ES2215916T3 - Purificacion de cuerpos proteicos de inclusion mediante microfiltracion de corriente transversal. - Google Patents
Purificacion de cuerpos proteicos de inclusion mediante microfiltracion de corriente transversal.Info
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Abstract
Procedimiento para la purificación y/o concentración de cuerpos proteicos de inclusión en una solución, caracterizado porque la solución que contiene cuerpos proteicos de inclusión es conducida pasando en forma tangencial por una o más membranas semipermeables, de tal manera que los cuerpos proteicos de inclusión son retenidos por las membranas y las sustancias o componentes de peso molecular o diámetro de partículas menores pueden atravesarlas, obteniéndose una solución purificada y/o concentrada de cuerpos proteicos de inclusión, en el que sobre la membrana semipermeable está colocada una matriz de mallas abiertas que está compuesta por hilos longitudinales y transversales que se cruzan, de tal manera que los hilos longitudinales y transversales vecinos guardan respectivamente una distancia entre ellos de 5 a 15 veces mayor que su grosor, que se encuentra en el intervalo de 150 a 600 m.
Description
Purificación de cuerpos proteicos de inclusión
mediante microfiltración de corriente transversal.
La invención se refiere a un procedimiento para
la purificación y/o concentración de cuerpos proteicos de inclusión
(inglés: "inclusion bodies" o "refractile bodies") en una
solución altamente concentrada que contiene partículas, en el que
se conduce la suspensión que contiene los cuerpos proteicos de
inclusión, pasando en forma tangencial por una o varias membranas
semipermeables, de manera que los cuerpos proteicos de inclusión son
retenidos detrás de las membranas, y sustancias con un peso
molecular menor pueden atravesar la membrana y/o son adsorbidas en
la membrana, de manera que se obtiene una suspensión de cuerpos
proteicos de inclusión purificada y/o concentrada. Se procede de la
misma manera para la separación de partículas de pared celular de
una suspensión de cuerpos proteicos de inclusión. Además, la
invención se refiere al uso de una instalación de microfiltración de
corriente transversal, para la purificación y/o concentración de
cuerpos proteicos de inclusión en una suspensión, así como para la
separación de partículas de pared celular de una preparación de
cuerpos proteicos de inclusión.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación y/o concentración de cuerpos
proteicos de inclusión en una solución altamente concentrada que
contiene partículas, un procedimiento para la separación de
partículas de pared celular de una suspensión de cuerpos proteicos
de inclusión, así como al uso de una instalación de microfiltración
de corriente transversal, para la purificación y/o concentración de
cuerpos proteicos de inclusión en una suspensión y para la
separación de partículas de pared celular de una preparación de
cuerpos proteicos de inclusión.
Los cuerpos proteicos de inclusión con
frecuencia se forman durante la alta expresión de proteínas
heterólogas u homólogas en Escherichia coli y están
compuestos por proteínas en alto estado de agregación, ácidos
nucleicos, enzimas de la biosíntesis de proteínas, así como
ribosomas. Los cuerpos proteicos de inclusión son partículas
amorfas, de alta densidad de electrones, que frente al citoplasma
presentan un límite discreto, pero que no están envueltos en una
membrana (Schoemaker JM y col. (1985): EMBO J 4:
775-780). Durante la preparación de los cuerpos
proteicos de inclusión, mediante interacciones diversas pueden
adsorberse en forma secundaria otras contaminaciones como, por
ejemplo, endotoxinas, restos de pared celular y lípidos (Marston
FAO (1986): Biochem. J. 240: 1-12).
Biomasa aquí denomina la suma de todos los
componentes de alto peso molecular, así como de bajo peso molecular,
que se presentan en una disgregación celular. Especialmente, la
proporción de restos de pared celular (partículas de pared
celular), así como de cuerpos proteicos de inclusión, pero también
de componentes como ácidos nucleicos, endotoxinas, proteína soluble
y componentes de bajo peso molecular, determinan las propiedades
fisicoquímicas del material de filtración. Las indicaciones de
concentración de biomasa siempre se refieren a la concentración de
peso celular húmedo antes de la disgregación. Se habla del llamado
equivalente de biomasa.
La presión transmembránica (TMP) se define
como:
TMP = (presión de entrada +
presión de salida)/2-presión del infiltrado
[bar]
La presión de entrada es la presión
ejercida en la entrada del rechazo (abertura de entrada del módulo).
La presión de salida es la presión ejercida en la salida del
rechazo (abertura de salida del módulo). La presión del
infiltrado es la presión ejercida en la salida del infiltrado
(filtrado).
Por transmisión aquí se entiende el
desenriquecimiento de componentes solubles a través de la membrana
hacia el infiltrado. Para ello se extraen muestras de infiltrado y
de rechazo en diversos momentos (x) durante la diafiltración, se
centrifugan (14000 x g, 15 min,) y el sobrenadante soluble se mide
fotométricamente a 280 nm, después de una dilución apropiada
(densidad óptica (DO) a 280 nm). Se relacionan luego los valores de
DO_{280} del infiltrado en cada momento x (DO_{280}infiltrado
(x)) con los valores de DO_{280} del rechazo en cada momento x
(DO_{280}(rechazo (x)) mediante la siguiente fórmula:
Transmisión =
DO_{280}(infiltrado (x)/DO_{280}(rechazo (x) x
100
Normalmente, la transmisión se modifica en el
transcurso de una diafiltración. Al principio, la membrana todavía
está exenta de componentes adsorbidos y no presenta capa de
recubrimiento. Por ello, por definición, la transmisión al comienzo
de la filtración es del 100%. Sin embargo, normalmente decrece
durante el transcurso de la filtración, porque se forma cada vez más
capa de recubrimiento que impide el transporte de componentes
solubles a través de la membrana hacia el infiltrado. Es decir, la
transmisión en suma sólo puede indicarse como valor medio
(transmisión media).
Por eliminación aquí se entiende el
desenriquecimiento de componentes solubles del rechazo. Para ello,
se extraen muestras del rechazo en diversos momentos (x) durante la
diafiltración, se centrifugan (14000 x g, 15 min.) y se mide el
sobrenadante soluble en forma fotométrica a 280 nm, después de una
dilución apropiada (densidad óptica a 280 nm). Luego se relacionan
los valores de DO_{280} (DO_{280}(rechazo (x)) con la
DO_{280} original del rechazo en el sobrenadante
soluble(DO_{280}(rechazo(0)) mediante la
siguiente fórmula:
Eliminación = 100
-(DO_{280}(rechazo(x)/DO_{280}(rechazo(0)
x
100)
La eliminación normalmente tiende hacia un valor
máximo hasta el final de la diafiltración. Es decir, los valores
representan el desenriquecimiento máximo alcanzado de componentes
solubles.
En el ámbito de la química de las proteínas, los
procedimientos de purificación de cuerpos proteicos de inclusión son
procedimientos usuales. En procedimientos de laboratorio que son
conocidos del estado de la técnica, por ejemplo, se separa el
material biológico obtenido (células bacterianas de E. coli)
mediante centrifugación, después de su disgregación (usualmente por
lisis enzimática con lisozima, tratamiento con ultrasonido u
homogeneización a alta presión), y el sedimento obtenido con ayuda
de la sedimentación o alternativamente, mediante microfiltración de
corriente transversal, que contiene los cuerpos proteicos de
inclusión y contaminaciones como células no disgregadas, envolturas
de células y fragmentos de pared celular, se lava con soluciones
reguladoras. Aunque en general se usa el procedimiento de
sedimentación para la purificación de cuerpos proteicos de
inclusión, después de su liberación de las células (por ejemplo,
Schoner RG y col. (1985): Biotechnology 3: 151-154;
Sharma SK y col. (1986): J. Biotechnol. 4: 119-124),
este procedimiento a mayor escala puede ocasionar dificultades
(Forman SM y col. (1990): J. Membr. Sci.
48:263-279). Se pueden lavar los cuerpos proteicos
de inclusión hasta un grado de pureza deseado, con ayuda de una
microfiltración de corriente transversal (Meagher MM y col. (1994):
Biotechnol. Bioeng. 43: 969- 977; Forman SM y col. (1990): J. Membr.
Sci. 48: 263-279).
El tamaño medio de partículas de los cuerpos
proteicos de inclusión depende de la respectiva proteína diana
expresada, de la cepa huésped, del sistema de expresión, así como
del medio de cultivo usado, y puede encontrarse en el intervalo de
0,07 \mum para la hormona del crecimiento humana (Blum P y col.
