WO2016157929A1 - インターフェロンαの経口投与による慢性難治性外耳炎治療効果 - Google Patents

インターフェロンαの経口投与による慢性難治性外耳炎治療効果 Download PDF

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WO2016157929A1
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interferon
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present
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伊藤　亮
松村　健
亨 五反田
紀子 田林
紀子 一町田
青木　隆
羽衣子 加賀谷
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
ホクサン株式会社
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    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals

Definitions

  • the present invention relates to a composition for oral administration for the prevention and / or treatment of chronic intractable otitis externa, comprising interferon ⁇ as an active ingredient.
  • otitis externa is one of the diseases that, when chronic, causes great headaches for effective treatment for veterinarians and owners. Although treatment strategies are extensive, various drugs are used to treat otitis externa. In addition, for otitis externa, coping therapy with anti-inflammatory agents and antibacterial substances is generally performed, and no preventive treatment is performed at present.
  • IFN interferon
  • human IFN- ⁇ was intravenously administered to human atopic dermatitis and showed a certain effect on the dermatitis (Patent Document 1).
  • non-human mammals showed an effect on otitis media by feeding human IFN ⁇ with milk substitute in, for example, cattle (Non-patent Document 1).
  • Patent Documents 2 and 3 It has also been reported that for dog refractory dermatitis, improvement of the dermatitis was observed by administering canine IFN- ⁇ by subcutaneous injection. Many of such existing interferon-containing preparations are generally administered at a high concentration of invasive administration (subcutaneous or intravenous injection). However, it is difficult to completely cure chronic refractory otitis externa such as malassezia otitis externa, and an excellent preventive or therapeutic agent has not been found.
  • JP-A-6-48957 Japanese Patent Laid-Open No. 10-306037 JP 2000-316585 A
  • the present inventors significantly improved the disease by orally administering a composition containing interferon (IFN) ⁇ as an active ingredient to a subject suffering from chronic intractable otitis externa that is difficult to treat by conventional techniques.
  • IFN interferon
  • the present invention provides a composition and pharmaceutical composition for oral administration (or for oral mucosa application or gingival application) for the prevention and / or treatment of chronic refractory otitis externa, comprising IFN- ⁇ as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing and / or treating chronic refractory otitis externa.
  • the present invention is as follows.
  • a method for preventing and / or treating chronic intractable otitis externa comprising orally administering interferon ⁇ .
  • the method of [7] above comprising orally administering a composition comprising interferon ⁇ and a chewable carrier or a paste-like carrier.
  • the method according to [8] above wherein 0.5 to 25000 LU / day of interferon ⁇ is orally administered per kg of body weight.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is a chewable carrier or a paste-like carrier.
  • composition for preventing and / or treating chronic refractory otitis externa of mammals according to the present invention can be prevented and treated by orally administering (or applying to the oral mucosa) the mammal. .
  • the result of confirming the introduction of CaIFN ⁇ -4 gene into strawberries by PCR is shown.
  • the results of cytopathic inhibitory effect and antiviral activity by CaIFN ⁇ -4 genetically modified strawberry fruit crushing liquid are shown.
  • 2500 LU of IFN ⁇ -4 per day per day was applied to the gingiva of the test dog for 21 days before feeding, and the observations of the external ear with the 3 groups were recorded.
  • the change of the clinical observation of the outer ear of each group during the administration period is shown.
  • the outer ear findings photograph of each test dog 21 days after the start of administration and the brown degree of earwax are shown.
  • the present invention relates to a composition for oral administration, oral mucosal application or gingival application of prevention and / or treatment of chronic refractory otitis externa containing interferon ⁇ as an active ingredient.
  • the composition of the present invention can be produced by combining IFN ⁇ and a biologically acceptable carrier.
  • Interferon is a protein having a molecular weight of about 20 kDa that is secreted in the living body of animals due to virus infection and the like.
  • IFN Interferon
  • mammals there are three types of IFNs: ⁇ , ⁇ , and ⁇ . Of these, ⁇ and ⁇ have structural similarities. For example, in humans and mice, there is a homology between ⁇ - ⁇ of about 40% in base sequence and about 35% in amino acid sequence. These IFNs are collectively referred to as type I IFNs.
  • type I IFN has been shown to have effects such as cytostatic effects, antitumor effects, activation of immune cells such as macrophages, and immune response regulation.
  • Polymorphism is seen in IFN ⁇ of mammals such as humans and mice. For example, in humans, 15 or more highly homologous genes (85% or more) have been found. A major feature is that there is no intron in the gene of IFN ⁇ , and there are a plurality of genes containing these polymorphisms in the genome.
  • IFN ⁇ includes all subtypes caused by these polymorphisms. Furthermore, in the amino acid sequences constituting these subtypes, one or more amino acid sequences include an amino acid sequence added, deleted, substituted, or inserted, and have a biological activity equivalent to or higher than that of IFN ⁇ . Proteins having a can also be used as IFN ⁇ in the present invention. As IFN ⁇ in the present invention, IFN ⁇ derived from any animal species can be used. Preferably, dog-derived IFN ⁇ can be used. More specifically, canine IFN ⁇ (hereinafter sometimes referred to as “CaIFN ⁇ -4”) has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • IFN ⁇ derived from other species can be used as long as it has a preventive and / or therapeutic effect on chronic intractable otitis externa.
  • IFN ⁇ subtypes derived from the following species are known.
  • the base sequence and amino acid sequence can be referred to by the GenBank accession number described below.
  • new subtypes may be found in addition to these subtypes.
  • Subtypes newly found in the future can also be used as IFN ⁇ in the present invention as long as they have the necessary activity.
  • the amino acid sequence usually specified by these accession numbers includes a signal sequence.
  • a mature protein from which the signal sequence has been removed is usually used as IFN ⁇ in the present invention.
  • the precursor protein consisting of an amino acid sequence with all or part of the signal sequence has the biological activity of IFN ⁇
  • the precursor protein can also be used as IFN ⁇ .
  • a precursor protein that can acquire the biological activity of IFN ⁇ by removing all or part of the signal sequence after administration can also be used as the IFN ⁇ of the present invention.
  • FeIFN-w E02521 FeIFN-a1: AY117395 FeIFN-a2: AY117394 FeIFN-a3: AY117393 FeIFN-a5: AY117392 FeIFN-a6: AY117391 FeIFN-a7: AB094996 FeIFN-a8: AB094997 FeIFN-a9: AB094998 FeIFN-a10: AB094999 FeIFN-a11: AB095000 FeIFN-a12: AB095001 FeIFN-a13: AB095002 FeIFN-a14: AB095003
  • Rodent IFN ⁇ (8 subtypes) D00460, M13660, M13710, X01969, X01971, X01972, X01973, X01974
  • Bovine IFN ⁇ (8 subtypes) M10952, M10953, M10954, M10955, M11001, X93087, X93088, X93089
  • IFN preparations have been put into practical use. These are all natural IFN ⁇ and are all included in preferred IFN ⁇ in the present invention.
  • OIF Oxitomo Pharmaceutical, BALL-1 Sumiferon (Sumitomo Pharmaceutical, NAMALWA) Wellferon (Glaxo-Wellcome, ⁇ -n1) Alferon (Purdue Frederick Co., ⁇ -n3)
  • BALL-1, NAMALWA, ⁇ -n1, and ⁇ -n3, which are also described as the origin of the above-mentioned natural type IFN ⁇ , are all the names of cell lines from which each IFN ⁇ is derived.
  • the natural type refers to IFN ⁇ produced by a cell line established from a living body regardless of genetic recombination. Natural IFN ⁇ can be recovered from the culture by, for example, culturing the cell line described above as the origin. Methods for culturing these cell lines and recovering IFN ⁇ from the culture are known.
  • recombinant IFN ⁇ is also included in the preferred IFN ⁇ of the present invention.
  • Recombinant IFN ⁇ is IFN ⁇ obtained by artificially expressing DNA encoding the amino acid sequence of IFN ⁇ .
  • a protein in which the amino acid sequence is modified can be used as the IFN ⁇ in the present invention. Specifically, for example, the following protein can be indicated as IFN ⁇ in the present invention.
  • A a protein comprising the amino acid sequence of said natural IFN ⁇
  • B a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, added, or inserted in the amino acid sequence of the natural IFN ⁇ , and having a biological activity equivalent to that of the natural IFN ⁇ .
  • C a protein encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence encoding said natural IFN ⁇ , and having a biological activity equivalent to that of natural IFN ⁇
  • said natural A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of IFN ⁇ and having biological activity equivalent to that of natural IFN ⁇ .
  • the biological activity of natural IFN ⁇ refers to the suppression, improvement, reduction, treatment or prevention of skin diseases, preferably chronic intractable otitis externa, by oral administration, oral mucosal application, or gingival application of the protein. Say what you can do. The fact that a protein has such an activity can be confirmed by actually applying the protein to the gums of a subject animal, for example.
  • Such an IFN ⁇ having a modified amino acid sequence can be referred to as a “variant” (modified) of IFN ⁇ .
  • a variant modified
  • Various techniques for modifying a given amino acid sequence are known. For example, a mutation can be introduced into the base sequence of a polynucleotide encoding IFN ⁇ , thereby altering the amino acid sequence encoded thereby.
  • By altering the amino acid sequence its biological activity can be regulated. For example, the biological activity of IFN ⁇ can be enhanced or the stability in the living body can be improved.
  • the alteration of the amino acid sequence is brought about by substitution, deletion, addition and insertion of amino acid residues.
  • Amino acid residue substitutions, deletions, additions, and insertions can each be made alone, or two, three, or all modifications can be made.
  • arbitrary modifications selected from the group consisting of substitution, deletion, addition, and insertion of amino acid residues can be applied at one or more positions in the amino acid sequence of natural IFN ⁇ .
  • Such variants also include fusion proteins comprising all or part of the IFN ⁇ amino acid sequence. Methods for predicting the effect of amino acid sequence changes on protein structure are known. Therefore, a variant of IFN ⁇ can be designed according to known methods.
  • amino acid sequence can be modified while maintaining the biological activity.
  • cysteine residues can be substituted or removed to prevent unwanted disulfide bonds.
  • protease sensitivity of IFN ⁇ can be regulated by altering the amino acid sequence. If protease resistance is imparted, the expression of IFN ⁇ can also be enhanced by preventing proteolysis by proteases in the expression system.
  • substitution of amino acid residues having similar properties in the modification of the amino acid sequence of IFN ⁇ is useful for maintaining protein structure and activity.
  • Substitution of amino acid residues that are similar in nature is called a conservative substitution.
  • a “conservative substitution” refers to an amino acid substitution that does not significantly alter the tertiary structure and / or activity of the protein. For example, substitution of an amino acid included in the following group with another amino acid residue in the group is included in the conservative substitution.
  • Neutral hydrophobic side chain (alanine, tryptophan, valine, phenylalanine, proline, methionine, leucine); (2) Neutral polar side chain (asparagine, glycine, glutamine, cysteine, serine, tyrosine, threonine); (3) basic side chains (arginine, histidine, lysine); (4) acidic side chains (aspartic acid, glutamic acid); (5) aliphatic side chains (alanine, isoleucine, glycine, valine, leucine); (6) aliphatic hydroxyl side chain (serine, threonine); (7) Amine-containing side chains (asparagine, arginine, glutamine, histidine, lysine); (8) aromatic side chains (tyrosine, tryptophan, phenylalanine); and (9) sulfur-containing side chains (cysteine, methionine).
  • amino acid substitution various methods known to those skilled in the art can be used. Specifically, the site-directed mutagenesis method of Kunkel et al. (Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985) can be used for amino acid substitution. . Alternatively, a polynucleotide comprising a base sequence encoding the assumed amino acid sequence can be chemically synthesized.
  • the number of amino acid residues to be substituted, deleted, added, or inserted is not limited as long as the obtained variant maintains the biological activity of IFN ⁇ required.
  • maintaining biological activity as used herein includes enhancing biological activity.
  • the number of amino acid residues to be substituted, deleted, added or inserted to obtain a variant of IFN ⁇ in the present invention is usually within 50 residues, for example, within 30 residues, preferably within 20 residues, More preferably, it is within 10 residues, particularly preferably within 5, and still more preferably 1 to 3 residues.
  • the biological activity of IFN ⁇ can be enhanced by modifying the amino acid sequence.
  • IFN ⁇ with enhanced biological activity is also included in IFN ⁇ in the present invention.
  • Enhancement of biological activity includes enhancement of IFN ⁇ activity per weight, extension of residence time in vivo, or suppression of physiological degradation.
  • the biological activity of IFN ⁇ can be enhanced by modifying the amino acid sequence of IFN ⁇ to an amino acid sequence that is conserved among several subtypes (US4695623, US4897471, US5985265). .
  • Such a variant can also be used as IFN ⁇ in the present invention.
  • a polynucleotide encoding a variant of IFN ⁇ can also be obtained by hybridization.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the coding region of the above-mentioned natural IFN ⁇ -encoding DNA encodes a protein having the same biological activity as IFN ⁇ . high.
  • “under stringent conditions” is specified by parameters well known in the art. Specifically, DNA hybridization conditions are generally said to be stringent at low ionic strength and temperatures slightly below the melting temperature (Tm) of the DNA hybrid complex. Specifically, the condition of about 3 ° C. lower than Tm is included in the stringent condition. The higher the stringency, the higher the identity between the probe sequence and the target sequence.
