CN107245477A - 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒 - Google Patents

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，包括猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：将编码Cap蛋白的PCV2‑ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2‑ORF2 DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；和Cap重组蛋白包涵体变性步骤；和溶液置换及蛋白复性步骤：采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换与蛋白复性；和病毒样颗粒组装和回收步骤：使用中空纤维膜或膜包，以PBS对回收溶液进行超滤，浓缩；制备方法中蛋白复性效率高，可将包涵体持续、大量地制备得到病毒样颗粒，适合工业化生产。

Description

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获 得的病毒样颗粒
技术领域
本发明涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒，属于生物培养技术领域。
背景技术
在猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗制备过程中，由PCV2-ORF2基因编码的Cap蛋白具有折叠为PCV2病毒样颗粒(VLP)的潜力而被作为PCV2亚单位疫苗抗原。在利用原核表达系统进行PCV2 Cap蛋白重组表达过程中，工业化条件下过表达的PCV2 Cap重组蛋白(rPCV2 Cap)未与促溶蛋白进行融合表达，常常在细胞中堆积，形成不溶的形式的颗粒包涵体(Inclusion Body，IB)；由IB形态的rPCV2 Cap复性至蛋白天然构象或VLP具有较高的难度。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，蛋白复性效率高，以切向流超滤的方式，可将包涵体持续、大量地制备得到病毒样颗粒，适合工业化生产。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，包括，
猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：
将编码Cap蛋白的PCV2-ORF2基因全长DNA(序列如SEQ ID NO.1所示)或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽(41个氨基酸残基)碱基序列的PCV2-ORF2 DNA片段(序列如SEQ IDNO.2所示)插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；Cap重组蛋白以包涵体形式存在细胞质中，破碎细胞取沉淀，然后对沉淀中的包涵体进行纯化；
Cap重组蛋白包涵体变性步骤：
在4℃的条件下，将包涵体溶解于Buffer-S0中，4℃离心，取第一上清液；在0-4℃的条件下，将第一上清液加至Buffer-S1中，充分混合后有蛋白析出，4℃离心取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于Buffer-S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后离心取第二上清液；测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer-S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为20-400μg/mL，得到变性蛋白溶液；
溶液置换及蛋白复性步骤：
在切向流超滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性；以Buffer-RF作为置换液，超滤过程中，中空纤维膜或膜包的孔径为5-8KD；超滤参数为：跨膜压TMP＝4.0-7.0psi，膜通量1.572±0.756LMH，剪切力Shear＝3727-3773S-1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；
病毒样颗粒组装和回收步骤：
在2-8℃条件下，将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，然后在2-8℃条件下静置6-18h，得到回收溶液；切向流超滤系统中，使用孔径为50KD的中空纤维膜或膜包，以PBS作为置换液对回收溶液进行超滤，浓缩；超滤参数为：跨膜压TMP＝8-13psi，膜通量21.631±4.366LMH，剪切力Shear＝3019-3098S-1，收集二次超滤溶液，离心取沉淀，得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒。
进一步地，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤中，对包涵体进行纯化为使用含有2mol/L尿素的缓冲液对沉淀进行洗涤，用质量分数2％的Triton X-100溶液去除包涵体中的膜碎片和膜蛋白。
进一步地，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，Buffer-S0包括20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，5-7M盐酸胍，pH为11.5-12.5。
进一步地，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，Buffer-S1包括20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，pH为8-9。