(1992): Bio/Technology 10: 301-304, hasta 1,5 \mum
para la b-lactamasa (Bowden GA y col. (1991):
Bio/Technology 9; 725-730). Otros ejemplos de la
bibliografía son cuerpos proteicos de inclusión de proquimosina con
diámetros de partículas de 1,26 \mum (\pm 1,2 \mum), así como
interferon, con 0,81 \mum (\pm 0,4 \mum) (Taylor G y col.
(1986): Bio/Technology 4: 553-557). En cambio,
restos de pared celular, dependiendo del procedimiento de
disgregación, presentan tamaños de partículas de entre 0,05 \mum y
1 \mum (Bailey SM y Meagher MM (1997): Biotechnol. Bioeng.
56(3): 304-310). Además, el grado de
disgregación también influye en la distribución de tamaños de
partícula en el homogeneizado bruto. De esta manera, en muchos
homogeneizados brutos existen distribuciones de tamaños de
partículas que se superponen, entre cuerpos proteicos de inclusión,
restos de pared celular y células no disgregadas.
Forman y col. indican una relación logarítmica
entre el flujo del infiltrado y la concentración creciente de la
biomasa en la solución de producto que se ha de filtrar. Esto
significa que el flujo del infiltrado decrece drásticamente cuando
la concentración inicial de biomasa en la solución de producto que
se ha de filtrar aumenta. Forman y col. indican como flujos máximos
de infiltrado 14 l/h m^{2} a un equivalente de biomasa de 25 g/l
(2,5%), de 12 l/gh m^{2} a un equivalente de biomasa de 50 g/l
(5%) y < 8 l/h m^{2} a un equivalente de biomasa de 100 g/l
(10%), para una membrana Durapore (Millipore) con un límite de
exclusión de 0,45 \mum. La carga de biomasa en la membrana en
estos experimentos se encontraba en aproximadamente 1,4 kg de
equivalente de peso celular húmedo/m^{2}. El aumento del flujo de
infiltrado más allá de un determinado valor límite a una
concentración dada de biomasa, en la solución de producto da por
resultado un incremento drástico de la TMP y con ello, el deterioro
de los poros de la membrana (obstrucción, en inglés, el llamado
"fouling"). Inversamente, el flujo del infiltrado decrece
durante la filtración, a una TMP dada.
Otros grupos de trabajo (Bailey SM & Meagher
MM (1997): J. Membr. Sci. 131: 29-38) indican que ya
a cargas de biomasa de 4-6% (40-60
g/l) en módulos de casetes de fibras huecas de polisulfona o
fluoruro de polivinilideno (PVDF), el flujo del infiltrado y la
transmisión decrecen a lo largo del tiempo, lo que aún se acentúa
por la adición de agentes caotrópicos como clorhidrato de
guanidina.
Meagher y colaboradores (Meagher MM y col.
(1994): Biotechnol. Bioeng. 43: 969-977) informaron
de resultados similares para la purificación de cuerpos proteicos de
inclusión de IL-2, a través de una membrana Durapore
(polietersulfona, 0,1 \mum). A una concentración de biomasa de 7%
(70g/l) de equivalente de peso celular húmedo en el rechazo, tanto
la transmisión proteica como el flujo del infiltrado
(20-10 l/h m^{2}) decrecen significativamente
durante el tiempo de filtración, lo que se atribuyó a la formación y
compresión de una capa de recubrimiento de la membrana. La
adsorción de proteína en la membrana depende tanto de las
propiedades fisicoquímicas de la solución de proteínas, como de las
de la membrana misma.
Por tanto, del estado de la técnica no se conocen
procedimientos que posibiliten filtrar soluciones con cuerpos
proteicos de inclusión, a concentraciones muy altas de biomasa, a
parámetros constantes de trabajo (presión, flujo del infiltrado,
flujo del rechazo). De la bibliografía no se puede extraer ninguna
indicación directa para lograr la reproducibilidad de los
parámetros característicos de la filtración a lo largo de muchos
ciclos de filtración. Esto hasta ahora impidió la transferencia a
la escala técnica del procedimiento de microfiltración de corriente
transversal para la purificación fina de suspensiones que contienen
cuerpos proteicos de inclusión.
Por ello, un objetivo en que se basa la presente
invención es proporcionar un procedimiento de purificación y
concentración, basado en la microfiltración de corriente
transversal, que posibilite purificar de manera sencilla cuerpos
proteicos de inclusión en cantidades técnicamente relevantes, con
parámetros de trabajo constantes, durante uno y a lo largo de
muchos ciclos de filtración. Otro objetivo en que se basa la
presente invención consistía en reducir de tal manera la
concentración de partículas de pared celular y otros componentes, de
bajo peso molecular, que se lograran los pasos subsiguientes de
procesamiento, especialmente, el replegado de la proteína diana
desnaturalizada, así como la purificación cromatográfica fina, con
rendimientos técnicamente relevantes.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para la purificación y/o concentración de
cuerpos proteicos de inclusión en una solución, que está
caracterizado porque la solución que contiene los cuerpos proteicos
de inclusión es conducida pasando en forma tangencial por una o
varias membranas semipermeables, de manera que los cuerpos de
inclusión proteicos son retenidos por las membranas, y sustancias o
componentes con peso molecular o diámetro de partículas más bajo,
pueden pasar a través de las membranas, con lo que se obtiene una
solución de cuerpos proteicos de inclusión purificada y/o
concentrada.
En otro aspecto, la presente invención se refiere
a un procedimiento para la separación de partículas de pared
celular de una preparación de cuerpos proteicos de inclusión, que
está caracterizado porque la preparación que contiene cuerpos
proteicos de inclusión es conducida pasando en forma tangencial por
una o varias membranas semipermeables, de manera que los cuerpos
proteicos de inclusión son retenidos por las membranas, y
sustancias o componentes con pesos moleculares o diámetros de
partículas más bajos pueden atravesar y/o ser adsorbidos por la
membrana, obteniéndose una solución de cuerpos proteicos de
inclusión con contenido de partículas esencialmente bajo.
Se halló ahora que mediante el procedimiento de
la presente invención, usando la instalación de microfiltración de
corriente transversal, se pueden purificar y concentrar cuerpos
proteicos de inclusión. Especialmente es sorprendente y nuevo que
los cuerpos proteicos de inclusión también puedan ser filtrados en
un punto de trabajo estable, a una alta carga de la solución
inicial con componentes solubles y en partículas (biomasa), sin que
se obstruya la membrana y/o baje el rendimiento de la filtración
por la formación de una capa de recubrimiento. Hasta ahora las
concentraciones alcanzables de biomasa en el rechazo eran bajas. A
altas concentraciones de biomasa, en cambio, el bloqueo del canal
del rechazo origina una alteración creciente del punto de trabajo
durante el ciclo de filtración o, en su caso, a lo largo de varios
ciclos de trabajo, por lo que el flujo del rechazo, así como el
flujo del infiltrado, decrecen constantemente. Los flujos de
infiltrado alcanzables, después de varios ciclos ya no posibilitan
una forma de trabajo atractiva desde el punto de vista económico.
La limpieza de las membranas bloqueadas de esta manera demuestra ser
costosa y casi siempre incompleta.
En cambio, para cargas bajas de biomasa en la
membrana, que conducen a problemas menores de bloqueo,
especialmente, a una escala técnicamente relevante, se necesita una
superficie de filtración extremadamente grande que afecta
negativamente la economía del paso de microfiltración de corriente
transversal.
Por ello, hasta ahora no se usó la
microfiltración de corriente transversal para la purificación y
concentración de preparaciones de cuerpos proteicos de inclusión a
una escala de relevancia técnica y a grandes concentraciones de
biomasa.
En cambio, el módulo de membrana de hidrato de
celulosa modificado que se usa aquí, sorprendentemente también
posibilita la filtración de cuerpos proteicos de inclusión a una
alta carga de la preparación inicial, con componentes solubles y en
partículas (biomasa), en un punto de trabajo estable, sin que se
obstruya la membrana y/o el rendimiento de la filtración decrezca
por la formación de una capa de recubrimiento. El punto de trabajo
estable sorprendentemente también se mantiene a lo largo de muchos
ciclos de filtración.