  • hybridization in 6 ⁇ SSC at 65 ° C. can be exemplified as stringent conditions.
  • 65 ° C., 3.5 ⁇ SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin, 2.5 mM NaH 2 PO 4 [pH 7], 0.5% SDS, Hybridization in a hybridization buffer consisting of 2 mM EDTA can also be shown as stringent conditions.
  • SSC is 0.15 M sodium chloride / 0.15 M sodium citrate having a pH of 7.
  • the membrane to which the DNA has been transferred is washed with 2 ⁇ SSC at room temperature, and then with 0.1 ⁇ SSC / 0.1 ⁇ SDS at a maximum temperature of 68 ° C. Wash.
  • a formamide hybridization solution can be used in place of the aqueous hybridization solution. That is, stringent hybridization conditions can be obtained, for example, by using a 50% formamide solution at 42 ° C.
  • stringent hybridization conditions can be obtained, for example, by using a 50% formamide solution at 42 ° C.
  • One skilled in the art can utilize other conditions and reagents to obtain a similar degree of stringency.
  • methods for screening cells and libraries for expression of variants, isolating them, and further cloning and sequencing the DNA of interest are well known.
  • a primer for amplifying the DNA can be designed based on the base sequence of the DNA to be isolated.
  • the target DNA is amplified by a gene amplification method such as a PCR method using a primer.
  • the identity between the amino acid sequence of the modified IFN ⁇ and the natural amino acid sequence is generally at least 65%, usually 75%, preferably 90%, more preferably 95% or more, and still more preferably 99% or more. is there.
  • Amino acid sequence homology can be calculated by various public software tools developed by NCBI (Bethesda, Maryland). Examples of base sequence and amino acid sequence analysis tools include Altschul SF, et al. , Heuristic algorithm (J Mol Biol, 1990, 215: 403-410). This tool is known as BLAST.
  • IFN ⁇ can be modified with other molecules as long as its biological activity is maintained.
  • a fusion protein of IFN ⁇ and another protein can be used as IFN ⁇ in the present invention.
  • modification of IFN ⁇ by a non-protein polymer compound is allowed.
  • IFN ⁇ modified with a polymer compound such as polyethylene glycol has been used as a preparation for administration into blood (US Pat. No. 5,382,657, US Pat. No. 5,559,213, US Pat. No. 6,177,074, US Pat. No. 5,951,974, US Pat. No. 5,981,709). Due to the modification with the polymer compound, IFN ⁇ has improved retention in blood.
  • IFN ⁇ used in the present invention can be synthesized chemically or genetically engineered according to its amino acid sequence.
  • natural IFN ⁇ can be used in the present invention.
  • Natural IFN ⁇ can be extracted from living organisms and biological materials.
  • cells that produce IFNa can be cultured, and natural IFNa can be recovered from the culture.
  • the genetic engineering synthesis method is preferable as a method for obtaining homogeneous IFN ⁇ easily and in large quantities. If the amino acid sequence to be synthesized is clear, those skilled in the art can predict and synthesize a base sequence encoding it.
  • natural cDNA or a variant thereof can be prepared and translated into a protein.
  • a 5 'non-transcribed sequence and a 5' non-translated sequence involved in initiation of transcription and translation can be combined as necessary.
  • a promoter sequence for gene transcription control can be linked to the gene.
  • An enhancer can also be added as a transcriptional regulatory sequence.
  • Expression vectors containing all necessary elements for expression are commercially available.
  • Known vectors include, for example, Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989, and the like. In general, these commercially available vectors have a multicloning site for inserting a DNA encoding an amino acid sequence.
  • the DNA to be expressed can be used as an expression vector by cleaving with an appropriate restriction enzyme and inserting it into the cloning site.
  • the necessary restriction enzyme sites can be ligated as synthetic oligonucleotides.
  • IFN ⁇ can also be expressed as a fusion protein.
  • a vector to which a myc tag or a His tag can be added is also known.
  • the expression vector thus prepared is transformed into a host cell into which the vector is introduced and capable of translation into the target protein.
  • the following cells can be used as host cells.
  • Prokaryotic cells eg, E. coli
  • Eukaryotic cells eg, CHO cells, COS cells, yeast expression systems, and insect cells
  • IFN ⁇ used in the present invention is predicted to contain a glycosylation site, it is preferable to use a eukaryotic cell as a host.
  • a eukaryotic cell For example, at least three glycation sites are predicted in the amino acid sequence of canine IFN ⁇ obtained using a baculovirus expression system (see Japanese Patent No. 5046030). Eukaryotic cells can be used for such expression of IFN ⁇ .
  • insect cells can be used as eukaryotic cell expression systems.
  • Methods for expressing foreign DNA in insect cells using a baculovirus expression system are known.
  • exogenous DNA can be expressed in insect cells by the technique described in Japanese Patent No. 5046030.
  • Natural IFN ⁇ is a secreted protein. Therefore, a signal sequence is also usually encoded in living body cDNA encoding IFN ⁇ .
  • canine IFN ⁇ shown in SEQ ID NO: 2 has a signal sequence at its N-terminal 23 residues.
  • an exogenous signal sequence can be used as the signal sequence.
  • a signal sequence that functions in a biological species from which the cell used for actual expression is derived can be used.
  • a chimeric protein is expressed in which a signal sequence that functions in a species other than human is added to the amino acid sequence of the mature protein of human IFN ⁇ .
  • the signal sequence of the expressed recombinant protein is removed in the process of secretion outside the cell.
  • human mature proteins are secreted.
  • DNA that encodes the amino acid sequence of the mature protein can be expressed if secretion outside the cell is not required.
  • IFN ⁇ When an amino acid sequence including a signal sequence is expressed, IFN ⁇ is accumulated in the culture supernatant. Alternatively, when expressed as an amino acid sequence having no signal sequence, mature IFN ⁇ protein accumulates in the cell. IFN ⁇ expressed by these genetic recombination can be recovered from the culture, purified and used in the composition of the present invention. Techniques for recovering and purifying IFN ⁇ from the culture are known. Alternatively, a culture itself containing an expression product or a crudely purified product can be used for the composition of the present invention. For example, IFN ⁇ expressed using yeast as a host can be lyophilized while containing yeast cells and blended with the composition of the present invention.
  • IFN ⁇ to be blended in the composition of the present invention IFN ⁇ expressed using a plant (for example, strawberry) as a host can also be used.
  • a plant body or plant cell of a transformed plant expressing IFN ⁇ can be used as a raw material for the composition of the present invention.
  • the present invention provides a composition for preventing and / or treating chronic refractory otitis externa, which includes a transformed plant capable of expressing a gene encoding IFN ⁇ .
  • the present invention relates to a composition for preventing and / or treating chronic refractory otitis externa, comprising an IFN ⁇ -containing fraction derived from a transformed plant capable of expressing a gene encoding IFN ⁇ .
  • a tissue containing IFN ⁇ of a transformed plant can be crushed and blended with the composition of the present invention.
  • the plant tissue can be pulverized after being dried.
  • the crushed plant tissue can be dried.
  • an IFN ⁇ -containing solution obtained by homogenizing a tissue containing IFN ⁇ of a transformed plant and filtering as necessary can be blended into the composition of the present invention as it is or after further drying. Any fraction containing IFN ⁇ derived from these transformed plants is included in the “transformed plant” in the present invention.
  • the composition for applying gingiva of the present invention can be produced without greatly changing the current production process.
  • plants include fruits such as strawberries, potatoes, tomatoes, beans, cereals, and pastures.
  • fruits such as strawberries, potatoes, tomatoes, beans, cereals, and pastures.
  • beans soybeans and red beans can be used.
  • cereals include rice, wheat and corn.
  • the transformed plant cell used in the present invention can be prepared by introducing a vector containing a gene encoding IFN ⁇ (or a protein having a biological activity equivalent to IFN ⁇ ) into the plant cell and expressing it.
  • a known endoplasmic reticulum retention signal for example, KDEL (SEQ ID NO: 5) or RDEL (SEQ ID NO: 6)
  • the endoplasmic reticulum retention signal consists of the following amino acid sequence, for example.
  • a secreted protein having an endoplasmic reticulum retention signal remains in the endoplasmic reticulum after expression and is stably retained.
  • the present invention is for oral administration of prophylaxis and / or treatment of chronic refractory otitis externa, comprising a transformed plant capable of expressing a gene encoding IFN ⁇ to which an endoplasmic reticulum retention signal has been added at the C-terminus.
  • a composition for application to the oral mucosa or gingiva is provided.
  • the present invention provides a preventive and / or chronic refractory otitis externa containing an IFN ⁇ -containing fraction derived from a transformed plant that can express an IFN ⁇ -encoding gene to which an endoplasmic reticulum retention signal has been added at the C-terminus.
  • the present invention relates to a composition for oral administration of treatment, for oral mucosa application or gingival application.
  • the vector used for gene expression in plant cells is not particularly limited as long as it contains a promoter that can be transcribed in plant cells and a terminator sequence including a polyadenylation site necessary for stabilization of the transcription product.
  • Examples of the usable vector include plasmids “pBI121”, “pBI221”, “pBI101” (all manufactured by Clontech).
  • Examples of promoters that can be transcribed in plant cells include promoters for constitutive gene expression in plant cells and promoters that are inducibly activated by external stimuli. The following promoters are known as promoters for constant expression. Cauliflower mosaic virus 35S promoter (Odell et al. 1985 Nature 313: 810); Rice actin promoter (Zhang et al. 1991 Plant Cell 3: 1155); Maize ubiquitin promoter (Cornejo et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23: 567)
  • IFN ⁇ By introducing a vector containing a gene encoding IFN ⁇ functionally linked to these promoters into a plant cell, IFN ⁇ can be expressed in the plant cell.
  • functionally linked means that a promoter and a gene encoding IFN ⁇ are bound so that IFN ⁇ is expressed in plant cells.
  • Plant cells to be transformed include various forms of plant cells. For example, a vector can be introduced into suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, callus and the like to obtain transformants.
  • Methods for introducing vectors into these plant cells are known. Specifically, various methods known to those skilled in the art such as an Agrobacterium-mediated method, a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation method), and a particle gun method can be used.
  • Plant bodies can be regenerated by redifferentiating transformed plant cells. Regeneration methods according to plant species have been established. The methods for redifferentiation of each plant species are listed below.
  • Potato The method of Visser et al. (Theor. Appl. Genet 78: 594 (1989));
  • Monocotyledons such as rice Method of Hiei et al. (Hiei Y, Komari T, Kubo T: Transformation of rice medium affectienne tumefaciens. Plant MoI id. , Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T: High efficiency transformation of maize (Zeamays L.) Mediated by Agrobacter. Poration method (Shimamoto, K., Terada, R., Izawa, T.et al.:Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts.Nature 338,274-276 (1989)), etc.
  • a transformed plant having a gene encoding IFN ⁇ introduced into its genome chromosome
  • offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material from the plant body, its progeny or clones, and mass-produce the plant body based on them. For example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc. can be used as propagation materials.
  • a technique for expressing a target protein in a plant using a plant virus vector is also known.
  • plant viral vectors that do not integrate into the genome foreign genes are usually not transmitted to offspring.
  • the expression level of a foreign gene using a plant virus vector in a plant is higher than that of a chromosome recombination method represented by the Agrobacterium method or the like.
  • a plant virus vector a tobacco mosaic virus vector is known as a practical virus vector.
  • the target substance can be produced in the plant body by growing the plant body and inoculating the plant body with infectious RNA transcribed from the expressed gene constructed at the time of inoculation.
  • composition of the present invention is useful for the prevention and / or treatment of chronic intractable otitis externa in mammals.
  • prevention refers to inhibiting the progression of chronic intractable otitis externa. In the absence of symptoms, delaying the onset of symptoms is preventive.
  • the treatment of chronic intractable otitis externa refers to alleviating at least one of the symptoms of the disease.
  • symptoms of chronic refractory otitis externa that can be prevented or treated include localized or diffuse otitis externa, external ear canal eczema, fungal otitis externa (for example, malassezia otitis externa) and the like.
  • the mammal for administering the composition of the present invention is preferably a human, a pet animal such as a dog or a cat, or a mammal raised in a zoo.
  • Such mammals include pigs, wild boars, goats, sheep, horses, cows, deer, donkeys, reindeer, rabbits, monkeys, gorillas, orangutans, chimpanzees, sloths, elephants, giraffes, rhinos, hippopotamus, tapirs, wolves, This includes hyenas, bears, pandas, red pandas, raccoons, foxes, raccoons, raccoons, tigers, lions, leopards, cheetahs, otters, seals, fur seals, sea lions, sea lions, dolphins, killer whales, and whales.
  • it is a dog.
  • the composition of the present invention refers to a composition for oral administration to mammals or for application to the oral mucosa or gingiva.
  • oral mucosa is not limited to that found in the oral cavity, or: (i) lingual surface, ie, surface mucosa of the tongue, (ii) sublingual surface, ie (Iii) buccal surface, ie buccal mucosa, (iv) palate surface, ie palate mucosa, (v) pharyngeal surface, ie pharyngeal mucosa , (Vi) meaning any mucosal surface that can be reached by administration to the oral cavity, such as the gingival surface, ie the mucosa of the gingiva, and (vii) the gingival crevice, ie the cavity formed between the teeth and the gingiva To do.
  • the composition of the present invention can be produced by blending interferon ⁇ and a biologically acceptable carrier.
