CN114736293B - SARS-CoV-2中和性纳米抗体、自组装铁蛋白融合纳米抗体及制备方法和应用 - Google Patents
SARS-CoV-2中和性纳米抗体、自组装铁蛋白融合纳米抗体及制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了SARS‑CoV‑2中和性纳米抗体、自组装铁蛋白融合纳米抗体及制备方法和应用。本发明首先提供了氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的SARS‑CoV‑2中和性纳米抗体，将该其与铁蛋白的C端融合得到自组装铁蛋白融合纳米抗体，电镜观察证实其展示在自组装铁蛋白笼形结构表面。本发明进一步将这些纳米抗体进行突变优化以提高其表达量和表达效率并提高其对假病毒的中和活性。本发明利用原核表达系统、真核表达系统分别表达纳米抗体融合蛋白。本发明提供的自组装铁蛋白融合纳米抗体颗粒在细胞水平上对SARS‑CoV‑2假病毒具有较强的中和能力，具有成为一种低成本、高中和活性的新冠病毒诊断和治疗药物的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及新型冠状病毒抗体，尤其涉及SARS-CoV-2中和性纳米抗体以及由SARS-CoV-2中和性纳米抗体和单体铁蛋白亚基融合在一起得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体及其制备方法和应用，属于新型冠状病毒抗体领域。
背景技术
新型冠状病毒病（Corona virus disease 2019，COVID-19）的致病物是严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ,SARS-CoV-2），病毒通过S蛋白（spike protein）上的受体结合域RBD（Receptor bindingdomain）与细胞受体ACE2（Angiotensin-converting enzyme 2）结合进入细胞，感染人体后能够引起包括呼吸道疾病在内的全身损伤。针对COVID-19的常规药物如α-干扰素、糖皮质激素、洛匹那韦和利托那韦联合用药等往往会产生一定的副作用，因此安全、高效的抗SARS-CoV-2药物的开发具有重要的意义。
纳米抗体( nanobody，Nb)作为小分子抗体的成员之一，与传统的抗体相比免疫原性更弱、穿透性更强、稳定性更好且对抗原的亲和力更高，针对S蛋白的纳米抗体可以特异性靶向新冠病毒S蛋白的受体结合域RBD，阻止其与细胞膜受体ACE2结合。铁蛋白（ferritin）能够自组装形成天然的蛋白纳米笼，整个笼状结构内径约为8nm，外径约为12nm，其在蛋白展示、抗原呈递、药物靶向输送等方面具有良好的应用前景。如果将纳米抗体与铁蛋白相融合，利用其自组装的特性，使纳米抗体以24聚体的形式展示在铁蛋白表面，可以有效提高纳米抗体对S蛋白的靶向亲和力从而提高其中和活性。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种SARS-CoV-2中和性纳米抗体；
本发明的目的之二是将SARS-CoV-2中和性纳米抗体进行突变得到表达量或抗体中和活性提高的突变体；
本发明的目的之三是将SARS-CoV-2中和性纳米抗体或SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体与单体铁蛋白亚基融合在一起得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体；
本发明的目的之四是将自组装铁蛋白融合纳米抗体进行突变得到抗体中和活性提高的突变体；
本发明的目的之五是提供制备所述SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体以及自组装铁蛋白融合纳米抗体的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了SARS-CoV-2中和性纳米抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所述。
本发明利用OptimumGeneTM技术，根据大肠杆菌与家蚕密码子偏好性，对编码SEQID NO.1所述蛋白的核苷酸序列进行优化改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变，优化后的编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2所示。
本发明在序列优化之后对SEQ ID NO.2所编码的蛋白分别进行氨基酸单位点突变以及双位点突变以提高其表达量和对SARS-CoV-2假病毒的中和活性，即本发明以优化后的H11-D4基因序列（其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示）为模板，设计多对引物对序列进行定点突变，具体的，本发明将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照L12A，V25S，A33T，P42L，W54M，S64Y，N78Q，A93G，R104K，D116E或V124S中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；本发明将上述这些单位点突变体在大肠杆菌表达系统中分别进行了表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.1按照A33T、W54M、S64Y或R104K的突变位点进行突变，获得的4个突变体的产量和中和SARS-CoV-2假病毒的能力明显提高；基于所确定的部分单位点的突变是有效突变，可以达到提高Ferritin-H11-D4突变体表达量的效果，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构决定着蛋白质的高级结构且上述进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，本发明将可以提高表达量的这4个单突变位点(A33T、W54M、S64Y或R104K )两两组合进行双位点突变，具体如下：将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列分别按照A33T-W54M、A33T-S64Y、A33T-R104K、W54M-S64Y、W54M-R104K或S64Y-R274K进行双位点突变；将上述双突变位点在大肠杆菌中表达，实验结果证明将SEQID NO.1所述氨基酸序列分别按照W54M-R104K或W224M-R274K进行双位点突变后，在表达量和相应的中和假病毒活性有最为明显的提高。
