CN112695053B - 一种重组猫干扰素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组猫干扰素的制备方法，该方法通过优化猫ω干扰素的序列以及去除原有信号肽，构建原核表达重组质粒。经过培养携带该重组质粒的大肠杆菌获得种子液，接种菌液然后经低温诱导获得发酵菌液，经离心，破碎，收获上清可溶性蛋白，最后经过镍柱亲和层析和透析超滤获得猫干扰素。该方法的优势在于根据大肠杆菌密码子偏好进行序列优化，同时去除原核表达中不需要的信号肽以及采用低温诱导，提高了原本在包涵体中表达的蛋白的可溶性，进一步简化了纯化工艺并提高了蛋白活性。

Description

一种重组猫干扰素的制备方法
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种重组猫干扰素的制备方法。
背景技术
猫干扰素是一种具有较强抗病毒能力的糖蛋白，临床上已经将其用于防治猫细小病毒病、猫传染性腹膜炎、猫水泡口炎病毒病等。随着分子生物学的发展，利用基因工程的方法将体外合成的干扰素已经获得成功。大肠杆菌表达系统因其具有高效、成本低廉等先天优势，成为现有技术中生产猫干扰素等蛋白的首要选择，但由于其表达效率过高、速度过快，往往使表达的外源蛋白不能正确折叠形成具有正确空间结构和特定生物学功能的蛋白质，表达产物常以不可溶的包涵体形式存在，因此将大肠杆菌表达系统表达的猫干扰素用于临床须进行蛋白复性，溶解包涵体需要高浓度的裂解液(8M尿素)，在后期去除裂解液的过程中由于难以控制裂解液的置换速率，常由于环境变化过于剧烈导致复性产物再次聚集失活。此外，为保证复性产物不再次聚集失活，在置换裂解液的过程中需要大量含有相对低浓度裂解液的置换液，而大量置换液的引入又会导致过低的复性收率，且由于置换步骤多导致成本高耗时长不适合规模化生产。因此，市场上大规模生产重组干扰素采用杆状病毒表达系统进行真核表达，成本较高，周期较长。本发明建立一套提高重组猫干扰素可溶性和活性的原核表达系统，使原核表达猫干扰素投入临床应用成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组猫干扰素的制备方法，旨在通过序列优化和低温诱导提高猫干扰素在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达，同时还提高蛋白的抗病毒活性。
为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组猫干扰素的制备方法，其具体步骤为：
1)根据大肠杆菌密码子偏好优化猫干扰素基因序列，并去除原有信号肽，优化后的序列如SEQ ID NO.2所示；
2)构建含有上述猫干扰素基因优化序列的重组质粒的大肠杆菌表达体系，并培养以获得种子液；
3)种子液经扩大培养后诱导表达，得到发酵菌液；
4)发酵菌液经破碎、离心后得到可溶性重组蛋白的上清液；
5)上清液经过镍柱亲和纯化以及透析、超滤后得到重组猫干扰素。
优选地，步骤2)中所述的大肠杆菌表达载体为pET-32a。
优选地，步骤3)中所述的诱导表达温度为18℃。
优选地，步骤3)中所述的诱导表达IPTG终浓度为0.6-0.8mmol/L。
优选地，步骤3)中所述的诱导表达时间为12-16小时。
优选地，步骤5)中所述的透析所用透析袋规格为10-15kd。
优选地，步骤5)中所述的超滤所用超滤管规格为10kd。
优选地，步骤5)中所述的透析所用溶剂以及所述的超滤所用置换溶液均为磷酸盐平衡生理盐水缓冲液。
采用上述技术方案，本发明具有的有益效果为：
1.本发明通过对猫干扰素序列根据大肠杆菌密码子偏好并去除原有信号肽进行优化，提高了重组蛋白的可溶性，减少了其在包涵体中的表达，从而使其能更好地应用于临床，本发明所使用的表达系统成本低廉，容易获得。
2.本发明通过优化诱导温度，进一步提高了重组蛋白在上清液中的表达量。
3.本发明制备的重组猫干扰素安全性好，抗病毒活性高。试验证明，其对CRFK细胞的最大安全浓度达47.4μg/mL，对VSV-GFP病毒的TCID50达106.4/100μL，活性优于现有商品化真核表达的FeIFN-ω。
4.本发明还具有生产成本低，工艺简单，蛋白得率高等优点。
附图说明
图1.优化前后FeIFN-ω2核酸序列的比较结果。
图2.FeIFN-ω2的PCR扩增结果，M.marker 2000；1-5.FeIFN-ω2优化序列扩增条带。
图3.不同温度下pET-32a-FeIFN-ω2序列优化前后的诱导表达情况；
