CN108864292B - 一种干扰素重组融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种干扰素重组融合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干扰素重组融合蛋白及其应用，所述融合蛋白由犬干扰素α和蓖麻毒素B链经(G4S)3柔性linker连接而形成。所述犬干扰素融合蛋白比普通犬干扰素α抗病毒活性提高，具有广谱抗病毒作用并提高了犬自身的免疫应答。

Description

一种干扰素重组融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及由犬干扰素α与蓖麻毒素B链蛋白组成的融合蛋白及其制备方法。
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)是一种具有强大抗病毒活性的糖蛋白，是宿主防御病原体侵入的第一批防线之一。干扰素在病毒感染过程中参与许多免疫相互作用，并促成诱导和调节先天和适应性抗病毒机制。然而，病毒可以“干扰”干扰素的抗病毒功能而逃逸免疫清除、造成慢性病毒感染。而基因工程重组干扰素的发展，使干扰素作为一种抗病毒药物选择依然具有很大吸引力，但目前用于治疗犬病毒病的重组犬干扰素因为半衰期短、频繁给药、中和抗体产生以及种属差异等原因而使治疗效果大打折扣。
蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)由RTA、RTB两个肽链以二硫键共价相连接。RTB链由260个氨基酸组成，分子量约34000，是能与半乳糖/N-乙酰基半乳糖胺特定结构结合的外源凝集素蛋白，具有凝集素活性。RTB单独存在时并没有毒性，目前认为RTB主要由二个功能：第一，它可以帮助RTA转运到细胞溶质中，抑制蛋白质的合成。第二，RTB配体具有广泛与受体特异性结合的能力，可以结合不同的糖结构，调解各种生物过程，包括细胞与宿主、病原体相互作用和先天免疫反应，可以用作异源性疫苗抗原的载体，例如RTB可融合不同的轮状病毒抗原VP7，P24及NSP4等，发挥粘膜佐剂作用，增强机体免疫反应。
发明内容
本发明提供一种具有高效抗病毒活性的融合蛋白。该蛋白由犬干扰素α与蓖麻毒素B链组成的融合蛋白。
本发明将犬干扰素α(CaIFNα)与蓖麻毒素B链(RTB)通过大肠杆菌原核表达系统进行共表达，制备具有干扰素生物活性的重组CaIFNα/RTB融合蛋白。
本发明的技术方案是：
本发明还提供了包含有SEQ ID 2氨基酸序列的融合蛋白CaIFNα-linker-RTB(CaIFNα/RTB)，该融合蛋白包括三部分，CaIFNα与RTB通过linker相连接，所述CaIFNα的蛋白序列为SEQ ID 3，所述RTB的蛋白序列为SEQ ID 4。
所述linker由(GGGGS)n组成，所述n＝1～5。优选n＝3
优选所述linker为GGGGSGGGGSGGGGS。
所述融合蛋白还包括有纯化标签，优选纯化标签为His标签。
本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID 1。
所述SEQ ID 1为融合蛋白核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0是被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现犬干扰素α原始基因的密码子在大肠杆菌中CAI值为0.27GC百分比为59.7％；而通过密码子优化后CAI值为1.通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。
本发明还公开一种包含SEQ ID 1核酸序列的重组载体。
所述重组载体选自PET系列载体、pUC系列载体、pCold系列载体、pSUMO系列载体、pDsRed系列载体、pBAD系列载体、pMAL系列载体、pACYC系列载体、pQE系列载体、pGEX系列载体。优选pUC57或pET-28。
本发明还公开一种包含上述重组载体的工程菌。
本发明还公开了SEQ ID 2所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含有SEQ ID 1的表达载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。