本发明的第二方面是提供SARS-CoV-2中和性纳米抗体的单位点突变体以及双位点突变体，其中，所述的SARS-CoV-2中和性纳米抗体的单位点突变体是将SEQ ID NO.1按照A33T、W54M、S64Y或R104K中的任何一种单位点突变所获得的任何一种单位点突变体，所述的SARS-CoV-2中和性纳米抗体的双位点突变体是将SEQ ID NO.1所述氨基酸序列按照W54M-R104K或W224M-R274K进行双位点突变后所得到任何一种双位点突变体。
本发明的第三方面是提供了一种将SARS-CoV-2中和性纳米抗体或SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体与单体铁蛋白亚基融合在一起得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体；
作为本发明一种优选的实施方式，将SARS-CoV-2中和性纳米抗体或SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体与单体铁蛋白亚基的C端连接得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体，其中，所述单体铁蛋白亚基包括但不限于细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是人铁蛋白重链亚基，其氨基酸原始序列为NCBI上GenBank序列号：AAA35832.1所示。所述SARS-CoV-2中和性纳米抗体是SARS-CoV-2中和性纳米抗体H11-D4，其氨基酸原始序列为PDB序列号:6YZ5_F，为了使H11-D4更好的展示在铁蛋白表面，将GGGSGGGGSGGGS（其氨基酸序列为SEQID NO.5所示）作为linker添加到SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的N端后与去掉了前5个及后21个氨基酸的铁蛋白C端相连接得到自组装铁蛋白融合纳米抗体（将该自组装铁蛋白融合纳米抗体命名为Ferritin-H11-D4），其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
本发明利用OptimumGeneTM技术，根据大肠杆菌与家蚕密码子偏好性，对编码SEQID NO.3所述氨基酸序列的核苷酸序列进行优化改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。优化后的的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示（Ferritin-H11-D4基因序列）。
本发明在序列优化之后对融合蛋白分别进行氨基酸单位点突变和双位点突变，以提高其表达量和对SARS-CoV-2假病毒的中和活性，即本发明以优化后的Ferritin-H11-D4基因序列（其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示）为模板，设计多对引物对序列进行定点突变，具体的，本发明将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列按照L182A，V195S，A203T，P212L，W224M，S234Y，N248Q，A263G，R274K，D286E或V294S中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体。
本发明将上述这些单位点突变体在大肠杆菌表达系统中分别进行了表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.3按照A203T、W224M、S234Y或R274K的突变位点进行突变获得的4个突变体，其产量和中和SARS-CoV假病毒的能力也有很大的提高。
基于所确定的部分单位点的突变是有效突变，可以达到提高Ferritin-H11-D4突变体表达量的效果，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构决定着蛋白质的高级结构且上述进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，本发明将可以有效提高表达量的这4个单突变位点(A33T、W54M、S64Y、R104K)两两组合进行双位点突变，具体如下：将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列分别按照A203T-W224M、A203T-S234Y、A203T-R274K、W224M-S234Y、W224M-R274K或S234Y-R274K进行双位点突变；将上述双突变位点在大肠杆菌中表达，实验结果证明将氨基酸序列SEQ ID NO.3按照W54M-R104K或W224M-R274K进行双位点突变后（双位点突变体分别命名为H11-D4-W54M-R104K、Ferritin-H11-D4-W224M-R274K）表达量和相应的中和假病毒活性有最为明显的提高，因此将H11-D4-W54M-R104K、Ferritin-H11-D4-W224M-R274K认为是最优的突变。将Ferritin-H11-D4-W54M-R104K在后续的实验中加以应用，并以后缀DM命名，即Ferritin-H11-D4-DM。根据在大肠杆菌宿主表达结果可见，所得多个优化突变序列表达量相比原始序列均有显著提升。