A)序列优化前的重组干扰素表达，M.蛋白标准分子量；1.pET-32a-FeIFN-ω2 37℃诱导上清；2.pET-32a-FeIFN-ω2 37℃诱导沉淀；pET-32a-FeIFN-ω2 26℃诱导上清；pET-32a-FeIFN-ω2 26℃诱导沉淀；pET-32a-FeIFN-ω2 18℃诱导上清；pET-32a-FeIFN-ω2 18℃诱导沉淀；
B)序列优化后的重组干扰素表达，M.蛋白标准分子量；1.pET-32a-FeIFN-ω2 37℃诱导上清；2.pET-32a-FeIFN-ω2 37℃诱导沉淀；pET-32a-FeIFN-ω2 26℃诱导上清；pET-32a-FeIFN-ω2 26℃诱导沉淀；pET-32a-FeIFN-ω2 18℃诱导上清；pET-32a-FeIFN-ω2 18℃诱导沉淀。
图4.pET-32a-FeIFN-ω2纯化情况，M.蛋白标准分子量；1.pET32a未诱导菌液；2.pET32a诱导菌液；3.pET32a-FeIFN-ω2 18℃诱导菌液；pET32a-FeIFN-ω2 18℃诱导菌液上清；pET32a-FeIFN-ω2重组蛋白的His-tag亲和层析纯化结果。
图5.重组FeIFN-ω2对CRFK的细胞毒性。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。未详细说明的方法和步骤请参照本领域常规的实验方法和步骤进行。
实施例1：猫干扰素序列的优化以及表达载体构建
1.猫干扰素序列的优化：
根据GenBank登录的猫干扰素FeIFN-ω2基因序列(NM_001102440.1)，使用Signal4.0进行分析，去除信号肽序列，根据大肠杆菌密码子偏好表在不改变氨基酸序列的情况下进行序列优化(SEQ ID NO.2)，序列全长543bp，由上海生工合成，优化前后比较结果见图1。根据未优化序列(SEQ ID NO.1)，使用Primer Premier5.0软件设计引物将合成片段连接到原核表达载体pET-32a，上游引物pET32a-FeIFN-ω2-F1为gctgatatcggatccgaattcTGCGCGCTGCCG(EcoRI)，下游引物pET32a-FeIFN-ω2-R1为gtggtggtggtggtgctcgagTCAAGATGAGCCCAGGTC(XhoI)。根据优化序列(SEQ ID NO.2)，使用Primer Premier5.0软件设计引物将合成片段连接到原核表达载体pET-32a，上游引物pET32a-FeIFN-ω2-F2为gctgatatcggatccgaattcTGCGCGCTGCCG(EcoRI)，下游引物pET32a-FeIFN-ω2-R2为gtggtggtggtggtgctcgagTTAGCTTGAGCCGTC(XhoI)，由武汉生工合成。
2.猫干扰素表达载体构建：
分别以猫淋巴结cDNA和合成的优化序列后的FeIFN-ω2为模板，pET32a-FeIFN-ω2-F1/R1、pET32a-FeIFN-ω2-F2/R2为引物，进行PCR扩增，将pET-32a同源臂引入序列。PCR反应体系如下：模板0.5μL；pET32a-FeIFN-ω2-F/R各1.0μL；dNTPs(10.0mM)0.4μL；PhantaMax Fidelity DNA Polymerase(1U/μL)0.2μL；；2XPhanta Max Buffer10μL；ddH2O补足至20μL。PCR反应条件：预变性95℃3min；变性95℃15sec；退火69℃15sec；延伸72℃30sec；彻底延伸72℃5min。反应结束后，以1.0％的琼脂糖进行核酸电泳检测(图2)，540bp左右有明显条带。
用限制性内切酶EcoRI和XhoI对pET-32a载体和回收的PCR产物进行双酶切，反应体系如下：PCR回收产物(1μg)或pET-32a载体(1μg)，EcoRI 1.0μL，XhoI 1.0μL，10×FastDigest Buffer 2.0μL，ddH2O补足至20μL，混匀后置于水浴上，37℃反应0.5h。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测。将大小正确的酶切产物回收。
应用TaKaRa公司的T4DNA连接酶对回收的酶切产物FeIFN-ω2目的片段和pET-32a载体进行连接。连接体系：T4DNA Ligase(350U/μL)1.0μL；10×T4DNA Ligase Buffer1.0μL；FeIFN-ω2目的片段6.0μL；pET-32a载体2.0μL；ddH2O补足至10.0μL，混匀后置于金属浴上，37℃反应0.5-1h。
转化感受态细胞DH5α扩增后测序鉴定重组阳性克隆，获得pET-32a-FeIFN-ω2。