所述CaIFNα/RTB融合蛋白对MDCK细胞无毒性。
所述表达载体为含有基因组2的PET28a大肠杆菌表达载体。
所述工程菌为BL21(DE3)/pET28a-CaIFNα/RTB，其制备方法为：
(1)人工合成带有柔性linker序列的犬干扰素α与蓖麻毒素B链蛋白，通过linker将犬干扰素α与蓖麻毒素B链蛋白连接，连接后的目的基因核苷酸序列表如sequecelisting所示。
(2)将连接后的目的基因连接到pET-28a质粒上获得重组表达载体。
(3)将重组表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌。
所述的纯化方法为：融合蛋白经变性溶解后经亲和层析，并复性，最后通过阴离子交换层析和分子筛层析纯化。
蓖麻毒素B链本身无毒，作为载体分子，可更好地促进物质的粘附和吸收，且可以保留各自的生物活性不受影响。本发明公开了重组CaIFNα/RTB融合蛋白的制备及体外抗病毒活性检测。
利用MTT法检测重组CaIFNα/RTB融合蛋白的细胞毒性，结果无毒。扩增VSV病毒，测得TCID50为10～7.37/100μL。利用MDCK-VSV系统，通过结晶紫染色，测得表达的重组CaIFNα/RTB融合蛋白的抗病毒效价为1.67×1011IU/mg，比干扰素的效价3×106相比，抗病毒活性提高了5个数量级。结果表明利用大肠杆菌原核表达系统成功获得重组CaIFNα/RTB融合蛋白，体外生物学活性检测证明其对MDCK细胞有高效的抗病毒活性，为犬干扰素抗病毒生物制剂的研发提供了新的依据。该融合蛋白在犬抗病毒药物中的应用，可制备对犬有特异生物活性且高效廉价的抗病毒生物制剂。
附图说明
图1目的条带PCR扩增和双酶切产物的核酸电泳图。
图2诱导表达SDS-PAGE结果。M：蛋白Marker，1.PET28a/BL21空载体诱导表达菌，2.PET28a-IFR/BL21诱导表达菌
图3重组CaIFNα/RTB融合蛋白表达的SDS-PAGE图。
图4重组蛋白纯化与复性结果M.蛋白Marker，1.包涵体8M尿素溶解液2.亲和层析流穿液3.杂蛋白液4.目的蛋白液
图5纯化后的融合蛋白SDS-PAGE图。
图6MTT法检测CaIFNα/RTB融合蛋白对MDCK细胞毒性结果。
图7重组CaIFNα/RTB融合蛋白MDCK-VSV抗病毒实验评价结果。
图8融合蛋白及干扰素抗病毒活性的效价图。
具体实施方式
实施例1 CaIFNα-linker-RTB目的蛋白的制备
1.1 CaIFNα-linker-RTB基因的获取
合成CaIFNα-linker-RTB目的基因，犬干扰素α下游加入(G4S)3linker序列，加入蓖麻毒素B链序列，并在目的基因两端分别加入NdeI与XhoI限制性酶切位点。合成后的目的基因核苷酸序列连接至pUC57载体，并将该质粒命名为pUC57-CaIFNα/RTB。
合成后的pUC57-CaIFNα/RTB经双酶切与测序鉴定，确保目的基因序列无误。
1.2大肠杆菌重组表达载体构建
目的片段经测序与双酶切鉴定准确无误后将pUC57-CaIFNα/RTB质粒与PET28a序列经NdeI与XhoI进行双酶切，并通过DNA胶回收纯化将CaIFNα/RTB目的片段与PET28a载体片段相连接。4℃连接过夜。
转化连接至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含卡那霉素的LB培养基平板过夜培养；挑取LB平板上的单菌落进行目的片段PCR鉴定，阳性克隆质粒经NdeI与XhoI双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示工程菌构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在1389bp出检测出单一条带，其结果如图1所示，说明成功得到了BL21(DE3)/pET28a-CaIFNα/RTB基因工程菌。
1.3重组CaIFNα/RTB融合蛋白的表达
挑取工程菌于含100μg/mL的卡那霉素LB培养基中，37℃摇床复苏1h，在LB培养基中方法培养4h，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，37℃诱导表达8h；收集菌体经SDS-PAGE电泳检测，其结果如图2所示，从图中可以看出，重组菌经诱导后菌体破碎沉淀51.2kd左右处可见优势表达条带，说明在包涵体中成功表达了融合蛋白。