本发明进一步将获得的最优双突变氨基酸序列Ferritin-H11-D4-W54M-R104K在家蚕表达系统中进行表达，在家蚕表达系统中的表达产物经过初步纯化后采用电镜进行观察，观察结果可见产物大小与预期符合的纳米颗粒，笼状体的直径为20纳米左右，中和试验检测的融合蛋白的中和假病毒能力较原核表达的融合蛋白有较大的提高。
本发明应用大肠杆菌及家蚕杆状病毒表达系统表达优化后的铁蛋白自组装融合蛋白Ferritin-H11-D4，其对假病毒的中和活性比单独表达的纳米抗体H11-D4高8倍，体现了铁蛋白表面展示多聚蛋白的优势；且与大肠杆菌表达的铁蛋白融合蛋白相比，家蚕杆状病毒表达系统表达的融合蛋白的中和活性高出近20倍，这足以说明了家蚕杆状病毒表达天然外源蛋白的优势。
本发明的第四方面是提供了制备所述SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体或者自组装铁蛋白融合纳米抗体的方法，包括：（1）构建含有SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体或者自组装铁蛋白融合纳米抗体的编码基因的原核表达载体或真核表达载体，将所构建的原核表达载体或真核表达载体在宿主细胞中进行表达，将所表达的重组蛋白纯化、复性、去除内毒素，即得。
作为本发明一种优选的具体实施方式，将所述SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体或者自组装铁蛋白融合纳米抗体的采用真核表达系统在家蚕中表达铁蛋白融合蛋白的方法包括以下步骤：
将所述的SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体或者自组装铁蛋白融合纳米抗体的编码基因在家蚕表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；优选的，将所述的SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体或者自组装铁蛋白融合纳米抗体的的编码基因构建到家蚕杆状表达载体中制备得到重组家蚕杆状病毒；将重组家蚕杆状病毒在家蚕细胞中扩增后在家蚕或蚕蛹中进行表达。
本发明的第五方面是提供了一种预防或治疗新型冠状病毒的药物组合物，包括有效量的活性成分和药物上可接受的佐剂或辅料，其中所述的活性成分选自(1)-(4)中的任何一种：
(1)ARS-CoV-2中和性纳米抗体；
(2)SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体；
(3)SARS-CoV-2中和性纳米抗体或SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体与单体铁蛋白亚基融合在一起得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体；
(4)将SARS-CoV-2中和性纳米抗体或SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体与单体铁蛋白亚基融合在一起得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体进行突变得到的突变体。
本发明提供的预防或治疗新型冠状病毒的药物组合物可通过各种途径使用，如静脉注射或鼻腔雾化吸入等。
本发明所提供的的ARS-CoV-2中和纳米抗体或自组装铁蛋白融合纳米抗体结构简单、分子量小、稳定性高，能够适应呼吸道的环境从而直接进行呼吸道给药，将其展现在铁蛋白笼状结构表面形成24聚形式一方面可以增强其对病毒的中和能力，另一方面可以延长其在体内的半衰期。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、本发明利用原核表达系统大肠杆菌、家蚕杆状病毒表达系统表达重组纳米抗体，制备过程不涉及到活的有害病毒，相比传统的抗体制作方法操作更加安全、简便，成本更低、适合进行快速大规模生产；
2、本发明所表达的纳米抗体与一般抗体相比分子量小、渗透性强、免疫原性弱、亲和力高、稳定性，较简单的结构也使其更容易重组表达，小分子量和高稳定性拓宽了其给药途径，可通过雾化吸入的方式直接进入呼吸道对病毒进行中和。
3、本发明将纳米抗体与铁蛋白相融合，利用铁蛋白自组装的特性，将纳米抗体以24聚体的形式展示在铁蛋白表面，可提高纳米抗体对S蛋白的靶向亲和力从而提高其中和活性。杆状病毒表达系统具有翻译后加工修饰的功能，利用杆状病毒表达系统可以将铁蛋白纳米笼展示多聚蛋白的功能得以最大程度的利用。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
本发明中所述的“L12A”单位点突变的含义是指将第12位的亮氨酸突变为丙氨酸，其余的单位点突变的含义以此类推。
本发明中所述的“A33T-W54M”双位点突变的含义是指将第33位的丙氨酸突变为苏氨酸以及同时将第54位的色氨酸突变为甲硫氨酸，其余的双位点突变的含义以此类推。
术语“抗体”是指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。词语“中和抗体”是指由B淋巴细胞产生的一种免疫球蛋白分子，它能够与病毒表面抗原进行结合从而阻断病原与宿主细胞受体的结合进而抑制病毒感染宿主。词语“假病毒”是指一种嵌合型病毒颗粒, 结构与野生病毒相似, 具有类似活病毒的生物特性, 但没有活病毒的致病性。