进一步地，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，第一上清液与Buffer-S1的体积比为1:5-20。
进一步地，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，Buffer-S2包括20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，6-8M尿素，pH为11.5-12.5。
进一步地，溶液置换及蛋白复性步骤中，Buffer-RF包括20-80mM Tris-Cl，80-200mM NaCl，0.5-2mM EDTA，1-10mM 2-ME，5-10％甘油，3-8％PEG4000，100-300mM L-精氨酸，0.1-0.5％Triton-X100，pH为5.5-6.5。
进一步地，病毒样颗粒组装和回收步骤中，利用蠕动泵，泵速20～50mL/min条件下将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，一次超滤溶液和Buffer-AS的体积比为1:15-25。
进一步地，病毒样颗粒组装和回收步骤中，Buffer-AS包括100-300mM柠檬酸铵，2-3％异丙醇，4-8％PEG 4000，pH 5-6。
本发明的第二个目的在于提供一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒，通过上述的方法制备得到。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的制备方法中，通过针对性地设计试剂，并配合制备步骤，在溶液置换及蛋白复性步骤中以中空纤维膜或膜包除去小分子量杂蛋白，病毒样颗粒组装和回收步骤中利用中空纤维膜或膜包除去未折叠为病毒样颗粒的杂蛋白，使得PCV2 Cap重组蛋白原材料无需与亲和层析去除标签蛋白或促溶融合蛋白融合表达；
2、本发明的制备方法中，蛋白复性效率高，并能稳定折叠形成PCV2 VLP；
3、本发明的制备方法中，利用切向流超滤的方式对PCV2 VLP进行收集，回收率较高；
4、本发明的制备方法中，将中空纤维膜或膜包串联，通过本发明可实现将包涵体大量、连续地制备病毒样颗粒，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例1电泳图；
图2为实施例1透射电镜图；
图3为实施例2电泳图；
图4为实施例2透射电镜图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
1、准备材料：
配制溶液：
Buffer-S0：20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，5-7M盐酸胍，pH为11.5-12.5。
Buffer-S1：20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，pH为8-9。
Buffer-S2：20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，6-8M尿素，pH为11.5-12.5。
Buffer-RF：20-80mM Tris-Cl，80-200mM NaCl，0.5-2mM EDTA，1-10mM 2-ME，5-10％甘油，3-8％PEG4000，100-300mM L-精氨酸，0.1-0.5％Triton-X100，pH为5.5-6.5。
Buffer-AS：100-300mM柠檬酸铵，2-3％异丙醇，4-8％PEG 4000，pH 5-6。
对中空纤维膜或膜包进行预清洗和膜润湿、标准水透过率(NWP)测定、完整性测试。
2、一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，包括，
猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：
将编码Cap蛋白的PCV2-ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2-ORF2 DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；Cap重组蛋白以包涵体形式存在细胞质中，破碎细胞取沉淀，然后使用含有2mol/L尿素的缓冲液对沉淀进行洗涤，用质量分数2％的Triton X-100溶液去除包涵体中的膜碎片和膜蛋白，得到包涵体，包涵体的纯度为84.5％。
Cap重组蛋白包涵体变性步骤：
在4℃的条件下，将包涵体溶解于10倍体积(m/V)的Buffer-S0中，4℃离心，取第一上清液；在0-4℃的条件下，将第一上清液加至5-20倍体积(m/V)的Buffer-S1中，充分混合后有蛋白析出，4℃离心取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于100倍体积的Buffer-S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后离心取第二上清液；测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer-S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为20-400μg/mL，得到变性蛋白溶液；
溶液置换及蛋白复性步骤：
在切向流超滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性；以Buffer-RF作为置换液，超滤过程中，聚醚砜中空纤维膜或膜包的孔径为5-8KD(蛋白分子量的1/5-1/3大小)；超滤参数为：跨膜压TMP＝4.0-7.0psi，膜通量1.572±0.756LMH，剪切力Shear＝3727-3773S-1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；
病毒样颗粒组装和回收步骤：