使用天根质粒小提试剂盒提取pET-32a-FeIFN-ω2质粒。
将pET-32a-FeIFN-ω2质粒转化感受态BL21(DE3)扩增后测序鉴定，得到含有pET-32a-FeIFN-ω2质粒的BL21菌液。
实施例2：猫干扰素诱导诱导表达和纯化
1.不同温度下猫干扰素的制备：
分别将序列未优化和优化后的pET-32a-FeIFN-ω2(BL21)菌种在37℃下，摇床180r/min培养12h。
将过夜培养的菌液以1：100的浓度接种氨苄青霉素抗性的LB培养基，培养至OD600至0.6，加入IPTG使其终浓度0.6mmol/L，分别在18℃、26℃、37℃诱导12h。12,000rpm离心2min收集诱导和未诱导的菌体，用PBS重悬后分别与5×SDS-PAGE上样缓冲液按照1:4的比例混匀，之后将蛋白样品置于沸水浴中加热5min，冷却至室温后，以1500rpm离心30s，取适量上清，进行15％聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)，之后观察目的蛋白的表达情况(图3)。结果表明，未优化序列的pET-32a-FeIFNω2在不同温度下均在包涵体中大量表达，序列优化后，随着温度降低，pET-32a-FeIFNω2在上清中的表达量逐渐增高。当诱导温度为18℃时，经过序列优化的pET-32a-FeIFNω2在上清中大量表达，重组蛋白的可溶性得到进一步改善。
2.重组蛋白的纯化：
将1L诱导后收集的pET-32a-FeIFN-ω2菌液用PBS清洗后，1500mPa压力破碎，4℃、10000r/min，离心10min，收集上清0.22μm滤器过滤，放于4℃备用。镍柱亲和层析法纯化，SDS-PAGE观察纯化情况(图4)。将纯化好的蛋白用10-15kd透析袋4℃透析过夜，透析所用溶液为磷酸盐平衡生理盐水缓冲液。将透析过夜的蛋白吸出，用10kd超滤管4℃，4000g离心15min，离心三次，置换溶液为磷酸盐平衡生理盐水缓冲液。超滤后吸出滤膜中剩余的蛋白溶液，分装后-20℃保存备用。
实施例3：重组FeIFN-ω2细胞毒性测定
取生长良好的CRFK细胞，按照100μL/well接种96孔板中进行培养，待长至单层，倒掉培养基，用DMEM冲洗，加入1％FBS DMEM倍比稀释的重组FeIFN-ω2(4倍稀释)，每孔加100μL，每个浓度做3孔，孵育24h，向每孔加入10μLCCK8溶液，37℃孵育1h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，并计算细胞活力，公式为细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]*100％，利用Graphpad绘制统计图(图5)。结果表明，随着稀释倍数的提高，重组FeIFN-ω2对细胞活力的影响逐渐降低，当浓度达到47.4μg/mL时，细胞活力维持在与正常CRFK细胞相同的范围内，说明重组FeIFN-ω2的浓度在低于47.4μg/mL时，其对细胞活力没有明显影响。
实施例4：重组FeIFN-ω2抗VSV-GFP活性测定
1.VSV TCID50的测定：
取生长良好的CRFK细胞，按照100μL/well铺到96孔板中进行培养，待长至单层，倒掉培养基，用DMEM冲洗，加入DMEM倍比稀释的VSV-GFP(10倍梯度)，每孔加100μL，每个浓度做8孔，继续细胞培养，每隔12-16h观察一次，记录每个孔的细胞病变情况(表1)，按Reed-Muench法计算VSV-GFP的TCID50。
表1不同稀释度VSV-GFP病毒使CRFK细胞病变情况
Figure BDA0002935289190000051
Figure BDA0002935289190000061
根据Reed-Muench法计算VSV-GFP的TCID50为106.4/100μL。
2.重组FeIFN-ω2抗VSV-GFP活性测定：
将生长状态良好的CRFK细胞消化后计数，以100μL/well均匀的铺到96孔板中，培养至细胞长至单层，吸出培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗3次，将4％FBS的DMEM培养基10倍倍比稀释纯化后的重组FeIFN-ω2加入细胞培养板中，每孔100μL，每个稀释度做6孔，放入37℃5％CO2培养箱中作用18h，弃掉含重组FeIFN-ω2的培养基，用DMEM培养基轻轻冲洗3次，每孔加入100μL含100TCID50的VSV-GFP病毒，37℃5％CO2培养箱中培养，同时设阴性对照(不加病毒只加入干扰素)、阳性对照(不加重组FeIFN-ω2，只加VSV-GFP病毒)和空白对照(只有细胞，不加病毒和干扰素)。每12h于倒置显微镜下观察细胞生长情况，待75％以上阳性对照孔的CRFK细胞可观察到明显病变和荧光时，统计各稀释度的细胞孔中的病变情况(表2)，以抑制半数细胞病变的干扰素的稀释度为1个干扰素单位(U)。按Reed-Muench法计算重组FeIFN-ω2的活性。以相同方法检测并计算真核表达的商品化FeIFN-ω，比较二者活性。