术语 “重组蛋白质或抗原”是指以重组DNA技术产生的蛋白质或抗原，其可用于在包括细菌、哺乳类细胞、昆虫细胞和植物的各种宿主中克隆和表达基因以产生蛋白质。术语“效力”是指如通过指定的效力测定测量的在抗原制剂或疫苗中抗原的量。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“转染”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
附图说明
图1（a）Ferritin未截短序列（6-176aa）形成的24聚体笼状结构，C端L176残基位于笼状结构内侧；（b）Ferritin截短序列（6-162aa）形成的24聚体笼状结构，经AI预测确认C端P162残基位于笼状结构外侧，其可将展示的三瓣结构，变成同源二聚体结构。
图2（a）H11-D4在大肠杆菌表达系统中表达的沉淀聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1: 空载为pET-28a载体的原核表达样品2:未诱导的H11-D4原核表达样品；3-7：诱导后的H11-D4原核表达样品；（b）Ferritin-H11-D4在大肠杆菌表达系统中表达的沉淀聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1: 空载为pET-28a载体的原核表达样品2:未诱导的Ferritin-H11-D4原核表达样品；3-7：诱导后的Ferritin-H11-D4原核表达样品。
图3 H11-D4及Ferritin-H11-D4在大肠杆菌表达系统中表达产物Westernblotting检测图；1：H11-D4大肠杆菌表达产物；2：Ferritin-H11-D4大肠杆菌表达产物；3：阴性对照。
图 4 Ferritin-H11-D4大肠杆菌表达产物纯化复性后透射电镜图；（a）：负染图；（b）：免疫金标图；标尺尺寸：100nm；图中可观察到符合预期大小的球状物质，且能看到金粒子附着在球状物核心部位，表明融合蛋白成功复性为球状纳米颗粒，并将H11-D4展示在铁蛋白表面。
图5 Ferritin-H11-D4在家蚕表达系统中表达产物Western blotting检测图；1：阴性对照；2：Ferritin-H11-D4家蚕表达产物。
图6 Ferritin-H11-D4纳米颗粒蚕血淋巴样品经初步纯化后透射电镜图；（a）：负染图；（b）：免疫金标图；标尺尺寸：100nm；图中可观察到大量符合预期大小的球状物质，且能看到金粒子附着在球状物核心部，表明融合蛋白成功自组装成笼状结构。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
⒈实验材料与试剂
⑴菌株、病毒株与载体：原核表达载体pET-28a（+）、转移载体pBR、家蚕细胞BmN、人源胚胎肾细胞（HEK293T）、家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid、家蚕品种JY1均为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；大肠杆菌感受态细胞Trans5α、Rosetta(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；pcDNA3.1-ACE2-GFP质粒、pcDNA3.1-S质粒为本实验室构建和保存；pNL4-3.Luc.R-E-质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。
⑵铁蛋白序列和SARS-CoV-2中和性纳米抗体H11-D4序列：优化合成的基因序列送至金斯瑞公司合成，并克隆到原核表达载体pUC57载体上。
⑶酶与试剂： T4 DNA连接酶、DNA聚合酶及所对应的缓冲液均购自北京诺维赞生物科技有限公司；限制性内切酶、Protein marker购自Thermo Scientific公司； Trans2KPlus ⅡDNA Marker、鼠源His-tag单克隆抗体购自北京全式金生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥有限公司；人铁蛋白重链兔源单克隆抗体购自爱博泰克生物技术有限公司；
⑷生化试剂：Tris、Ampicillin、Kanamycin、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N,N,N',N'-TetraMethylethylene diamine)、过硫酸铵（Ammonium Persulfate）、卡那霉素（Kanamycin）购自Sigma公司；萤火虫荧光素酶检测试剂盒、细胞裂解液、IPTG购自Promega公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物（Yeast Extract）、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；0.2 um、0.45 um滤器购自Gelman Sciences公司；溴化乙锭（EB）、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；His标签蛋白纯化试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；VigoFect高效真核转染试剂购自苏州拜吉氏生物科技有限公司；胎牛血清购自Invitrogen公司；牛血清白蛋白购自罗氏公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。
⑸培养基：大肠杆菌培养基为2×YT培养基；家蚕昆虫细胞培养基为TC-100购自AppliChem公司；293T细胞培养基为DMEM培养基。
⒉实验方法中用于定点突变的融合PCR方法