  • Biologically acceptable carriers include interferon alpha that is formulated and carriers that are inert to the organism to which the composition is administered.
  • a carrier inert to a living organism means that the carrier does not interfere with the function of a normal living organism.
  • Normal biological functions include metabolic function, reproductive function, motor function, nerve action, and the like.
  • components that are metabolized by the normal metabolic function of an organism are contained in a biologically acceptable carrier.
  • components that are not digested or metabolized or components that are difficult to perform and do not interfere with the functions of the organism are all included in the biologically acceptable carrier.
  • a food containing IFN ⁇ constitutes a preferred embodiment of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention can also be administered orally as a pharmaceutical composition for the purpose of preventing or treating chronic intractable otitis externa.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and / or treating chronic intractable otitis externa, which contains interferon ⁇ as an active ingredient.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and / or treating chronic intractable otitis externa, comprising interferon ⁇ and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention further relates to the use of interferon alpha in the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of chronic intractable otitis externa.
  • the invention also relates to the use of interferon alpha in a method for the prevention and / or treatment of chronic intractable otitis externa.
  • an active treatment method for chronic intractable otitis externa has not been known.
  • the therapeutic effect of chronic refractory otitis externa that has already progressed was confirmed by administering the therapeutic agent for chronic refractory otitis externa of the present invention.
  • the present invention provides a therapeutic agent for chronic intractable otitis externa, which contains interferon ⁇ as an active ingredient.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating chronic intractable otitis externa, comprising interferon ⁇ and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention further relates to the use of interferon alpha in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of chronic intractable otitis externa.
  • the invention also relates to the use of interferon alpha in the treatment of chronic intractable otitis externa.
  • the composition of the present invention can be obtained by blending interferon ⁇ with a component that is ingested as a food or feed of a mammal.
  • a component that is ingested as a food or feed of a mammal When feed is given to pet animals in particular, it is called pet food.
  • Pet food is included in the food or feed of the present invention.
  • a pet animal refers to a non-human animal that is bred for the purpose of appreciation and pets. Therefore, for example, animals raised for the purpose of shipping or using meat, eggs, hair, milk, etc. are usually included in livestock and are distinguished from pets.
  • animals such as police dogs and guide dogs that are raised for the purpose of working (working animals) are fed with the same feed as pet animals. Even if the purpose of the breeding is a working role, when the same feed as the pet is given to the same animal species as the pet, the feed is included in the pet food referred to in the present invention.
  • food or feed contains carbohydrates, proteins, minerals, fats, moisture, or fibers.
  • Many of the raw materials are animal and plant tissues, microbial cells, and processed products thereof.
  • a processed product refers to a product obtained by heating, drying, freeze-drying, or extraction using these materials as raw materials.
  • a plurality of different processes can be combined with the process for obtaining a series of processed products.
  • Preservatives, preservatives, antioxidants, pigments, fragrances, moisturizers, seasonings and the like can be blended in food or feed.
  • components such as a bulking agent, a binder, or a viscosity modifier may be added.
  • these components naturally-derived components and synthesized components are used. Therefore, it can be set as the food composition based on this invention by mix
  • IFN (alpha) with these general food or feed materials.
  • IFN (alpha) at the time of ingestion of the food or feed which does not contain general IFN (alpha).
  • the food composition or feed composition of the present invention can be obtained by adding interferon ⁇ to a material generally used as food or feed.
  • the amount of interferon ⁇ added to the food composition or feed composition according to the present invention is usually 1 to 15000 LU / day per kg body weight, preferably 0.5 to 25000 LU / day per kg body weight. That is, 1 to 15000 LU, preferably 0.5 to 25000 LU of interferon ⁇ can be blended per 1 kg of body weight with respect to the daily standard food or feed intake.
  • administration of interferon is indicated by displaying the intake of the food per day according to the amount of interferon ⁇ .
  • the amount can also be controlled. For example, when one chewing gum is mixed with a daily dose, it is recommended that the amount of chewing gum consumed per day be one.
  • Chewable composition comprising interferon alpha The composition containing IFN ⁇ in the present invention can be blended with a chewable carrier to form a chewable composition. That is, the present invention provides a composition comprising IFN ⁇ and a chewable carrier.
  • the chewable carrier refers to a component that is chewed when administered to the oral cavity of an animal.
  • the chewable carrier can be a material that can be chewed or can be a material that is not easily broken into small pieces by chewing.
  • various gum bases are also included in the chewable carrier in the present invention.
  • a carrier that can maintain a constant volume even when chewing in the mouth for a long time is used for the gum base.
  • the gum base for example, vegetable resin, chicle, vinyl acetate resin, ester gum, polyisobutylene, calcium carbonate, or gelton (Pontianak) can be used.
  • a gum base is a chewable carrier suitable for processing the chewable composition of the present invention for administration to the oral cavity of a subject.
  • the chewable composition in the present invention is used as a pharmaceutical, it is a chewable pharmaceutical composition, and when used as a food, it is a chewable food.
  • the composition of the present invention is used as a chewable feed, the chewable feed composition is obtained.
  • the size of the chewable composition can be adjusted in order to induce chewing behavior. In other words, chewing behavior can be induced in a non-human animal by processing it to such a size that it cannot be swallowed. Furthermore, more chewing behavior can be induced by increasing the hardness according to the animal.
  • Paste type composition containing interferon alpha The composition containing IFN ⁇ in the present invention can be blended with a paste-like carrier to form a paste-like composition. That is, the present invention provides a composition comprising IFN ⁇ and a pasty carrier.
  • the paste-like carrier can also be referred to as a carrier having a semi-solid consistency.
  • the paste-like carrier includes a gel-like carrier.
  • a paste-like composition can be prepared, for example, by adding a solvent such as water to a water-soluble polysaccharide or polymer compound.
  • Water-soluble polysaccharides or polymer compounds include glucose, sucrose, maltose, sorbitol, xylitol, starch, gelatin, pectin, alginic acid, alginate, cellulose, ethylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, guar gum (Guar gum; polygalactomannan), glucomannan, carrageenan, xanthan gum, tamarind gum, carbopol, agarose, agar and the like.
  • polymer compounds such as polyethylene glycol and polyvinyl pyrrolidone can also be incorporated into the composition of the present invention as a gel carrier.
  • the composition of the present invention can be selected in any shape such as solid, gel or liquid. In order to maintain the activity of IFN ⁇ , it is desirable to distribute it in a dry state. Alternatively, the dried composition can be made into a gel or a liquid by adding an appropriate solvent such as water at the time of taking the composition. Furthermore, the composition of the present invention can be distributed in a frozen state.
  • composition of the present invention may additionally contain components such as a fragrance, a pigment, a corrigent, a sweetener, and a seasoning.
  • a composition containing a chewable carrier plant fibers and the like can be further added to expect a tooth brushing effect.
  • the content of IFN ⁇ is usually 0.5 to 25000 LU / day per kg body weight, for example, 1 to 15000 LU / day per kg body weight, more specifically 2 to 5000 LU / day, usually 2 to It can be blended so as to be about 500 LU / day, preferably about 2 to 10 LU / day.
  • the amount of IFN ⁇ used to be low the risk of side effects due to IFN ⁇ administration in the present invention is negligibly small.
  • the blending ratio of IFN ⁇ in the composition of the present invention can be determined based on the intake amount of the composition.
  • the amount of IFN ⁇ to be blended in the feed can be determined based on the body weight of the animal to which the composition of the present invention is to be administered and the daily intake of the feed.
  • 1 LU corresponds to 1 IU of human natural IFN ⁇ .
  • the present invention includes (1) a composition comprising interferon ⁇ and a biologically acceptable carrier, and (2) administration of the composition effective for the prevention and / or treatment of chronic intractable otitis externa.
  • a kit is provided for preventing and / or treating chronic refractory otitis externa, comprising instructions describing the amounts.
  • the titer (LU) of IFN ⁇ can be determined according to the technique described in Japanese Patent No. 5046030, for example.
  • composition of the present invention can achieve the effect of preventing and / or treating chronic intractable otitis externa by applying it to animals (for example, oral administration or oral mucosa application or gingival application). That is, this invention provides the method for preventing and / or treating the chronic intractable otitis externa of a mammal including the process of applying interferon alpha.
  • a method for treating chronic intractable otitis externa which comprises the step of applying interferon ⁇ to the gums of mammals, preferably dogs, is a preferred embodiment of the present invention.
  • composition of the present invention can be applied to mammalian gingiva, for example, in any shape such as solid, paste, gel or liquid.
  • Solid formulations can be applied indirectly to the gingiva via chewing or swallowing.
  • the solid preparation can be indirectly applied to the gingiva as a mouthful tablet (so-called troche).
  • Pasty or gel preparations can be applied directly to the gums in addition to chewing and swallowing.
  • the liquid preparation can be administered through spraying on the gingiva, mouth washing or gargle action.
  • the composition of the present invention is used as a pharmaceutical composition. That is, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of chronic refractory otitis externa in mammals comprising interferon ⁇ and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier an inert carrier that is usually used for drug preparation can be used.
  • CaIFN ⁇ -4 canine interferon ⁇
  • the CaIFN ⁇ 4 gene was obtained from a cDNA library prepared using the mRNA of canine cells (MDCK cells) stimulated by Newcastle disease virus B1 strain inactivated by ultraviolet rays as a template. And cloned by the PCR method.
  • the primer sequences used for cloning are as follows. Sense primer: 5'-GCAGGATCCACGATGGCCCTGC-3 '(SEQ ID NO: 3); and Antisense primer: 5'- GCTGAGCTCAAAGTTCATCCTTATGATGATGATGATGATGTTTCCTCCTCCTTACTCTT-3' (SEQ ID NO: 4)
  • CaIFN ⁇ -4 gene SEQ ID NO: 1; amino acid sequence: SEQ ID NO: 2
  • a BamHI sequence was added to the 5 ′ end side and a SacI sequence was added to the 3 ′ end side by PCR.
  • a His-Tag sequence was added downstream of the CaIFN ⁇ -4 sequence for the purpose of suppressing secretion of the expressed protein from the endoplasmic reticulum and accumulating it in the host cell.
  • a DNA fragment amplified by PCR hereinafter, CaIFN ⁇ -4-His-KDEL
  • CaIFN ⁇ -4-His-KDEL A DNA fragment amplified by PCR (hereinafter, CaIFN ⁇ -4-His-KDEL) was introduced into pCR2.1 vector (Invitrogen) by TA cloning, transformed into Escherichia coli, and cloned.
  • a plasmid was extracted from the E. coli transformant, and the nucleotide sequence was confirmed.
  • Example 2 Preparation of canine interferon ⁇ (CaIFN ⁇ 4) gene for plant expression
  • the plasmid after confirmation of the base sequence was co-digested with restriction enzymes BamHI and SacI, and the CaIFN ⁇ -4-His-KDEL gene (BamHI-SacI fragment) was obtained. Cut out.
  • the plant expression vector pBE2113-GUS Plant Cell Physiol. 1996, 37, 49-59
  • -SacI fragment ligase-treated to prepare pBE2113-CaIFN ⁇ -4-His-KDEL.
  • Transformation of strawberry pBE2113-CaIFN ⁇ -4-His-KDEL was introduced into Agrobacterium (Rhizobium radiobacter LBA4404), kanamycin (Km) resistant strains were selected, and strawberry transformation experiments were performed. Callus induction and redifferentiation were performed using a Km-added medium, and Km resistant individuals were selected. Using DNA extracted from leaves of Km resistant individuals as a template, introduction of the CaIFN ⁇ -4 gene was confirmed by Genomic PCR (FIG. 1).
  • Example 4 Cultivation and fruit collection of CaIFN ⁇ -4 expressing transgenic strawberry A strawberry cultured seedling of a high expression line in which the expression of the target protein was confirmed was acclimatized, and hydroponically cultivated to collect the fruit.
  • Example 5 Evaluation of physiological activity of recombinant strawberry (fruit) -expressed CaIFN ⁇ -4 As a positive control and standard product for the evaluation of physiological activity of CaIFN ⁇ , according to Table 2007-080942 (Japanese Patent Application No. 2007-553936), baculo Virus-expressed CaIFN ⁇ -4 was prepared. The collected CaIFN ⁇ -4 transgenic strawberry fruit was crushed with PBS to prepare a fruit crushing solution. A non-recombinant strawberry fruit crush solution was prepared as a negative control.
  • the physiological activity was evaluated by a cytopathic effect (Cytopathic Effect, CPE) suppression method using swine vesicular stomatitis virus (VSV), which is a general method for measuring interferon ⁇ bioactivity.
  • CPE Cytopathic Effect
  • VSV swine vesicular stomatitis virus
  • Dog-derived A-72 cells were used as sensitive cells.
  • CaIFN ⁇ -4 titer measurement a sample obtained by diluting the disruption solution, the positive control and the negative control with a maintenance medium from 10 4 times to 128 ⁇ 10 4 times in two steps was used as a sample. Details of the test method are described below.
  • the antiviral activity of interferon ⁇ is represented by the unit “LU”, and the unit “LU” is synonymous with the international unit “IU” indicating the activity of interferon ⁇ in antiviral activity.
  • FIG. 2 shows the cytopathic inhibitory effect and antiviral activity of the CaIFN ⁇ -4 genetically modified strawberry fruit crush solution.