表2不同稀释度重组干扰素抑制VSV-GFP病毒复制情况
Figure BDA0002935289190000062
Figure BDA0002935289190000071
根据Reed-Muench法计算出重组FeIFN-ω2的活性为2.91x1010U/mg，商品化FeIFN-ω活性为2.63x106U/mg。
结果表明，经过优化后的重组干扰素FeIFN-ω2具有显著的抗病毒活性，在较低浓度下仍可以抑制病毒的复制，其效果明显优于真核表达的商品化FeIFN-ω。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种重组猫干扰素的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> 猫ω干扰素(FeIFN-ω)
<400> 1
tgcgcgctgc cggggagcca cgcgcaggtt agcagggaca acttggtgct cctgggccag 60
atgcggagac tgtccccttt cttgtgcctg cgggccagaa aagacttccg cttcccccgg 120
gagatgctgg agggcggcca gctccgggag gcccaggccg ccgccgccgt cctgcgggag 180
ctgctccagc agaccttcaa cctgttgcac acggagcgct cctcggcggc ctggagcccc 240
gcgccgctgc acggactccg ctctggcctc caccggcagc tggaagccct ggacgcctgc 300
ttgctgcagg ccacgggcga gggagagcgc gccacgggcg agggagagcg cgccccgggg 360
atgcacggcc ctgtcctggc catcaagagg tacttccagg acatccgcgt ctacctggag 420
gacgagggat acagtgactg cgcctgggaa attgtcaggc tggaaatcat gagagccttg 480
tcctcctcgg cgaccttgca agacagcttg gccatcaagg atggagacct gggctcatct 540
tga 543
<210> 2
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tgcgcgctgc cgggtagcca cgcgcaggtt agccgtgata acctggttct gctgggccag 60
atgcgtcgtc tgagcccgtt cctgtgcctg cgtgcgcgta aagatttccg tttcccgcgt 120
gaaatgctgg aaggtggcca gctgcgtgaa gcgcaggcgg ctgcggcggt tctgcgtgaa 180
ctgctgcagc agaccttcaa cctgctgcac accgaacgtt ctagcgcggc gtggagcccg 240
gcgccgctgc acggcctgcg tagcggcctg caccgccagc tggaagcgct ggatgcgtgc 300
ctgctgcagg cgaccggcga aggtgaacgt gcgaccggcg aaggcgaacg tgcgccgggc 360
atgcacggcc cggttctggc gatcaaacgt tacttccagg atatccgtgt ttacctggaa 420
gatgaaggct actctgattg cgcgtgggaa atcgttcgtc tggaaatcat gcgtgcgctg 480
agctctagcg cgaccctgca ggatagcctg gcgatcaaag atggtgatct gggctctagc 540
taa 543

Claims (5)

1.一种重组猫干扰素的制备方法，其特征在于包括：
1)根据大肠杆菌密码子偏好优化猫干扰素基因序列，并去除原有信号肽，优化后的序列如SEQ ID NO.2所示；
2)构建含有上述猫干扰素基因优化序列的重组质粒的大肠杆菌表达体系，并培养以获得种子液；