参照邝翡婷等人（一种载体构建的新方法：重组融合PCR 法，基因组学与应用生物学，2012 年，第31 卷，第6 期，第634-639 页）所描述的方法进行。
实施例1 H11-D4与Ferritin-H11-D4优化序列的表达与中和活性检测
一、有关溶液和培养基的配置
有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书（Joseph et al.,分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998）。
二、 SARS-CoV-2中和性纳米抗体H11-D4基因序列和铁蛋白基因序列的合成。
为了使H11-D4蛋白与铁蛋白更好的融合表达，利用信号肽分析软件（SignalP）和跨膜结构域分析软件(TMHMM)分别对H11-D4蛋白（PDB: 6YZ5_F）和人铁蛋白重链（GenBank:AAA35832.1）的氨基酸序列进行分析，得出H11-D4蛋白和铁蛋白无信号肽和跨膜区存在，考虑到H11-D4的原核表达载体上含有His标签，因此去掉了H11-D4的后7个His标签序列后进行融合。
对Ferritin蛋白的高级结构进行分析，发现其C端为一段约20个氨基酸形成的alpha螺旋，并向铁蛋白笼状结构内部延伸（图1A）。而将该段α螺旋结构删除后，C端氨基酸残基可以暴露在铁蛋白笼状结构外部，且两两亚基之间的C端残基空间结构比较接近，有利于抗体表达过程中双链结构的形成。为进一步确认该Ferritin蛋白的序列设计的可行性，将序列在本地超算部署并深度学习后的AlphaFold 2软件中进行结构预测和分析，结果显示：Ferritin蛋白去掉N端5个氨基酸和C端21个氨基酸的序列可以保证基本空间骨架结构与完整序列一致，预测具备形成类似天然24聚体的笼状结构，且C端残基暴露在笼状结构表面（图1B），每四个亚基的C端残基空间距离较近，利于相邻的两两随机结合形成同源二聚体。为了进一步保障抗体同源二聚体的形成，将抗体与Ferritin序列之间添加3×G3S为柔性连接肽，给予抗体二聚体形成所需的自由折叠空间，同样通过AlphaFold 2进行结构预测和分析，结果显示：Ferritin部分结构与天然结构一致，预测可以形成天然24聚体，柔性连接肽两两靠近暴露在铁蛋白纳米笼状结构外侧，与预期一致。为了提高目的基因在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列GCCAAC。为了提高翻译终止效率，终止密码子改为TAA。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pBR及原核表达载体pET-28a(+)中。
纳米抗体H11-D4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，纳米抗体H11-D4与铁蛋白C端通过3×G3S相连得到的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
利用OptimumGeneTM技术，根据大肠杆菌与家蚕密码子偏好性，对编码SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3所述蛋白的核苷酸序列进行优化改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。优化后的编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示。
将上述优化设计后的H11-D4蛋白基因序列和Ferritin基因序列人工合成。
三、重组质粒pET28a-H11-D4和pET28a-Ferritin-H11-D4的构建
⒈ H11-D4和Ferritin-H11-D4原始融合蛋白基因序列的PCR扩增
PCR扩增H11-D4基因序列：以pUC57-linker-H11-D4为模板，PCR扩增引物序列如下：
F15’-CGGGATCCGCCAACATGCAGGTGCAACTGGTTGAAAGC-3’
R15’-CGGAATTCTTAGCTGCTAACGGTCACTTGGG-3’
PCR扩增Ferritin基因序列：以pUC57-Ferritin为模板，PCR扩增引物序列如下：
F2：5’- CGGGATCCGCCAACATGACCAGCCAAGTGCGTCAAAAC- 3’
R2：5’-CCACCACCGCTACCACCACCCGGCGCGCCCATCTTACG-3’
PCR扩增linker-H11-D4基因序列：以pUC57-linker-H11-D4为模板，PCR扩增引物序列如下：
F3：5’-TGCGTAAGATGGGCGCGCCGGGTGGTGGTAGCGGTGGTG-3’
R1：5’-CGGAATTCTTAGCTGCTAACGGTCACTTGGG-3’
PCR扩增Ferritin-H11-D4基因序列：以PCR产物Linker-H11-D4和Ferritin为模板，利用Overlap-PCR扩增出Ferritin-H11-D4，PCR扩增引物序列如下：
F2：5’- CGGGATCCGCCAACATGACCAGCCAAGTGCGTCAAAAC-3’
R3：5’-TGCGTAAGATGGGCGCGCCGGGTGGTGGTAGCGGTGGTG-3’
PCR反应体系如下所示：模板1μL，10×LA Buffer 5 μL，dNTP Mix 1 μL，上下游引物各2μL，2×Phanta Mix Buffer 25 μL，dd H2O 18μL，总体积为50μL。
PCR参数设置：95℃，30 s；95℃，15 s，60℃，15 s，72℃，60s，共29个循环；72℃，5min。
⒉玻璃奶纯化回收DNA片段
