CN108251445B - 一种gcrv ii s9及s10重组蛋白规模化的制备工艺及应用 - Google Patents

一种gcrv ii s9及s10重组蛋白规模化的制备工艺及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白规模化的制备工艺及应用，制备工艺包括重组标记蛋白工程菌构建和发酵的步骤、切向流微滤回收蛋白包涵体的步骤、rGCRV2 S9和rGCRV2 S10蛋白变性与连续复性。本发明方法主要使用切向流微滤和超滤技术对各步骤上清与沉淀分离，无需进行大体积样品离心；由大肠杆菌表达的包涵体形式的S9及S10重组蛋白经过变性和连续复性，可去除内毒素和菌体蛋白，复性后重组蛋白生物学活性良好。关键是本发明的制备工艺操作简单、整个过程中，无需进行大体积样品离心，降低了工作强度，适合大规模工业生产。

Description

一种GCRV II S9及S10重组蛋白规模化的制备工艺及应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白质纯化技术，尤其涉及一种GCRV II S9及S10重组蛋白规模化的制备工艺及应用。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水鱼类养殖的主要品种，草鱼出血病是困扰我国草鱼养殖常见病害，草鱼出血病原发病主要由II型草鱼呼肠孤病毒(grasscarp reovirus，GCRV II)侵袭草鱼上皮组织所致，对GCRV早期预防可有效防控草鱼出血病对草鱼养殖造成的损失。研究表明使用GCRV全病毒灭活疫苗或由GCRV S9及S10编码蛋白制备的亚单位疫苗对GCRV防控均有良好效果，但鱼类疫苗口服或浸泡免疫疫苗需要使用较高浓度抗原，全病毒培养或利用亲和层析法制备抗原的成本较高，难于应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白规模化的制备工艺。本发明方法主要使用切向流微滤和超滤技术对各步骤上清与沉淀分离，无需进行大体积样品离心；由大肠杆菌表达的包涵体形式的S9及S10重组蛋白经过变性和连续复性，可去除内毒素和菌体蛋白，复性后重组蛋白生物学活性良好。关键是本发明的制备工艺操作简单、整个过程中，无需进行大体积样品离心，降低了工作强度，适合大规模工业生产。
本发明的目的之二在于提供一种草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白在GCRVII血清抗体检测中的应用以及在GCRV II亚单位疫苗中的应用。本发明大规模制备的S9及S10重组蛋白，生物学活性良好，可用于GCRV感染诊断，配合使用GCRV S9及S10重组蛋白制备的亚单位疫苗免疫效果优于单独一种蛋白免疫效果。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白规模化的制备工艺，其特征在于包括，
重组标记蛋白工程菌构建的步骤：分别构建表达GCRV II S9重组蛋白和GCRV IIS10重组蛋白的基因工程菌，分别为GV2B9和GV2B10；
重组基因工程菌高密度发酵的步骤：分别复苏基因工程菌GV2B9和GV2B9，进行培养特性、蛋白表达及纯粹性检验；分别根据发酵罐装量制备适宜体积种子菌；分别在发酵罐内加入培养基，通入气体，接种种子菌，边搅拌边补液；发酵过程中，每隔1h无菌取样，检测菌液OD600nm数值变化，当OD600nm超过8时，停止补液，加入IPTG进行诱导，诱导时长为4～6h；按照以上方法进行发酵，发酵总时长不超过10小时，得到GV2B9发酵液和GV2B10发酵液；
切向流微滤回收蛋白包涵体的步骤：分别采用孔径为0.4～0.5μm的中空纤维膜柱或膜包对发酵液进行微滤浓缩与滤洗，得到高浓度的菌体；然后分别利用物理法破碎菌体，采用孔径为0.1～0.2μm的中空纤维膜柱或膜包对破碎的菌体进行滤洗、浓缩，分别回收得到两种rGCRV2 S9和rGCRV2 S10包涵体，分装后-20℃保存；
rGCRV2 S9和rGCRV2 S10蛋白变性与连续复性：先分别将rGCRV2 S9和rGCRV2 S10进行蛋白变性溶解，然后分别对rGCRV2 S9和rGCRV2 S10进行蛋白连续复性。
进一步地，在重组标记蛋白工程菌构建的步骤中，具体构建方法如下：对草鱼肠孤病毒II型病毒基因组中S9和S10编码蛋白进行生物信息学分析，以GCRV II型病毒S9和S10氨基酸序列(GCRV II型病毒S9和S10氨基酸序列在Genebank的登陆号分别为：ADT79740、ADT79741)作为参考序列，分别对编码两蛋白的密码子进行优化并人工合成基因序列GCRVII opti-S9和GCRV II opti-S10，将两合成的基因片段分别通过NdeI/Xho I和BamH I/XhoI内切酶插入原核表达载体PET21b；GCRV S9表达序列ORF 3’端融合6个组氨酸编码序列；GCRV S10表达序列ORF 5’端融合T7短肽编码序列；合成序列经测序验证，分别转化大肠杆菌表达菌感受态细胞BL21(DE3)；利用IPTG进行小量诱导，收集大肠杆菌，利用SDS-PAGE及Western Blot验证菌体裂解物中目的蛋白表达情况；得到表达GCRV II S9重组标记蛋白工程菌为：GCRV II opti-S9/BL21(DE3)，缩写：GV2B9；表达GCRV II S10重组标记蛋白工程菌为：GCRV II opti-S10/BL21(DE3)，缩写：GV2B10；成功构建的表达菌扩大培养后冻干保存。
进一步地，所述GCRVII opti-S9的基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述GCRV IIopti-S10的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，在重组基因工程菌高密度发酵的步骤中，所述种子菌活菌数≥1.0×109CFU；所述培养基的总量为发酵罐总体积的50％～55％，设置通气量为10L/min，种子菌接的种量为培养基体积的3.0～8.0％，接种后菌液OD600nm为0.4～0.6；所述搅拌转速为350～500rpm；一次性连续补液，补液量与培养基总体积不超过发酵罐体积的60％；所述诱导的最佳时机为OD600nm＝8.0～10.0，IPTG诱导浓度为0.1～0.6mM。
进一步地，在切向流微滤回收蛋白包涵体的步骤中，高浓度的菌体制备具体操作如下：(1)发酵液微滤浓缩：分别以新鲜的发酵液，菌含量10～50g/L，作为料液A，采用孔径为0.4～0.5μm的中空纤维膜柱或膜包进行微滤浓缩，浓缩条件如下：温度4～25℃，起始跨膜压0.1～0.2bar，菌体浓缩过程中跨膜压不超过0.4bar；采用滤出液控制方式，对料液进行10倍浓缩；(2)菌体滤洗：分别向浓缩后的料液中泵入2倍体积PBS溶液作为料液B，进行滤洗操作；混匀料液B，在搅拌条件下对菌体进行滤洗，滤洗条件如下：温度4～25℃，滤洗时跨膜压在0.1～0.4bar，采用等体积置换液方式，置换量为6～8倍料液B体积；滤洗结束，按照步骤(1)浓缩方法对滤洗液再次微滤浓缩至原体积。
进一步地，所述PBS溶液的配方如下：137mM NaCl，2.68mM KCl，22.7mM Na2HPO4·12H2O，7.35mM KH2PO4，针对GCRV II S9重组标记蛋白工程菌处理时，PBS溶液的pH值7.5～8.3；针对GCRV II S10重组标记蛋白工程菌处理时，PBS溶液的pH值5.5～6.5。
