CN101143889B - 一种大肠杆菌表达的重组人白介素-11的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种重组人白介素11(rhIL-11)的精纯化方法。步骤包括如下：利用葡聚糖凝胶G-25脱盐柱对融合蛋白进行脱盐后，收集脱盐液进行阴、阳离子交换层析柱串联上样，上样完毕后用特有的Gly-NaOH缓冲液洗脱，收集主要洗脱蛋白液，上葡聚糖凝胶G-25脱盐柱脱盐，得到高纯度蛋白样品。本方法具有适合规模化生产、操作简便、生产周期短、产品纯度高、工艺稳定性强等特点。
Description
技术领域
本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及大肠杆菌表达的重组人白介素-11(rhIL-11)的高效精纯化方法，属于医药技术领域。
背景技术
白介素-11(IL-11)是人体内的一种重要的细胞因子，可与其它细胞因子协同作用刺激人体粒细胞、红细胞、巨核细胞前体细胞的生长，诱导巨核细胞成熟而促进血小板生成。天然的人IL-11由178个氨基酸组成，含有大量的碱性氨基酸如：脯氨酸、亮氨酸等，不含半胱氨酸，缺少二硫键，等电点为11.7，结构稳定。
1997年11月，美国Genetic Institute公司生产的rhIL-11由FDA批准上市，用于治疗癌症患者放、化疗引起的再生性血小板减少症。1998年Genetic Institute公司申请了生产方法专利US5760189，公开了以融合蛋白高效表达重组人白介素-11的方法，但是由于采用专一性的肠肽激酶(enterokinase)对融合蛋白进行切割，价格比较昂贵，大大的增加了生产成本，同时由于引进了异源蛋白，给下游纯化也造成了很大困难。
针对上述技术的不足，专利CN1114617C公开了盐酸羟胺切割融合蛋白的方法，从而解决了上述问题，但是对于rhIL-11的精纯化，该方法采用对融合蛋白羟胺切割液进行透析，然后通过单独琼脂糖凝胶(CM-Sepharose)柱层析，再用0-1mol/LNaCl进行线性梯度洗脱，这种方法存在以下缺陷：透析去除盐酸羟胺时间太长，处理量小，不适合大规模生产；另外国内文献报导有采用亲和层析的方法，此方法虽然专一性强，但载体价格昂贵，机械强度低，配基制备困难，同样存在成本过高的问题；还有采用分子筛层析的方法，这种方法可以得到高纯度的样品，但是装柱柱效要求严格，上样流速、上样量也限制的很低，同样不适合扩大生产。
另外，对于类似于羟胺切割后含高盐、高杂质的蛋白纯化，据相关报道大多采用超滤去除盐酸羟胺及脱盐，再采用单独琼脂糖凝胶(CM-Sepharose)柱层析，通过控制洗脱液的离子强度来控制洗脱组分得到目的蛋白，这样处理的缺点是：超滤的方法造成目的蛋白吸附损失，脱盐液直接上琼脂糖凝胶(CM-Sepharose)柱会造成大量的杂蛋白吸附在柱上，影响了产品的纯度和收率。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种rhIL-11的高效精纯化方法。
实施本发明的前期步骤为现有技术：采用目的蛋白以融合表达方式在大肠杆菌中直接表达和含有羟胺特异切割位点Asn-Gly(天冬酰胺-甘氨酸)的工程菌株PTI 117/DH5α，融合蛋白中的前导肽为大肠杆菌硫氧还原蛋白(thioredoxin)，可引导其后的rhIL-11以可溶状态存在于大肠杆菌的细胞浆中，使rhIL-11具有天然的生物学活性；在其N端甘氨酸前引入了一个盐酸羟胺特异切割位点Asn-Gly(天冬酰胺-甘氨酸)，从而使大肠杆菌表达的融合蛋白可用盐酸羟胺特异切割，以释放完整的rhIL-11蛋白。
本发明的具体步骤包括：
(1)融合蛋白羟胺切割液经过葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐，得切后脱盐液；
(2)脱盐液连续通过阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱串联层析系统，截留未被切开的融合蛋白及杂质；
(3)采用Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联层析系统进行平衡，使融合蛋白吸附到阴离子交换层析柱上，目的蛋白吸附到阳离子交换层析柱上；
(4)采用添加了NaCl的Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液中对进行了步骤(3)处理后的阳离子交换层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出阳离子交换层析柱，收集洗脱蛋白液；
(5)洗脱蛋白液经过葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度的蛋白样品。
经过上述步骤的处理，得到的目标蛋白白介素-11纯度高，一次处理量大，且收率大大提高，为大规模生产提供了技术基础。
上述步骤(2)中的阴离子交换层析柱的层析介质包括琼脂糖凝胶(Sepharose)类、聚苯乙烯(SOURCE)类，配基包括季铵基Q或二乙基氨乙基DEAE。
上述步骤(2)和步骤(4)中的阳离子交换层析柱的层析介质包括琼脂糖凝胶(Sepharose)类、聚苯乙烯(SOURCE)类，配基包括磺甲基S或磺丙基SP或羧甲基CM。
阴阳离子交换层析柱的层析介质能够用氢氧化钠在位清洗消毒，流速高，为生产的准备提供了方便。
所述步骤(2)中所述的脱盐液可以连续通过阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱串联层析系统。
所述步骤(2)中所述的脱盐液可以通过阴离子交换层析柱之后收集，再集中通过阳离子交换层析柱。
所述步骤(3)和步骤(4)中所述的Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液的pH值为6.0-11.0，浓度为0.1mol/L-1.0mol/L。
在该缓冲液的作用下，目标蛋白和融合蛋白由于等电点的不同而分离到不同的层析柱上，极大地提高了产品纯度，方法简单。
所述步骤(4)中的添加了NaCl的Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液中NaCl浓度为：0.2mol/L-1.0mol/L。
添加NaCl后，缓冲液的离子强度发生了变化，从而使吸附在阳离子交换层析柱上的目标蛋白，解吸，达到了分离的目的。
本发明的技术关键点在于：
在对盐酸羟胺切割液进行纯化的过程中，将超滤方式改用脱盐方式，在阳离子交换层析柱前增加了一步阴离子交换层析柱，极大的提高了产品的纯度和工艺稳定性，缩短了工艺周期，一次性处理蛋白量大，适合于大规模生产。
在阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱组成的串联层析系统的平衡过程中，采用的是pH7.0-10.0，0.1mol/L-0.3mol/LGly-NaOH缓冲体系，当盐酸羟胺切割脱盐液先通过阴离子交换层析柱时，由于目的蛋白由于等电点大于平衡缓冲液pH值而呈荷正电穿出，吸附到阳离子交换层析柱上；而融合蛋白等电点小于平衡缓冲液pH而呈荷负电被吸附到阴离子交换层析柱上，这样目的蛋白和融合蛋白就能很好的分离，提高了目的蛋白的纯度和收率。
与现有技术相比，本发明的优良效果如下：
本发明工艺设计合理，工艺过程简单，易于控制，便于操作，重复性好；目的蛋白损失少，蛋白收率和质量有明显提高；一次性处理蛋白量大，工艺稳定性强，适合于大规模工业生产。
表1现有技术与本发明技术参数对比
| 技术参数 | 规模 | 原液收率 | 原液纯度 | 生产周期 |
| 现有技术 | 纯化 40L/批 | 8-12％ | 含有融合蛋白等杂质，纯度 低于95％ | 36小时 |
| 本发明 | 纯化 120L/批 | 30-43％ | 纯度大于96％ | 34小时 |
附图说明
图1、2、3是三批重组人白介素-11原液SDS-PAGE电泳分析后的目的蛋白纯度图。
具体实施方式
以下通过实施例将进一步说明本发明，这些实例不应作为本发明的限制。
实施本发明的全部步骤为：菌种的构建-菌种活化-制备种子液(一、二级种子)-发酵(IPTG诱导表达)-收获洗涤菌体-化学法释放融和蛋白-离心收集上清-一步静态悬浮层析纯化融和蛋白-盐酸羟胺切割融和蛋白-脱盐柱脱盐-阴阳串联层析柱纯化-脱盐柱脱盐-高纯度目的蛋白。
融合蛋白羟胺切割液可由现有技术直接获得。
实施例1