配置1％（w/v）琼脂糖凝胶，对PCR扩增的产物进行电泳；将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，快速切下含有单一的目的核酸条带的凝胶，放入1.5 mL的离心管中，称重，加三倍体积的6 M NaI，放于37℃恒温培养箱中融化；向已经完全融化的溶液中加8 μL Glassmilk，混匀，冰浴5 min，中间摇匀两次；8000 rpm离心10 s，弃掉上清；加800 μL New Wash洗涤，轻轻弹起后离心，重复2次；弃去上清，将离心管放37℃恒温培养箱干燥2～3 min；干燥后加20μL 0.1×TE溶解，混合充分溶解DNA，12000 rpm离心5 min，取上清立即用于连接，其余放-20℃保存。
⒊目的基因PCR产物酶切处理
将PCR产物跑胶，胶回收正确的产物用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切反应获得目的片段H11-D4、Ferritin-H11-D4。酶切体系如下所示：
目的片段10 μL，10×Buffer E 5 μL，BamHI 1 μL，EcoRⅠ1 μL，ddH2O 33 μL，共50μL。
⒋目的基因与pET-28a（+）载体和pBR载体的连接与转化
⑴酶切处理pET-28a（+）载体和pBR载体
用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对pET-28a（+）载体和pBR载体进行双酶切，85℃灭活10 min，保存于-20℃备用。
⑵连接
酶切回收的目的片段与经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切处理后的pET-28a（+）、pBR载体连接。用T4 DNA连接酶25℃，连接10min。连接体系如下所示：回收目的片段6μL，载体1 μL，5×Buffer 2μL，T4 DNA连接酶5μL，共10μL。
⑶转化
取-80℃保存的感受态细胞，快速融化一半，加入上述连接产物，冰上放置半小时；42℃恒温水浴锅中放置90s，迅速置于冰上3～5min；向管中加入适量的2×YT培养基，37℃恒温培养箱中静置培养60min；离心，弃去大部分上清，留200μL。将目的蛋白与pET-28a（+）和pBR的连接产物分别涂布于2×YT平板(50μg/mL Kana)、2×YT平板(60μg/mL Amp)上，37℃恒温培养箱正置培养30min，后倒置培养过夜。
⒌核酸快速抽提法粗筛阳性克隆
挑取2×YT平板上的单菌落，分别接种于2×YT（50μg/mL Kana）、2×YT(60μg/mLAmp)液体培养基中，置于37℃恒温震荡培养器中，设置转速为220 rpm，过夜培养；取500 μL菌液于离心管内，收集菌体；加入30 μL Loading Buffer和20 μL酚/氯仿（1:1），用涡旋震荡器充分混匀，使菌体重悬；12000 rpm离心3 min，取8 μL上清进行琼脂糖凝胶电泳，同时以同样方法处理的空载体作为对照。凝胶成像系统的紫外灯下观察条带，选取质粒带明显退后的菌液提取质粒。
⒍ SDS碱裂解法提取质粒DNA
收集3mL菌液于离心管中，SDS碱裂解法提取质粒DNA，-20℃保存备用。
⒎阳性克隆的酶切与测序鉴定
酶切体系如下所示：重组质粒DNA 3 μL，10×Buffer E 3 μL，BamH I 0.5 μL，EcoR Ⅰ 0.5 μL，ddH2O 14 μL，共20 μL。
37℃反应2 h后，取7 μL用1％的琼脂糖进行电泳检测。酶切检测正确的质粒DNA测序，结果和目的基因一致，得到的重组质粒命名为pET28a-H11-D4、pET28a-Ferritin-H11-D4、pBR- H11-D4、pBR-Ferritin-H11-D4。
四、重组质粒的原核表达与中和活性检测
⒈重组质粒在大肠杆菌中诱导表达
将鉴定正确的重组表达质粒pET28a-H11-D4、pET28a-Ferritin-H11-D4转化Rosetta(DE3)感受态细胞，37℃，培养至OD600在0.6时加入不同浓度的IPTG（0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.8mM、1.0mM），继续培养5h后收集菌液，用SDS-PAGE电泳分析表达情况，pET28a-H11-D4、pET28a-Ferritin-H11-D4分别在17.9 kD、37.1 kD处出现了特异条带，这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达，IPTG终浓度为1.0mM时目的蛋白表达量最高，用超声波将菌体细胞破碎，发现上清有少量目的蛋白，沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-H11-D4和His-Ferritin-H11-D4主要以不可溶的包涵体形式存在，聚丙烯凝胶电泳图见图2。
⒉重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理
将保存于-80℃表达量高的菌种划线，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于4 mL的2×YT液体培养基（50 μg/mL Kan）中，37℃培养过夜；1％的菌液转接于200 mL含的2×YT液体培养基（50 μg/mL Kan）中，37℃震荡培养，使OD值达0.6左右，加入IPTG（终浓度为1.0mM），37℃继续培养5 h；4℃，5000 rpm离心10 min收集菌体，用无菌ddH2O洗2次，离心收集菌体。用裂解缓冲液重悬菌体，用量为100 μL裂解液/mL菌液，冰浴30 min，冰上超声波破碎裂解菌体；4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀即为重组蛋白包涵体；包涵体沉淀用变性裂解液重悬，置于4℃恒温环境中过夜搅拌，将包涵体充分溶解，12000r/min，4℃，离心20min，收集上清后用0.45μm的滤膜过滤后备用。
⒊镍柱亲和层析纯化重组蛋白