加入质量体积比1:1的PBS重选菌体沉淀；-20℃与室温反复冻融沉淀3次；4℃超声裂解细菌沉淀，工作5s间隔5s超声10min，整个过程重复2～3次；4℃，12000r/min离心15min，取破碎沉淀得到粗制融合蛋白，表达结果见图3。
1.4.融合蛋白纯化与复性
4.1 His亲和层析
将所获得包涵体沉淀用8mol/L尿素溶液(配方:Tris 50mmol/L、Urea 8mol/L、NaCl0.5mol/mL、pH＝8.0)溶解后，上样至Ni-chelating sepharose Ni2+亲和层析柱，洗脱液为含300mmol/L咪唑的8M尿素(配方：Tris 50mmol/L，Urea 8mol/L，NaCl 0.5mol/L，pH＝8.0)。当咪唑浓度为300mmol/L时，收集洗脱峰即为纯化后的CaIFNα/RTB融合蛋白，纯化后的蛋白如图4所示。
4.2重组CaIFNα/RTB融合蛋白复性
纯化后CaIFNα/RTB融合蛋白补加甘油至100mL/L，蔗糖至5g/L，GSH至0.9mmol/L，GSSG至0.1mmol/L，补加少许Brij35，并将CaIFNα/RTB融合蛋白浓度调节至0.6mg/mL，移取到截留量为3Kd的透析带中。配制蛋白复性液(配方:Tris 50mmol/L，甘油100mL/L，蔗糖5g/L，GSH 0.9mmol/L，GSSG 0.1mmol/L，少许Brij 35，pH＝8.0)进行透析梯度复性，结果见图5。复性结束后用PEG20000浓缩蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白浓度为1.40mg/mL用0.22μm滤器过滤除菌后保存于-80℃。
实施例2 CaIFNα-linker-RTB融合蛋白的活性检测
2.1 CaIFNα/RTB融合蛋白的细胞毒性
利用MTT法，检测实验所得的重组CaIFNα/RTB融合蛋白对MDCK细胞的毒性作用，主要步骤如下：
(1)将生长良好的MDCK细胞用胰蛋白酶消化，离心、重悬制成细胞悬液，计数板计数后，以1×105个/mL接种96孔板，每孔100μL。37℃，5％CO2培养箱培养过夜，使细胞贴壁为单层。
(2)将实验所得的CaIFNα/RTB融合蛋白，按照102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6μg/mL进行稀释。
(3)取出预先铺好的96孔培养板，将稀释好的蛋白样品加入相应孔中，每孔100μL，每个浓度做3个复孔，37℃，5％CO2培养箱培养24h。
(4)每孔加入10μL MTT溶液，37℃，5％CO2培养箱继续培养4h。
(5)吸尽96孔板中培养液，每孔加入100μL DMSO，摇床上振荡10min。
(6)多功能高端酶标仪测定每孔490nm处OD值，进行数据分析。
采用MTT法检测CaIFNα/RTB融合蛋白对MDCK细胞是否有毒性。根据酶标仪检测的各组490nm处OD值的分析结果(图6)可知，与正常C组相比，CaIFNα/RTB融合蛋白各组值均大于或等于正常组，说明CaIFNα/RTB融合蛋白本身对MDCK无毒性。
2.2采用MDCK/VSV系统，检测实验所表达的CaIFNα/RTB融合蛋白的抗病毒活性
(1)将生长良好的MDCK细胞用胰蛋白酶消化，离心、重悬制成细胞悬液，计数板计数后，以1×105个/mL接种96孔板，每孔100μL。37℃，5％CO2培养箱培养过夜，使细胞贴壁为单层。
(2)取干扰素标准品，按说明书溶解后，以8％DMEM培养液预先稀释至标准品活力单位：105、5×104、104、5×103、103、5×102、102、5×101、101、5×100IU/mL。待检样品CaIFNα/RTB：按照101～107梯度以及5×100～5×107梯度稀释。
(3)取出预先铺好MDCK细胞的96孔培养板，将不同稀释度的干扰素标准品及待检样品溶液移入相对应的孔中，每孔100μL。每个浓度做3个复孔，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。37℃，5％CO2培养箱培养24h。
(4)根据测定的VSV的TCID50，用无血清的DMEM培养液稀释至100TCID50。
(5)弃去96孔板中培养液，无血清培养液洗1遍，加入100TCID50的病毒液，每孔100μL。细胞对照孔只加DMEM培养液，不加病毒液，每孔100μL。37℃，5％CO2培养箱培养24h。
