：购自Qiagen公司；
鸡α干扰素定量检测试剂盒：购自江苏科晶生物科技有限公司；
0.4mg/ml的生物素溶液：称取生物素0.04g，溶解于100mL单蒸水中，用孔径为0.22微米纤维素滤膜无菌过滤。
水溶性葡聚糖DextranT2000：购自上海一研生物科技有限公司，货号EY-(BY)-0702；
亚氨基二乙酸(IDA)：购自上海弘顺生物科技有限公司公司；
环氧氯丙烷：购自济南世纪通达化工有限公司公司；
CuSO4：购自上海乾劲化工科技有限公司公司；
咪唑：购自上海容立化学科技有限公司公司；
50KDa分子量陶瓷膜、30KDa分子量陶瓷膜、10KDa分子量陶瓷膜均购自安徽普朗膜技术有限公司；
淀粉：购自北京好丽宇工贸有限公司；
聚乙二醇2000：购自河南通商进出口有限公司；
大豆卵磷脂：购自山东唐正生物科技有限公司。
培养基：
LB培养基
每100mlLB培养基含有：1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g氯化钠，pH 7.4。
配制方法：在950ml ddH2O中溶解10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后用NaOH调节pH为7.4，用ddH2O定容至1L。若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。
YPD培养基
配方：酵母膏：蛋白胨：葡萄糖＝1:2:2(质量比)。
配制方法：溶解10g酵母膏，20g蛋白胨于900ml ddH2O中，如制平板需加入20g琼脂；121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却后加入100ml单独灭菌(115℃高压蒸汽灭菌15min)的葡萄糖溶液(含20g葡萄糖)。
BMGY培养基
每100mlBMGY培养基含有：1g酵母粉、2g胰蛋白胨、1ml甘油、0.34gYNB(不含硫酸铵及氨基酸)、1g硫酸铵、1.0941g KH2PO4、0.4473g K2HPO4·3H2O、0.1ml 0.4mg/ml的生物素溶液。
100LBMGY培养基的配制方法：在ddH2O中加入1000g酵母粉，2000g胰蛋白胨，1L甘油，340gYNB(不含硫酸铵及氨基酸)，1000g硫酸铵，KH2PO4 1094.1g，K2HPO4·3H2O 447.3g，加热搅拌溶解，定容至99900ml，然后121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至室温后流加100ml单独灭菌的生物素溶液，混匀后分装到合适的无菌容器中。
BMMY培养基
每100mlBMMY培养基含有：1g酵母粉、2g胰蛋白胨、0.5ml甲醇、0.34g YNB(不含硫酸铵及氨基酸)、1g硫酸铵、1.0941g KH2PO4、0.4473g K2HPO4·3H2O、0.1ml 0.4mg/ml的生物素溶液。
1000LBMMY培养基的配制方法：在ddH2O中加入10000g酵母粉，20000g胰蛋白胨，5L甲醇，3400gYNB(不含硫酸铵及氨基酸)，10000g硫酸铵，KH2PO4 10941g，K2HPO4·3H2O4473g，加热搅拌溶解，定容至999900ml，然后121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至室温后流加1L单独灭菌的生物素溶液，混匀后分装到合适的无菌容器中。
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册，例如分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratorymanual，2001)，或制造厂商说明书。
实施例1.本发明生产重组鸡α-干扰素的工程菌的构建
步骤1、目的基因的获得
我们在NCBI上找到红原鸡α-干扰素原始基因序列(SEQ ID NO.3)，删除了红原鸡α-干扰素原有的信号肽，并且对其具有简并密码子的氨基酸进行统计分析，选择使用频率高的密码子，得到新的重组鸡α-干扰素基因序列(SEQ ID NO.1)，委托生工生物工程(上海)有限公司进行全基因合成，获得目的基因。
设计引物，通过PCR反应使目的基因的5’端加上EcoR I酶切位点，3’端加上Not I酶切位点。PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收513bp的片段，该片段的DNA序列见SEQ ID NO.2。
上述引物的核苷酸序列如下：
正向引物F1(5’-3’)：GGAATTCCATGTGTAACCACTT；
反向引物R1(5’-3’)：ATTTGCGGCCGCTTTAAGTTCTAGTG。
上述PCR反应体系(25μl)：2×PCR Master Mix 10μl、正向引物200nM、反向引物200nM、目的基因模板1μl、剩余体积用ddH2O补足。
上述PCR反应程序：预变性95℃5min，1个循环；变性95℃10s、退火58℃10s、延伸72℃30s，40个循环；最终延伸72℃5min，1个循环。