  • 100 ⁇ l of A-72 cell suspension prepared to 1 ⁇ 10 5 cells / ml using a growth medium was added to each well of a 96-well microplate, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 2 days.
  • the medium is removed from each well, and samples and standard samples (0.5 ⁇ 10 4 to 0.5% 10 4 LU / ml of baculovirus-expressing CaIFN ⁇ -4 prepared to 1.0 ⁇ 10 4 LU / ml) are removed.
  • the sample was prepared by 2-fold serial dilution up to 64 ⁇ 10 4 times) and added to 4 wells per specimen. 100 ⁇ l of maintenance medium was added to each of the cell control well and the virus control well. The cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 1 day, and 10 ⁇ l per well of VSV dilution prepared to 1.0 ⁇ 10 3 MOI using a maintenance medium was added to each sample well and virus control well. After culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 for 3 days, the medium on the plate was discarded, 80 ⁇ l of 1% crystal violet staining solution was added to each well, and allowed to stand at room temperature in the dark for 30 minutes.
  • Example 6 Preparation of test drug The harvested strawberry fruits expressing CaIFN ⁇ -4 were freeze-dried and crushed to prepare freeze-dried powder. A test drug was prepared by mixing CaIFN ⁇ -4 expressing strawberry freeze-dried powder with a stabilizing agent, maltose. The potency test of the test drug was performed and confirmed to be 1.2 ⁇ 10 4 LU / g.
  • Example 7 Administration test (Part 1) The test drug prepared in Example 6 was given to the test dog, and the inflammation-inhibiting effect against malassess otitis externa was verified. The test dogs prepared six 6-month-old sibaines and conducted experimental infection with Malassezia as follows.
  • Malassezia Malassezia pachydermatis (ATCC 14522 strain) was used.
  • the lyophilized cells were dissolved in sterilized distilled water and cultured on a Sabouraud agar medium at 30 ° C. for 7 days.
  • the colonies that recognized growth were sufficiently scraped and suspended in sterilized physiological saline as a stock solution.
  • a part of the stock solution was serially diluted 10 times, and 10 ⁇ L was taken from each diluted bacterial solution.
  • the number of bacteria collected is measured, and the number of bacteria when multiplied by the dilution factor is taken as the number of bacteria in the stock solution, and diluted with sterilized physiological saline to 1.7 ⁇ 10 6 /0.1 mL. It was. All 6 test dogs were inoculated with 0.1 mL of left and right outer ears and experimentally infected with the prepared challenge bacteria solution.
  • the test dog observed the test dog after the experimental infection, and confirmed the presence or absence of expression of four symptoms characteristic of malassessing otitis externa, redness of the outer ear, malodor of the outer ear, and browning of the earwax. Each case was scored with a score of 1 and the symptoms were scored. That is, zero was given in the case of no onset, and a maximum score of 4 was obtained when all 4 cases were observed (as a case, score 2 etc. when a sense of sensation and earwax were confirmed).
  • each group was divided into 2 groups, and a test drug administration group and a non-administration control group were set.
  • Table 1 shows the body weight of the test dog at the time of administration.
  • the administration method was oral administration, and more specifically, as follows.
  • the test drug was CaIFN ⁇ -4, and an equivalent amount of 2500 LU was weighed (about 0.2 g), and a small amount of water (100 ⁇ l or less) was dropped into it and kneaded to make a paste. The whole amount of the pasty test drug was applied to the gingiva of the test dog.
  • FIG. 3 shows changes in clinical observations of the outer ear of each group during the administration period.
  • FIG. 4 shows the outer ear findings and the degree of brownness of the earwax of each test dog on day 21 after the start of administration.
  • Example 8 Administration test (Part 2) The administration test is in accordance with the method described in Example 7, except that the test drug with the content of CaIFN ⁇ -4 as an active ingredient being 1/10 is changed in the administration period (Shiba hybrid, 2 years and 4 months old). ) To examine the inflammation-inhibiting effect on malassezia otitis externa.
  • the test dogs used for the verification are as follows.
  • CaIFN ⁇ -4 (250 LU / head) was applied twice a week at a frequency of twice per week to the administration group (7 times in total), and the external ear observations with the subject group (non-administration group) were recorded. .
  • four symptoms i.e., olfaction, redness of the outer ear, malodor of the outer ear, and blackening of the earwax, characteristic of malachitic otitis were scored.
  • FIG. 5 shows changes in clinical observations of the outer ear of each group during the administration period. By starting gingival application of the test drug in the administration group, it was significantly reduced compared with the non-administration control group, and significant compared with the non-administration group.
  • FIG. 6 shows the outer ear findings of each test dog on the 21st day after the start of administration and the brownness of the earwax. Similar to the results of the administration test of Example 7, the outer ear local lesion in the administration group was clearly reduced. From the above, it is clear that gingival application administration of canine interferon ⁇ exhibits an anti-inflammatory effect against intractable otitis externa caused by Malassezia even when the concentration employed in Example 7 is reduced to 1/10. It became.
  • the present invention is useful for the prevention or treatment of chronic refractory otitis externa in animals.
  • prevention and treatment of chronic intractable otitis externa is generally an important issue.
  • the effect of the composition of the present invention can be obtained by applying it to the gums.

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Abstract

　本発明は、慢性難治性外耳炎に対する即効性でかつ持続性のある治療薬を提供することを目的とする。本発明は、インターフェロンα（ＩＦＮα）を有効成分とする、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療のための組成物、医薬組成物、食品および飼料を提供する。本発明の組成物を経口投与することにより、慢性難治性外耳炎を抑制、軽減、治療および予防することができる。本発明におけるＩＦＮαは、微量の投与によって十分な効果を得ることができる。

Description

インターフェロンαの経口投与による慢性難治性外耳炎治療効果
　本発明は、インターフェロンαを有効成分として含む、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療の経口投与用組成物に関する。
　外耳炎は非常に一般的な疾患であり、イヌやネコなどのペットでは非常に高い罹患率で発症する疾患である。また、外耳炎は、慢性化すると、獣医師および飼い主にとって効果的に治療する上で非常に頭を悩ませる疾患の一つでもある。治療戦略は広範囲にわたるが、外耳炎を治療するための様々な薬剤が使用されている。また、外耳炎に対しては、一般に、抗炎症剤や抗菌物質による対処療法が執られ、予防的な処置は行われないのが現状である。
　昨今、イヌの外耳炎は広義の皮膚疾患として捉えられてきており、例えば、マラセチア性の外耳炎の場合、外耳皮膚のバリアが脆弱となることで、マラセチアが常在菌であるにも関わらず炎症を引き起こすと言われている。
　これまで、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患の治療にインターフェロン（ＩＦＮ）を提供することが報告されている。例えば、ヒトのアトピー性皮膚炎に対して、ヒトＩＦＮ－βを静脈内投与することにより、該皮膚炎に一定の効果を示したことが報告されている（特許文献１）。また、非ヒト哺乳動物では、例えば、ウシにおいて、ヒトＩＦＮαを代用乳と共に給餌することにより、中耳炎に効果を示したことが報告されている（非特許文献１）。
　イヌ難治性皮膚炎に対して、皮下注射によりイヌＩＦＮ－γを投与することにより、該皮膚炎の改善が見られたことも報告されている（特許文献２および３）。このような既存のインターフェロンを含有する製剤の多くは、高濃度の侵襲性投与（皮下または静脈注射）が一般的である。しかしながら、マラセチア性外耳炎等の慢性化した難治性外耳炎の完治は困難であり、優れた予防薬または治療薬は見出されていない。
特開平６－４８９５７号公報 特開平１０－３０６０３７号公報 特開２０００－３１６５８５号公報
ＡＪＶＲ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１，ｐ．１６４－１７６
　皮膚疾患は慢性化することが多く、上記従来技術による治療が繰り返し行われることも多い。そのため、完治に至るまで治療が長期化する、あるいは完治に至らない場合もある。したがって、従来技術による治療薬を用いて長期間治療されても完治に至らないような皮膚炎として慢性難治性外耳炎に対する即効性でかつ持続性のある治療薬が望まれている。また、従来のインターフェロン製剤の多くが高濃度の侵襲性投与であったのに対して、低用量インターフェロンの経口投与によれば、安全性や投与の簡便性等の優位な点が期待される。