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose F.F)，阳离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(CM-SepharoseF.F)。
3、利用pH10.0，浓度0.1mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用pH10.0，浓度0.1mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH 10.0、浓度0.1mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.2mol/L NaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡3个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达30％以上。
实施例2
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、用pH9.2、浓度0.3mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分别进行平衡，阴离子交换层析柱的层析介质为聚苯乙烯30Q(SOURCE 30Q)，阳离子交换层析柱的层析介质为聚苯乙烯30S(SOURCE 30S)。
3、利用pH9.2、浓度0.3mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液分别平衡大约十个柱体积，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱将脱盐液进行串联上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；利用pH9.2，0.3mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.3mol/L NaCl洗脱液进行洗脱，收集主要洗脱蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡3个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达40％以上。
实施例3
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质琼脂糖凝胶(Q-Sepharose F.F)，阳离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(SP-Sepharose F.F)。
3、利用pH7.0、浓度0.2mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH 7.0、浓度0.2mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.4mol/LNaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡3个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达35％以上。
实施例4
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为为琼脂糖凝胶(Q-Sepharose big bead)，阳离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(CM-SepharoseF.F)。
3、利用pH8.0、浓度0.4mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH 8.0、浓度0.4mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.7mol/LNaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡3个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达30％以上。
实施例5
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为聚苯乙烯30Q(SOURCE 30Q)，阳离子交换层析柱的层析介质为聚苯乙烯15S(SOURCE 15S)。
3、利用pH10.0、浓度0.5mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH10.0、浓度0.5mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.8mol/LNaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡3个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达30％以上。
实施例6
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为聚苯乙烯15Q(SOURCE15Q)，阳离子交换层析柱的层析介质为聚苯乙烯30S(SOURCE 30S)。
3、利用pH9.0、浓度0.6mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH9.0、浓度0.6mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.5mol/LNaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡3个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达35％以上。
实施例7
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(Q-Sepharose big bead)，阳离子交换层析柱的层析介质为聚苯乙烯(SOURCE 15S)。
3、利用pH10.0、浓度0.7mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH 10.0、浓度0.7mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.6mol/LNaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡3个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达40％以上。
实施例8
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为聚苯乙烯30Q(SOURCE 30Q)，阳离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(CM-Sepharose F.F)。
3、利用pH6.2、浓度0.15mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH6.2、浓度0.15mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制1.0mol/LNaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡3个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达96％以上，串联柱收率可达35％以上。
实施例9
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为15Q(SOURCE15Q)，阳离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(CM-Sepharose F.F)。