用EcoR I和Not I双酶切处理PCR产物，37℃，酶切20min。
100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；EcoR I酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。
酶切产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收片段，得到线性化的目的基因片段。
步骤2、表达载体的构建
用EcoR I和Not I双酶切处理表达载体pPICZαA质粒，酶切体系和条件同步骤1。酶切产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收3.6kp的片段，得到线性化的质粒片段。
将步骤1得到的目的基因片段与线性化的质粒片段按1pmol:10pmol的比例混合均匀，加入5μLT4-DNA连接酶，在25℃条件下连接15min，连接产物即重组子(pPICZαA-鸡α干扰素)。
用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自Invitrogen公司)。转化具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，42℃热激90秒，冰上放置2min，然后加入液体LB培养基缓摇1个小时，3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有100μg/ml博来霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。次日分别挑取12个单菌落，接种在含有100μg/ml博来霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pPICZαA-鸡α干扰素质粒。
委托生工生物工程(上海)有限公司对其中10份pPICZαA-鸡α干扰素质粒进行测序，将测序正确的质粒备用。
步骤3、重组酵母菌的获得
(1)电转化
用步骤2筛选的pPICZαA-鸡α干扰素质粒电击转化X-33酵母感受态细胞，具体操作步骤如下：
pPICZαA-鸡α干扰素质粒10μL转入80μL X-33酵母感受态细胞中，轻轻混匀充分，加入到置于冰上预冷5min的0.2cm的石英电转化杯中。电转化杯使用前预先用70％乙醇清洗浸泡，并置于紫外灯下消毒半小时。将石英电转化杯擦干外壁的水分，放入BioRadGenePulse电转化仪的槽中以1.5kV、25μF、200Ω、0℃的条件下电击，转化后立即加入1mL4℃预冷30min的D-山梨醇，混匀。将电转化杯放于30℃恒温箱中温育1-2h，得到电转化产物。取150μL电转化产物均匀涂布于含100μg/ml博来霉素的YPD选择平板培养基上，观察转化子的生长，30℃培养3-5天，得到生产鸡α干扰素的工程菌。
(2)阳性菌株的筛选
筛选阳性菌株，具体步骤如下：常温下随机挑选YPD平板内的长势较好的单一菌落，用灭菌的牙签或枪头挑取单一菌落，在含100μg/ml博来霉素的YPD平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的10ul无菌去离子水EP管中，加5μl(5u/μl)的溶细胞酶(购自美国sigma公司)，37℃水浴半小时，-80℃静置15分钟，沸水中煮沸5分钟，12000RPM离心5分钟，取上清0.5-1μl作为模板，加到25μl PCR反应体系中。
PCR引物的核苷酸序列为：
正向引物F1(5’-3’)：GGAATTCCATGTGTAACCACTT；
反向引物R1(5’-3’)：ATTTGCGGCCGCTTTAAGTTCTAGTG。
上述PCR反应体系(25μl)：2×PCR Master Mix 10μl、正向引物200nM、反向引物200nM、模板1μl、剩余体积用ddH2O补足。
上述PCR反应程序：预变性95℃5min，1个循环；变性95℃10s、退火58℃10s、延伸72℃30s，40个循环；最终延伸72℃5min，1个循环。
PCR反应结束后取10μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成相系统中观察并拍照记录，在513bp处有明显条带，证明构建的毕赤酵母含有目的基因，为阳性克隆(图5)。
实施例2.重组鸡α-干扰素的发酵工艺
1、多拷贝菌株的筛选
将实施例1获得的阳性克隆单菌落依次划线接种到含300μg/ml、600μg/ml、900μg/ml博来霉素YPD固体培养基上，筛选出稳定多拷贝的高产菌种。具体步骤如下：
将含100μg/ml博来霉素的YPD平板上的阳性克隆单菌落采用“三步划线法”接种到含300μg/ml博来霉素的YPD选择平板培养基上，30℃培养3-5天后观察菌落。
将含300μg/ml博来霉素的YPD平板上长势较好的单一菌落采用“三步划线法”接种到含600μg/ml博来霉素的YPD选择平板培养基上，30℃培养3-5天后观察菌落。