　本発明者らは、インターフェロン（ＩＦＮ）αを有効成分として含む組成物を、従来技術によって治療が困難な慢性難治性外耳炎を患っている対象に経口投与することによって、該疾患が顕著に改善されることを見いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、ＩＦＮ－αを有効成分として含む、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療の経口投与用（または口腔粘膜塗布用もしくは歯肉塗布用）の組成物および医薬組成物を提供し、さらに、慢性難治性外耳炎を予防および／または治療するための方法を提供するものである。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
　［１］インターフェロンαを有効成分として含む、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療の経口投与用組成物。
　［２］インターフェロンαと咀嚼性の担体を含む、上記［１］に記載の組成物。
　［３］咀嚼性の担体が食品である、上記［２］に記載の組成物。
　［４］咀嚼錠またはチューインガムである、上記［３］に記載の組成物。
　［５］インターフェロンαとペースト状の担体を含む、上記［１］に記載の組成物。
　［６］体重１ｋｇあたり０．５～２５０００ＬＵ／日のインターフェロンαが配合されている、上記［１］～［５］に記載の組成物。
　［７］インターフェロンαを経口投与することを含む、慢性難治性外耳炎を予防および／または治療するための方法。
　［８］インターフェロンαと咀嚼性の担体またはペースト状の担体とを含む組成物を経口投与することを含む、上記［７］に記載の方法。
　［９］体重１ｋｇあたり０．５～２５０００ＬＵ／日のインターフェロンαが経口投与される、上記［８］に記載の方法。
　［１０］インターフェロンαと薬学的に許容される担体とを含む、慢性難治性外耳炎を予防および／または治療するための医薬組成物。
　［１１］薬学的に許容される担体が咀嚼性の担体またはペースト状の担体である、上記［１０］に記載の医薬組成物。
　［１２］体重１ｋｇあたり０．５～２５０００ＬＵ／日のインターフェロンαが配合されている、上記［１１］に記載の医薬組成物。
　［１３］慢性難治性外耳炎の治療および／または予防のための経口用組成物の製造におけるインターフェロンαの使用。
　本発明による哺乳動物の慢性難治性外耳炎の予防および／または治療のための組成物を、哺乳動物に経口投与（または口腔粘膜塗布）することによって、該外耳炎を予防および治療することができる。
ＰＣＲにより、イチゴへのＣａＩＦＮα－４遺伝子導入を確認した結果を示す。 ＣａＩＦＮα－４遺伝子組換えイチゴ果実破砕液による細胞変性抑制効果および抗ウイルス活性の結果を示す。 投与群３頭には、給餌前に１頭１日当たり２５００ＬＵのＩＦＮα－４を被験犬の歯肉へ２１日間連続塗布投与し、非投与群３頭との外耳観察所見を記録した。投与期間中の各群の外耳臨床観察所見の推移を示す。 投与開始後２１日目の各被験犬の外耳所見写真および耳垢の褐色程度を示す。 投与群３頭には、給餌前に１頭１日当たり２５０ＬＵのＩＦＮα－４を被験犬の歯肉へ週２回塗布投与し、非投与群３頭との外耳観察所見を記録した。投与期間中の各群の外耳臨床観察所見の推移を示す。 投与開始後２１日目の各被験犬の外耳所見写真および耳垢の褐色程度を示す。
　本発明は、インターフェロンαを有効成分として含む、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療の経口投与用、口腔粘膜塗布用または歯肉塗布用の組成物に関する。本発明の組成物は、ＩＦＮαと生物学的に許容される担体を配合することによって製造することができる。
　インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス感染などにともなって動物の生体内で分泌される分子量約２０ｋＤａのタンパク質である。哺乳動物においては、α、β、およびγの３種類のＩＦＮがある。このうちαとβは構造上の類似性を有している。例えば、ヒトやマウスでは、α－βの間で、塩基配列で４０％程度、アミノ酸配列で３５％程度の相同性がある。これらのＩＦＮは総称してＩ型ＩＦＮと呼ばれる。Ｉ型ＩＦＮは、抗ウイルス作用の他に、細胞増殖抑制効果、抗腫瘍作用、マクロファージ等の免疫細胞の活性化作用、および免疫応答調節作用などの作用を有することが明らかにされている。
　ヒトやマウスなどの哺乳動物のＩＦＮαには多型が見られる。例えば、ヒトにおいては、１５以上の相同性の高い（８５％以上）遺伝子群が見出されている。ＩＦＮαの遺伝子にはイントロンが無く、ゲノム中にこれらの多型を含む複数の遺伝子が存在しているのが大きな特徴である。
　本発明におけるＩＦＮαには、これらの多型によってもたらされるサブタイプの全てが含まれる。更に、これらのサブタイプを構成するアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸配列が、付加、欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＩＦＮαと同等、あるいはそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質も、本発明におけるＩＦＮαとして利用することができる。本発明におけるＩＦＮαとして、任意の動物種に由来するＩＦＮαを利用することができる。好ましくは、イヌ由来のＩＦＮαを用いることができる。より具体的には、イヌＩＦＮα（以下、「ＣａＩＦＮα－４」と称する場合がある）は、配列番号１で示される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を有する。
　あるいは、慢性難治性外耳炎に対する予防および／または治療効果を有する限り、他の生物種に由来するＩＦＮαを利用することもできる。例えば、以下の生物種に由来するＩＦＮαのサブタイプが公知である。これらの天然のＩＦＮαの各サブタイプについては、いずれも以下に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーで、その塩基配列およびアミノ酸配列を参照することができる。いずれの生物種においても、これらのサブタイプに加え、新たなサブタイプが新たに見出される可能性がある。今後新たに見出されるサブタイプも、必要な活性を有している限り、本発明におけるＩＦＮαとして利用することができる。
　なお通常これらのアクセッションナンバーによって特定されるアミノ酸配列は、シグナル配列を含んでいる。アミノ酸配列がシグナル配列を含む場合、通常は、当該シグナル配列が除かれた成熟タンパク質が、本発明におけるＩＦＮαとして利用される。シグナル配列の全て、あるいは一部を伴ったアミノ酸配列からなる前駆タンパク質が、ＩＦＮαの生物学的活性を有する場合には、前駆タンパク質をＩＦＮαとして用いることもできる。更に、投与後に、シグナル配列の全て、あるいは一部が除かれることで、ＩＦＮαの生物学的活性を獲得することができる前駆タンパク質も、本発明のＩＦＮαとして利用することができる。
　イヌＩＦＮα（８種のサブタイプ）
　CaIFN-a1：M28624　　CaIFN-a2：M28625　　CaIFN-a3：O97945
　CaIFN-a4：AB102731　CaIFN-a5：AB125934　CaIFN-a6：AB125935
　CaIFN-a7：AB125936　CaIFN-a8：AB125937
　ネコＩＦＮα（１４種のサブタイプ）
　FeIFN-w：E02521　　　FeIFN-a1：AY117395　 FeIFN-a2：AY117394
　FeIFN-a3：AY117393　 FeIFN-a5：AY117392　 FeIFN-a6：AY117391
　FeIFN-a7：AB094996　 FeIFN-a8：AB094997　 FeIFN-a9：AB094998
　FeIFN-a10：AB094999　FeIFN-a11：AB095000　FeIFN-a12：AB095001
　FeIFN-a13：AB095002　FeIFN-a14：AB095003
　げっ歯類ＩＦＮα（８種のサブタイプ）
　D00460、M13660、M13710、X01969、X01971、X01972、X01973、X01974
　ウシＩＦＮα（８種のサブタイプ）
　M10952、M10953、M10954、M10955、M11001、X93087、X93088、X93089
　ブタIFNα
　IFN-a1：X57191.1
　ヒトＩＦＮα（２１種のサブタイプ）
　HuIFN-a1：DQ185447　　HuIFN-a2：NM000605　 HuIFN-a3：E00176
　HuIFN-a4：NM021068　　HuIFN-a5：NM002169　 HuIFN-a6：NM021002
　HuIFN-a7：NM021057　　HuIFN-a8：NM002170　 HuIFN-a10：NM002171
　HuIFN-a13：NM006900　 HuIFN-a14：NM002172　HuIFN-a16：NM002173
　HuIFN-a17：NM021268　 HuIFN-a21：NM002175　HuIFN-a2a：AAS92248
　HuIFN-a2b：AAP20099　 HuIFN-a1b：AAL35223　HuIFN-a4b：CAA26701
　HuIFN-aI’：AAA52725（＝HuIFN-a17subtype）
　HuIFN-aI1：CAA01748（＝HuIFN-a17subtype）
　HuIFN-a-j：CAA23792　 HuIFN-aT：I79343　　 HuIFN-aO：I79344
　HuIFN-aN：I58999　　　HuIFN-aB：0902162A
　例えば、次のようなヒト由来ＩＦＮ製剤が実用化されている。これらはいずれも天然型のＩＦＮαで、いずれも本発明における好適なＩＦＮαに含まれる。
　オーアイエフ（大塚製薬製、BALL-1）
　スミフェロン（住友製薬製、NAMALWA）
　Wellferon（Glaxo-Wellcome、α-n1）
　Alferon（Purdue Frederick Co.、α-n3）
　なお、上記の天然型ＩＦＮαの由来として併記した、ＢＡＬＬ－１、ＮＡＭＡＬＷＡ、α－ｎ１、およびα－ｎ３は、いずれも各ＩＦＮαが由来する細胞株の名前である。天然型とは、遺伝子組み換えによらず、生体から樹立された細胞株が産生するＩＦＮαを言う。天然型のＩＦＮαは、例えば、由来として記載した上記の細胞株を培養することによって、その培養物から回収することができる。これらの細胞株の培養と、培養物からのＩＦＮαの回収のための方法は公知である。
　これに対してリコンビナントＩＦＮαも同様に、本発明における好ましいＩＦＮαに含まれる。リコンビナントＩＦＮαとは、ＩＦＮαのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを人為的に発現させることによって得られたＩＦＮαである。更に、本発明におけるＩＦＮαには、これら天然に存在するＩＦＮαのアミノ酸配列を含むタンパク質に加え、当該アミノ酸配列が改変されたタンパク質を利用することができる。具体的には、例えば、以下のようなタンパク質を、本発明におけるＩＦＮαとして示すことができる。
（ａ）前記天然のＩＦＮαのアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記天然のＩＦＮαのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が、置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列を含み、天然のＩＦＮαと同等の生物学的活性を有するタンパク質；
（ｃ）前記天然のＩＦＮαをコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、天然のＩＦＮαと同等の生物学的活性を有するタンパク質；および
（ｄ）前記天然のＩＦＮαのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、天然のＩＦＮαと同等の生物学的活性を有するタンパク質。
　本発明において、天然のＩＦＮαの生物学的活性とは、当該タンパク質の経口投与、口腔粘膜塗布、または歯肉塗布によって、皮膚疾患、好ましくは慢性難治性外耳炎を抑制、改善、軽減、治療または予防し得ることをいう。あるタンパク質がこのような活性を有することは、実際に、例えば、被験動物の歯肉にタンパク質を塗布することによって確認することができる。
　このようなアミノ酸配列が改変されたＩＦＮαは、ＩＦＮαの「バリアント」（改変体）と呼ぶことができる。与えられたアミノ酸配列を改変するためのさまざまな手法が公知である。例えば、ＩＦＮαをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に変異を導入し、それによってコードされるアミノ酸配列を改変することができる。アミノ酸配列の改変によって、その生物学的な活性を調節することができる。例えば、ＩＦＮαの生物学的な活性を増強したり、生体中における安定性を改善することができる。
　アミノ酸配列を改変するための多くの手法が公知である。例えば、「モレキュラークローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋなどに記載された方法を利用することができる。
　アミノ酸配列の改変は、アミノ酸残基の置換、欠失、付加、および挿入によってもたらされる。アミノ酸残基の置換、欠失、付加、および挿入は、それぞれ単独で施すこともできるし、２つ、３つ、あるいは全ての修飾を与えることもできる。更に、天然のＩＦＮαのアミノ酸配列の中の、１または複数の位置において、アミノ酸残基の置換、欠失、付加、および挿入からなる群から選択される任意の修飾を施すことができる。このような改変体には、ＩＦＮαアミノ酸配列の全体または部分を含む融合タンパク質も含まれる。アミノ酸配列の変化がタンパク質の構造に与える影響を予測するための方法が知られている。したがって、既知の方法に従って、ＩＦＮαの改変体を設計することができる。このような方法の一例は、Ｄａｈｉｙａｔ　ａｎｄ　ＭａｙｏによってＳｃｉｅｎｃｅ　２７８：８２８７，１９９７に記載されている。Ｄａｈｉｙａｔ　ａｎｄ　Ｍａｙｏの方法を適用することにより、ＩＦＮαのアミノ酸配列を改変したときに、活性の維持に必要な構造を保っているか否かを解析することができる。
　また、生物学的活性を維持したまま、アミノ酸配列のみを改変することもできる。例えば、望ましくないジスルフィド結合を防ぐために、システイン残基を置換または除去することができる。同様に、アミノ酸配列の改変によってＩＦＮαのプロテアーゼ感受性を調節することもできる。プロテアーゼ耐性を付与すれば、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質分解を防ぐことによってＩＦＮαの発現を増強することもできる。
　ＩＦＮαのアミノ酸配列の改変において、性質が似ているアミノ酸残基への置換が、タンパク質の構造や活性の維持に有用であることが知られている。性質が似ているアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれる。「保存的置換」とは、タンパク質の三次構造および／または活性を大きく変化させないアミノ酸置換を言う。例えば、次に示したグループに含まれるアミノ酸の、グループ内の他のアミノ酸残基への置換は、保存的置換に含まれる。
（１）中性疎水性側鎖（アラニン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、ロイシン）；
（２）中性極性側鎖（アスパラギン、グリシン、グルタミン、システイン、セリン、チロシン、トレオニン）；
（３）塩基性側鎖（アルギニン、ヒスチジン、リシン）；
（４）酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸）；
（５）脂肪族側鎖（アラニン、イソロイシン、グリシン、バリン、ロイシン）；
（６）脂肪族水酸基側鎖（セリン、トレオニン）；
（７）アミン含有側鎖（アスパラギン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、リシン）；
（８）芳香族側鎖（チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン）；および
（９）硫黄含有側鎖（システイン、メチオニン）