取上述过滤后的包涵体溶液，用Ni-NTA树脂层析柱纯化该表达蛋白，反复上柱3次后用含250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白。蛋白电泳显示含250mM咪唑的洗脱缓冲液可将目的蛋白完全洗脱，纯化后的重组蛋白His-H11-D4、His-Ferritin-H11-D4条带单一、大小正确，纯化后的蛋白含量分别为25.16mg/L、8.70mg/L。
⒋重组蛋白的Western Blot鉴定
对纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳后用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，以稀释3000倍的鼠源His-tag为一抗，稀释6000倍的HPR标记的羊抗鼠IgG为二抗，孵育结束后，添加显色液用荧光化学发光仪成像。Western Blot验证结果如图3，重组表达产物可检测到17.9 kDa（H11-D4）、37.1 kDa（Ferritin-H11-D4）大小的特异性条带。
⒌重组蛋白的复性与浓缩
将纯化后包涵体蛋白用变性洗脱液（不含咪唑）稀释蛋白浓度至150μg/mL后装入透析袋中。将装入蛋白的透析袋用密封夹夹好后从6M、4M、2M、1M 、0M 依次降低透析液中尿素浓度，透析液中添加适量的氧化还原剂，每个浓度均4℃低速搅拌透析，4-6 h 更换新鲜透析液一次，最后用过滤后的PBS (pH=7.4) 4℃透析过夜，高速离心去除沉淀。在上清中加入1%的 Triton X-114，冰浴30min后37°C 孵育 10 分钟，12000r/min离心15min，小心吸取上层水相至新的 EP管中，重复此步骤2-3次即可去除内毒素。最后用超滤管（默克）进行超滤浓缩（pH=7.4），稀释至1mg/mL，-80℃分装保存。
⒍电镜观察
（1）负染：将蛋白样品稀释10倍后滴于干净的塑料薄膜上，用尖头镊子小心夹取铜网边缘沾取样品，吸附3min后用滤纸吸附多余样品，ddH2O清洗3次，滴加1%醋酸铀染液，染色3min，吸掉多余的染液后晾干，透射电镜观察，结果如图4（a）所示，可见直径为20nm左右的球状结构，证明目的蛋白Ferritin-H11-D4复性成功，周围阴影状为表面展示的蛋白H11-D4。
（2）免疫金标：将蛋白样品稀释10倍后滴于干净的塑料薄膜上，用尖头镊子小心夹取铜网边缘沾取样品，吸附5min后用滤纸吸取多余样品，ddH2O清洗3次后吸干多余水分。将稀释50倍的兔源铁蛋白一抗滴于干净的塑料薄膜上，用尖头镊子小心夹取吸附Fe-H11-D4蛋白的铜网边缘沾取一抗，孵育10min后用滤纸吸取多余样品，ddH2O清洗3次后吸干多余水分。再将稀释50倍的羊抗兔IgG金标二抗滴于干净的塑料薄膜上，用尖头镊子小心夹取铜网边缘吸附二抗，孵育10min，用滤纸吸取多余样品，ddH2O清洗3次后吸干多余水分。滴加1%醋酸铀染液，染色5min，用滤纸吸取多余染液后晾干，透射电镜观察。观察结果如图4（b）所示，免疫金标实验所用一抗靶向铁蛋白，从免疫电镜观察到的纳米金颗粒基本定位于纳米颗粒核心部位，有力证明了纳米抗体以多聚蛋白的形式展示在铁蛋白表面。
⒎ SARS-CoV-2假病毒构建及感染力测定
参照参考文献（梁婉欣,刘淑燕,段炼等人，中国热带医学:1-13[2022-05-09]；李琳,郭彦,赵光宇等人，生物技术通讯,2014,25(02):194-197.）的实验方法，实验方法大致如下：
将293T细胞以2×105/孔接种于6孔细胞培养板，37℃、5% CO2培养至细胞密度为80%。转染前1h更换新鲜无血清DMEM培养基。按照VigoFect说明书，将pNL4-3.Luc.R-E质粒与pcDNA3.1-S质粒共转染到293T细胞中。转染12h后更换为含有10% FBS的DMEM培养基。48h后收获细胞上清，4 ℃，5000r/min,离心10min,吸取上清液用0.45μm 滤膜过滤后分装，避免反复冻融，-80℃保存待用。
将293T细胞以2×104/孔接种于96孔板中，37℃、5% CO2培养至细胞密度为80%。将pcDNA3.1-ACE2-GFP质粒转染到293T细胞中，3-6h后更换含有10%血清的新鲜DMEM培养基，24h后观察荧光，将假病毒2倍梯度稀释10个梯度后加入96孔板，每个稀释度设置三个重复。培养12h后，去除假病毒上清液，更换含有10%FBS的DMEM培养基。48h后检测荧光素酶活性，确定假病毒感染力。
⒏中和试验
参照参考文献（梁婉欣,刘淑燕,段炼等人，中国热带医学:1-13[2022-05-09]；李琳,郭彦,赵光宇等人，生物技术通讯,2014,25(02):194-197.）的实验方法，实验方法大致如下：
将293T细胞以2×104/孔接种于96孔板中，37℃、5% CO2培养至细胞密度为80%时将pcDNA3.1-ACE2-GFP质粒转染到293T细胞中，24h后观察荧光。分别将H11-D4、Ferritin-H11-D4和BSA从100μg/mL 进行5倍梯度稀释，共稀释10个梯度，与等体积假病毒（RLU=40000）混合，DMEM与假病毒混合作阳性对照、仅加DMEM孔作阴性对照，每个样本设置3个重复孔。37℃孵育1h后加入细胞中，培养12h更换含有10%FBS的DMEM培养基，48h后检测萤火虫荧光素酶表达量，计算纳米抗体对假病毒进入细胞的抑制率，并用GraphPad Prism计算其IC50。
⒐实验结果
中和试验得到的IC50值如表1所示：
表1 优化后的H11-D4、Ferritin-H11-D4序列表达产物的IC50
五、重组质粒在家蚕真核表达系统中表达与中和活性检测
⒈家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备