将含600μg/ml博来霉素的YPD平板上长势较好的单一菌落采用“三步划线法”接种到含900μg/ml博来霉素的YPD选择平板培养基上，30℃培养3-5天后观察菌落。此平板上所有单菌落均为多拷贝菌株。
2、一级种子培养
从第三次筛选的YPD固体培养基上挑取单菌落，接入装有250mL YPD液体培养基的1L三角瓶中，置于摇床中，在30℃、200rpm的条件下培养至OD600＝0.6～0.8；镜检无染菌后，作为一级种子液备用。
3、二级种子培养
将4瓶一级种子液共1L接种到已灭菌的100L BMGY发酵培养基中，使用发酵种子罐培养，控制通气量在5L/min，温度30℃，转速200rpm，待OD600＝0.6～0.8，且镜检无误后作为二级种子液备用。此阶段需要12～16h。
4、发酵培养
(1)菌体快速生长阶段
用泵将备好的100L二级种子液泵入1吨BMMY液体培养基中。发酵条件控制在转速200rpm，温度30℃，pH5.0，通气量10L/min。每4h取样一次测定其碳源剩余、菌体浓度，初期使用分光光度计测量其600nm吸光值(OD600)，后期测量湿重作为参考。发酵期间通过调整转速和通气量使溶氧保持在30％以上。以溶氧电极数值上升到100％为标志表示初始碳源已消耗殆尽，即可进入菌体边富集边诱导阶段。此阶段需要12～16h。
(2)菌体边富集边诱导阶段
以6～9mL/h/L的恒定速率补加浓度为0.1g/ml的山梨醇溶液，以2～3mL/h/L的恒定速率补加甲醇，发酵条件控制在转速200rpm，温度28℃，pH5.0，溶氧(DO)在20～30％之间。每6h取样1次，测OD600、细胞湿重及细胞干重，分析酵母菌生长状态。菌体湿重达400g/L以上时，停止补加山梨醇。转入甲醇诱导表达阶段。此阶段需要6～8h。
(3)菌体诱导阶段
以9～12mL/h/L的速率补加甲醇，发酵条件控制在转速200rpm，温度28℃，pH6.0，DO在20～30％之间。维持发酵到42～44h，湿重达到500g/L以上，结束发酵，得发酵液。
发酵液中鸡α-干扰素的浓度测定
用鸡α-干扰素定量检测试剂盒(江苏科晶生物科技有限公司)测定发酵液中重组鸡α-干扰素的浓度，按使用说明书操作(夹心ELISA)。连续3批发酵液中鸡α-干扰素的浓度如表1所示：
表1.连续3批发酵液中鸡α-干扰素浓度的ELISA检测结果
检测项目 第1批 第2批 第3批 均值
浓度(g/L) 20.6 20.7 21.1 20.8±0.15
本发明的上述发酵菌种已送中国典型培养物保藏中心进行菌种保藏，保藏编号为CCTCC M 2019748。
实施例3.鸡α-干扰素的后提取工艺
步骤1：放罐
首先将保存的重组毕赤酵母菌株(CCTCC M 2019748)按照实施例2的方法进行多拷贝菌株的筛选、一级种子培养、二级种子培养，然后将二级种子液按15％(v/v)的接种量转接到15T(吨)BMMY液体培养基中进行发酵培养(方法同实施例2)，制得毕赤酵母发酵液。用鸡α干扰素定量检测试剂盒测定毕赤酵母发酵液中重组鸡α-干扰素的浓度，测得发酵液中鸡α-干扰素的浓度为20～22g/L。
步骤2：离心
将储料罐内的发酵液通过离心机离心，离心机转速为12000rpm，离心机处理量为1.2m3/h；所述离心机为串联的两个连续GQ-105型管式离心机，由辽阳隆达制药机械有限公司生产；离心后，弃去菌体，保留上清液；上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序。
步骤3：膜分离
将上清液先通过50KDa分子量陶瓷膜设备进行过滤，过滤压力：进口压力为0.5MPa，出口压力0.2MPa；上清液流速为1m3/h；收集滤出液。再将上述滤出液通过10KDa分子量陶瓷膜设备进行过滤，过滤压力：进口压力为0.5MPa，出口压力0.25MPa；滤出液流速为1.2m3/h；收集截留液。所述陶瓷膜设备由安徽普朗膜技术有限公司生产。经两次膜分离，截留到分子量为10～30KDa的所有蛋白。
步骤4：亲和-膜分离的吸附过程
往上述步骤3得到的截留液中加入等体积的4mg/mL Cu2+-IDA-葡聚糖载体，加入NaCl溶液使反应体系中NaCl的终浓度为0.9mol/L，调节pH值为8.0，恒温水浴30℃、以500rpm/min搅拌反应30min，吸附反应完成，得到反应液。
所述Cu2+-IDA-葡聚糖载体是以分子量200KDa的水溶性葡聚糖DextranT2000为基质，亚氨基二乙酸(IDA)作为螯合剂，Cu2+做亲和配基制备出大分子水溶性葡聚糖亲和-超滤载体。
具体制备方法为(以1g为例)：
(1)葡聚糖碱活化：室温下，取1g葡聚糖T2000溶解于25mL 0.1mol/L NaOH溶液中，在25℃下，摇床活化30min。
(2)葡聚糖环氧活化：碱活化完成后，加入1mL环氧氯丙烷，置于超声场中以30℃水浴，频率130kHz，功率500W的条件反应4h，3000×g离心30min后，弃上清。
(3)耦联IDA：采用三齿配体IDA为间隔臂，配制含IDA 0.15g/mL的浓度为1.5mol/L的Na2CO3溶液。环氧活化完成后，加入10mL IDA溶液于步骤(2)中所述的超声条件下反应1h，3000×g离心30min后，弃上清。