Con el procedimiento de la presente invención se
purifican y/o se concentran cuerpos proteicos de inclusión a altas
concentraciones de biomasa, de entre 50 g/l y 2500 g/l,
preferentemente, de entre 500 g/l y 1500 g/l. La selección del
límite de separación de la membrana (cut-off) aquí
depende del diámetro medio de partículas y de la distribución de
tamaños de partículas de los cuerpos proteicos de inclusión. El
límite de separación en la membrana de hidrato de celulosa
hidrófila modificada, usada conforme a la invención, puede
encontrarse entre 0,1 y 0,65 \mum, preferentemente, en 0,45
\mum.
Se puede procesar toda magnitud de volumen,
tratándose preferentemente una solución con un volumen de 1 a 100000
l, muy preferentemente, de 1 a 1200 l. La solución que contiene los
cuerpos proteicos de inclusión es conducida en condiciones
apropiadas de presión, pasando al lado de la membrana o de las
membranas, siendo la presión de derrame preferentemente mayor que la
presión transmembránica (TMP). Preferentemente, se trabaja a una
TMP de 0,05 a 3 bar, muy preferentemente, a una TMP de 0,1 a 0,5
bar, de mayor preferencia, a una TMP de 0,2 a 0,4 bar, con lo que
la presión de derrame es mayor que la presión transmembránica. El
flujo del rechazo puede ser variado en un amplio intervalo y se
debería seleccionar de tal manera, que se alcanzara una corriente
turbulenta (número de Reynolds > 30; Meyeroltmanns F (1991);
BioTec 5: 918-921). Para reducir el flujo mínimo de
rechazo al que se alcanza una corriente turbulenta, en los módulos
de membrana usados conforme a la invención están incluidos
interruptores de flujo. Su forma y disposición geométrica están
descritos en una solicitud de patente separada con el título
"Módulos de filtración de corriente transversal en forma de
módulos de ranura amplia mejorados", presentada el mismo día
(documento WO-A-0185316).
En la carga de biomasa se debe distinguir entre
la concentración de biomasa en el rechazo (indicada en g/l) y la
carga de biomasa específica de superficie (indicada en kg/m^{2}).
Una concentración demasiado alta de biomasa en el rechazo puede
conducir a la obstrucción de los canales de rechazo, mientras que
una carga de biomasa específica de superficie demasiado alta
conduce a la formación de una capa de recubrimiento en la membrana
(el llamado "fouling").
La concentración de biomasa en el rechazo con los
módulos de hidrato de celulosa modificados aquí usados puede
ascender hasta 1500 g/l, mientras que la carga específica de
superficie de la biomasa puede aumentarse hasta 30 kg/m^{2}.
También puede llevarse a cabo el procedimiento a
temperaturas variables. Preferentemente, se trabaja en un intervalo
de temperaturas de 4ºC a 40ºC.
En otro aspecto de la invención, la preparación
de cuerpos proteicos de inclusión purificada conforme a la invención
presenta una carga significativamente menor de endotoxinas, en
comparación con el material inicial.
En los ensayos descritos se usaron módulos de
canal tamizante modificados de diversas maneras, que están provistos
de una membrana Hydrosart® de hidrato de celulosa modificado (de
Sartorius AG, Alemania). Aquí los módulos se diferencian en forma
determinante en la configuración geométrica del tejido. La membrana
Hydrosart® es obtenible en el mercado con límites de exclusión de
0,1, 0,2, 0,45, así como de 0,65 \mum.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se produjo masa celular de E. coli W 3110,
en la que estaba presente una proteína diana como cuerpos proteicos
de inclusión (por ejemplo, interleucina-4 R121D
Y124D), en forma fermentativa, según el estado de la técnica
(Riesenberg y col., 1990: Appl. Microbiol. Biotechnol. 34:
77-82). Las células fueron disgregadas en una
concentración de biomasa húmeda de 30-40%, por
lisis enzimática (lisozima: 1 mg/g de peso seco de células) con
ayuda de un homogeneizador estándar (Bran & Lübbe, Alemania).
Como tampón se usó tris-HCl 100 mM (pH 8) con 5 mM
de ácido etilendiamino-tetraacético (EDTA). En tres
ciclos de homogeneización a 500 bar se logró la disgregación celular
mecánica. Se estableció el grado de disgregación en forma analítica
de imagen en 80-90%. A continuación, se concentró el
homogeneizado bruto obtenido mediante un separador (Westfalia,
Alemania), en el que se recogió la masa seca total en el fango. A
continuación, el sedimento fluido fue
crio-peletizado en nitrógeno líquido y hasta su uso
siguiente en los experimentos de filtración fue almacenado a
-70ºC.
Con la ayuda de este procedimiento se prepararon
tres lotes independientes de homogeneizado bruto y se almacenaron
como crio-pelets a -70ºC hasta el uso siguiente.
Se analizan muestras de las soluciones que
contienen cuerpos proteicos de inclusión (rechazo antes de la
diafiltración, rechazo después de la diafiltración), así como el
infiltrado total, mediante el procedimiento del lisado de
amebocitos de limulus, según la Farmacopea Europea (Pharm. Eur.). La
detección de endotoxinas se efectuó mediante el procedimiento de
"gel sólido", en el que la adición de una solución que contiene
endotoxinas a una solución de lisado de amebocitos de limulus
(solución de LAL) origina la formación de gel en una mezcla. La
formación de gel se basa en una cascada de coagulaciones que
transcurre en varios pasos.
Una instalación de microfiltración de corriente
transversal está compuesta normalmente por los componentes que están
representados en la figura 10.
Para la determinación de los valores en agua, se
hace funcionar la instalación con agua completamente desmineralizada
(agua VE), ajustándose las siguientes presiones con la ayuda de las
válvulas de mariposa (4 y 5):
| R(de entrada): | 2 bar TMP: 1 bar |
| R (de salida): | 1 bar |
| P: | 0,5 bar |
En la salida del rechazo y en la salida del
infiltrado se determinan respectivamente los flujos. La medición
sirve para determinar el estado de los módulos antes del primer uso
y antes y después de cada ciclo de producto.
A continuación, se enjuaga suficientemente toda
la instalación con tampón lavador (tris-HCl 0,05M,
pH 7, etilendiaminotetraacetato-Na_{4} 5 mM,
Zwittergent 3-14 al 0,1%). Se cierra la válvula de
mariposa para la salida de infiltrado (5) y se detiene la bomba. Se
vacía el recipiente del rechazo y, a continuación, se llena con
suspensión de cuerpos proteicos de inclusión.
Se descongela una parte del homogeneizado en
forma de crio-pelets que, por ejemplo, equivalga a
300 g del peso celular húmedo original, y se coloca en un recipiente
separado de rechazo. Se completa el volumen de la suspensión con
tampón lavador (tris-HCl 0,05M, pH 7,
etilendiaminotetraacetato-Na_{4} 5 mM, Zwittergent
3-14 (Fluka) al 0,1%), hasta el valor de volumen
total indicado de rechazo, hecha la sustracción del volumen muerto,
y se conecta a la entrada de la bomba. El volumen muerto de la
instalación es de 0,55 l. Se hace arrancar la bomba con la válvula
de mariposa del infiltrado (5) cerrada y se bombea el rechazo en
circuito cerrado, durante aproximadamente 5 minutos. Se establecen
las siguientes presiones por ajuste del rendimiento de la bomba
(R(de entrada)) y con ayuda de la válvula de mariposa:
| R(de entrada): | 1 bar TMP: 0,35 bar |
| R(de salida): | 0,5 bar |
| P: | 0,4 bar |
Se abre la válvula del infiltrado con especial
cuidado para evitar la compresión de una capa de recubrimiento
eventualmente presente sobre la membrana. A partir de los ajustes
indicados se calcula una presión transmembránica (TMP) de 0,35 bar
que resultó ser óptima según determinaciones previas de punto de
trabajo.
Durante la diafiltración que sigue ahora, se
cambia el volumen del rechazo hasta cinco veces. Se mantiene el
volumen del rechazo en un nivel constante, mediante la adición
continua de tampón lavador.
Después de cada 0,5 l de volumen de infiltrado se
examinan los ajustes de presión y se documentan (TMP constante de
0,35 bar) y se extraen muestras de rechazo y de infiltrado. Además,
se determinan el flujo del rechazo y del infiltrado.
Al final de la diafiltración, opcionalmente puede
concentrarse el rechazo hasta aproximadamente 50% del volumen
original, mediante la interrupción del suministro del tampón
lavador.