进一步地，在切向流微滤回收蛋白包涵体的步骤中，回收蛋白包涵体的具体操作如下：(1)破菌：分别将高浓度的菌体中加入等体积PBSTU溶液，搅拌混匀，泵入高压菌体裂解机的储料罐，工作温度≤8℃，裂解压力400～800bar，循环破碎3次，最后一次菌体裂解液，为料液C，接流至无菌容器内；(2)菌体蛋白滤洗、浓缩与包涵体蛋白回收：分别向料液C中加入等体积PBS溶液，室温下搅拌清洗2～6h；采用孔径为0.1～0.2μm的中空纤维膜柱或膜包进行滤洗、浓缩，采用等体积置换液方式对回收的菌体蛋白滤洗，条件温度4～25℃，跨膜压在0.2～0.4bar，置换量为3～6倍料液C的体积；滤洗结束，对滤洗液进行3倍浓缩，浓缩过程中跨膜压不超过0.4bar；然后在转速为6000rpm条件下离心15分钟，收集洗滤液中沉淀，为料液D，即为rGCRV2 S9和rGCRV2 S10包涵体，分装后-20℃保存。
进一步地，在rGCRV2 S9和rGCRV2 S10蛋白变性与连续复性中，rGCRV2 S9蛋白变性溶解与连续复性具体操作如下：(1)rGCRV2 S9蛋白变性溶解：取新鲜制备或-20℃保存的rGCRV2 S9包涵体，溶解于5～10倍体积的含盐酸胍4-7M的TBSG溶液中，25℃或室温，振荡1～3h；4℃，8000rpm，离心15min；取上清，弃沉淀；利用TBS溶液将溶液稀释至含盐酸胍4M；利用比色法或蛋白定量试剂盒测定上清中总蛋白浓度，用含有4M盐酸胍的TBS溶液将蛋白稀释至20～200μg/mL，采用真空过滤泵对溶液进行除菌处理，滤液接流至无菌罐内，以此作为料液X1；(2)rGCRV2 S9蛋白连续复性：采用15～25Kd中空纤维膜柱或膜包进行溶液置换，去除溶液中盐酸胍；采用恒体积透析模式对溶解在含4M盐酸胍TBS溶液中的蛋白进行溶液置换与蛋白复性，置换液或复性液均为pH 5～6的PBS溶液；条件温度2～8℃，跨膜压TMP＝4.0～5.3psi，剪切力Shear＝3500～3800S-1，置换量为8～12倍料液X1体积，收集洗滤溶液，2～8℃放置12～16h后，即为rGCRV2S9复性蛋白。
进一步地，在rGCRV2 S9和rGCRV2 S10蛋白变性与连续复性中，rGCRV2 S10蛋白变性溶解与连续复性具体操作如下：(1)rGCRV2 S10蛋白变性溶解：取新鲜制备或-20℃保存的rGCRV2 S10包涵体，溶解于8～10倍体积的含6～8M尿素的TBSU溶液中，25℃或室温，振荡1～2h；4℃，10000rpm，离心15min；取上清，弃沉淀；利用TBS溶液将溶液稀释至含尿素5M；利用比色法或蛋白定量试剂盒测定上清中总蛋白浓度，用含有5M尿素的TBS溶液将蛋白稀释至20～400μg/mL，采用真空过滤泵对溶液进行除菌处理，滤液接流至无菌罐内，以此作为料液Y1；(2)rGCRV2 S10蛋白连续复性：采用10～15Kd中空纤维膜柱或膜包进行溶液置换，去除溶液中尿素变性剂；采用恒体积透析模式对溶解在含5M尿素的TBS溶液中的变性蛋白进行溶液置换与蛋白复性，置换液或复性液均为pH 8～9.5的PBS溶液；条件温度2～8℃，跨膜压TMP＝4.0～7.0psi，剪切力Shear＝3500～3850S-1，置换量为8～12倍料液Y1体积，收集洗滤溶液，2～8℃放置8～12h后，即为rGCRV2 S10复性蛋白。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白在GCRV II血清抗体检测中的应用以及在GCRV II亚单位疫苗中的应用，其特征在于，采用如上所述的草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白规模化的制备工艺制备得到的rGCRV2 S9重组蛋白或rGCRV2 S10重组蛋白或rGCRV2 S9重组蛋白与rGCRV2 S10重组蛋白联合使用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)利用切向流微滤(孔径0.1-0.5μm)法分离各环节中沉淀与上清，如连续收集高密度发酵后GCRV S9及S10菌体，连续收集包涵体形式的GCRV S9及S10重组蛋白。
(2)高密度发酵的两种工程菌，GCRV S9及S10重组蛋白主要以包涵体形式存在(优势：表达量大，发酵时间短，条件容易控制)，通过对包涵体粗纯，两种蛋白纯度均可达到80％。
(3)针对两种蛋白性质，应用不同方法对其进行变复性。
(4)整个过程中，无需进行大体积样品离心，降低了工作强度。
(5)制备rGCRV2 S9重组蛋白与rGCRV2 S10重组蛋白可用于GCRV感染诊断；两种蛋白配合使用制备的GCRV亚单位疫苗免疫效果优于单独一种蛋白免疫效果。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的rGCRV2 S9重组蛋白的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图2为本发明实施例2制备得到的rGCRV2 S10重组蛋白的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
其中，图1中，M为蛋白Ladder；1为纯化前的rGCRV2 S9包涵体；2为纯化后的rGCRV2S9包涵体；3为rGCRV2 S9复性蛋白；图2中，M为蛋白Ladder；1为纯化前的rGCRV2 S10包涵体；2为纯化后rGCRV2 S10包涵体；3为rGCRV2 S10复性蛋白。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一种草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白规模化的制备工艺，包括，
1、重组标记蛋白工程菌构建的步骤：分别构建表达GCRV II S9重组蛋白和GCRVII S10重组蛋白的基因工程菌，分别为GV2B9和GV2B10；
具体构建方法如下：对草鱼肠孤病毒II型病毒基因组中S9和S10编码蛋白进行生物信息学分析，以GCRV II型病毒S9和S10氨基酸序列(ADT79740、ADT79741)作为参考序列，分别对编码两蛋白的密码子进行优化并人工合成基因序列GCRV II opti-S9和GCRV IIopti-S10，将两合成的基因片段分别通过NdeI/Xho I和BamH I/XhoI内切酶插入原核表达载体PET21b；GCRV S9表达序列ORF 3’端融合6个组氨酸编码序列；GCRV S10表达序列ORF5’端融合T7短肽编码序列；合成序列经测序验证，分别转化大肠杆菌表达菌感受态细胞BL21(DE3)；利用IPTG进行小量诱导，收集大肠杆菌，利用SDS-PAGE及Western Blot验证菌体裂解物中目的蛋白表达情况；得到表达GCRV II S9重组标记蛋白工程菌为：GCRV IIopti-S9/BL21(DE3)，缩写：GV2B9；表达GCRV II S10重组标记蛋白工程菌为：GCRV IIopti-S10/BL21(DE3)，缩写：GV2B10；成功构建的表达菌扩大培养后冻干保存。