(4)螯合金属离子：分别取25mL 0.05mol/L的CuSO4溶液加入耦联IDA后的葡聚糖溶液中，在25℃下，摇床反应1h。3000×g离心30min后，弃上清后得到Cu2+-IDA-葡聚糖载体。
步骤5：去除未吸附的重组干扰素和杂蛋白
吸附反应完成后，加入与反应液等体积的磷酸盐缓冲液；
将混合液通过50KDa分子量陶瓷膜设备进行过滤，过滤压力：进口压力为0.5MPa，出口压力0.2MPa；滤出液流速为1m3/h；收集截留液，去除未与Cu2+-IDA-葡聚糖载体结合的重组干扰素和杂蛋白。
所述磷酸盐缓冲液的成分为：2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/LNa2HPO4、0.3mol/LNaCl，pH 8.0。
步骤6：亲和-膜分离的洗脱过程
往上述步骤5得到的截留液中依次加入洗脱液A、B、C、D、E进行洗脱，将混合液通过30KDa分子量陶瓷膜设备进行过滤，过滤压力：进口压力为0.5MPa，出口压力0.2MPa；滤出液流速为1m3/h；收集各个洗脱步骤的滤出液。
洗脱液A的成分为：2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.02mol/L咪唑，pH 8.0。
洗脱液B的成分为：2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.1mol/L咪唑，pH 8.0。
洗脱液C的成分为：2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.15mol/L咪唑，pH 8.0。
洗脱液D的成分为：2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.2mol/L咪唑，pH 8.0。
洗脱液E的成分为：2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.3mol/L咪唑，pH 8.0。
步骤7：过滤除盐
将上述收集的滤出液通过10kDa陶瓷膜过滤脱盐，过滤压力：进口压力为0.5MPa，出口压力0.25MPa；滤出液流速为1.2m3/h；收集截留液，即得到重组鸡α-干扰素原液。
重组鸡α-干扰素的纯度测定
取发酵液和制备的重组鸡α-干扰素原液进行SDS-PAGE和SEC-HPLC检测，按《中华人民共和国药典》(2015年版)分析反应产物的纯度，SDS-PAGE结果见图2，SEC-HPLC检测结果见表2。
表2.连续3批重组鸡α-干扰素原液SEC-HPLC检测结果
检测项目 1 2 3 均值
鸡α-干扰素纯度(％) 98.9 98.7 98.2 98.6
重组鸡α-干扰素的得率测定
取60升发酵液，采用上述提取工艺提取重组鸡α-干扰素原液；用鸡α干扰素定量检测试剂盒(江苏科晶生物科技有限公司)测定重组鸡α-干扰素浓度，按使用说明书操作(夹心ELISA)。
重组鸡α-干扰素蛋白得率＝(重组鸡α-干扰素原液浓度×原液体积)/(发酵液重组鸡α-干扰素浓度×发酵液总体积)×100％。
检测连续3批重组鸡α-干扰素原液的蛋白得率，具体结果见表3。
表3.连续3批重组鸡α-干扰素原液的蛋白得率
喷雾干燥
每100ml重组鸡α-干扰素原液中加入赋形剂5g淀粉、保护剂2g聚乙二醇2000，1g大豆卵磷脂和2ml甘油后，以1000rpm/min，搅拌20min，得到重组鸡α-干扰素赋形液；将干扰素赋形液喷雾干燥，采用无锡市能达干燥设备有限公司生产的喷雾干燥机进行喷雾干燥；进口温度为110℃，出口温度为70℃，喷液速度为200L/h，得到重组鸡α-干扰素干粉。
重组鸡α-干扰素活性测定
取5g重组鸡α-干扰素干粉，溶于5mL蒸馏水，无菌过滤后采用细胞病变抑制法测定干扰素的活性，采用MDBK/VSV系统检测干扰素的生物活性，由标准品计算出样品的效价。测定方法参照《中华人民共和国药典》2005年版。
重组鸡α-干扰素活性收率＝重组鸡α-干扰素原液活性/发酵液重组鸡α-干扰素活性×100％。
检测连续3批重组鸡α-干扰素原液的活性，具体结果见表4。
表4.连续3批重组鸡α-干扰素原液的活性
可见，本发明提取工艺获得的重组鸡α-干扰素干粉活性收率达96.73％。
实施例4.Cu2+-IDA-葡聚糖载体的重复使用
采用实施例3的工艺提取重组鸡α-干扰素原液，设置5个实验组，在亲和-膜分离的洗脱过程中，第一组使用新制备的Cu2+-IDA-葡聚糖载体，第二组使用从第一组回收的Cu2+-IDA-葡聚糖载体，第三组使用从第二组回收的Cu2+-IDA-葡聚糖载体，第四组使用从第三组回收的Cu2+-IDA-葡聚糖载体，第五组使用从第四组回收的Cu2+-IDA-葡聚糖载体。
结果如图3所示，随着Cu2+-IDA-葡聚糖载体使用次数的增加，其对重组鸡α-干扰素吸附量有所下降，经5次重复使用后Cu2+-IDA-葡聚糖载体对重组鸡α-干扰素的吸附量下降了不到20％。每次重复使用所得的重组鸡α-干扰素的洗脱率均在90％左右，平均洗脱率为92.09％。其中，洗脱率(％)＝重组鸡α-干扰素洗脱量/重组鸡α-干扰素吸附量。
序列表
<110> 山东仙普爱瑞科技股份有限公司