3、利用pH11.0、浓度1.0mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH11.0、浓度1.0mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.9mol/LNaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡3个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达30％以上。
实施例10
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为为琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose F.F)，阳离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(SP-SepharoseF.F)。
3、利用pH10.5、浓度0.9mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH8.0、浓度0.2mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.3mol/LNaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡5个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达40％以上。
实施例11
1、采用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱对融合蛋白羟胺切割液进行脱盐，收集切后脱盐液。
2、先将阴阳离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为聚苯乙烯30Q(SOURCE 30Q)，阳离子交换层析柱的阳离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(SP-Sepharose F.F)。
3、利用pH10.5、浓度0.35mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液对串联柱进行平衡，平衡大约10个柱体积后将脱盐液上样，上样压力控制在0.3bar以下。
4、上样结束后，用步骤3中所述的缓冲液冲洗10个柱体积，冲洗完毕，将阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱分开，以同样缓冲液冲洗阳离子交换层析柱10个柱体积以上；以pH10.5、浓度0.35mol/L Gly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配制0.4mol/LNaCl洗脱液进行洗脱，收集主要目的蛋白液。
5、用缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱，平衡4个柱体积左右取流出液测pH值、电导率与平衡缓冲液相同，将目的蛋白液上样脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度蛋白样品。
6、在百级层流罩下进行除菌过滤，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99％以上，串联柱收率可达30％以上。
Claims (8)
1.一种大肠杆菌表达的重组人白介素-11的纯化方法，其特征在于：它是对融合蛋白羟胺切割液进行处理，步骤如下：
(1)融合蛋白羟胺切割液经过葡聚糖凝胶G-25脱盐柱脱盐，得切后脱盐液；
(2)脱盐液依次通过阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱串联层析系统，截留未被切开的融合蛋白及大量的杂质；
(3)采用Gly-NaOH缓冲液对串联柱进行平衡，使融合蛋白吸附到阴离子交换层析柱上，目标蛋白吸附到阳离子交换层析柱上；
(4)采用添加了NaCl的Gly-NaOH缓冲液中对进行了步骤(3)处理后的阳离子交换层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出阳离子交换层析柱，收集洗脱蛋白液；
(5)洗脱蛋白液经过葡聚糖凝胶G-25脱盐柱脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度的蛋白样品；
上述步骤(2)中的阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶类或聚苯乙烯类，配基为季铵基Q或二乙基氨乙基DEAE；
上述步骤(2)和步骤(4)中的阳离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶类或聚苯乙烯类，配基为磺甲基S或磺丙基SP或羧甲基CM。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达的重组人白介素-11的纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述的脱盐液连续通过阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱串联层析系统。
3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌表达的重组人白介素-11的纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述的脱盐液通过阴离子交换层析柱之后收集，再集中通过阳离子交换层析柱。
4.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌表达的重组人白介素-11的纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(4)中所述的Gly-NaOH缓冲液的pH值为6.0-11.0，浓度为0.1mol/L-1.0mol/L。
5.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达的重组人白介素-11的纯化的方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(4)中所述的Gly-NaOH缓冲液的pH值为6.0-11.0，浓度为0.1mol/L-1.0mol/L。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌表达的重组人白介素-11的纯化方法，其特征在于：所述步骤(4)中的添加了NaCl的Gly-NaOH缓冲液中NaCl的浓度为：0.2mol/L-1.0mol/L。
7.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌表达的重组人白介素-11的纯化方法，其特征在于：所述步骤(4)中的添加了NaCl的Gly-NaOH缓冲液中NaCl的浓度为：0.2mol/L-1.0mol/L。
8.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达的重组人白介素-11的纯化方法，其特征在于：所述步骤(4)中的添加了NaCl的Gly-NaOH缓冲液中NaCl的浓度为：0.2mol/L-1.0mol/L。
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| 张颖等.人白细胞介素11融合蛋白切割位点的改变及成熟蛋白的纯化.中国生物化学与分子生物学报16 1.2000,16(1),6-9. * |
| 李鸿钧等.羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、表达产物纯化及生物活性.中国生物化学与分子生物学报17 2.2001,17(2),139-142. |
| 李鸿钧等.羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、表达产物纯化及生物活性.中国生物化学与分子生物学报17 2.2001,17(2),139-142. * |
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