其中，所述GCRVII opti-S9的基因序列如SEQ ID NO:1所示，即GAGCGTAGCACTTACAACATCTGCACGCCGGGTTTCTTCGGTGCTAACGTCCCACCTTTCAAGACGATCGACATCCAGCGCAGCACCACGGGTGGTAACACGCTGTGGAACGCACGTGGTCACGATGCATTCCGTACCTACCCAAAGGTCGTCAGCCACGAGAAAGACTTCCCTCTGATCTACACCGAACAGTTCACCTTCAACCTGCTGATCGGTGCCTTCCTGCAGCAGCCACTGCTGCAGAACTCCATCGACCGCCAGTGGCGTGGTATGATCTGGACCAGCGACCGTCTGTCTTCTCTGCGTATCGCTCCTCCAAACAGCCGTGTAGCAGACCTGCCGCGTGCATATCGTACTCTGGATCTGGCAAACTACCCGCTGTGGGGTACTGCTCCGGCAGCACTGCAAACTCTGTGGATGGATTCTTGTCTGATGACTCTGGAATCCCTGTCCGCACGTGGTCCGTTTCTGTACCTGCGTCACCCGCAAGCACGTCCGGATGGTAATGTACTGCGTGCTCTGCAACAGCATATCAGCAAACCGATGGAAGCTATCGTGAGCGAAGCCTACCAGTCCATCGCTGTGGGTCCGCTGACTCTGCAGGATGGTTACTACCGTGCTCTGTCCGTTATTACCCTGATCTACCTGGCGTCCCTGACTGGCCGTCTGGGCCCGGATCGTACTTATTACGGCTTCTACGTGCAGTTCCCGAAAAAACGCAAATTCGAAGACCTGGGCTACTTCGCCTACAACGCCGACGGCCGTAACGTGGCTGTGCTGCAGTCTATTAACGCGTACATCTACTGCGCCTCCCCGGATTGGCAGTATTCCTGCGCTCTGTATTATCTGCACGTGCTGTCTGCGCTGTCTCTGTCTTGGACCGACCCGGTTGGCATGATTGACGGCTTCTCTTGCGTTAACCAGTTCACCGACGTTCCGGGCTGGTTTGCCACCAACCGTGCTCTGCACACTCATTCTTTTAACTGGTTTAACCTGCTGGAAGACGCGATTGACACCCTGGTTGCGCGCCGCTATTGGACCAACGCGGTTGGCCAGGCGATTCGCCAGGAATGGACCGCGGCGCGTGATCGTTGGCGTGTAATTATGGACGCGACCCGTGATGAAGATGACCTGGTAGTTTTTCGCACCCCGGATGACTGTCGTCGCCGCCTGAAACCGTATGGCGATAATAATTGGACCCGCGCGTATGACACCGCGGATGTTGTTCGCGTACTGGATCGCCTGTTTCCG；
所述GCRV II opti-S10的基因序列如SEQ ID NO:2所示，即GCAGGTGTCTCTCTGAACATCAACCGCAACATCTCCAACTCCGCAAGCACGATCTTCCTGGAGGACATCCCTCTGCTGTCCTGCAGCGTCCGTTGTGAGCCTGGTAAAGGTCGTGAGCTGCCAAAGTTCAACATGTCCTGCCCAGCTATCAACGCAATGGGTCGTTGCCTGAACCCAATGAAGTTCATCGCGGAGCACTGGGTCCCGAACAGCCCGTCTCGTAAACCGTCTCGTCAACACTGGCGTAACGTACTGAACGGTCTGGAATTCTCCAACGGTCGTGGTTTCGACGTGCTGTCTTTCTCCCCGGCTGGTATGGCTGTTCTGCGTGATATCCTGACGGAAGACTCTGTGAACTACTGCTTCGACGAATCCAACACCTGCAGCCTGTTCACCCTGCTGTACACCCTGTGCTGCGACGCAGCAGGTGTTGAACCGATGGACCTGGATTCTCGTCAAACCGACGCATCTGCACGTATGGTGTCTTACCAGGACCGTGCTATCGTGCTGACCTCTAACGAAGCTGGCGACCGTATCGAACCGTGGAACGTAGAACTGGACAAAGAATTCGGCAACCCGGACCTGCTGTCTCGTCTGAACATCTCCTACGGTGTGCAGCGTTACGGCGATTCTAAAGCCTCCACCGACACCCTGACTCTGGCTGATGCTCCGGAACGTTCTAAACCGGCTCTGATTACCGTTCAGCCGCTGCTGGTTGCCATGTGTATCAAACAGTCCCTGGATGGCCTGCTGGCGCTGAGCGATCTGCGTCTGCGTTTTGATCAGTATCCGGGCTATGCCAATGCGCTGATGAATGCGATGGCGATGTATGCGTGTCTGGATCGCGATCTGATGCGCTTTCTGCTGCGCCTGGAAATGACTCATGCCAGCACTGTTAGCGAAGTAGCGGAATGTTGGCGTAATAGCCGCAATAGCCGCGATGCGACTGGCTGTCACATTGTTCCGCGCCAGGGCCTGCTGATTATTGTTAGCGGCGATGTTGAAGTACGCCGCATTTTTGCGCAGATGCTG。
2、重组基因工程菌高密度发酵的步骤：分别复苏基因工程菌GV2B9和GV2B10，进行培养特性、蛋白表达及纯粹性检验；分别根据发酵罐装量制备适宜体积种子菌；分别在发酵罐内加入培养基，通入气体，接种种子菌，边搅拌边补液；发酵过程中，每隔1h无菌取样，检测菌液OD600nm数值变化，当OD600nm超过8时，停止补液，加入IPTG进行诱导，诱导时长为4～6h；按照以上方法进行发酵，发酵总时长不超过10小时，得到GV2B9发酵液和GV2B10发酵液；
其中，所述种子菌活菌数≥1.0×109CFU；所述培养基的总量为发酵罐总体积的50％～55％，设置通气量为10L/min，种子菌接的种量为培养基体积的3.0～8.0％，接种后菌液OD600nm为0.4～0.6；所述搅拌转速为350～500rpm；一次性连续补液，补液量与培养基总体积不超过发酵罐体积的60％；所述诱导的最佳时机为OD600nm＝8.0～10.0，IPTG诱导浓度为0.1～0.6mM。
3、切向流微滤回收蛋白包涵体的步骤：
利用切向流中空纤维膜柱或切向流膜包对大肠杆菌发酵液进行微滤，分别①浓缩料液收集菌体，②洗涤料液，去除残留培养基及细菌代谢物，③对菌体裂解后的包涵体进行回收。对两重组基因工程菌GV2B9，GV2B10发酵液的微滤处理及蛋白回收方法基本相同。主要操作步骤如下：
3.1 准备工作
按照切向流设备操作说明检查设备管路、压力表过滤夹具，对管路进行预冲洗和水通量测试。
3.2 发酵液微滤浓缩与滤洗(孔径为0.4～0.5μm的中空纤维膜柱或膜包)
3.2.1 发酵液微滤浓缩：分别以新鲜的发酵液，菌含量10～50g/L，作为料液A，采用孔径为0.4～0.5μm的中空纤维膜柱或膜包进行微滤浓缩，浓缩条件如下：温度4～25℃，起始跨膜压0.1～0.2bar，菌体浓缩过程中跨膜压不超过0.4bar；采用滤出液控制方式，对料液进行10倍浓缩；
3.2.2 菌体滤洗：分别向浓缩后的料液中泵入2倍体积PBS溶液，作为料液B，进行滤洗操作；混匀料液B，在搅拌条件下对菌体进行滤洗，滤洗条件如下：温度4～25℃，滤洗时跨膜压在0.1～0.4bar，采用等体积置换液方式，置换量为6～8倍料液B体积；滤洗结束，按照步骤3.2.1的浓缩方法对滤洗液再次微滤浓缩至原体积。所述PBS溶液的配方如下：137mM NaCl，2.68mM KCl，22.7mM Na2HPO4·12H2O，7.35mM KH2PO4，针对GCRV II S9重组标记蛋白工程菌处理时，PBS溶液的pH值7.5～8.3；针对GCRV II S10重组标记蛋白工程菌处理时，PBS溶液的pH值5.5～6.5。
3.3 破菌与蛋白包涵体回收
3.3.1 破菌：
分别将高浓度的菌体中加入等体积PBSTU溶液，搅拌混匀，泵入高压菌体裂解机的储料罐，工作温度≤8℃，裂解压力400～800bar，循环破碎3次，最后一次菌体裂解液，为料液C，接流至无菌容器内；
3.3.2 菌体蛋白滤洗、浓缩与包涵体蛋白回收(孔径为0.1～0.2μm的中空纤维膜柱或膜包)