<120> 一种鸡α-干扰素的后提取工艺
<130> P190832-XPA
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtgtaacc acttgagacc acaagacgct actttctctc acgactcttt gcaattgttg 60
agagacatgg ctccaacttt gccacaattg tgtccacaac acaacgcttc ttgttctttc 120
aacgacacta tcttggacac ttctaacact agacaagctg acaagactac tcacgacatc 180
ttgcaacact tgttcaagat cttgtcttct ccatctactc cagctcactg gaacgactct 240
caaagacaat ctttgttgaa cagaatccac agatacactc aacacttgga acaatgtttg 300
gactcttctg acactagatc tagaactaga tggccaagaa acttgcactt gactatcaag 360
aagcacttct cttgtttgca cactttcttg caagacaacg actactctgc ttgtgcttgg 420
gaacacgtta gattgcaagc tagagcttgg ttcttgcaca tccacaactt gactggtaac 480
actagaact 489
<210> 2
<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaattccat gtgtaaccac ttgagaccac aagacgctac tttctctcac gactctttgc 60
aattgttgag agacatggct ccaactttgc cacaattgtg tccacaacac aacgcttctt 120
gttctttcaa cgacactatc ttggacactt ctaacactag acaagctgac aagactactc 180
acgacatctt gcaacacttg ttcaagatct tgtcttctcc atctactcca gctcactgga 240
acgactctca aagacaatct ttgttgaaca gaatccacag atacactcaa cacttggaac 300
aatgtttgga ctcttctgac actagatcta gaactagatg gccaagaaac ttgcacttga 360
ctatcaagaa gcacttctct tgtttgcaca ctttcttgca agacaacgac tactctgctt 420
gtgcttggga acacgttaga ttgcaagcta gagcttggtt cttgcacatc cacaacttga 480
ctggtaacac tagaacttaa agcggccgca aat 513
<210> 3
<211> 582
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggctgtgc ctgcaagccc acagcaccca cgggggtacg gcatcctgct gctcacgctc 60
cttctgaaag ctctcgccac caccgcctcc gcctgcaacc accttcgccc ccaggatgcc 120
accttctctc acgacagcct ccagctcctc cgggacatgg ctcccacact accccagctg 180
tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc aacgacacca tcctggacac cagcaacacc 240
cggcaagccg acaaaaccac ccacgacatc cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc 300
cccagcactc cagcccactg gaacgacagc caacgccaaa gcctcctcaa ccggatccac 360
cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg gacagcagcg acacgcgctc ccggacgcga 420
tggcctcgca accttcacct caccatcaaa aaacacttca gctgcctcca caccttcctc 480
caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg 540
ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac acgcgcactt ag 582
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaattccat gtgtaaccac tt 22