　アミノ酸の置換には、当業者に知られたさまざまな方法を利用することができる。具体的には、Ｋｕｎｋｅｌらの部位特異的変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８－４９２，１９８５）を、アミノ酸の置換に利用することができる。あるいは想定されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを化学的に合成することもできる。
　本発明において、置換、欠失、付加、または挿入されるアミノ酸残基の数は、得られる改変体が必要なＩＦＮαの生物学的な活性を維持する限り制限されない。先に述べたとおり、ここで言う生物学的な活性の維持には、生物学的活性の増強が含まれる。本発明におけるＩＦＮαの改変体を得るための、置換、欠失、付加、または挿入されるアミノ酸残基の数は、通常５０残基以内、例えば、３０残基以内、好ましくは２０残基以内、より好ましくは１０残基以内、特に好ましくは５以内、更に好ましくは１～３残基である。
　更に、アミノ酸配列の改変によってＩＦＮαの生物学的な活性を増強することができる。生物学的な活性を増強されたＩＦＮαも、本発明におけるＩＦＮαに含まれる。生物学的な活性の増強には、重量当たりのＩＦＮαの活性の増強と、生体内における滞留時間の延長、あるいは生理的な分解の抑制が含まれる。例えば、ＩＦＮαのアミノ酸配列を、いくつかのサブタイプの間で保存されたアミノ酸配列に改変することによって、ＩＦＮαの生物学的な活性を増強できることが明らかにされている（ＵＳ４６９５６２３，ＵＳ４８９７４７１，ＵＳ５９８５２６５）。このような改変体を本発明におけるＩＦＮαとして利用することもできる。
　ＩＦＮαの改変体をコードするポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションによって得ることもできる。例えば、前記の天然のＩＦＮαをコードするＤＮＡのコード領域からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ＩＦＮαと同様の生物学的活性を有するタンパク質をコードしている可能性が高い。本発明において、「ストリンジェントな条件下」とは、当技術分野で周知のパラメーターによって特定される。具体的には、ＤＮＡのハイブリダイゼーション条件は、低イオン強度、およびＤＮＡハイブリッド複合体の融解温度（Ｔｍ）をわずかに下回る温度において、一般にストリンジェントであると言われる。具体的には、Ｔｍよりも約３℃低い条件は、ストリンジェントな条件に含まれる。ストリンジェンシーが高いほど、プローブ配列と標的配列との間の同一性は高い。
　このような条件は、この種の方法をまとめた参考文献で参照することができる。具体的には、例えば、先に示した「モレキュラークローニング：実験マニュアル」や「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」などに記載されている。これらの方法によって、前記天然のＩＦＮαのＤＮＡをプローブとして、未だＩＦＮαが単離されていない生物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、当該生物のＩＦＮαをコードするｃＤＮＡを得ることができる。あるいは既にＩＦＮαが単離されている生物種のｃＤＮＡライブラリーからは、更に新たなサブタイプを単離できる可能性がある。
　例えば、６５℃の、６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件として例示することができる。あるいは、６５℃の、３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4［ｐＨ７］、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ　ＥＤＴＡからなるハイブリダイゼーション緩衝液中でのハイブリダイゼーションを、ストリンジェントな条件として示すこともできる。なおＳＳＣは、ｐＨ７の０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウムである。ストリンジェントな条件においては、ハイブリダイゼーションの後に、ＤＮＡを転写したメンブレンを２×ＳＳＣにて室温で洗浄し、その後に０．１×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて最高６８℃までの温度で洗浄する。
　あるいは、水性ハイブリダイゼーション溶液に代えて、ホルムアミドハイブリダイゼーション溶液を用いることもできる。すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を、例えば、４２℃の５０％ホルムアミド溶液を用いることによって得ることができる。当業者は、同程度のストリンジェンシーを得るために、他の条件や、試薬類を利用することができる。また、改変体の発現のために細胞およびライブラリーをスクリーニングし、それらを単離し、更に目的とするＤＮＡをクローニングおよびシークエンシングするための方法も周知である。例えば、単離すべきＤＮＡの塩基配列に基づいて、当該ＤＮＡを増幅するためのプライマーをデザインすることができる。プライマーを利用して、ＰＣＲ法などの遺伝子増幅法によって、目的とするＤＮＡが増幅される。
　本発明においてＩＦＮαの改変体のアミノ酸配列と天然のアミノ酸配列との同一性は、一般に、少なくとも６５％、通常７５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上である。アミノ酸配列の相同性は、ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって開発された、さまざまな公開ソフトウエアツールによって算出することができる。塩基配列やアミノ酸配列の解析ツールには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，ｅｔ　ａｌ．，のヒューリスティックアルゴリズム（Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，１９９０，２１５：４０３－４１０）が含まれる。このツールは、ＢＬＡＳＴとして知られている。
　本発明において、ＩＦＮαは、その生物学的活性を維持する限り、他の分子によって修飾することもできる。具体的には、ＩＦＮαと他のタンパク質との融合タンパク質を、本発明におけるＩＦＮαとして利用することができる。その他、非蛋白性の高分子化合物によるＩＦＮαの修飾も許容される。例えば、ポリエチレングリコール等の高分子化合物で修飾されたＩＦＮαが血中への投与用製剤として利用されている（ＵＳ５３８２６５７，ＵＳ５５５９２１３，ＵＳ６１７７０７４，ＵＳ５９５１９７４，ＵＳ５９８１７０９）。高分子化合物による修飾によって、ＩＦＮαは血液中での滞留性が改善される。
　本発明に用いるＩＦＮαは、そのアミノ酸配列にしたがって、化学的に、あるいは遺伝子工学的に合成することができる。あるいは天然のＩＦＮαを本発明に利用することもできる。天然のＩＦＮαは、生体や生体材料から抽出することができる。あるいはＩＦＮαを産生する細胞を培養し、その培養物から天然のＩＦＮαを回収することもできる。中でも遺伝子工学的な合成方法は、均質なＩＦＮαを容易に、かつ大量に得るための方法として好ましい。合成すべきアミノ酸配列が明らかであれば、当業者はそれをコードする塩基配列を予測し、合成することができる。あるいは天然のｃＤＮＡやその改変体を調製し、タンパク質に翻訳させることができる。アミノ酸配列をコードするＤＮＡをもとに、ｉｎ　ｖｉｖｏで、あるいはｉｎ　ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳するための多くの手法が公知である。例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてタンパク質に翻訳するためには、一般的には、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始にかかわる５’非転写配列および５’非翻訳配列などを組み合わせることができる。より具体的には、５’非転写調節配列として、遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を遺伝子に連結することができる。転写調節配列として、エンハンサーを付加することもできる。
　発現のために必要な要素のすべてを含む発現ベクターが市販されている。公知のベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９等にも記載されている。一般にこれらの市販のベクターには、アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入するためのマルチクローニングサイトが用意されている。発現させるべきＤＮＡは、適当な制限酵素で切断し、当該クローニングサイトに挿入することで、発現ベクターとすることができる。必要な制限酵素サイトは、合成オリゴヌクレオチドとしてライゲーションすることもできる。融合タンパク質発現用ベクターを利用すれば、ＩＦＮαを融合タンパク質として発現させることもできる。例えば、ｍｙｃタグやＨｉｓタグなどを付加することができるベクターも公知である。
　こうして作製された発現ベクターは、当該ベクターを導入し、目的とするタンパク質への翻訳が可能な宿主細胞に形質転換される。宿主細胞としては、例え、次のような細胞を利用することができる。
　原核細胞（例えば、大腸菌）
　真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母発現システム、および昆虫細胞）
　本発明に利用するＩＦＮαが糖鎖付加部位を含むと予測される場合には、真核細胞を宿主として利用するのが好ましい。例えば、バキュロウイルス発現系を用いて得たイヌＩＦＮαのアミノ酸配列には、少なくとも３箇所の糖化部位が予測されている（特許第５０４６０３０号参照）。このようなＩＦＮαの発現には、真核細胞を利用することができる。
　真核細胞発現系として、例えば、昆虫細胞を利用することができる。バキュロウイルス発現系を利用して、昆虫細胞において外来性のＤＮＡを発現させるための方法が公知である。例えば、特許第５０４６０３０号に記載されるような手法により、昆虫細胞で外来性のＤＮＡを発現させることができる。
　天然のＩＦＮαは、分泌タンパク質である。したがってＩＦＮαをコードする生体由来のｃＤＮＡには、通常シグナル配列もエンコードされている。例えば、配列番号２に示すイヌＩＦＮαは、そのＮ末端２３残基はシグナル配列である。
　上記のような遺伝子工学的な手法によって本発明に用いるＩＦＮαを合成する場合、シグナル配列として、外来性のシグナル配列を利用することもできる。例えば、ヒトＩＦＮαをヒト以外の細胞で発現させるとき、実際の発現に用いる細胞が由来する生物種において機能するシグナル配列を利用することができる。この場合、ヒトＩＦＮαの成熟タンパク質のアミノ酸配列に、ヒト以外の種において機能するシグナル配列が付加された、キメラタンパク質が発現する。発現した組み換えタンパク質は、細胞外への分泌の過程でシグナル配列が除去される。その結果、ヒトの成熟タンパク質が分泌される。あるいは、細胞外への分泌を必要としないのであれば、成熟タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを発現させることもできる。シグナル配列の欠損によって開始コドンを失う場合には、５’末端に人為的に開始コドン（ａｔｇ）を付加することもできる。
　シグナル配列を含むアミノ酸配列を発現させた場合には、培養上清中にＩＦＮαが蓄積される。あるいはシグナル配列を持たないアミノ酸配列として発現させた場合には、細胞内にＩＦＮαの成熟タンパク質が蓄積する。これらの遺伝子組み換えによって発現したＩＦＮαは、培養物から回収し精製して本発明の組成物に利用することができる。培養物からＩＦＮαを回収し、精製するための手法は公知である。あるいは、発現産物を含む培養物そのもの、あるいは粗精製物を本発明の組成物に利用することもできる。例えば、酵母を宿主として発現させたＩＦＮαを、酵母菌体を含んだまま凍結乾燥し、本発明の組成物に配合することができる。
　更に、本発明の組成物に配合するためのＩＦＮαとして、植物（例えば、イチゴ）を宿主として発現させたＩＦＮαを利用することもできる。この場合、ＩＦＮαを発現する形質転換植物の植物体あるいは植物細胞を本発明の組成物の原料として利用することができる。すなわち、本発明は、ＩＦＮαをコードする遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物を含む、慢性難治性外耳炎を予防および／または治療するための組成物を提供する。あるいは本発明は、ＩＦＮαをコードする遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物に由来するＩＦＮα含有分画を含む、慢性難治性外耳炎を予防および／または治療するための組成物に関する。
　例えば、形質転換植物のＩＦＮαを含む組織を、破砕して、本発明の組成物に配合することができる。植物組織を乾燥させた後に粉砕することもできる。あるいは破砕した植物組織を乾燥させることもできる。また、形質転換植物のＩＦＮαを含む組織をホモジェナイズし、必要に応じてろ過して得られたＩＦＮα含有溶液をそのまま、あるいは更に乾燥した後に、本発明の組成物に配合することもできる。これらの形質転換植物に由来するＩＦＮαを含む分画は、いずれも本発明における「形質転換植物」に含まれる。
　形質転換植物として、現在、飼料やペットフードの原料とされている植物を利用すれば、現行の製造工程を大きく変えることなく、本発明の歯肉塗布用組成物を製造することができる。
　このような植物として、具体的には、イチゴ、ジャガイモ、トマト、豆類、穀類等の果実類ならびに牧草類などが挙げられる。豆類としては、ダイズおよび小豆等を利用することができる。穀類としては、イネ、コムギおよびトウモロコシ等を示すことができる。
　本発明に用いる形質転換植物細胞は、ＩＦＮα（あるいはＩＦＮαと同等な生物学的活性を有するタンパク質）をコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入し、発現させることで作製できる。植物細胞におけるＩＦＮαの発現にあたり、ＩＦＮαのＣ末端に、公知の小胞体保持シグナル（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）（例えば、ＫＤＥＬ（配列番号５）またはＲＤＥＬ（配列番号６））を付加することもできる。小胞体保持シグナルとは、例えば、次のようなアミノ酸配列からなる。小胞体保持シグナルを有する分泌タンパク質は、発現後、小胞体内に留まり安定に保持される。
　すなわち、本発明は、Ｃ末端に小胞体保持シグナルを付加されたＩＦＮαをコードする遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物を含む、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療の経口投与用、口腔粘膜塗布用または歯肉塗布用組成物を提供する。あるいは本発明は、Ｃ末端に小胞体保持シグナルを付加されたＩＦＮαをコードする遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物に由来するＩＦＮα含有分画を含む、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療の経口投与用、口腔粘膜塗布用または歯肉塗布用組成物に関する。
　植物細胞における遺伝子発現に用いるベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーターと転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されない。利用可能なベクターとしては、例えば、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）などが挙げられる。植物細胞で転写可能なプロモーターとしては、例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを用いることができる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、次のようなプロモーターが公知である。
　カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．１９８５　Ｎａｔｕｒｅ　３１３：８１０）；
　イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．１９９１　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　３：１１５５）；
　トウモロコシのユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ　ｅｔ　ａｌ．１９９３　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：５６７）
　これらプロモーターに機能的に結合したＩＦＮαをコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入することにより、植物細胞内でＩＦＮαを発現させることができる。ここで「機能的に結合」とは、植物細胞内でＩＦＮαが発現するように、プロモーターとＩＦＮαをコードする遺伝子とが結合していることを意味する。形質転換される「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞が含まれる。例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどにベクターを導入し形質転換体とすることができる。
　ベクターをこれらの植物細胞に導入するための方法は公知である。具体的には、アグロバクテリウムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
　形質転換された植物細胞を再分化させることにより、植物体を再生させることができる。植物種に応じた再分化の方法が確立されている。以下に各植物種の再分化のための方法を列挙する。
　ジャガイモ：Ｖｉｓｓｅｒらの方法（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ　７８：５９４（１９８９））；チユーバーディスク法
　イネ等の単子葉穀類：Ｈｉｅｉらの方法（Ｈｉｅｉ　Ｙ，Ｋｏｍａｒｉ　Ｔ，Ｋｕｂｏ　Ｔ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　１９９７　３５：１－２　２０５－１８）；Ｉｓｈｉｄａらの方法（Ｉｓｈｉｄａ　Ｙ，Ｓａｉｔｏ　Ｈ，Ｏｈｔａ　Ｓ，Ｈｉｅｉ　Ｙ，Ｋｏｍａｒｉ　Ｔ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ　Ｔ：Ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９９６　Ｊｕｎ　１４：６　７４５－５０）；エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｔｅｒａｄａ，Ｒ．，Ｉｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．：Ｆｅｒｔｉｌｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ　３３８，２７４－２７６（１９８９））など
　イチゴ：Ａｓａｏらの方法（Ａｓａｏ，Ｈ．，Ｙ．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｓ．Ａｒａｉ，Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｍ．Ｈｉｒａｉ，Ｋ．ｙｏｓｈｉｄａ，Ａ．Ｓｈｉｎｍｙｏ　ａｎｄ　Ｔ．Ｈｉｂｉ．：Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ａ　ｆｕｎｇａｌ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ　ｈｕｍｕｌｉ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ａ　ｒｉｃｅ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１４（３）：１４５－１４９（１９９７））
　一旦、ゲノム（染色体）内にＩＦＮαをコードする遺伝子が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に該植物体を量産することもできる。例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等を繁殖材料とすることができる。
　更に、植物ウイルスベクターによって、植物において、目的のタンパク質を発現させる技術も公知である。ゲノムに組み込まれない植物ウイルスベクターを用いた場合、通常、外来性遺伝子は子孫には伝達されない。しかし現在のところ、植物ウイルスベクターを用いた外来性遺伝子の植物における発現レベルは、アグロバクテリウム法等に代表される染色体組換え法よりも高いことが知られている。植物ウイルスベクターとしてはタバコモザイクウイルスベクターが実用可能なウイルスベクターとして公知である。具体的には、植物体を育成し、接種可能時期に構築した発現遺伝子から転写させた感染性RNAを植物体に接種することにより、目的物質を植物体内で生産させることができる。
　本発明の組成物は、哺乳動物の慢性難治性外耳炎の予防および／または治療に有用である。本発明において、予防とは、慢性難治性外耳炎の進行を抑制することをいう。症状が出ていない状態においては、症状の発生を遅らせることが予防である。また慢性難治性外耳炎の治療とは、該疾患の症状の少なくとも一つを軽減することを言う。本発明において、予防あるいは治療すべ慢性難治性外耳炎の症状には、限局性またはびまん性外耳道炎、外耳道湿疹、真菌外耳炎（例えば、マラセチア性外耳炎）などが含まれる。
　本発明の組成物を投与するための哺乳動物としては、ヒト、またはイヌやネコなどのペット動物、あるいは動物園で飼育されている哺乳動物が好ましい。このような哺乳動物には、ブタ、イノシシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、シカ、ロバ、トナカイ、ウサギ、サル、ゴリラ、オランウータン、チンパンジー、ナマケモノ、ゾウ、キリン、サイ、カバ、バク、オオカミ、ハイエナ、クマ、パンダ、レッサーパンダ、ハクビシン、キツネ、タヌキ、アライグマ、トラ、ライオン、ヒョウ、チータ、カワウソ、アザラシ、オットセイ、トド、アシカ、イルカ、シャチ、およびクジラなどが含まれる。好ましくは、イヌである。
　本発明において、本発明の組成物は、哺乳動物の経口に投与するため、または口腔粘膜もしくは歯肉に塗布するための組成物をいう。ここで、本明細書で使用するとき、「口腔粘膜」とは、限定されないが、口腔に見られる、または：（ｉ）舌表面、すなわち、舌の表面粘膜、（ｉｉ）舌下表面、すなわち、口腔底部裏層の粘膜、（ｉｉｉ）頬側表面、すなわち、頬裏層の粘膜、（ｉｖ）口蓋表面、すなわち、口蓋裏層の粘膜、（ｖ）咽頭表面、すなわち、咽頭裏層の粘膜、（ｖｉ）歯肉表面、すなわち、歯肉の粘膜、および（ｖｉｉ）歯肉溝、すなわち、歯と歯肉との間に形成された空洞、などの口腔に投与することによって到達できる任意の粘膜表面を意味する。
　本発明の組成物は、インターフェロンαと生物学的に許容される担体を配合することによって製造することができる。生物学的に許容される担体とは、配合されるインターフェロンα、および当該組成物が投与される生物に対して、不活性な担体が含まれる。生物に対して不活性な担体とは、担体が正常な生物の機能に干渉しないことを言う。正常な生物の機能には、代謝機能、生殖機能、運動機能、神経作用などが含まれる。例えば、生物の正常な代謝機能によって代謝される成分は、生物学的に許容される担体に含まれる。あるいは消化や代謝が行われない成分や、行われにくい成分であって、生物の機能に干渉しない成分は、いずれも生物学的に許容される担体に含まれる。例えば、ＩＦＮαが配合された食品は、本発明の組成物の好ましい態様を構成する。また、本発明の組成物は、慢性難治性外耳炎の予防あるいは治療を目的とする医薬組成物として経口投与等することもできる。
　すなわち本発明は、インターフェロンαを有効成分として含有する、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療のための医薬組成物に関する。あるいは本発明は、インターフェロンαと薬学的に許容される担体を含む、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療のための医薬組成物に関する。更に本発明は、インターフェロンαの慢性難治性外耳炎の予防および／または治療ための医薬組成物の製造における使用に関する。また本発明は、インターフェロンαの慢性難治性外耳炎の予防および／または治療のための方法における使用に関する。
　特に、従来の技術においては慢性難治性外耳炎に対する積極的な治療方法は知られていなかった。本発明においては、実施例７でも確認されたとおり、本発明の慢性難治性外耳炎の治療剤を投与することによって、既に進行している慢性難治性外耳炎の治療効果が確認された。すなわち、本発明は、インターフェロンαを有効成分として含有する、慢性難治性外耳炎の治療剤を提供した。あるいは本発明は、インターフェロンαと薬学的に許容される担体を含む、慢性難治性外耳炎の治療用医薬組成物に関する。更に本発明は、インターフェロンαの慢性難治性外耳炎の治療のための医薬組成物の製造における使用に関する。また本発明は、インターフェロンαの慢性難治性外耳炎の治療における使用に関する。
　続いて本発明におけるインターフェロンαを含有する組成物の具体的な態様について説明する。
　インターフェロンαを含む食品組成物：
　通常、哺乳動物の食品（ｆｏｏｄ）あるいは飼料（ｆｅｅｄ）として摂取される成分にインターフェロンαを配合することによって、本発明の組成物とすることができる。飼料が特にペット動物に与えられる場合には、ペットフードと呼ばれる。ペットフードは、本発明における食料あるいは飼料に含まれる。なおペット動物とは、鑑賞や愛玩を目的として飼育されている非ヒト動物を言う。したがって、例えば、食肉、卵、毛、乳汁などの出荷や使役を目的として飼育されている動物は、通常家畜に含まれ、ペットとは区別される。ただし、警察犬や盲導犬などの、使役を目的として飼育される動物（使役動物；ｗｏｒｋｉｎｇ　ａｎｉｍａｌ）に対して、愛玩動物と同じ飼料が与えられる場合もある。飼育の目的が使役であっても、ペットと同じ動物種に対してペットと同じ飼料が与えられる場合には、当該飼料は本発明でいうペットフードに含まれる。
　一般に、食品あるいは飼料は、炭水化物、タンパク質、ミネラル、脂肪、水分、あるいは繊維などを含む。その原料の多くは、動物や植物の組織、微生物菌体、ならびにそれらの加工品である。加工品とは、これらの素材を原料として、加熱、乾燥、凍結乾燥、あるいは抽出などによって得られた製品を言う。一連の加工品を得るための工程には、複数の異なる工程を組み合わせることもできる。
　食品あるいは飼料には、保存剤、防腐剤、酸化防止剤、色素、香料、保湿剤、調味料などを配合することもできる。また食品の形態に合わせて、増量剤、結合剤、あるいは粘度調整剤等の成分が添加されることもある。これらの成分には、天然由来の成分や、合成された成分が利用されている。したがって、これらの、一般の食品あるいは飼料素材に、ＩＦＮαを配合することによって、本発明に基づく食品組成物とすることができる。更に、一般のＩＦＮαを含まない食品あるいは飼料の摂取時に、ＩＦＮαを混入することによって、本発明の組成物とすることもできる。
　本発明の食品組成物、あるいは飼料組成物は、一般に食品あるいは飼料として利用される素材に、インターフェロンαを添加することによって得ることができる。本発明による食品組成物あるいは飼料組成物に添加されるインターフェロンαの量は、通常体重１ｋｇあたり１～１５０００ＬＵ／日、好ましくは体重１ｋｇあたり０．５～２５０００ＬＵ／日である。つまり、１日の標準的な食品あるいは飼料の摂取量に対して、体重１ｋｇ当たり、１～１５０００ＬＵ、好ましくは０．５～２５０００ＬＵのインターフェロンαを配合することができる。食品組成物が、チューインガム（ｃｈｅｗｉｎｇ　ｇｕｍ）などの嗜好性食品（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｏｏｄ）の場合には、インターフェロンαの配合量に応じて、１日当たりの当該食品の摂取量を表示することで、インターフェロンの投与量を制御することもできる。例えば、チューインガム１枚に１日分の投与量を配合したときには、１日当たりのチューインガムの摂取量が１枚であることが推奨される。
　インターフェロンαを含む咀嚼性組成物（ｃｈｅｗａｂｌｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）：
　本発明におけるＩＦＮαを含む組成物は、咀嚼性の担体と配合して、咀嚼性組成物とすることができる。すなわち本発明は、ＩＦＮαと咀嚼性の担体（ｃｈｅｗａｂｌｅ　ｃａｒｒｉｅｒ）を含む組成物を提供する。本発明において、咀嚼性の担体とは、動物の口腔に投与したときに、咀嚼される成分を言う。咀嚼性の担体は、噛み砕かれる素材であることもできるし、咀嚼によって小さな破片に砕かれにくい素材であることもできる。具体的には、例えば、グルコース、シュクロース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、でんぷん、ゼラチン、アルギン酸、アルギン酸塩、セルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、グアガム（ｇｕａｒ　ｇｕｍ；ポリガラクトマンナン）、グルコマンナン、キサンタンガム、カーボポール等を示すことができる。
　あるいは、各種のガムベースも本発明における咀嚼性の担体に含まれる。一般にガムベースには、口の中で長時間咀嚼しても、なお一定の体積が維持される担体が利用される。ガムベースとしては、例えば、植物性樹脂、チクル、酢酸ビニル樹脂、エステルガム、ポリイソブチレン、炭酸カルシウム、あるいはジェルトン（ポンチアナック）等を利用することができる。ガムベースは、本発明における咀嚼性組成物を、対象の口腔への投与用に加工する場合に好適な咀嚼性担体である。
　本発明における咀嚼性組成物が、医薬品として利用される場合には、咀嚼性の医薬組成物であり、食品として供される場合には、咀嚼性食品である。あるいは、本発明の組成物を咀嚼性の飼料とする場合には、咀嚼性の飼料組成物となる。なお、非ヒト動物においては、咀嚼行動を誘導するために、咀嚼性組成物の大きさを調節することができる。すなわち、一口で飲み込まれない程度の大きさに加工することによって、非ヒト動物において咀嚼行動を誘導することができる。更に、硬さを動物に合わせて高めることにより、より多くの咀嚼行動を誘導することもできる。
　インターフェロンαを含むペースト状の組成物（ｐａｓｔｅ　ｔｙｐｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）：
　本発明におけるＩＦＮαを含む組成物は、ペースト状の担体と配合して、ペースト状の組成物とすることもできる。すなわち、本発明は、ＩＦＮαとペースト状の担体（ｐａｓｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ）を含む組成物を提供する。本発明において、ペースト状の担体とは、半固形状（ｓｅｍｉ－ｓｏｌｉｄ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を有する担体と言うこともできる。あるいはペースト状の担体には、ゲル状の担体が含まれる。
　ペースト状の組成物は、例えば、水溶性の多糖類あるいは高分子化合物に、水などの溶媒を加えることで調製することができる。水溶性の多糖類あるいは高分子化合物には、グルコース、シュクロース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、でんぷん、ゼラチン、ペクチン、アルギン酸、アルギン酸塩、セルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、グアガム（ｇｕａｒ　ｇｕｍ；ポリガラクトマンナン）、グルコマンナン、カラギーナン、キサンタンガム、タマリンドガム、カーボポール、アガロース、寒天等が含まれる。このほか、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの高分子化合物も、ゲル状の担体として本発明の組成物に配合することができる。
　本発明の組成物は、固形状、ゲル状、液状など任意の形状を選択することができる。ＩＦＮαの活性を維持するためには、乾燥された状態で流通させるのが望ましい。あるいは、組成物の摂取時に水などの適当な溶媒を加えることによって、乾燥した組成物をゲル状や液状にすることもできる。更に、本発明の組成物を凍結状態で流通させることもできる。
　また本発明の組成物は、香料、色素、矯味剤、甘味料、調味料などの成分を付加的に含むことができる。更に咀嚼性担体を配合した組成物においては、更に植物繊維などを配合して、歯牙のブラッシング効果を期待することもできる。