Para extraer el rechazo, se cierra lentamente la
válvula de mariposa del infiltrado (5) y se bombea el rechazo en
circuito cerrado. A continuación, se suministran
0,5-1 l de tampón lavador (= 1 a 2 veces el volumen
muerto) a la instalación y mientras tanto se vacía completamente el
rechazo hacia el recipiente inicial de rechazo.
En primer lugar, se enjuaga la instalación con 2
l de solución de NaCl al 0,9%, durante lo cual permanece cerrada la
válvula de mariposa del infiltrado (5). Se ajusta el rendimiento de
la bomba de manera que la presión en la entrada del rechazo
(R(de entrada)) ascienda a 3 bar. Se abre completamente la
válvula de mariposa en R(salida) (7b). Luego se bombean otros
2 l de solución de NaCl al 0,9%, aproximadamente durante 10 minutos
en la circulación del rechazo.
A continuación, se enjuaga la instalación con 2,5
l de solución de ácido cítrico al 2%. Se mantienen iguales los
ajustes de presión. Se remueven los primeros 0,5 l de la
instalación, a continuación, se hace circular la solución durante
aproximadamente 10 minutos en la circulación del rechazo.
Se barre la solución limpiadora de ácido cítrico
con aproximadamente 20 l de agua completamente desmineralizada. A
continuación, se irrigan 2,5 l de solución
Ultrasil-62 al 1% (Henkel AG, Alemania) que está
templada a 40ºC. Los ajustes de presión se mantienen iguales. Se
remueven los primeros 0,5 ml de la instalación, a continuación, se
hace circular la solución durante aproximadamente 10 minutos en la
circulación del rechazo. Se barre la solución limpiadora Ultrasil
con aproximadamente 20 l de agua completamente desmineralizada.
Finalmente, se efectúa una limpieza con 2,5 l de
solución de NaOH 1 N, que está templada a 40ºC. Los ajustes de
presión permanecen iguales. Se remueven los primeros 0,5 l de la
instalación, a continuación, se hace circular la solución durante
aproximadamente 10 minutos en la circulación del rechazo. Entonces
se abre completamente la válvula de mariposa en la salida de
infiltrado (5). Seguidamente, se enjuaga la instalación con
aproximadamente 20 l de agua completamente desmineralizada para
librarla de la sosa cáustica.
Al final, se efectúa nuevamente una determinación
del valor en agua (véase arriba).
Por corto tiempo (hasta 7 días) se puede
almacenar toda la instalación, incluyendo los módulos introducidos,
en agua completamente desmineralizada. A un tiempo mayor de reposo
(>7 días) se almacena toda la instalación, incluyendo los módulos
introducidos, en etanol acuoso al 20%.
Se centrifugan las muestras (14000 x g, durante
15 minutos) y se diluyen apropiadamente con tampón lavador. A
continuación, se mide la DO (densidad óptica) a 280 nm en un
espectrofotómetro usual en el mercado, contra una cubeta de
referencia (tampón lavador).
Usando el protocolo de ensayo descrito, partiendo
de una partida uniforme de homogeneizado bruto (véase el ejemplo 1),
se realizaron varios ciclos de filtración.
Los resultados del primer ciclo de diafiltración
(nueva membrana de placa Hydrosart (0,1 m^{2}, 0,45 \mum)) de
homogeneizado bruto de E. coli (partida # 1) con cuerpos
proteicos de inclusión de interleucina-4 R121D Y124D
están compilados en la figura 1.
La eliminación de componentes solubles del
rechazo crece durante el transcurso de la filtración y finaliza,
después de 3,3 cambios de volumen, en un valor de meseta de 55%. La
transmisión, a partir de 100%, que corresponde a una membrana
completamente libre, decrece continuamente hasta un valor final de
9%, después de 3,3 cambios de volumen. El flujo del rechazo se
encuentra altamente constante en 46-48 l/h. El flujo
del infiltrado decrece continuamente, de 82 l/h m^{2} hasta 27
l/h m^{2}, después de 3,3 cambios de volumen.
Antes del funcionamiento con el producto, se
determinan los valores en agua del nuevo módulo de membrana, que
dan 37,2 l/h (flujo del rechazo) y 1968 l/h m^{2} (flujo del
infiltrado). Después del funcionamiento con el producto y de la
limpieza del módulo (véase arriba), ya sólo se midieron 22,8 l/h
(flujo del rechazo) y 1800 l/h m^{2} (flujo del infiltrado).
En el ciclo de producto inmediatamente
subsiguiente se establecieron exactamente iguales condiciones
iniciales y se usó el mismo producto inicial. Los valores en agua
iniciales se encontraban en 22,8 l/h (flujo del rechazo) y 1848 l/h
m^{2} (flujo del infiltrado). Después de irrigar el homogeneizado
bruto, ya después de 1,5 l de volumen de infiltrado, el flujo del
rechazo se había derrumbado hasta 2,5 l/h y el flujo del infiltrado
hasta 2 l/h m^{2}. Se interrumpió entonces el funcionamiento con
el producto y se transfirió la instalación nuevamente al estado
inicial, según el protocolo precedente. Los valores en agua,
después de la limpieza de la instalación, se encontraban en 19,4
l/h (flujo del rechazo) y 1704 l/h m^{2}.
En el ciclo de producto inmediatamente
subsiguiente nuevamente se establecieron exactamente las mismas
condiciones iniciales (véase arriba) y se usó el mismo producto
inicial. Los valores en agua antes del funcionamiento con el
producto se encontraban en 19,6 l/h (flujo del rechazo) y 1680 l/h
m^{2} (flujo del infiltrado). Pero la suspensión de
homogeneizado bruto ya no se pudo verter en la instalación en este
ciclo. El canal del rechazo en seguida estaba bloqueado. Por eso se
interrumpió el funcionamiento con el producto y se transfirió la
instalación nuevamente al estado inicial, según el protocolo
precedente. Ya no se pudo limpiar el módulo según el protocolo
estándar de limpieza, descrito anteriormente.
Con la ayuda de los valores en agua indicados
para el flujo del rechazo y del infiltrado, así como de los flujos
del rechazo y del infiltrado en el funcionamiento con el producto,
se puede ver que el canal del rechazo a 230 g de equivalente de
peso celular húmedo/l se bloqueaba por el depósito de partículas.
También la membrana misma, ya después de tres ciclos, a una carga de
biomasa de la membrana de 300 g de peso celular húmedo/m^{2} se
bloqueó de manera significativa por formación de una capa de
recubrimiento.
Se seleccionaron la disposición experimental, la
manera de proceder, así como las instrucciones para la limpieza, en
forma análoga al ejemplo 1. La preparación del material de partida,
(véase el ejemplo 1), así como la carga de biomasa en la membrana (3
kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}) y la concentración
de biomasa (230 g de equivalente de peso celular húmedo/l) fueron
idénticas a las condiciones enunciadas en el ejemplo 2.
Se ensayaron tres módulos Hydrosart modificados,
con interruptores de flujo ("pantallas") y geometrías de
canal, realizados en formas diferentes (véase la parte general en
la sección de ejemplos). La membrana misma no fue variada
(Hydrosart con un límite de exclusión de 0,45 \mum).
En la figura 2 se ilustra a manera de ejemplo el
primer ciclo de diafiltración (nuevo módulo de placa Hydrosart tipo
# 1, 0,1 m^{2}, 0,45 \mum) de homogeneizado bruto de E.
coli (partida # 1) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D. La eliminación de
componentes solubles del rechazo crece durante el transcurso de la
filtración y, después de 3,3 cambios de volumen, finaliza en un
valor de meseta de 61%. La transmisión, partiendo de 100%, que
corresponde a una membrana completamente libre, decrece
constantemente hasta un valor final de 9%, después de 3,3 cambios
de volumen. El flujo del rechazo se encuentra altamente constante en
81-86 l/h. El flujo del infiltrado decrece
constantemente de 82 l/h m^{2} hasta 21 l/h m^{2}, después de
3,3 cambios de volumen.
Antes del funcionamiento con el producto, se
determinaron los valores en agua del módulo de membrana modificado,
recién salido de fábrica, que dieron 52,8 l/h (flujo del rechazo) y
2136 l/h m^{2} (flujo del infiltrado). Después del funcionamiento
con el producto y de la limpieza del módulo (véase arriba), ya se
midieron sólo 46,8 l/h (flujo del rechazo) y 1968 l/h m^{2} (flujo
del infiltrado).