分别向料液C中加入等体积PBS溶液，室温下搅拌清洗2～6h；采用孔径为0.1～0.2μm的中空纤维膜柱或膜包进行滤洗、浓缩，采用等体积置换液方式对回收的菌体蛋白滤洗，条件温度4～25℃，跨膜压在0.2～0.4bar，置换量为3～6倍料液C的体积；滤洗结束，对滤洗液进行3倍浓缩，浓缩过程中跨膜压不超过0.4bar；然后在转速为6000rpm条件下离心15分钟，收集洗滤液中沉淀，为料液D，即为rGCRV2 S9和rGCRV2 S10包涵体，分装后-20℃保存。
4、rGCRV2 S9和rGCRV2 S10蛋白变性与连续复性
4.1 rGCRV2 S9蛋白变性溶解与连续复性
4.1.1 rGCRV2 S9蛋白变性溶解：
取新鲜制备或-20℃保存的rGCRV2 S9包涵体，溶解于5～10倍体积(m/V)的含盐酸胍4-7M的TBSG溶液[TBSG的配方：20～100mM Tris.cl，30～100mM NaCl，50～150mM 2-ME，5～7M GdnHCl(盐酸胍)，pH 10.0～11.0]中，25℃或室温，振荡1～3h；4℃，8000rpm，离心15min；取上清，弃沉淀；利用TBS溶液(TBS的配方：20～100mM Tris.cl，30～100mM NaCl，50～150mM 2-ME，pH 10.0～11.0)将溶液稀释至含盐酸胍4M；利用比色法或蛋白定量试剂盒测定上清中总蛋白浓度，用含有4M盐酸胍的TBS溶液将蛋白稀释至20～200μg/mL，采用真空过滤泵对溶液进行除菌处理，滤液接流至无菌罐内，以此作为料液X1；
4.1.2 rGCRV2 S9蛋白连续复性：
采用15～25Kd中空纤维膜柱或膜包进行溶液置换，去除溶液中盐酸胍；采用恒体积透析模式对溶解在含4M盐酸胍TBS溶液中的蛋白进行溶液置换与蛋白复性，置换液或复性液均为pH 5～6的PBS溶液；条件温度2～8℃，跨膜压TMP＝4.0～5.3psi，剪切力Shear＝3500～3800S-1，置换量为8～12倍料液X1体积，收集洗滤溶液，2～8℃放置12～16h后，即为rGCRV2 S9复性蛋白。
应用免疫学试验验证rGCRV2 S9生物学活性，内毒素等，对重组蛋白进行定量、分装和保存。
4.2 rGCRV2 S10蛋白变性溶解与连续复性
4.2.1 rGCRV2 S10蛋白变性溶解
取新鲜制备或-20℃保存的rGCRV2 S10包涵体，溶解于8～10倍体积的含6～8M尿素的TBSU溶液[TBSU的配方：20～100mM Tris.cl，30～100mM NaCl，50～150mM 2-ME，6～8MUREA(尿素)，pH 9.3～11.0]中，25℃或室温，振荡1～2h；4℃，10000rpm，离心15min；取上清，弃沉淀；利用TBS溶液将溶液稀释至含尿素5M；利用比色法或蛋白定量试剂盒测定上清中总蛋白浓度，用含有5M尿素的TBS溶液(TBS的配方：20～100mM Tris.cl，30～100mMNaCl，50～150mM 2-ME，pH 9.3～11.0)将蛋白稀释至20～400μg/mL，采用真空过滤泵对溶液进行除菌处理，滤液接流至无菌罐内，以此作为料液Y1；
4.2.2 rGCRV2 S10蛋白连续复性
采用10～15Kd中空纤维膜柱或膜包进行溶液置换，去除溶液中尿素变性剂；采用恒体积透析模式对溶解在含5M尿素的TBS溶液中的变性蛋白进行溶液置换与蛋白复性，置换液或复性液均为pH 8～9.5的PBS溶液；条件温度2～8℃，跨膜压TMP＝4.0～7.0psi，剪切力Shear＝3500～3850S-1，置换量为8～12倍料液Y1体积，收集洗滤溶液，2～8℃放置8～12h后，即为rGCRV2 S10复性蛋白。
应用免疫学试验验证rGCRV2 S10生物学活性，内毒素等，对重组蛋白进行定量、分装和保存。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
实施例1 一种草鱼呼肠孤病毒II型S9重组蛋白规模化的制备工艺，包括，
1、重组标记蛋白工程菌构建的步骤：构建表达GCRV II S9重组蛋白，为GV2B9；
具体构建方法如下：对草鱼肠孤病毒II型病毒基因组中S9编码蛋白进行生物信息学分析，以GCRV II型病毒S9氨基酸序列作为参考序列(Genebank登陆号ADT79740)，分别对编码蛋白的密码子进行优化并人工合成基因序列GCRV II opti-S9，将合成的基因片段分别通过NdeI/Xho I和BamH I/XhoI内切酶插入原核表达载体PET21b；GCRV S9表达序列ORF3’端融合6个组氨酸编码序列；合成序列经测序验证，分别转化大肠杆菌表达菌感受态细胞BL21(DE3)；利用IPTG进行小量诱导，收集大肠杆菌，利用SDS-PAGE及Western Blot验证菌体裂解物中目的蛋白表达情况；得到表达GCRV II S9重组标记蛋白工程菌为：GCRV IIopti-S9/BL21(DE3)，缩写：GV2B9；成功构建的表达菌扩大培养后冻干保存。其中，所述GCRVII opti-S9的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2、重组基因工程菌高密度发酵的步骤：复苏基因工程菌GV2B9，进行培养特性、蛋白表达及纯粹性检验；根据发酵罐装量制备适宜体积种子菌；分别在发酵罐内加入培养基，通入气体，接种种子菌，边搅拌边补液；发酵过程中，每隔1h无菌取样，检测菌液OD600nm数值变化，当OD600nm超过8时，停止补液，加入IPTG进行诱导，诱导时长为5h；按照以上方法进行发酵，发酵总时长不超过10小时，得到GV2B9发酵液；
其中，所述种子菌活菌数≥1.0×109CFU；所述培养基的总量为发酵罐总体积的55％，设置通气量为10L/min，种子菌接的种量为培养基体积的5.0％，接种后菌液OD600nm为0.5；所述搅拌转速为400rpm；一次性连续补液，补液量与培养基总体积不超过发酵罐体积的60％；所述诱导的最佳时机为OD600nm＝9.0，IPTG诱导浓度为0.4mM。
3、切向流微滤回收蛋白包涵体的步骤：
利用切向流中空纤维膜柱或切向流膜包对大肠杆菌发酵液进行微滤，分别①浓缩料液收集菌体，②洗涤料液，去除残留培养基及细菌代谢物，③对菌体裂解后的包涵体进行回收。主要操作步骤如下：
3.1 准备工作
按照切向流设备操作说明检查设备管路、压力表过滤夹具，对管路进行预冲洗和水通量测试。
3.2 发酵液微滤浓缩与滤洗(孔径为0.45μm的中空纤维膜柱或膜包)
3.2.1 发酵液微滤浓缩：分别以新鲜的发酵液，菌含量35g/L，作为料液A，采用孔径为0.45μm的中空纤维膜柱或膜包进行微滤浓缩，浓缩条件如下：温度18℃，起始跨膜压0.15bar，菌体浓缩过程中跨膜压不超过0.4bar；采用滤出液控制方式，对料液进行10倍浓缩；
3.2.2 菌体滤洗：分别向浓缩后的料液中泵入2倍体积PBS溶液，作为料液B，进行滤洗操作；混匀料液B，在搅拌条件下对菌体进行滤洗，滤洗条件如下：温度18℃，滤洗时跨膜压在0.2bar，采用等体积置换液方式，置换量为7倍料液B体积；滤洗结束，按照步骤3.2.1的浓缩方法对滤洗液再次微滤浓缩至原体积。所述PBS溶液的配方如下：137m M NaCl，2.68mM KCl，22.7mM Na2HPO4·12H2O，7.35mM KH2PO4，GCRV II S9重组标记蛋白工程菌处理时，PBS溶液的pH值8.0。
3.3 破菌与蛋白包涵体回收
3.3.1 破菌：
分别将高浓度的菌体中加入等体积PBSTU溶液，搅拌混匀，泵入高压菌体裂解机的储料罐，工作温度≤8℃，裂解压力600-bar，循环破碎3次，最后一次菌体裂解液，为料液C，接流至无菌容器内；
3.3.2 菌体蛋白滤洗、浓缩与包涵体蛋白回收(孔径为0.15μm的中空纤维膜柱或膜包)