　本発明の組成物において、ＩＦＮαの含有量は、体重１ｋｇあたり通常０．５～２５０００ＬＵ／日、例えば、体重１ｋｇあたり１～１５０００ＬＵ／日、より具体的には２～５０００ＬＵ／日、通常２～５００ＬＵ／日、好ましくは２～１０ＬＵ／日程度となるように配合することができる。例えば、血液中に抗ウイルス効果を期待して投与されるＩＦＮαの投与量は、数ＭＩＵ～１０ＭＩＵ（１ＭＩＵ＝１０００ＩＵ）ときわめて高用量である。これに対して、ＩＦＮαの使用量を低く抑えることによって、本発明におけるＩＦＮα投与による副作用の危険は無視しうるほどに小さい。本発明の組成物におけるＩＦＮαの配合割合は、当該組成物の摂取量に基づいて決定することができる。例えば、飼料に配合する場合には、本発明の組成物を投与すべき動物の体重と、１日当たりの飼料の摂取量に基づいて、飼料に配合すべきＩＦＮαの量を決定することができる。なお、本発明における１ＬＵは、ヒト天然型ＩＦＮαの１ＩＵに相当する。
　あるいは、本発明の組成物に含まれるＩＦＮαの含有量に基づいて、当該組成物を体重１ｋｇ当たり、一日に何ｇを摂取すればよいのかを、指示書において説明することもできる。すなわち本発明は、（１）インターフェロンαと生物学的に許容される担体とを含む組成物と、（２）当該組成物の慢性難治性外耳炎の予防および／または治療のために有効な投与量を記載した指示書を含む、慢性難治性外耳炎を予防および／または治療するためのキットを提供する。
　本発明において、ＩＦＮαの力価（ＬＵ）は、例えば、特許第５０４６０３０号に記載されている手法に従って決定することができる。
　本発明の組成物は、動物に適用（例えば、経口投与または口腔粘膜塗布もしくは歯肉塗布）することによって、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療の効果を実現することができる。すなわち本発明は、インターフェロンαを適用する工程を含む、哺乳動物の慢性難治性外耳炎を予防および／または治療するための方法を提供する。特に、インターフェロンαを哺乳動物、好ましくはイヌの歯肉に塗布する工程を含む慢性難治性外耳炎の治療方法は、本発明における好ましい態様である。
　本発明の組成物は、例えば、固形状、ペースト状、ゲル状、液状などの任意の形状として、哺乳動物の歯肉に塗布することができる。固形製剤は、咀嚼あるいは嚥下行為を介して、歯肉に間接的に塗布することができる。あるいは、口中錠（いわゆるトローチ剤）として固形製剤を歯肉に間接的に塗布することもできる。ペースト状あるいはゲル状製剤は、咀嚼や嚥下行為に加え、歯肉に直接塗布することができる。液状製剤は、嚥下行為に加え、歯肉への噴霧、口内洗浄やうがい行為を介して投与することができる。
　本発明を医療行為として適用する場合には、本発明の組成物は、医薬組成物として利用される。すなわち本発明は、インターフェロンαと薬学的に許容される担体を含む、哺乳動物の慢性難治性外耳炎の予防および／または治療のための医薬組成物を提供する。本発明において、薬学的に許容される担体とは、通常、薬剤の製剤に利用されている不活性な担体を利用することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例１〕イヌインターフェロンα（ＣａＩＦＮα－４）遺伝子のクローニング
　ＣａＩＦＮα４遺伝子は、紫外線で不活化したニューカッスル病ウイルスＢ１株により刺激したイヌ細胞（ＭＤＣＫ細胞）のｍＲＮＡを鋳型として作製したｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ法によりクローニングした。なお、クローニングに使用したプライマーの配列は以下の通りである。
　センスプライマー：5'-GCAGGATCCACGATGGCCCTGC-3'（配列番号３）；および
　アンチセンスプライマー：5'- GCTGAGCTCAAAGTTCATCCTTATGATGATGATGATGATGTTTCCTCCTCCTTACTCTT-3'（配列番号４）
　ＣａＩＦＮα－４遺伝子（配列番号１；アミノ酸配列：配列番号２）には、ＰＣＲ法により、５’末端側にＢａｍＨＩ配列を、３’末端側にＳａｃＩ配列を付加した。さらに発現タンパク質のアフィニティー精製を目的にＨｉｓ－Ｔａｇ配列を、発現タンパク質の小胞体からの分泌を抑制し宿主細胞内に蓄積させる目的で小胞体保持シグナルＫＤＥＬをＣａＩＦＮα－４配列の下流に付加した。ＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片（以下、ＣａＩＦＮα－４－Ｈｉｓ－ＫＤＥＬ）は、ｐＣＲ２．１　ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へＴＡクローニング法により導入し、大腸菌に形質転換し、クローニングを行った。大腸菌の形質転換体よりプラスミドを抽出し、塩基配列を確認した。
〔実施例２〕植物発現用イヌインターフェロンα（ＣａＩＦＮα４）遺伝子の作製
　塩基配列確認後のプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ・ＳａｃＩにて同時消化し、ＣａＩＦＮα－４－Ｈｉｓ－ＫＤＥＬ遺伝子（ＢａｍＨＩ－ＳａｃＩ断片）を切り出した。植物発現用ベクターｐＢＥ２１１３－ＧＵＳ（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６，３７，４９－５９）を同じく制限酵素ＢａｍＨＩ・ＳａｃＩにて同時消化し、ＣＩＡＰ処理を施した後、ＣａＩＦＮα－４－Ｈｉｓ－ＫＤＥＬ遺伝子（ＢａｍＨＩ－ＳａｃＩ断片）と混和してライゲース処理を行い、ｐＢＥ２１１３－ＣａＩＦＮα－４－Ｈｉｓ－ＫＤＥＬを作製した。
〔実施例３〕イチゴ形質転換
　ｐＢＥ２１１３－ＣａＩＦＮα－４－Ｈｉｓ－ＫＤＥＬをアグロバクテリウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ　ＬＢＡ４４０４）に導入し、カナマイシン（Ｋｍ）耐性株を選抜し、イチゴの形質転換実験を行った。Ｋｍ添加培地を用いてカルス誘導と再分化を行い、Ｋｍ耐性個体を選抜した。Ｋｍ耐性個体の葉から抽出したＤＮＡを鋳型とし、Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＰＣＲ法にて、ＣａＩＦＮα－４遺伝子の導入を確認した（図１）。
〔実施例４〕ＣａＩＦＮα－４発現遺伝子組換えイチゴの栽培と果実採取
　目的タンパク質の発現が確認された高発現系統のイチゴ培養苗を馴化し、水耕栽培し果実を採取した。
〔実施例５〕遺伝子組換えイチゴ（果実）発現ＣａＩＦＮα－４の生理活性評価
　ＣａＩＦＮαの生理活性評価の陽性対照および標準品として、再表２００７－０８０９４２（特願２００７－５５３９３６）に準じて、バキュロウイルス発現ＣａＩＦＮα－４を調製した。採取したＣａＩＦＮα－４遺伝子組換えイチゴ果実をＰＢＳで破砕して、果実破砕液を調製した。陰性対照として非組換えイチゴ果実破砕液を調製した。生理活性評価は、一般的なインターフェロンα生物活性測定法である豚水疱性口炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ）による細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ）抑制法にて実施した。感受性細胞としてイヌ由来Ａ－７２細胞を用いた。ＣａＩＦＮα－４力価測定には、破砕液、陽性対照および陰性対照を維持培地で１０4倍～１２８×１０4倍まで２段階希釈したものを試料として供試した。試験方法の詳細を以下に記載する。なお、本明細書にてインターフェロンαの抗ウイルス活性は単位「ＬＵ」で表すが、単位「ＬＵ」はインターフェロンαの活性を示す国際単位「ＩＵ」とは、抗ウイルス活性において同義である。
　２５ｍｌフラスコに１×１０5／ｍｌに調製したＡ－７２浮遊細胞液を５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ2で２日間培養した。Ａ－７２細胞が単層を形成したらフラスコ内の培地を捨て、各イチゴ破砕液を維持培地で１０3倍に希釈後５ｍｌ添加した。３７℃、５％ＣＯ2で１日間培養し、維持培地を用いて１，０００ＭＯＩに調製したＶＳＶ希釈液を０．５ｍｌ添加した。３７℃、ＣＯ2で３日間培養し、倒立顕微鏡下でフラスコ内の細胞を観察した。ＣａＩＦＮα－４遺伝子組換えイチゴ果実破砕液による細胞変性抑制効果および抗ウイルス活性の結果を図２に示す。更に増殖培地を用いて１×１０5個／ｍｌに調製したＡ－７２細胞浮遊液を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ2で２日間培養した。Ａ－７２細胞が単層を形成したら、各ウェルから培地を除き、試料および標準品試料（１．０×１０4ＬＵ／ｍｌに調製したバキュロウイルス発現ＣａＩＦＮα－４を０．５×１０4～６４×１０4倍まで２倍段階希釈して作製）を１検体あたり４ウェルに添加した。細胞コントロールウェルおよびウイルスコントロールウェルには維持培地を１００μｌずつ添加した。３７℃、５％ＣＯ2で１日培養し、各試料ウェルおよびウイルスコントロールウェルには維持培地を用いて１．０×１０3ＭＯＩに調製したＶＳＶ希釈液を１ウェル当たり１０μｌずつ添加した。３７℃、５％ＣＯ2で３日間培養し、プレート上の培地を捨て、１％クリスタルバイオレット染色液を各ウェルに８０μｌずつ添加し、暗所、室温で３０分間静置した。流水で洗浄し、風乾後、プレートリーダーを用いて波長５９５ｎｍの吸光度を測定し、遺伝子組換えイチゴ果実によって発現されたＣａＩＦＮα－４は生物活性（抗ウイルス活性）を有することおよび、定量可能であることを確認した。
　なお、ＣａＩＦＮα－４発現イチゴ果実破砕液のＣａＩＦＮα－４力価測定については、「ゲタウイルスを用いたヒトインターフェロン測定の試み」（ウイルス５５（２）３１７－３２６（２００５））に準じて、より安全性の高いゲタウイルスを用いた測定方法の検討を行い、ＶＳＶによるＣａＩＦＮα－４力価測定結果と、ゲタウイルス（ハルナ株）によるＣａＩＦＮα－４力価測定結果との間に高い相関関係が認められたことから（ｒ２＝０．９９６８６）、ゲタウイルスを用いることとした。
〔実施例６〕試験薬の調製
　収穫したＣａＩＦＮα－４発現イチゴ果実を凍結乾燥し、破砕して凍結乾燥粉末を調製した。ＣａＩＦＮα－４発現イチゴ凍結乾燥粉末と安定化剤であるマルトースとを混合し、試験薬を調製した。試験薬の力価試験を実施し、１．２×１０4ＬＵ／ｇであることを確認した。
〔実施例７〕投与試験（その１）
　上記実施例６で調製した試験薬を被験犬に供与し、マラセチア性外耳炎に対する炎症抑制効果を検証した。被験犬は６ヶ月齢のシバイヌを６頭用意し、以下の要領でマラセチア菌の実験感染を実施した。
　マラセチア菌はＭａｌａｓｓｅｚｉａ　ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ（ＡＴＣＣ　１４５２２株）を使用した。凍結乾燥状態の菌体を滅菌蒸留水で溶解し、サブロー寒天培地で３０℃、７日間培養した。発育を認めるコロニーを十分掻きとり、滅菌生理食塩水に懸濁したものを原液とした。原液の一部を１０倍階段希釈し、それぞれの希釈菌液から１０μＬ分取した。分取した菌数を測定し、希釈倍率を乗じたときの菌数を原液の菌数とし、１．７×１０6／０．１ｍＬとなるように滅菌生理食塩水で希釈して攻撃菌液とした。調製した攻撃菌液を６頭すべての被験犬に、左右外耳に０．１ｍＬずつ接種し、実験的に感染させた。
　被験犬は、実験感染後の被験犬を観察し、マラセチア性外耳炎に特徴的な痒覚・外耳発赤・外耳悪臭・耳垢黒褐色化の４症状について発現の有無を確認した。それぞれの症例の発現にスコア１を付し、症状をスコア化した。すなわち、無発症の場合はゼロ、全４症例が認められた場合は最大スコア４とした（症例として、痒覚と耳垢が確認された場合は、スコア２等）。
　菌液を攻撃後、７日目に３頭ずつ２群に群分けし、試験薬投与群ならびに非投与対照群を設定した。被験犬の投与時体重を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　投与方法は、経口投与とし、より具体的には以下のように実施した。
　試験薬をＣａＩＦＮα－４として２５００ＬＵ相当量を計量（約０．２ｇ）し、これに少量の水（１００μｌ以下）を滴下して練り、ペースト状にした。ペースト状試験薬の全量を被験犬の歯肉に塗布した。
　投与群３頭には、給餌前に１頭１日当たり２５００ＬＵ、被験犬の歯肉へ２１日間連続塗布投与し、非投与群３頭との外耳観察所見を記録した。投与期間中の各群の外耳臨床観察所見の推移を図３に示す。投与群で試験薬の歯肉塗布投与を開始することで、非投与対照群と比較して有意に軽減していった。投与開始後９日目から回復傾向が認められ、投与開始後１４日目の臨床スコアの差は、非投与群と比較して有意であった。
　投与開始後２１日目の各被験犬の外耳所見写真ならびに耳垢の褐色程度を図４に示す。明らかに投与群での外耳局所病変は軽減していることが判明した。なお、試験薬投与期間中、投与群の全個体で本剤投与に起因すると思われる副作用等は一切観察されなかった。
　以上のことから、イヌインターフェロンαの歯肉塗布投与は、マラセチア菌に起因する難治性外耳炎に対して炎症抑制効果を示すことが明らかとなった。
〔実施例８〕投与試験（その２）
　投与試験は、実施例７に記載の方法に準じるが、有効成分であるＣａＩＦＮα－４の含有量を１／１０にした試験薬を投与期間を変えて被験犬（シバ系雑種、２歳４ヶ月）に供与して、マラセチア性外耳炎に対する炎症抑制効果を検証した。検証に使用した被験犬は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　投与群３頭にＣａＩＦＮα－４（２５０ＬＵ／頭）を週２回の頻度で、給餌前に歯肉塗布投与し（計７回実施）、対象群（非投与群）との外耳観察所見を記録した。実施例７と同様に、マラセチア性外耳炎に特徴的な痒覚・外耳発赤・外耳悪臭・耳垢黒褐色化の４症状をスコア化した。投与期間中の各群の外耳臨床観察所見の推移を図５に示す。投与群で試験薬の歯肉塗布投与を開始することで、非投与対照群と比較して有意に軽減し、非投与群と比較して有意であった。
　投与開始後２１日目の各被験犬の外耳所見写真ならびに耳垢の褐色程度を図６に示す。実施例７の投与試験の結果と同様に、明らかに投与群での外耳局所病変は軽減していた。
　以上のことから、イヌインターフェロンαの歯肉塗布投与は、実施例７で採用した濃度を１／１０にしたとしても、マラセチア菌に起因する難治性外耳炎に対して炎症抑制効果を示すことが明らかとなった。
　本発明は、動物の慢性難治性外耳炎の予防あるいは治療に有用である。イヌやネコなどのペットにおいては、一般的に、慢性難治性外耳炎の予防や治療は重要な課題となっている。本発明の組成物は、歯肉に塗布することで、その効果を得ることができる。

Claims (13)

  1. 　インターフェロンαを有効成分として含む、慢性難治性外耳炎の予防および／または治療の経口投与用組成物。
  2. 　インターフェロンαと咀嚼性の担体を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 　咀嚼性の担体が食品である、請求項２に記載の組成物。
  4. 　咀嚼錠またはチューインガムである、請求項３に記載の組成物。
  5. 　インターフェロンαとペースト状の担体を含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 　体重１ｋｇあたり０．５～２５０００ＬＵ／日のインターフェロンαが配合されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 　インターフェロンαを経口投与することを含む、慢性難治性外耳炎を予防および／または治療するための方法。
  8. 　インターフェロンαと咀嚼性の担体またはペースト状の担体とを含む組成物を経口投与することを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　体重１ｋｇあたり０．５～２５０００ＬＵ／日のインターフェロンαが経口投与される、請求項７または８に記載の方法。
  10. 　インターフェロンαと薬学的に許容される担体とを含む、慢性難治性外耳炎を予防および／または治療するための医薬組成物。
  11. 　薬学的に許容される担体が咀嚼性の担体またはペースト状の担体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 　体重１ｋｇあたり０．５～２５０００ＬＵ／日のインターフェロンαが配合されている、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
  13. 　慢性難治性外耳炎の治療および／または予防のための経口用組成物の製造におけるインターフェロンαの使用。
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