Los flujos del rechazo y los flujos del
infiltrado en el funcionamiento con el producto en los siguientes 7
ciclos de funcionamiento con el producto están compilados en la
figura 3a. El flujo del rechazo en el funcionamiento con el
producto decrece desde 86 l/h en el primer ciclo hasta 19 l/h en el
octavo ciclo. El mayor derrumbe en el flujo del rechazo en el
funcionamiento con el producto se observó entre el primero y el
segundo ciclo. El flujo medio del infiltrado fluctúa entre 15 y 35
l/h m^{2}.
La eliminación de componentes solubles del
rechazo se encuentra entre 60% y 80% en todos los funcionamientos
con el producto. La transmisión media se encuentra entre 40% y
80%.
Los resultados de la limpieza del módulo
Hydrosart tipo # 1, es decir, los valores en agua antes y después
del funcionamiento con el producto, para el flujo del rechazo y el
flujo del infiltrado, están representados en la figura 3b. Se puede
reconocer claramente que el valor en agua del rechazo decrece
constantemente en el transcurso de los ciclos y que en el 5º ciclo
prácticamente se derrumba. Esto indica, como en el módulo Hydrosart
estándar, un problema de bloqueo en la entrada del rechazo.
Los valores en agua para el flujo del infiltrado,
en el transcurso de 8 ciclos caen de 2136 l/h m^{2} a 1344 l/h
m^{2}, es decir, en el 37%. La eficacia del paso individual de
limpieza se encuentra entre 87% (la peor eficacia del paso) y 100%
(la mejor eficacia del paso).
El módulo Hydrosart modificado tipo # 1 ya
manifiesta datos de rendimiento notablemente mejorados y pudo ser
usado durante ocho ciclos de funcionamiento con el producto, aunque
el módulo Hydrosart estándar en las mismas condiciones ya estaba
bloqueado irreversiblemente después de tres ciclos de funcionamiento
con el producto.
Sin embargo, con la geometría de canal y la
estructura del interruptor de flujo (pantalla), usadas en el tipo #
1, se presenta como antes el problema del bloqueo del canal del
rechazo, en el transcurso de los ciclos. Por las constantes
modificaciones dentro de un ciclo de producto o a lo largo de varios
ciclos, tampoco se puede mantener un punto de trabajo estable con
el módulo del tipo # 1.
En la figura 4 está ilustrado a manera de ejemplo
el primer ciclo de diafiltración (nuevo módulo Hydrosart de placa
tipo # 2, 0,05 m^{2}, 0,45 \mum) de un homogeneizado bruto de
E. coli (partida # 1) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D. La eliminación de
componentes solubles del rechazo aumenta durante el transcurso de
la filtración y finaliza después de 3,8 cambios de volumen con un
valor de meseta de 75%. La transmisión, a partir de 100%, que
corresponde a una membrana completamente libre, decrece
constantemente hasta un valor final de 25%, después de 3,8 cambios
de volumen. La transmisión media se encuentra en 53%. El flujo del
rechazo se encuentra altamente constante en 190 l/h. El flujo del
infiltrado decrece constantemente a partir de un valor inicial de
156 l/h m^{2}, finalizando en un valor de 38 l/h m^{2}.
Antes del funcionamiento con el producto, se
determinaron los valores en agua del módulo de membrana modificado,
recién salido de fábrica, que dieron 648 l/h (flujo del rechazo) y
3744 l/h m^{2} (flujo del infiltrado). Después del funcionamiento
con el producto y de la limpieza del módulo (véase arriba), se
midieron 708 l/h (flujo del rechazo) y 3720 l/h m^{2} (flujo del
infiltrado).
Los flujos del rechazo y los flujos del
infiltrado en los 6 siguientes ciclos de funcionamiento con el
producto están compilados en la figura 5a. El flujo del rechazo es
altamente constante en el funcionamiento con el producto y fluctúa
por 185 l/h. No se observa ningún derrumbe del flujo del rechazo en
el funcionamiento con el producto. El flujo medio del infiltrado
fluctúa por 50 l/h m^{2}.
La eliminación de componentes solubles del
rechazo en todos los funcionamientos con producto se encuentra entre
60% y 80%. La transmisión media se encuentra entre 45% y 75%.
Los resultados de la limpieza del módulo
Hydrosart tipo # 2, es decir, los valores en agua, antes y después
del funcionamiento con el producto, para el flujo del rechazo y el
flujo del infiltrado, están representados en la figura 5b. Los
valores en agua para el flujo del rechazo son levemente decrecientes
y se encuentran entre 650 y 700 l/h en el 1º ciclo y en 580 l/h en
el último ciclo. Esto indica que el problema de bloqueo en la
entrada del rechazo está notablemente reducido, en comparación con
el módulo Hydrosart estándar y con el módulo Hydrosart modificado
tipo # 1.
Los valores en agua para el flujo del infiltrado,
en el transcurso de 7 ciclos sólo decrecen levemente de 3744 l/h
m^{2} hasta 3408 l/h m^{2}, es decir, sólo en el 9%. La
eficacia del paso individual de limpieza se encuentra entre 92% (la
peor eficacia del paso) y 105% (la mejor eficacia del paso).
El módulo Hydrosart modificado tipo # 2 frente al
módulo Hydrosart estándar y al módulo Hydrosart tipo # 1 presenta
datos de rendimiento notablemente mejorados y pudo ser usado durante
siete funcionamientos con producto, aunque en las mismas condiciones
el módulo Hydrosart estándar ya estaba bloqueado en forma
irreversible después de tres ciclos de funcionamiento con
producto.
Con la geometría de canal y la estructura de los
interruptores de flujo (pantalla), usadas en el módulo Hydrosart
tipo # 2, el problema del bloqueo del canal de rechazo, en el
transcurso de los ciclos, está reducido significativamente. Por las
condiciones constantes dentro de un ciclo de producto y a lo largo
de varios ciclos, con el módulo Hydrosart tipo # 2 se puede mantener
un punto de trabajo estable, también con una carga de biomasa de 3
kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2} (230 g de
equivalente de peso celular húmedo/l).
En la figura 6 se ilustra a manera de ejemplo el
primer ciclo de diafiltración (nuevo módulo Hydrosart de placa tipo
# 3, 0,1 m^{2}, 0,45 m) de homogeneizado bruto de E. coli
(partida # 2) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D. En estos ensayos se
redujo el volumen de rechazo a 1,3 l (0,55 l de volumen muerto). La
eliminación de componentes solubles del rechazo aumenta en el
transcurso de la filtración y finaliza después de 3,8 cambios de
volumen, en un valor de meseta de 77%. La transmisión, a partir de
100%, que corresponde a una membrana completamente libre, decrece
constantemente hasta un valor final de 13%, después de 3,8 cambios
de volumen. El flujo del rechazo se encuentra en forma altamente
constante en 129-132 l/h. El flujo del infiltrado es
prácticamente constante, en un valor medio de 31,7 l/h m^{2}
(\pm 2,95).
Antes del funcionamiento con el producto, fueron
determinados los valores en agua del módulo de membrana modificado,
recién salido de fábrica, que dieron 105,6 l/h (flujo del rechazo) y
1320 l/h m^{2} (flujo del infiltrado). Después del funcionamiento
con el producto y de la limpieza del módulo (véase arriba), se
midieron 110,4 l/h (flujo del rechazo) y 1344 l/h m^{2} (flujo
del infiltrado).
En forma paralela, se efectuó un experimento con
un módulo de tamiz Durapore V (límite de exclusión: 0,45 \mum, 0,1
m^{2} de superficie filtrante, de fluoruro de polivinilideno
hidrofilizado (PVDF), sin interruptor de flujo (de "canal
abierto") en las mismas condiciones. Se eligió el mismo orden de
ensayos que fue descrito en el ejemplo 2. Sin embargo, el soporte
del módulo fue cambiado por un soporte correspondiente para la
membrana Durapore. La carga de biomasa (homogeneizado bruto,
partida # 2) en este experimento se encontraba también en 3 kg de
equivalente de peso celular húmedo/m^{2} o 230 g de equivalente de
peso celular húmedo/l. El volumen de rechazo ascendía a 1,3 l y se
efectuaron 3,8 cambios de volumen (5 l de volumen de infiltrado). El
flujo del rechazo ascendía a 90 l/h. Se estableció la TMP inicial en
0,3 bar, aunque en este experimento no se mantuvo constante la TMP,
como en todos los demás ensayos, sino que el flujo de infiltrado fue
fijado en un valor de 38 l/h m^{2}. Un aumento de la TMP también
muestra un bloqueo de poros de membrana, como en los otros ensayos
lo muestra la caída del flujo del infiltrado.