分别向料液C中加入等体积PBS溶液，室温下搅拌清洗4h；采用孔径为0.15μm的中空纤维膜柱或膜包进行滤洗、浓缩，采用等体积置换液方式对回收的菌体蛋白滤洗，条件温度18℃，跨膜压在0.3bar，置换量为5倍料液C的体积；滤洗结束，对滤洗液进行3倍浓缩，浓缩过程中跨膜压不超过0.4bar；然后在转速为6000rpm条件下离心15分钟，收集洗滤液中沉淀，为料液D，即为rGCRV2S9包涵体，分装后-20℃保存。
4.rGCRV2 S9蛋白变性溶解与连续复性
4.1 rGCRV2 S9蛋白变性溶解：
取新鲜制备或-20℃保存的rGCRV2 S9包涵体，溶解于8倍体积(m/V)的含盐酸胍6M的TBSG溶液[TBSG的配方：60mM Tris.cl，65mM NaCl，100mM 2-ME，6M GdnHCl(盐酸胍)，pH10.5]中，25℃或室温，振荡2h；4℃，8000rpm，离心15min；取上清，弃沉淀；利用TBS溶液(TBS的配方：75mM Tris.cl，75mM NaCl，100mM 2-ME，pH 10.5)将溶液稀释至含盐酸胍4M；利用比色法或蛋白定量试剂盒测定上清中总蛋白浓度，用含有4M盐酸胍的TBS溶液将蛋白稀释至150μg/mL，采用真空过滤泵对溶液进行除菌处理，滤液接流至无菌罐内，以此作为料液X1；
4.2 rGCRV2 S9蛋白连续复性：
采用20Kd中空纤维膜柱或膜包进行溶液置换，去除溶液中盐酸胍；采用恒体积透析模式对溶解在含4M盐酸胍TBS溶液中的蛋白进行溶液置换与蛋白复性，置换液或复性液均为pH 5～6的PBS溶液；条件温度2～8℃，跨膜压TMP＝4.7psi，剪切力Shear＝3600S-1，置换量为10倍料液X1体积，收集洗滤溶液，2～8℃放置14h后，即为rGCRV2 S9复性蛋白。
应用免疫学试验验证rGCRV2 S9生物学活性，内毒素等，对重组蛋白进行定量、分装和保存。
实施例2 一种草鱼呼肠孤病毒II型S10重组蛋白规模化的制备工艺，包括，
1、重组标记蛋白工程菌构建的步骤：构建表达GCRV II S10重组蛋白的基因工程菌，为GV2B10；
具体构建方法如下：对草鱼肠孤病毒II型病毒基因组中S10编码蛋白进行生物信息学分析，以GCRV II型病毒S10氨基酸序列作为参考序列(Genebank登陆号为ADT79741)，分别对编码两蛋白的密码子进行优化并人工合成基因序列GCRV II opti-S10，将两合成的基因片段分别通过NdeI/Xho I和BamH I/XhoI内切酶插入原核表达载体PET21b；GCRV S10表达序列ORF 5’端融合T7短肽编码序列；合成序列经测序验证，分别转化大肠杆菌表达菌感受态细胞BL21(DE3)；利用IPTG进行小量诱导，收集大肠杆菌，利用SDS-PAGE及WesternBlot验证菌体裂解物中目的蛋白表达情况；得到表达GCRV II S10重组标记蛋白工程菌为：GCRV II opti-S10/BL21(DE3)，缩写：GV2B10；成功构建的表达菌扩大培养后冻干保存。其中，所述GCRV II opti-S10的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
2、重组基因工程菌高密度发酵的步骤：复苏基因工程菌GV2B10，进行培养特性、蛋白表达及纯粹性检验；分别根据发酵罐装量制备适宜体积种子菌；分别在发酵罐内加入培养基，通入气体，接种种子菌，边搅拌边补液；发酵过程中，每隔1h无菌取样，检测菌液OD600nm数值变化，当OD600nm超过8时，停止补液，加入IPTG进行诱导，诱导时长为5h；按照以上方法进行发酵，发酵总时长不超过10小时，得到GV2B9发酵液和GV2B10发酵液；
其中，所述种子菌活菌数≥1.0×109CFU；所述培养基的总量为发酵罐总体积的55％，设置通气量为10L/min，种子菌接的种量为培养基体积的5.0％，接种后菌液OD600nm为0.5；所述搅拌转速为420rpm；一次性连续补液，补液量与培养基总体积不超过发酵罐体积的60％；所述诱导的最佳时机为OD600nm＝9.0，IPTG诱导浓度为0.4mM。
3、切向流微滤回收蛋白包涵体的步骤：
利用切向流中空纤维膜柱或切向流膜包对大肠杆菌发酵液进行微滤，分别①浓缩料液收集菌体，②洗涤料液，去除残留培养基及细菌代谢物，③对菌体裂解后的包涵体进行回收。主要操作步骤如下：
3.1 准备工作
按照切向流设备操作说明检查设备管路、压力表过滤夹具，对管路进行预冲洗和水通量测试。
3.2 发酵液微滤浓缩与滤洗(孔径为0.45μm的中空纤维膜柱或膜包)
3.2.1 发酵液微滤浓缩：分别以新鲜的发酵液，菌含量10～50g/L，作为料液A，采用孔径为0.45μm的中空纤维膜柱或膜包进行微滤浓缩，浓缩条件如下：温度18℃，起始跨膜压0.15bar，菌体浓缩过程中跨膜压不超过0.4bar；采用滤出液控制方式，对料液进行10倍浓缩；
3.2.2 菌体滤洗：分别向浓缩后的料液中泵入2倍体积PBS溶液，作为料液B，进行滤洗操作；混匀料液B，在搅拌条件下对菌体进行滤洗，滤洗条件如下：温度18℃，滤洗时跨膜压在0.3bar，采用等体积置换液方式，置换量为7倍料液B体积；滤洗结束，按照步骤3.2.1的浓缩方法对滤洗液再次微滤浓缩至原体积。所述PBS溶液的配方如下：137m M NaCl，2.68mM KCl，22.7mM Na2HPO4·12H2O，7.35mM KH2PO4，针对GCRV II S10重组标记蛋白工程菌处理时，PBS溶液的pH值6.0。
3.3 破菌与蛋白包涵体回收
3.3.1 破菌：
分别将高浓度的菌体中加入等体积PBSTU溶液，搅拌混匀，泵入高压菌体裂解机的储料罐，工作温度≤8℃，裂解压力600bar，循环破碎3次，最后一次菌体裂解液，为料液C，接流至无菌容器内；
3.3.2 菌体蛋白滤洗、浓缩与包涵体蛋白回收(孔径为0.15μm的中空纤维膜柱或膜包)
分别向料液C中加入等体积PBS溶液，室温下搅拌清洗4h；采用孔径为0.15μm的中空纤维膜柱或膜包进行滤洗、浓缩，采用等体积置换液方式对回收的菌体蛋白滤洗，条件温度18℃，跨膜压在0.3bar，置换量为4.5倍料液C的体积；滤洗结束，对滤洗液进行3倍浓缩，浓缩过程中跨膜压不超过0.4bar；然后在转速为6000rpm条件下离心15分钟，收集洗滤液中沉淀，为料液D，即为rGCRV2 S10包涵体，分装后-20℃保存。
4、rGCRV2 S10蛋白变性与连续复性
4.1 rGCRV2 S10蛋白变性溶解
取新鲜制备或-20℃保存的rGCRV2 S10包涵体，溶解于9倍体积的含7M尿素的TBSU溶液[TBSU的配方：45mM Tris.cl，55mM NaCl，100mM 2-ME，7M UREA(尿素)，pH 10.1]中，25℃或室温，振荡1.5h；4℃，10000rpm，离心15min；取上清，弃沉淀；利用TBS溶液将溶液稀释至含尿素5M；利用比色法或蛋白定量试剂盒测定上清中总蛋白浓度，用含有5M尿素的TBS溶液(TBS的配方：60mM Tris.cl，55mM NaCl，100mM 2-ME，pH 10.1)将蛋白稀释至255μg/mL，采用真空过滤泵对溶液进行除菌处理，滤液接流至无菌罐内，以此作为料液Y1；
4.2 rGCRV2 S10蛋白连续复性
采用13Kd中空纤维膜柱或膜包进行溶液置换，去除溶液中尿素变性剂；采用恒体积透析模式对溶解在含5M尿素的TBS溶液中的变性蛋白进行溶液置换与蛋白复性，置换液或复性液均为pH 8.9的PBS溶液；条件温度6℃，跨膜压TMP＝6.0psi，剪切力Shear＝3600S-1，置换量为10倍料液Y1体积，收集洗滤溶液，2-8℃放置10h后，即为rGCRV2 S10复性蛋白。