在2-8℃条件下，利用蠕动泵，泵速20～50mL/min条件下将一次超滤溶液加至15-25倍体积的Buffer-AS中，然后在2-8℃条件下静置6-18h，得到回收溶液；切向流超滤系统中，孔径为50KD的聚醚砜中空纤维膜或膜包，以PBS作为置换液对回收溶液进行超滤，浓缩；超滤参数为：跨膜压TMP＝8-13psi，膜通量21.631±4.366LMH，剪切力Shear＝3019-3098S-1，收集二次超滤溶液，对二次超滤溶液进行蔗糖密度梯度离心，取沉淀，得到经纯化的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，进行电镜分析。
实施例1
配制溶液：
Buffer-S0：60mM Tris-Cl，100mM NaCl，150mM 2-ME，7M盐酸胍，pH为12.4。
Buffer-S1：50mM Tris-Cl，50mM NaCl，100mM 2-ME，pH为9.3。
Buffer-S2：60mM Tris-Cl，100mM NaCl，150mM 2-ME，8M尿素，pH为12.1。
Buffer-RF：60mM Tris-Cl，150mM NaCl，0.5mM EDTA，2mM 2-ME，5％甘油，6％PEG4000，100mM L-精氨酸，0.1％Triton-X100，pH为5.9。
Buffer-AS：200mM柠檬酸铵，2％异丙醇，7％PEG 4000，pH 5.5。
PBS：8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4·12H2O,0.24g KH2PO4，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调pH值至6.5，加水定容至1L。
本实施例使用的设备如下：
设备：SPECTRUM KMPi切向流过滤系统(SYM3-U20-A)
膜组件：SPECTRUM MicroKros中空纤维过滤柱：5Kda、50KDa，改性聚醚砜(mPES)，235cm2。
详细步骤如下：
Cap重组蛋白包涵体变性步骤：
按具体实施方式中猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤，制备Cap重组蛋白包涵体；
取1g重组蛋白包涵体，在4℃的条件下，将包涵体溶解于10mL Buffer-S0中，处理1h后，4℃12000rpm离心15min，取第一上清液；在0-4℃的条件下，将10mL第一上清液快速滴加至100mL的Buffer-S1中，搅拌静置30min，有蛋白析出，4℃8000rpm离心15min取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于150mL Buffer-S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后4℃12000rpm离心15min取第二上清液；BCA蛋白定量试剂盒测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer-S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为80μg/mL，得到变性蛋白溶液；
溶液置换及蛋白复性步骤：
SPECTRUM KMPi切向流过滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性，Buffer-RF作为置换液，使用孔径5KD的聚醚砜中空纤维膜进行超滤，超滤参数为：泵速100mL/min，平均Shear＝3745±15S-1，跨膜压TMP＝4.5psi，膜通量1.632LMH，剪切力Shear＝3727-3773S-1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；；一次超滤溶液被浓缩至170mL，用30mL缓冲液冲洗管道，最终收集一次超滤溶液共200mL；
病毒样颗粒组装和回收步骤：
在2-8℃条件下，利用蠕动泵，泵速25mL/min条件下将一次超滤溶液缓慢滴加至20倍体积的Buffer-AS中，然后在4℃条件下静置6h，得到回收溶液；使用孔径为50KD的聚醚砜中空纤维膜，用1000mL PBS作为置换液对200mL回收溶液进行超滤，超滤参数为：泵速200mL/min，跨膜压TMP＝10psi，膜通量22.431±3.756LMH，剪切力Shear＝3047S-1，得到二次超滤溶液25mL，用15mL缓冲液冲洗管道残留，最终收集40mL二次超滤溶液，对二次超滤溶液进行蔗糖密度梯度离心，取沉淀，得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒。
检测与评价：
1、SDS-PAGE电泳和PCV2 VLP透射电镜检测：
电泳图如图1所示，可看出约25KDa的条带，应用透射电镜观察浓缩、纯化的滤液，电镜下，可见大量球状、直径在15-20nm的病毒粒子，如图2所示，粒子大小与PCV2病毒粒径(17nm)一致。
2、参数分析：
按制备方法中的试剂倍量增加100倍，体积20L，8倍超滤，平均过滤速度1.632LMH，工艺时间按10.5h计算：所需中空纤维膜面积：20×8÷1.632÷10.5＝9.3㎡。即，在优化参数条件下，选择9.3㎡中空纤维柱，在相同时间内可完成20L蛋白液复性工艺；
病毒样颗粒回收：同样，按制备方法中的增加100倍，体积20L，5倍超滤，平均过滤速度22.431LMH，工艺时间按1.4h计算：所需中空纤维膜面积：20×5÷22.431÷1.4＝3.2㎡。即，在优化参数条件下，选择3.2㎡中空纤维柱，在相同时间内可完成20L复性蛋白中病毒样颗粒回收；
利用蛋白定量试剂盒分析，蛋白回收率为47.9％。
实施例2
配制溶液：
Buffer-S0：80mM Tris-Cl，50mM NaCl，150mM 2-ME，6M盐酸胍，pH为11.8。
Buffer-S1：80mM Tris-Cl，100mM NaCl，50mM 2-ME，pH为9.0。
Buffer-S2：80mM Tris-Cl，50mM NaCl，150mM 2-ME，6M尿素，pH为12.5。