Después de 3,8 cambios de volumen, se obtuvo una
eliminación del 70%. La transmisión cayó desde el valor inicial de
100% hasta 10%. La TMP aumentó durante la filtración de 0,3 bar
hasta 0,65 bar. El flujo del rechazo no fue observado en este
experimento.
El módulo Hydrosart, tipo # 3, en las mismas
condiciones muestra los mejores datos de rendimiento, frente al
módulo de tamiz Durapore V. Con el módulo Hydrosart, tipo # 3 se
desenriquecen del rechazo aproximadamente 80% de la proporción
soluble de proteínas, mientras que con el módulo de tamiz
Durapore-V se alcanza una eliminación de
aproximadamente 70%. Las curvas de transmisión de ambos casos son
comparables. Pero, ante todo, el flujo del infiltrado (o, en su
caso, la TMP) con el módulo Hydrosart, tipo # 3 es aproximadamente
constante, mientras que la TMP en el caso del módulo de tamiz
Durapore-V aumenta notablemente (o, en su caso, el
flujo del infiltrado decrece), lo que se observó también con los
otros tipos de módulo examinados.
Debido al hecho de que con el uso del módulo
Hydrosart, tipo # 3 tanto el flujo del rechazo como el flujo del
infiltrado se mantienen prácticamente constantes durante la
filtración, en la siguiente serie de ensayos se aumentó por etapas
hasta el factor 5, tanto la carga de biomasa en la membrana como la
concentración de biomasa en el rechazo. Aquí se usó una segunda
partida de homogeneizado bruto (# 2).
Los flujos del rechazo y los flujos del
infiltrado en el funcionamiento con el producto en los siguientes 4
ciclos de funcionamiento con el producto, con cargas de biomasa en
aumento en la membrana, están compilados en la figura 7a. El flujo
del rechazo en el funcionamiento con el producto decrece de 130 l/h,
en el primer ciclo, a 3 kg de equivalente de peso celular
húmedo/m^{2}, hasta 100 l/h, en el cuarto ciclo, con 15 kg de
equivalente de peso celular húmedo/m^{2}. Es decir, a un aumento
de la carga de biomasa hasta el 500%, el flujo del rechazo sólo
decrece en el 23%. El flujo medio del infiltrado decrece de 30 l/h
m^{2} con 3 kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}, en
el primer ciclo, hasta 10 l/h m^{2} con 15 kg de equivalente de
peso celular húmedo/m^{2}, en el cuarto ciclo. Es decir, el flujo
del infiltrado disminuye en el 50% al aumentarse la carga de
biomasa en el 500%.
La eliminación de componentes solubles del
rechazo, con 3 kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2} se
encuentra en 75% y fluctúa en 60% al aumentar la carga de biomasa a
5, 10 y 15 kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}. La
transmisión media se encuentra entre 30% y 40%.
Los resultados de la limpieza del módulo
Hydrosart, tipo # 3, es decir, los valores en agua, antes y después
del funcionamiento con el producto, para el flujo del rechazo y el
flujo del infiltrado, están representados en la figura 7b. Los
valores en agua, tanto para el flujo del rechazo, como para el flujo
del infiltrado son altamente constantes, aunque se aumentó la carga
de biomasa en la membrana en el 500%. Esto indica que el problema
del bloqueo en la entrada del rechazo, así como en los poros de la
membrana fueron reducidos significativamente mediante las
modificaciones en la construcción del módulo.
La eficacia del paso individual de limpieza se
encuentra entre 93% (la peor eficacia del paso) y 100% (la mejor
eficacia del paso).
En otro experimento se averiguó el límite exacto
de la posibilidad de carga de biomasa del módulo Hydrosart, tipo #
3. Para ello, partiendo de una carga de biomasa de 15 kg de
equivalente de peso celular húmedo/m^{2}, con la que se inició la
diafiltración, en determinados momentos se aumentó la concentración
de cuerpos proteicos de inclusión en el rechazo. Los resultados de
este experimento están compilados en la figura 8 (A). El flujo del
rechazo, a un aumento del 50% de la concentración de biomasa en el
rechazo, de 1153 g de equivalente de peso celular húmedo/l a 1773
g/l, decrece de 108 l/h hasta 72 l/h, es decir, en el 33%. El flujo
del infiltrado, a un aumento del 70% de la carga de biomasa en la
membrana, de 15 kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2} a
26 kg/m^{2}, decrece de aproximadamente 16 l/h m^{2} hasta
aproximadamente 7 l/h m^{2}, es decir, en el 56%. Por lo tanto, el
límite superior para la carga de biomasa en la membrana se
encuentra en aproximadamente 22 kg de equivalente de peso celular
húmedo/m^{2}. Por encima de este límite, por un lado, el flujo del
infiltrado decrece a un valor menor de 10 l/h m^{2} y, por el
otro lado, el flujo del rechazo sigue bajando notablemente.
Un nuevo aumento de la posibilidad de carga de
biomasa hasta 30 kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2},
correspondiente a 2307 g de equivalente de peso celular húmedo/l, en
el siguiente ciclo, ya no fue posible y condujo al bloqueo de la
entrada del rechazo durante el proceso de irrigación. Pero se pudo
limpiar completamente el módulo como antes y después de llevarse a
cabo el protocolo de limpieza estándar (véase el ejemplo 2) presentó
un valor en agua para el rechazo de 122 l/h y un valor en agua para
el infiltrado de 1320 l/h m^{2}.
En un ensayo comparativo con el módulo Hydrosart
estándar (0,1 m^{2}, formato de placa, lote Nº 96108741/Nº 008),
en el que se usó el homogeneizado bruto de la partida # 3, se
aumentó por etapas la concentración de biomasa en el rechazo,
partiendo de una carga de biomasa de 3 kg de equivalente de peso
celular húmedo/m^{2} (230 g de equivalente de peso celular
húmedo/l) hasta 10 kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}
(figura 8 (B)). El flujo del rechazo, así como el flujo del
infiltrado, en el funcionamiento con el producto también decrecen
significativamente dentro de una etapa de concentración de biomasa.
Ya a 10 kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2} (769 g de
equivalente de peso celular húmedo/l) los flujos de infiltrado se
encuentran en sólo 12-13 l/h m^{2}, aunque sólo se
diafiltraron pocos volúmenes de infiltrado.
El módulo Hydrosart modificado, tipo # 3 muestra
datos de rendimiento mejorados significativamente y pudo ser usado
en 5 ciclos de funcionamiento con producto, en los que la carga de
biomasa fue aumentada hasta el 500%. En iguales condiciones de
ensayo, el módulo Hydrosart estándar ya estaba bloqueado en forma
irreversible después de tres ciclos de funcionamiento con producto,
a una carga de biomasa de 3 kg de equivalente de peso celular
húmedo/m^{2}.
Con la geometría de canal y la estructura de los
interruptores de flujo (pantalla) usadas en el tipo # 3, ya no se
reconoce el problema del bloqueo del canal del rechazo en el
transcurso de los ciclos. Por las condiciones constantes durante un
ciclo de producto y a lo largo de varios ciclos, con el módulo
Hydrosart, tipo # 3 puede mantenerse un punto de trabajo estable,
también a una carga de biomasa de hasta 22 kg de equivalente de peso
celular húmedo/m^{2} (1466 g de equivalente de peso celular
húmedo/l).
En la comparación directa, el módulo Hydrosart
estándar muestra datos de rendimiento notablemente menores, a una
carga de biomasa significativamente menor.
Se hizo funcionar el módulo Hydrosart, tipo # 3
en una serie de ensayos inmediatamente subsiguiente, con otra
partida de homogeneizado bruto (# 3), a una carga de biomasa de 15
kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}, para abarcar
también efectos que sean originados por otro lote de homogeneizado
bruto.
El flujo del rechazo en el funcionamiento con el
producto, para la partida nueva de homogeneizado bruto # 3 se
encontraba constante en sólo 35 l/h durante 3 ciclos. El flujo del
infiltrado se encontraba constante entre 10 y 15 l/h m^{2} por 3
ciclos. La eliminación se encontraba entre 40% y 50% y la
transmisión media se encontraba entre 20% y 30%.