应用免疫学试验验证rGCRV2 S10生物学活性，内毒素等，对重组蛋白进行定量、分装和保存。
对比例1 采用亲和层析法制备rGCRV2 S9抗原。
rGCRV2 S9的亲和层析制备过程如下：
(1)重组基因工程菌GV2B9高密度发酵、切向流微滤回收蛋白包涵体、rGCRV2 S9蛋白变性溶解操作步骤与以上方法相同。
(2)亲和层析法纯化rGCRV2 S9：①取HisTrap HP预装柱，柱床体积为5ml；②用缓冲液平衡5个床体积，流速为1ml/min；③取10ml料液X1，0.45μm滤膜过滤后上样，流速为1ml/min；④用含低浓度咪唑(20-40mM)的缓冲液清洗10个床体积，流速为1ml/min；⑤用含高浓度咪唑(300-500mM)的缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰；⑥用纯水洗5个柱床体积，再用20％的乙醇洗5个柱床体积，流速为1ml/min。
(3)取洗脱峰回收样品，置于透析袋中，分别用含6M，4M，2M，1M和0M尿素的TBS进行梯度透析，每个浓度的透析时间为4-6小时，回收透析袋中溶液，即为rGCRV2 S9复性蛋白。
该亲和层析法制备抗原及进行工艺放大的成本较高，蛋白回收率低，工业化应用技术要求较高，蛋白大量制备难度大。
对比例2 采用分子筛层析法制备rGCRV2 S10抗原。
rGCRV2 S10的分子筛层析制备过程如下：
(1)重组基因工程菌GV2B10高密度发酵、切向流微滤回收蛋白包涵体、rGCRV2 S10蛋白变性溶解操作步骤与以上方法相同。.....
(2)层析法纯化rGCRV2 S10：①取Superose 6 increase预装柱，柱床体积为24ml；②用缓冲液平衡5个床体积，流速为1ml/min；③取10ml料液Y1，0.45μm滤膜过滤后上样，流速为1ml/min；④逐个收集洗脱峰；⑥用纯水洗5个柱床体积，再用20％的乙醇洗5个柱床体积，流速为1ml/min。
(3)取所有洗脱峰回收样品，用SDS-PAGE法检测目的蛋白回收峰。将目的蛋白回收液转移至透析袋中，分别用含6M，4M，2M，1M和0M尿素的TBS进行梯度透析，每个浓度的透析时间为4-6小时，回收透析袋中溶液，即为rGCRV2 S10蛋白。
采用该分子筛层析法制备抗原的纯度稍低，需组合不同类型层析柱进行进一步纯化，蛋白制备成本较高，难于用于水产制品领域原材料制备。
下面，对实施例1-2以及对比例1-2的制备得到的重组蛋白的纯度进行检测，以及成本进行计算，结果如表1。
表1 不同工艺对重组蛋白的纯度和成本的对比结果
纯度 成本
实施例1 89.3％ 0.05～0.1元/毫升
实施例2 84.2％ 0.05～0.1元/毫升
对比例1 93.7％ 2.0～3.0元/毫升
对比例2 75.1％ 3.0～5.0元/毫升
应用实施例1 S9重组蛋白在GCRV II血清抗体检测中的应用
采用ELISA法检测草鱼血清GCRV抗体，具体检测方法如下：
(1)重组蛋白定量与包被：分别以anti-His tag单抗和anti-GCRV S9多克隆抗体为捕获抗体和识别抗体，对实施例1制得的rGCRV2 S9进行准确定量。用8μg/mL rGCRV2 S9包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，4℃包被过夜；
(2)封闭：加入封闭液150μL/孔，37℃封闭1h；
(3)样本配制与孵育：将草鱼待检血清、阳性血清和阴性血清1:40，按100μL/孔加样，室温孵育60min；洗涤3次，拍干；
(4)加酶标抗体：于各反应孔，加入HRP-anti-IgM-Mab，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤3次，拍干；
(5)显色：加TMB显色液，100μL/孔，室温避光显色5-10min；
(6)终止：每孔加终止液100μL终止反应，终止后10min内读数，酶标仪OD450nm读数。
检测结果如下：
(1)试验有效性条件 如果(Pm－Nm)≥0.30，同时Nm≤0.15，则实验有效。(Pm：阳性对照OD450nm的平均值；Nm：阴性对照OD450nm的平均值)。如表1所示，试验结果，Pm为0.880，Nm为0.162，试验结果成立。
(2)结果判定 抗体的阳性或阴性通过计算Cut-off值(COV)进行判定。
COV＝Nm×2.1(阴性对照孔OD值＜0.08时按0.08计算)，样本OD450nm值≥COV值时，判定为抗体阳性(+)；否则为阴性。试验结果，Nm＝0.162，COV＝0.340，25份血清样本中，15分血清样本OD450nm平均值大于0.340，判断为GCRV抗体阳性。
表1 GCRV ELISA抗体检测OD450nm
编号 OD<sub>450nm</sub>均值 编号 OD<sub>450nm</sub>均值 编号 OD<sub>450nm</sub>均值
1 0.467 10 0.347 19 0.427
2 0.391 11 0.332 20 0.605
3 0.391 12 0.385 21 0.303
4 0.441 13 0.389 22 0.267
5 0.349 14 0.286 23 0.250
6 0.367 15 0.291 24 0.265
7 0.336 16 0.287 25 0.331
8 0.412 17 0.362 Pm 0.880
9 0.400 18 0.426 Nm 0.162
应用实施例2 重组蛋白联合使用配制GCRV II亚单位疫苗
1 疫苗配制方法(1)重组蛋白定量分别以anti-His tag单抗和anti-GCRV S9多克隆抗体为捕获抗体和识别抗体对实施例1制得的rGCRV2 S9进行准确定量。分别以anti-T7tag单抗和anti-GCRV S10多克隆抗体为捕获抗体和识别抗体对实施例2制得的rGCRV2 S10进行准确定量。(2)水剂疫苗配制取精确定量的rGCRV2 S9和rGCRV2 S10，分别用PBS调节浓度至200μg/mL，按照SEPPIC 201佐剂说明配制三种疫苗：①rGCRV S9浓度为100μg/mL的疫苗A；②rGCRV S10浓度为100μg/mL的疫苗B；和③rGCRV S9和rGCRV S10浓度分别为50μg/mL的疫苗C。2安全性试验
健康斑马鱼(Danio rerio)，体重0.6～1.0g，在消毒洁净的水族箱中饲养。取斑马鱼，分为4组，每组均25尾以上，分别用3种疫苗对斑马鱼超剂量接种，腹腔注射200μL/尾，空白对照组注射等量生理盐水。观察4周。
如表2所示，试验结果，与空白对照组相比，试验组死亡率无显著升高，日常观察鱼只活动、反应性和采食行为均正常，说明各疫苗性良好。
表2 三种疫苗的安全试验
Figure BDA0001533849550000241
3 免疫攻毒保护试验
健康草鱼，体重15～20g，在消毒洁净的水族箱中饲养。取暂养超过7天以上的草鱼，分为5组，每组均25尾以上，分5个水族箱隔离饲喂。分别用3种疫苗对G1-3组草鱼接种注射，腹腔注射500μL/尾，攻毒对照组(Ch)注射等量生理盐水；免疫2周后，用GCRV II强毒株进行攻毒，每尾鱼腹腔注射1.0×105TCID50mL-1。空白对照组不做任何处理。及时清除死亡的草鱼，跟踪并记录15天之内的草鱼死亡情况。
免疫攻毒试验结果如表3，与攻毒对照组相比，疫苗免疫组(G1-3组)对GCRV强毒有明显高的保护率，其中，应用两种蛋白联合配制的疫苗效果更为明显(与攻毒对照相比，使用rGCRV S9和rGCRV S10联合免疫，对草鱼的保护率提高56.14％)；此外，试验结果显示，两种重组蛋白联合免疫的效果较单独免疫的效果明显提高。
表3 三种疫苗的免疫攻毒试验
Figure BDA0001533849550000251