3)种子液经扩大培养后诱导表达，所述的诱导表达温度为18℃，时间为12-16小时，IPTG终浓度为0.6-0.8mmol/L，得到发酵菌液；
4)发酵菌液经破碎、离心后得到可溶性重组蛋白的上清液；
5)上清液经过镍柱亲和纯化以及透析、超滤后得到重组猫干扰素。
2.根据权利要求1所述的重组猫干扰素的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的大肠杆菌表达载体为pET-32a。
3.根据权利要求1所述的重组猫干扰素的制备方法，其特征在于：步骤5)中所述的透析所用透析袋规格为10-15kd。
4.根据权利要求1所述的重组猫干扰素的制备方法，其特征在于：步骤5)中所述的超滤所用超滤管规格为10kd。
5.根据权利要求1所述的重组猫干扰素的制备方法，其特征在于：步骤5)中所述的透析所用溶液以及所述的超滤所用置换溶液均为磷酸盐平衡生理盐水缓冲液。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113185601A (zh) * 2021-06-09 2021-07-30 唐山怡安生物工程有限公司 一种大熊猫干扰素的制备方法
CN113322222A (zh) * 2021-07-02 2021-08-31 江苏恒丰强生物技术有限公司 一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺
CN113430220A (zh) * 2021-08-17 2021-09-24 江苏恒丰强生物技术有限公司 一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌合成方法、构建方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1730491A (zh) * 2005-08-09 2006-02-08 中国科学院微生物研究所 猫ω干扰素及其编码基因与应用
CN1919870A (zh) * 2006-09-13 2007-02-28 中国科学院微生物研究所 一种猫α干扰素及其编码基因与其应用
CN109206501A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 东北农业大学 猫干扰素ω、其编码基因及其在抗病毒方面的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104311671B (zh) * 2013-11-14 2017-06-16 长春西诺生物科技有限公司 猫长效融合干扰素及其制备方法与应用
WO2016157929A1 (ja) * 2015-03-31 2016-10-06 国立研究開発法人産業技術総合研究所 インターフェロンαの経口投与による慢性難治性外耳炎治療効果
CN109206502B (zh) * 2018-09-26 2022-03-04 东北农业大学 一种猫干扰素ω及其制备方法和在抗病毒中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1730491A (zh) * 2005-08-09 2006-02-08 中国科学院微生物研究所 猫ω干扰素及其编码基因与应用
CN1919870A (zh) * 2006-09-13 2007-02-28 中国科学院微生物研究所 一种猫α干扰素及其编码基因与其应用
CN109206501A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 东北农业大学 猫干扰素ω、其编码基因及其在抗病毒方面的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cloning, Prokaryotic Soluble Expression, and Analysis of Antiviral Activity of Two Novel Feline IFN-ω Proteins;Xiaona Wang et al.,;《Viruses》;20200319;第12卷;全文 *
猫α和ω干扰素的原核表达及抗病毒活性测定;仇婧;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》;20160815(第08期);摘要，第20页第1.5.5节 *

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