Los valores en agua, después de llevar a cabo el
protocolo estándar de limpieza, se encontraban constantes en 1300
l/h m^{2} de valor en agua del infiltrado y en 100 l/h de valor
en agua del rechazo.
También cambiando la partida de homogeneizado
bruto (# 3) se logró un flujo de infiltrado comparable al de los
experimentos anteriores con la primera partida de homogeneizado
bruto (# 1). El flujo de rechazo se encontraba notablemente más
bajo que en los experimentos anteriores. La capacidad de ser
limpiado del módulo Hydrosart, tipo # 3 se mantuvo en un nivel alto
constante.
En las figuras 9a/9b se ilustra una determinación
del punto de trabajo del módulo Hydrosart, tipo # 3, a una carga de
biomasa de 3 kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}
(correspondiente a 230 g/l). La representación de la figura 9a
corresponde a la elegida por Forman y col., en la que se describió
una determinación del punto de trabajo para una membrana Durapore
(0,45 \mum) a una concentración de biomasa de 25 g de equivalente
de peso celular húmedo/l, hasta una concentración de 100 g de
equivalente de peso celular húmedo/l. Si se comparan estos datos de
la bibliografía con los valores representados en la figura 9a para
el módulo Hydrosart modificado, tipo # 3, se destacan los
siguientes aspectos:
La TMP óptima para el módulo Hydrosart
modificado, tipo # 3, se encuentra en 0,35 bar. Un aumento por
encima de este óptimo conduce a un decrecimiento del flujo del
infiltrado, lo que se puede explicar por el aumento del grosor de la
capa de recubrimiento sobre la membrana.
El flujo del infiltrado logrado mediante el
módulo Hydrosart, tipo # 3, en este experimento, se encuentra en
aproximadamente 20 l/h m^{2}. Los flujos máximos de infiltrado
logrados con el módulo Durapore, a una concentración de biomasa de
100 g de equivalente de peso celular húmedo, se encuentran en < 8
l/h m^{2}. La TMP óptima para la membrana Durapore se encuentra
en aproximadamente 0,1 bar.
En la figura 9b está ilustrada la misma
determinación del punto de trabajo, en una representación
tridimensional. A una TMP de 0,35 bar y una alimentación de 100 l/h
existe un punto óptimo global. Adicionalmente, se encuentran puntos
óptimos locales a una alimentación de 70 y 150 l/h a una TMP de
también 0,35 bar. Los puntos de trabajo óptimos están compilados de
nuevo en una sinopsis en la tabla 2.
| TMP [bar] | Alimentación [l/h] | P de entrada [bar] | P de salida [bar] | P del infiltrado [bar] |
| 0,35 | 70 | 0,6 | 0,3 | 0,1 |
| 0,35 | 100 | 1,0 | 0,3 | 0,3 |
| 0,35 | 150 | 1,4 | 0,3 | 0,5 |
Valores óptimos globales y locales para el módulo
Hydrosart, tipo # 3. El valor óptimo global está marcado con
negrilla. Los otros dos puntos de trabajo representan valores
óptimos locales con los que también se pueden lograr flujos de
infiltrado satisfactorios. Carga de biomasa: 3 kg de equivalente de
peso celular húmedo/m^{2}. Concentración de biomasa: 230 g de
equivalente de peso celular húmedo/l de rechazo.
Una presión transmembránica de 0,35 bar también
ya resultó ser óptima antes, para los módulos Hydrosart estándar (no
se muestran los datos).
En ensayos independientes se obtuvieron los
siguientes resultados y desenriquecimiento de endotoxinas, a cargas
de biomasa de 15 y 45 kg de equivalente de peso celular
húmedo/m^{2} de superficie filtrante, usando el módulo Hydrosart,
tipo # 3 (0,1 m^{2} de superficie filtrante):
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
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La suma hallada de todas las endotoxinas se
encuentra en aproximadamente 90%. El desenriquecimiento de
endotoxinas desde el rechazo hacia el infiltrado se encuentra en
aproximadamente 50%, correspondiente a 0,3 grado logarítmico.
En la tabla 3 se muestran los resultados de
ensayos para el aumento de la escala. Para estos experimentos se
usaron módulos Hydrosart del tipo # 3 con una superficie filtrante
de 0,6 m^{2} por módulo (formato 2/3 de Sartocon). La instalación
usada en principio estaba construida de igual manera como está
descrita en el ejemplo 2. Pero se cambió el soporte del módulo de
placa por un soporte de Sartocon-3 y se cambió la
bomba por una bomba de pistón rotativo correspondientemente más
grande (4 m^{3}/h), con retén frontal de doble acción (empresa
Johnson). El volumen de rechazo colocado fue aumentado a 5 l y el
volumen muerto de la instalación se encontraba en 2,5 l. Los otros
volúmenes (por ejemplo, de soluciones limpiadoras y volúmenes de
tampón lavador) fueron adaptados en forma
correspondiente.
correspondiente.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Compilación de los resultados de los experimentos
para el aumento de escala en la microfiltración de homogeneizado
bruto de E. coli. A manera de ejemplo, se usaron cuerpos
proteicos de inclusión de interleucina-4 R121D
Y124D.
Los datos representan los valores medios de
respectivamente 3 experimentos independientes que fueron realizados
en condiciones estandarizadas iguales (para condiciones de
filtración y limpieza, véase el ejemplo 2).
Los datos compilados en la tabla 3 ponen en claro
que se puede cambiar la escala del módulo Hydrosart, tipo # 3 en
forma lineal, moviéndose los datos de rendimiento del formato del
módulo Sartocon-3 en forma correspondiente a los del
módulo de formato de placa. El aumento de la escala en un factor 6
tiene como consecuencia que el flujo del rechazo en el
funcionamiento con producto se incremente exactamente en un factor
6. En forma correspondiente, se incrementa el valor en agua para el
rechazo en exactamente el factor 6. Los otros datos de rendimiento,
como flujo del infiltrado en el funcionamiento con producto, el
valor en agua para el infiltrado, la eliminación y la transmisión
permanecen iguales, dentro de los límites de la respectiva exactitud
de determinación.
Apeler H, Wehlmann H (1998):
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Interleukin-4 and Interleukin-4
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Figura 1 Diafiltración de homogeneizado bruto de
E. coli (partida # 1) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D. 1º ciclo del producto
con un módulo estándar Hydrosart de placa (0,1 m^{2}) 3051860601
W-SG, lote Nº 96108741/13 nuevo, recién salido de
fábrica. 300 g de equivalente de peso celular húmedo (3 kg de
equivalente de peso celular húmedo/m^{2}). Volumen total de
rechazo: 2,55 l (117 g de equivalente de peso celular húmedo/l).
Figura 2 Diafiltración de homogeneizado bruto de
E. coli (partida # 1) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D. 1º ciclo del producto
con un módulo Hydrosart de placa modificado, tipo # 1 (0,1 m^{2}),
lote Nº 98025101, recién salido de fábrica. 300 g de equivalente de
peso celular húmedo (3 kg de equivalente de peso celular
húmedo/m^{2}). Volumen total de rechazo: 2,55 l (117 g de
equivalente de peso celular húmedo/l).
Figura 3a Flujo del rechazo (l/h) y flujo medio
del infiltrado (l/h m^{2}) en el funcionamiento con el producto,
dependiendo del número del ciclo. Diafiltración de homogeneizado
bruto de E. coli (partida # 1) con cuerpos proteicos de
inclusión de interleucina-4 R121D Y124D. 1º a 9º
ciclos de producto con un módulo Hydrosart de placa modificado, tipo
# 1 (0,1 m^{2}), lote Nº 98025101, recién salido de fábrica. 300 g
de equivalente de peso celular húmedo (3 kg de equivalente de peso
celular húmedo/m^{2}). Volumen total de rechazo: 2,55 l (117 g de
equivalente de peso celular húmedo/l).
Figura 3b Valores en agua antes y después del
funcionamiento con el producto. Flujo del rechazo (l/h) y flujo del
infiltrado (l/h m^{2}), dependiendo del número del ciclo.
Diafiltración de homogeneizado bruto de E. coli (partida # 1)
con cuerpos proteicos de inclusión de interleucina-4
R121D Y124D. 1º a 9º ciclos de producto con un módulo Hydrosart de
placa modificado, tipo # 1 (0,1 m^{2}), lote Nº 98025101, recién
salido de fábrica. 300 g de equivalente de peso celular húmedo (3 kg
de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}). Volumen total de
rechazo: 2,55 l (117 g de equivalente de peso celular húmedo/l).