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
序列表
<110> 广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<120> 一种草鱼呼肠孤病毒II 型S9及S10重组蛋白规模化的制备工艺及应用
<130> 广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<141> 2017-12-29
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
gagcgtagca cttacaacat ctgcacgccg ggtttcttcg gtgctaacgt cccacctttc 60
aagacgatcg acatccagcg cagcaccacg ggtggtaaca cgctgtggaa cgcacgtggt 120
cacgatgcat tccgtaccta cccaaaggtc gtcagccacg agaaagactt ccctctgatc 180
tacaccgaac agttcacctt caacctgctg atcggtgcct tcctgcagca gccactgctg 240
cagaactcca tcgaccgcca gtggcgtggt atgatctgga ccagcgaccg tctgtcttct 300
ctgcgtatcg ctcctccaaa cagccgtgta gcagacctgc cgcgtgcata tcgtactctg 360
gatctggcaa actacccgct gtggggtact gctccggcag cactgcaaac tctgtggatg 420
gattcttgtc tgatgactct ggaatccctg tccgcacgtg gtccgtttct gtacctgcgt 480
cacccgcaag cacgtccgga tggtaatgta ctgcgtgctc tgcaacagca tatcagcaaa 540
ccgatggaag ctatcgtgag cgaagcctac cagtccatcg ctgtgggtcc gctgactctg 600
caggatggtt actaccgtgc tctgtccgtt attaccctga tctacctggc gtccctgact 660
ggccgtctgg gcccggatcg tacttattac ggcttctacg tgcagttccc gaaaaaacgc 720
aaattcgaag acctgggcta cttcgcctac aacgccgacg gccgtaacgt ggctgtgctg 780
cagtctatta acgcgtacat ctactgcgcc tccccggatt ggcagtattc ctgcgctctg 840
tattatctgc acgtgctgtc tgcgctgtct ctgtcttgga ccgacccggt tggcatgatt 900
gacggcttct cttgcgttaa ccagttcacc gacgttccgg gctggtttgc caccaaccgt 960
gctctgcaca ctcattcttt taactggttt aacctgctgg aagacgcgat tgacaccctg 1020
gttgcgcgcc gctattggac caacgcggtt ggccaggcga ttcgccagga atggaccgcg 1080
gcgcgtgatc gttggcgtgt aattatggac gcgacccgtg atgaagatga cctggtagtt 1140
tttcgcaccc cggatgactg tcgtcgccgc ctgaaaccgt atggcgataa taattggacc 1200
cgcgcgtatg acaccgcgga tgttgttcgc gtactggatc gcctgtttcc g 1251
<210> 2
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
gcaggtgtct ctctgaacat caaccgcaac atctccaact ccgcaagcac gatcttcctg 60
gaggacatcc ctctgctgtc ctgcagcgtc cgttgtgagc ctggtaaagg tcgtgagctg 120
ccaaagttca acatgtcctg cccagctatc aacgcaatgg gtcgttgcct gaacccaatg 180
aagttcatcg cggagcactg ggtcccgaac agcccgtctc gtaaaccgtc tcgtcaacac 240
tggcgtaacg tactgaacgg tctggaattc tccaacggtc gtggtttcga cgtgctgtct 300
ttctccccgg ctggtatggc tgttctgcgt gatatcctga cggaagactc tgtgaactac 360
tgcttcgacg aatccaacac ctgcagcctg ttcaccctgc tgtacaccct gtgctgcgac 420
gcagcaggtg ttgaaccgat ggacctggat tctcgtcaaa ccgacgcatc tgcacgtatg 480
gtgtcttacc aggaccgtgc tatcgtgctg acctctaacg aagctggcga ccgtatcgaa 540
ccgtggaacg tagaactgga caaagaattc ggcaacccgg acctgctgtc tcgtctgaac 600
atctcctacg gtgtgcagcg ttacggcgat tctaaagcct ccaccgacac cctgactctg 660
gctgatgctc cggaacgttc taaaccggct ctgattaccg ttcagccgct gctggttgcc 720
atgtgtatca aacagtccct ggatggcctg ctggcgctga gcgatctgcg tctgcgtttt 780
gatcagtatc cgggctatgc caatgcgctg atgaatgcga tggcgatgta tgcgtgtctg 840
gatcgcgatc tgatgcgctt tctgctgcgc ctggaaatga ctcatgccag cactgttagc 900
gaagtagcgg aatgttggcg taatagccgc aatagccgcg atgcgactgg ctgtcacatt 960
gttccgcgcc agggcctgct gattattgtt agcggcgatg ttgaagtacg ccgcattttt 1020
gcgcagatgc tg 1032

Claims (5)

1.一种草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白在制备GCRV II亚单位疫苗中的应用，其特征在于，GCRV II亚单位疫苗由草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10两种重组蛋白联合配制而成，草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白的制备工艺，包括以下步骤：