(6)取出96孔板，弃去上清，每孔加入50μL结晶紫染色液，室温放置30min。
(7)流水小心冲去染色液，吸干残留液体，每孔加入100μL脱色液，室温振荡5min。
(8)用多功能高端酶标仪测定每孔570nm处OD值，记录结果。
(9)分别计算各干扰素样品的半效稀释倍数(即从样品溶液至相当于标准品50％最大效应点的稀释倍数)，按下式计算重组融合蛋白的效价
Figure BDA0001709870660000061
采用MDCK/VSV系统检测CaIFNα/RTB融合蛋白在体外的抗病毒活性。图7为显微镜下观察到的100TCID50攻毒后，在病毒对照孔发生100％病变时，干扰素标准品和待检样品CaIFNα/RTB融合蛋白作用的各孔的细胞状态。由图可知，干扰素标准品和CaIFNα/RTB融合蛋白分别在100IU/mL(稀释倍数为3×104)和5×104稀释时可使50％细胞发生病变。通过表1检测的干扰素标准品在570nm处测得OD值绘制干扰素标准曲线，将待检样品CaIFNα/RTB融合蛋白测得的OD值代入公式换算，得出不同稀释倍数待检样品相对于干扰素标准品的效价。
Figure BDA0001709870660000062
Figure BDA0001709870660000071
根据干扰素效价计算公式得出：CaIFNα/RTB融合蛋白效价＝3×106×105×108)/(3×103×6×104)≈1.67×1011IU/mL，即每mL CaIFNα/RTB融合蛋白效价为1.67×1011IU，aIFNα/RTB融合蛋白浓度为1.40mg/mL
将干扰素标准品及CaIFN/RTB稀释比例为x轴，将结晶紫染液染色后OD570nm值为Y轴作图，从图8中可看出CaIFN/RTB效价明显高于干扰素标准品。干扰素标准品于6000倍稀释后无法抵御100TCID50VSV病毒感染，但在相同稀释倍数下CaIFN/RTB可抵御病毒感染，证明CaIFN/RTB活性比干扰素标准品高。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Figure IDA0001709870710000011
Figure IDA0001709870710000021
Figure IDA0001709870710000031
Figure IDA0001709870710000041
Figure IDA0001709870710000051
Figure IDA0001709870710000061
Figure IDA0001709870710000071
Figure IDA0001709870710000081

Claims (9)

1.一种干扰素重组融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白为CaIFNα-linker-RTB，包含有SEQ ID 2氨基酸序列的融合蛋白，该融合蛋白包括三部分：CaIFNα与RTB通过linker相连接，所述CaIFNα的蛋白序列为SEQ ID 3 ，所述RTB的蛋白序列为SEQ ID 4。
2.一种编码权利要求1所述的干扰素重组融合蛋白序列的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQ ID 1。
3.一种包含权利要求2所述SEQ ID 1基因序列的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体选自pET系列载体、pUC系列载体、pCold系列载体、pSUMO系列载体、pDsRed系列载体、pBAD系列载体、pMAL系列载体、pACYC系列载体、pQE系列载体、pGEX系列载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体选自pUC57或pET-28。
6.一种包含权利要求3所述重组载体的工程菌。
7.制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：将含有SEQ ID 1的表达载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白。
8.权利要求1所述的干扰素重组融合蛋白在制备犬的抗病毒药物中的应用。
9.权利要求1所述的干扰素重组融合蛋白在制备犬的抗病毒生物制剂中的应用。
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