Figura 4 Diafiltración de homogeneizado bruto de
E. coli (partida # 1) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D. 1º ciclo de producto con
un módulo Hydrosart de placa modificado, tipo # 2 (0,05 m^{2}),
lote Nº 98055101, recién salido de fábrica. 300 g de equivalente de
peso celular húmedo (3 kg de equivalente de peso celular
húmedo/m^{2}). Volumen total de rechazo: 1,3 l (230 g de
equivalente de peso celular húmedo/l).
Figura 5a Flujo del rechazo (l/h) y flujo medio
del infiltrado (l/h m^{2}) en el funcionamiento con producto,
dependiendo del número del ciclo. Diafiltración de homogeneizado
bruto de E. coli (partida # 1) con cuerpos proteicos de
inclusión de interleucina-4 R121D Y124D. 1º a 7º
ciclos de producto con un módulo Hydrosart de placa modificado, tipo
# 2 (0,05 m^{2}), lote Nº 98055101, recién salido de fábrica. 300
g de equivalente de peso celular húmedo (3 kg de equivalente de peso
celular húmedo/m^{2}). Volumen total de rechazo: 1,3 l (230 g de
equivalente de peso celular húmedo/l).
Figura 5b Valores en agua antes y después del
funcionamiento con producto. Flujo del rechazo (l/h) y flujo del
infiltrado (l/h m^{2}), dependiendo del número del ciclo.
Diafiltración de homogeneizado bruto de E. coli (partida # 1)
con cuerpos proteicos de inclusión de interleucina-4
R121D Y124D. 1º a 7º ciclos de producto con un módulo Hydrosart de
placa modificado, tipo # 2 (0,05 m^{2}), lote Nº 98055101, recién
salido de fábrica. 300 g de equivalente de peso celular húmedo (3 kg
de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}). Volumen de rechazo:
1,3 l (230 g de equivalente de peso celular húmedo/l).
Figura 6 Diafiltración de homogeneizado bruto de
E. coli (partida # 2) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D. 1ºciclo de producto con
un módulo Hydrosart de placa modificado, tipo # 3 (0,1 m^{2}),
lote Nº 99015111, recién salido de fábrica. 300 g de equivalente de
peso celular húmedo (3 kg de equivalente de peso celular
húmedo/m^{2}). Volumen de rechazo: 1,3 l (230 g de equivalente de
peso celular húmedo/l).
Figura 7a Flujo del rechazo (l/h) y flujo medio
del infiltrado (l/h m^{2}) en el funcionamiento con producto,
dependiendo del número del ciclo, aumentando la carga de biomasa en
la membrana. Diafiltración de homogeneizado bruto de E. coli
(partida # 2) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D. 1º a 5º ciclos de
producto en un módulo Hydrosart de placa modificado, tipo # 3 (0,1
m^{2}), lote Nº 99015111, recién salido de fábrica. 3 kg de
equivalente de peso celular húmedo/m^{2}, 5 kg/m^{2}, 10
kg/m^{2}, 15 kg/m^{2}, correspondientes a 230 g de equivalente
de peso celular húmedo/l, 384 g/l, 770 g/l, 1153 g/l.
Figura 7b Valores en agua antes y después del
funcionamiento con producto. Flujo del rechazo (l/h) y flujo del
infiltrado (l/h m^{2}), dependiendo del número del ciclo.
Diafiltración de homogeneizado bruto de E. coli (partida # 2)
con cuerpos proteicos de inclusión de interleucina-4
R121D Y124D. 1º a 5º ciclos de producto con un módulo Hydrosart de
placa modificado, tipo # 3 (0,1 m^{2}), lote Nº 99015111, recién
salido de fábrica. 3 kg de equivalente de peso celular
húmedo/m^{2}, 5 kg/m^{2}, 10 kg/m^{2}, 15 kg/m^{2},
correspondientes a 230 g de equivalente de peso celular húmedo/l,
384 g/l, 770 g/l, 1153 g/l.
Figura 8 Aumento por etapas de la carga de
biomasa.
A. Diafiltración de homogeneizado bruto de E.
coli (partida # 2) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D, con un módulo Hydrosart
de placa modificado, tipo # 3 (0,1 m^{2}), lote Nº 99015111.
Condiciones iniciales: 1500 g de equivalente de peso celular húmedo
(15 kg de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}). Volumen de
rechazo: 1,3 l (1153 g de equivalente de peso celular húmedo/l).
Aumento por etapas de la carga de biomasa en la membrana en los
momentos indicados en el gráfico, en el transcurso de la
diafiltración, a 20, 22, 24 y finalmente, a 26 kg de equivalente de
peso celular húmedo/m^{2}. Por el cambio de volumen en el rechazo,
resultan correspondientemente 1176 g de equivalente de peso celular
húmedo/l, 1466 g/l, 1600 g/l y finalmente, 1733 g/l.
B. Diafiltración de homogeneizado bruto de E.
coli (partida # 3) con cuerpos proteicos de inclusión de
interleucina-4 R121D Y124D, con un módulo Hydrosart
de placa estándar (0,1 m^{2}), lote Nº 96108741/008. Condiciones
iniciales: 300 g de equivalente de peso celular húmedo (3 kg de
equivalente de peso celular húmedo/m^{2}). Volumen de rechazo: 1,3
l (230 g de equivalente de peso celular húmedo/l). Aumento por
etapas de la carga de biomasa en la membrana, en los momentos
indicados en el gráfico, en el transcurso de la diafiltración, a 5
kg y finalmente, a 10 kg de equivalente de peso celular
húmedo/m^{2}. Después de esto, debido a los bajos flujos del
infiltrado, se interrumpió el experimento. Se mantuvo constante el
volumen del rechazo en 1,3 l. De esto en el rechazo resultan de
manera correspondiente 384 g de equivalente de peso celular húmedo/l
y 769 g/l, dependiendo de la concentración de
biomasa.
biomasa.
Figura 9a Establecimiento del punto de trabajo
del módulo Hydrosart modificado, tipo # 3. Carga de biomasa: 3 kg
de equivalente de peso celular húmedo/m^{2} (230 g de equivalente
de peso celular húmedo/l), homogeneizado bruto de partida # 2. El
flujo del infiltrado está representado en dependencia de la presión
transmembránica (TMP). El flujo del rechazo (F_{r}) fue fijado en
aproximadamente 110 l/h y aproximadamente 140 l/h. Se realizó el
experimento reciclando totalmente todas las corrientes de
volumen.
Figura 9b Establecimiento del punto de trabajo
del módulo Hydrosart modificado, tipo # 3. Carga de biomasa: 3 kg
de equivalente de peso celular húmedo/m^{2} (correspondiente a 230
g de equivalente de peso celular húmedo/l), homogeneizado bruto de
la partida # 2. Se representa el flujo del infiltrado en dependencia
con la presión transmembránica (TMP) y la alimentación (= flujo del
rechazo + flujo del infiltrado). Se realizó el experimento
reciclando totalmente todas las corrientes de volumen.
Figura 10 Representación esquemática de la
construcción de ensayo de una instalación de microfiltración de
corriente transversal
El volumen muerto de la instalación usada
asciende a 0,55 l.
Claims (3)
1. Procedimiento para la purificación y/o
concentración de cuerpos proteicos de inclusión en una solución,
caracterizado porque la solución que contiene cuerpos
proteicos de inclusión es conducida pasando en forma tangencial por
una o más membranas semipermeables, de tal manera que los cuerpos
proteicos de inclusión son retenidos por las membranas y las
sustancias o componentes de peso molecular o diámetro de partículas
menores pueden atravesarlas, obteniéndose una solución purificada
y/o concentrada de cuerpos proteicos de inclusión, en el que sobre
la membrana semipermeable está colocada una matriz de mallas
abiertas que está compuesta por hilos longitudinales y transversales
que se cruzan, de tal manera que los hilos longitudinales y
transversales vecinos guardan respectivamente una distancia entre
ellos de 5 a 15 veces mayor que su grosor, que se encuentra en el
intervalo de 150 a 600 \mum.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la carga de biomasa en la membrana es
mayor de 65 g de equivalente de peso celular húmedo/m^{2}.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la carga de biomasa es mayor de 650 g de
equivalente de peso celular húmedo/m^{2}.
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