重组标记蛋白工程菌构建的步骤：分别构建表达GCRV II S9重组蛋白和GCRV II S10重组蛋白的基因工程菌，分别为GV2B9和GV2B10；其中， GCRV II S9重组蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示；所述GCRV II S10重组蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示；
重组基因工程菌高密度发酵的步骤：分别复苏基因工程菌GV2B9和GV2B10，进行培养特性、蛋白表达及纯粹性检验；分别根据发酵罐装量制备适宜体积种子菌；分别在发酵罐内加入培养基，通入气体，接种种子菌，边搅拌边补液；发酵过程中，每隔1h无菌取样，检测菌液OD600数值变化，当OD600超过8时，停止补液，加入IPTG进行诱导，诱导时长为4~6h；按照以上方法进行发酵，发酵总时长不超过10小时，得到GV2B9和GV2B10发酵液；其中，所述种子菌活菌数≥1.0×109CFU；所述培养基的总量为发酵罐总体积的50%~55%，设置通气量为10L/min，种子菌接种量为培养基体积的3.0~8.0%，接种后菌液OD600=8.0~10.0，IPTG诱导浓度为0.1~0.6mM；
切向流微滤回收蛋白包涵体的步骤：分别采用孔径为0.4~0.5μm的中空纤维膜柱或膜包对发酵液进行微滤浓缩与滤洗，得到高浓度的菌体；然后分别利用物理法破碎菌体，采用孔径为0.1~0.2μm的中空纤维膜柱或膜包对破碎的菌体进行滤洗、浓缩，分别回收得到两种rGCRV2 S9和rGCRV2 S10包涵体，分装后-20℃保存；高浓度的菌体制备具体操作如下：（1）发酵液微滤浓缩：分别以新鲜的发酵液，菌含量10~50g/L，作为料液A，采用孔径为0.4~0.5μm的中空纤维膜柱或膜包对发酵液进行微滤浓缩，浓缩条件如下：温度4~25℃，起始跨膜压0.1~0.2bar，菌体浓缩过程中跨膜压不超过0.4bar；采用滤出液控制方法，对料液进行10倍浓缩；（2）菌体滤洗：分别向浓缩后的料液中泵入2倍体积PBS溶液作为料液B，进行滤洗操作；混匀料液B，在搅拌条件下对菌体进行滤洗，滤洗条件如下：温度4~25℃，滤洗时跨膜压在0.1~0.4bar，采用等体积置换液方法，置换量为6~8倍料液B体积；滤洗结束，按照步骤（1）浓缩方法对滤洗液再次微滤浓缩至原体积；
rGCRV2 S9和rGCRV2 S10蛋白变性与连续复性；先分别将rGCRV2 S9和rGCRV2 S10进行蛋白变性溶解，然后分别对rGCRV2 S9和rGCRV2 S10进行蛋白连续复性。
2.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白在制备GCRV II亚单位疫苗中的应用，其特征在于，在重组标记蛋白工程菌构建的步骤中，具体构建方法如下：对草鱼呼肠孤病毒II型S9和S10编码蛋白进行生物信息学分析，以GCRV II 型病毒S9和S10氨基酸序列作为参考序列，分别对编码两蛋白的密码子进行优化并人工合成基因序列GCRVII opti-S9和GCRV II opti-S10，即SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；将两合成的基因片段分别通过NdeI/Xho I和BamHI/XhoI内切酶插入原核表达载体PET21b；GCRV S9表达序列ORF3'端融合6个组氨酸编码序列；GCRV S10表达序列ORF 5'端融合T7短肽编码序列；合成序列经测序验证，分别转化大肠杆菌表达菌感受态细胞BL21DE3；利用IPTG进行小量诱导，收集大肠杆菌，利用SDS-PAGE及Western Blot验证菌体裂解物中目的蛋白表达情况；得到表达GCRV II S9重组标记蛋白工程菌为GV2B9；表达GCRV II S10重组标记蛋白工程菌为GV2B10；成功构建的表达菌扩大培养后冻干保存。
3.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白在制备GCRV II亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述PBS溶液的配方如下：137mM NaCl，2.68mM KCl，22.7mMNa2HPO4•12H2O，7.35mM KH2PO4，针对GCRV II S9重组标记蛋白工程菌处理时，PBS溶液的pH值7.5～8.3；针对GCRV II S10重组标记蛋白工程菌处理时，PBS溶液的pH值5.5~6.5。
4.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白在制备GCRV II亚单位疫苗中的应用，其特征在于，在rGCRV2 S9和rGCRV2 S10蛋白变性与连续复性中，rGCRV2 S9蛋白变性溶液与连续复性具体操作如下：（1）rGCRV2 S9蛋白变性溶解：取新鲜制备或-20℃保存的rGCRV2 S9包涵体，溶解于5~10倍体积的含4~7M盐酸胍的TBSG溶液中，25℃或室温，振荡1~3h；4℃，8000rpm，离心15min，取上清，弃沉淀；TBSG的配方：20～100mM Tris.cl，30～100mM NaCl，50～150mM 2-ME，5 ～7M GdnHCl，pH 10.0～11.0；利用TBS溶液将溶液稀释至含盐酸胍4M；利用比色法或蛋白定量试剂盒测定上清中总蛋白浓度，用含有4M盐酸胍的TBS溶液将蛋白稀释至20~200μm/mL，采用真空过滤泵对溶液进行除菌处理，滤液接流至无菌罐内，以此作为料液X1；（2）rGCRV2 S9蛋白连续复性：采用15~25Kd中空纤维膜柱或膜包进行溶液置换，去除溶液中盐酸胍；采用恒体积透析模式对溶解在含4M盐酸胍TBS溶液中的蛋白进行溶液置换与蛋白复性，置换溶或复性液均为pH5~6的PBS溶液；条件温度2~8℃，跨膜压TMP=4.0~5.3psi，剪切力Shear=3500~3800S-1，置换量为8~12倍料液X1体积，收集洗滤溶液，2~8℃放置12~16h后，即为rGCRV2 S9复性蛋白。
5.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒II型S9及S10重组蛋白在制备GCRV II亚单位疫苗中的应用，其特征在于，在rGCRV2 S9和rGCRV2 S10蛋白变性与连续复性中，rGCRV2S10蛋白变性溶解与连续复性具体操作如下：（1）rGCRV2 S10蛋白变性溶解；取新鲜制备或-20℃保存的rGCRV2 S10包涵体，溶解于8~10倍体积的含6~8M尿素的TBSU溶液中，25℃或室温，振荡1~2h；4℃，10000rpm，离心15min；取上清，弃沉淀；TBSU溶液的配方：20～100mMTris.cl，30～100mM NaCl，50～150mM 2-ME，6～8M UREA，pH 9.3～11.0；利用TBS溶液将溶液稀释含尿素5M；利用比色法或蛋白定量试剂盒测定上清中总蛋白浓度，用含有5M尿素的TBS溶液将蛋白稀释至20~400μm/mL，采用真空过滤泵对溶液进行除菌处理，滤液接流至无菌罐内，以此作为料液Y1；（2）rGCRV2 S10蛋白连续复性，采用10~15Kd中空纤维膜柱或膜包进行溶液置换，去除溶液中尿素变性剂，采用恒体积透析模式对溶解在含5M尿素的TBS溶液中的变性蛋白进行溶液置换与蛋白复性，置换液或复性液均为pH 8~9.5的PBS溶液；条件温度2~8℃，跨膜压TMP=4.0~7.0psi，剪切力Shear=3500~3850S-1，置换量为8~12倍料液Y1体积，收集洗滤溶液，2~8℃放置8~12h后，即为rGCRV2 S10复性蛋白。
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