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atttgcggcc gctttaagtt ctagtg 26

Claims (10)

1.一种鸡α-干扰素的后提取工艺，其特征在于，包括步骤：
S1.将含有鸡α-干扰素的发酵液离心，弃菌体，保留上清液；
S2.将上清液先通过50KDa分子量陶瓷膜过滤，收集滤出液；再将所述滤出液通过10KDa分子量陶瓷膜过滤，收集截留液；
S3.向步骤S2的截留液中加入等体积的Cu2+-IDA-葡聚糖载体和NaCl溶液，进行吸附反应，得到反应液；
S4.向步骤S3的反应液中加入等体积的磷酸盐缓冲液，混匀后通过50KDa分子量陶瓷膜过滤，收集截留液；
S5.向步骤S4的截留液中加入洗脱液，对鸡α-干扰素进行洗脱，然后通过30KDa分子量陶瓷膜过滤，收集滤出液；
S6.将步骤S5的滤出液通过10KDa分子量陶瓷膜过滤脱盐，收集截留液，即得鸡α-干扰素原液。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤S2中，所述通过50KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.2MPa，上清液流速为1m3/h；所述通过10KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.25MPa，滤出液流速为1.2m3/h。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤S3中，加入等体积的4mg/mL Cu2+-IDA-葡聚糖载体，加入NaCl溶液使反应体系中NaCl的终浓度为0.9mol/L，调节pH值为8.0，30℃恒温水浴，以500rpm/min的速度搅拌反应30min，得到反应液。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤S4中，所述磷酸盐缓冲液含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/LNa2HPO4、0.3mol/L NaCl，pH 8.0；所述通过50KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.2MPa，滤出液流速为1m3/h。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤S5中，依次用洗脱液A、B、C、D、E对截留液中吸附在所述Cu2+-IDA-葡聚糖载体上的鸡α-干扰素进行洗脱，分别收集各洗脱步骤的滤出液，其中：
洗脱液A含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.02mol/L咪唑，pH 8.0；
洗脱液B含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.1mol/L咪唑，pH 8.0；
洗脱液C含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.15mol/L咪唑，pH 8.0；
洗脱液D含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.2mol/L咪唑，pH 8.0；
洗脱液E含有2.7mmol/L NaH2PO4、47.3mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、0.3mol/L咪唑，pH 8.0。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤S5中，所述通过30KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.2MPa，滤出液流速为1m3/h。
7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤S6中，所述通过10KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.25MPa，滤出液流速为1.2m3/h。
8.根据权利要求1-7任一所述的工艺，其特征在于，鸡α-干扰素的得率至少为63％，纯度至少为98％，活性收率至少为96％。
9.一种生产鸡α-干扰素的方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵培养能够表达鸡α-干扰素的工程菌，获得含有鸡α-干扰素的发酵液，然后采用权利要求1-8任一所述的后提取工艺回收纯化发酵液中的鸡α-干扰素。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述工程菌采用保藏编号为CCTCCM2019748的毕赤酵母菌株。
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