Buffer-RF：80mM Tris-Cl，200mM NaCl，1mM EDTA，10mM 2-ME，10％甘油，3％PEG4000，200mM L-精氨酸，0.4％Triton-X100，pH为6.1。
Buffer-AS：250mM柠檬酸铵，2.8％异丙醇，6％PEG 4000，pH 5.8。
PBS：8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4·12H2O,0.24g KH2PO4，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调pH值至6.5，加水定容至1L。
本实施例使用的设备如下：
设备：Sartocon Slice 200切向流超滤仪
膜组件：超滤膜包、材质Hydrosart，孔径5kDa、50kDa、面积200cm2。
详细步骤如下：
Cap蛋白包涵体变性步骤：
按具体实施方式中猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤，制备Cap重组蛋白包涵体；
取1g重组蛋白包涵体，在4℃的条件下，将包涵体溶解于10mL Buffer-S0中，处理1.2h后，4℃12000rpm离心15min，取第一上清液；在0-4℃的条件下，将10mL第一上清液快速滴加至100mL的Buffer-S1中，搅拌静置30min，有蛋白析出，4℃8000rpm离心15min取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于50mL Buffer-S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后4℃12000rpm离心15min取第二上清液；BCA蛋白定量试剂盒测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer-S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为370μg/mL，得到变性蛋白溶液；
溶液置换及蛋白复性步骤：
Sartocon Slice 200切向流超滤仪中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性，Buffer-RF作为置换液，使用孔径5KD的Hydrosart膜包进行超滤，超滤参数为：泵速100mL/min，跨膜压TMP＝4.5psi，膜通量1.489LMH，剪切力Shear＝3727-3773S-1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；一次超滤溶液被浓缩至170mL，用30mL缓冲液冲洗管道，最终收集一次超滤溶液共200mL；
病毒样颗粒组装和回收步骤：
在2-8℃条件下，利用蠕动泵，泵速25mL/min条件下将一次超滤溶液缓慢滴加至25倍体积的Buffer-AS中，然后在4℃条件下静置6h，得到回收溶液；使用孔径为50KD的Hydrosart膜包，用1000mL PBS作为置换液对200mL回收溶液进行超滤，超滤参数为：泵速200mL/min，跨膜压TMP＝12psi，膜通量20.154±5.312LMH，剪切力Shear＝3047S-1，得到二次超滤溶液25mL，用15mL缓冲液冲洗管道残留，最终收集40mL二次超滤溶液，对二次超滤溶液进行蔗糖密度梯度离心，取沉淀，得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒。
检测与评价：
1、SDS-PAGE电泳和PCV2 VLP透射电镜检测：
电泳图如图3所示，可看出约25KDa的条带，应用透射电镜观察浓缩、纯化的滤液，电镜下，可见大量球状、直径在15-20nm的病毒粒子，如图4所示，粒子大小与PCV2病毒粒径(17nm)一致。
2、参数分析：
按制备方法中的试剂倍量增加100倍，体积20L，8倍超滤，平均过滤速度1.489LMH，工艺时间按11.8h计算：所需中空纤维膜面积：20×8÷1.489÷11.8＝9.1㎡。即，在优化参数条件下，选择9.1㎡左右超滤膜包，在相同时间内可完成20L蛋白液复性工艺；
病毒样颗粒回收：同样，按制备方法中的增加100倍，体积20L，5倍超滤，平均过滤速度20.154LMH，工艺时间按1.7h计算：所需中空纤维膜面积：0×5÷20.154÷1.7＝2.92㎡。即，在优化参数条件下，选择2.92㎡中空纤维柱，在相同时间内可完成20L复性蛋白中病毒样颗粒回收；
利用蛋白定量试剂盒分析，蛋白回收率为42.6％。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
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Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225 230
<210> 2
<211> 192
<212> PRT
<213> PCV2 Cap氨基酸
<400> 2
Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile
1 5 10 15
Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg
20 25 30
Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg
35 40 45
Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe
50 55 60
Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser
65 70 75 80
Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr
85 90 95
Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro
100 105 110
Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser
115 120 125
Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu
130 135 140
Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala
145 150 155 160
Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met
165 170 175
Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
180 185 190

Claims (10)

1.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括，
猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：
将编码Cap蛋白的PCV2-ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2-ORF2 DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；Cap重组蛋白以包涵体形式存在细胞质中，破碎细胞取沉淀，然后对沉淀中的包涵体进行纯化；
Cap重组蛋白包涵体变性步骤：
在4℃的条件下，将包涵体溶解于Buffer-S0中，4℃离心，取第一上清液；在0-4℃的条件下，将第一上清液加至Buffer-S1中，充分混合后有蛋白析出，4℃离心取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于Buffer-S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后离心取第二上清液；测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer-S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为20-400μg/mL，得到变性蛋白溶液；
溶液置换及蛋白复性步骤：
在切向流超滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性；以Buffer-RF作为置换液，超滤过程中，中空纤维膜或膜包的孔径为5-8KD；超滤参数为：跨膜压TMP＝4.0-7.0psi，膜通量1.572±0.756LMH，剪切力Shear＝3727-3773S-1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；
病毒样颗粒组装和回收步骤：
在2-8℃条件下，将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，然后在2-8℃条件下静置6-18h，得到回收溶液；切向流超滤系统中，使用孔径为50KD的中空纤维膜或膜包，以PBS作为置换液对回收溶液进行超滤，浓缩；超滤参数为：跨膜压TMP＝8-13psi，膜通量21.631±4.366LMH，剪切力Shear＝3019-3098S-1，收集二次超滤溶液，离心取沉淀，得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤中，对包涵体进行纯化为使用含有2mol/L尿素的缓冲液对沉淀进行洗涤，用质量分数2％的Triton X-100溶液去除包涵体中的膜碎片和膜蛋白。
3.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，Buffer-S0包括20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，5-7M盐酸胍，pH为11.5-12.5。
4.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，Buffer-S1包括20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，pH为8-9。
5.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，第一上清液与Buffer-S1的体积比为1:5-20。
6.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，Buffer-S2包括20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，6-8M尿素，pH为11.5-12.5。
7.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，溶液置换及蛋白复性步骤中，Buffer-RF包括20-80mM Tris-Cl，80-200mM NaCl，0.5-2mM EDTA，1-10mM 2-ME，5-10％甘油，3-8％PEG4000，100-300mM L-精氨酸，0.1-0.5％Triton-X100，pH为5.5-6.5。
8.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，病毒样颗粒组装和回收步骤中，利用蠕动泵，泵速20～50mL/min条件下将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，一次超滤溶液和Buffer-AS的体积比为1:15-25。
9.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，病毒样颗粒组装和回收步骤中，Buffer-AS包括100-300mM柠檬酸铵，2-3％异丙醇，4-8％PEG 4000，pH 5-6。
10.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，通过权利要求1所述的方法制备得到。
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