按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6 .22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒亲本株感染对数生长期的细胞约50mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1mL病毒DNA抽提液(1L中含Tris 12 .1g，EDTA33.6g，KCl 14 .1g，pH 7 .5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1 .5mL离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/mL，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μLTE Buffer中，放4℃保存备用。
⒉重组家蚕杆状病毒rBmBacmid（PPH-H11-D4、PPH-Ferritin-H11-D4）的构建
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1 .5mL无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid DNA(专利：ZL201110142492 .4 ,公开号：CN102286534A)，2μg重组转移质粒（pBR-H11-D4或pBR-Ferritin-H11-D4）和5μL脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μL，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1 .5mL无血清培养基和300μLFBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rBmBacmid-H11-D4、rBmBacmid-Ferritin-H11-D4的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1mL共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid（PPH-H11-D4、PPH-Ferritin-H11-D4）
⒊重组病毒rBmBacmid（PPH-H11-D4、PPH-Ferritin-H11-D4）在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid（PPH-H11-D4、PPH-Ferritin-H11-D4）感染正常生长的BmN细胞，3-5d后待细胞成团、皱缩，收集上清液获得大量的重组病毒rBmBacmid- PPH-H11-D4、rBmBacmid- PPH-Ferritin-H11-D4。
⒋重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μL，加入150μL(0 .5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μL(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μL的TE溶解DNA。取上述病毒基因组DNA1μL进行PCR扩增，反应条件为95℃，30 s；95℃，15 s，60℃，15 s，72℃，60s，共29个循环；72℃，5min。取15μL反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。
⒌重组病毒在家蚕和蚕蛹中的表达
所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1（由本发明人实验室保存）。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》（上海科学技术出版社，1991）的常规方法进行。饷食后48 h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105 pfu rBmBacmid（PPH-H11-D4、PPH-Ferritin-H11-D4），4～5 d后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行ELISA法检测。
将蚕血淋巴用PBS稀释后超声破碎(10s×10次)，然后用12000rpm离心10分钟去除细胞碎片，取上清35000r/min超速离心，离心后的沉淀用PBS重悬，取上清35000r/min超速离心3h，离心后的沉淀用PBS重悬，获得初步纯化的展示抗体的铁蛋白纳米粒子。
ELISA法测定家蚕中表达重组蛋白的浓度，将原核表达的Fe-H11-D4 蛋白以不同浓度包被酶标板，将超离纯化的Fe-H11-D4、阴性对照家蚕（Luc组）样品以5倍比进行稀释（1:5 -1:15625）分别包被至酶标板。将稀释1000倍的人铁蛋白重链兔源单抗为一抗孵育2h，稀释3000倍的HRP 标记的山羊抗兔 IgG为二抗孵育1h，根据OD492 nm的吸光值绘制标准曲线，测得家蚕中表达的Ferritin-H11-D4浓度为101.227μg/mL。
⒍ Western blotting检测
将重组病毒感染的家蚕血淋巴用PBS(pH7.4)稀释10倍超声波破碎后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，PBST配制的5%脱脂奶粉为封闭液，以稀释1000倍的人铁蛋白兔源单抗为一抗，稀释3000倍的HPR标记的羊抗兔IgG为二抗，孵育结束后，添加显色液用荧光化学发光仪成像。Western Blot验证结果如图5，重组表达产物可检测到33.4kDa（Ferritin-H11-D4）大小的特异性条带，与预期大小一致。
⒎电镜观察
具体实验方法参考上述步骤，观察结果如图6所示，（a）图中可见大量直径约20nm的球形颗粒；（b）图所示均在球形蛋白核心部位附着金粒子，证明铁蛋白成功自组装为笼状结构，而纳米抗体展示在粒子表面。
⒏中和试验
分别将表达H11-D4、Ferritin-H11-D4组的蚕血淋巴和Luc对照组蚕血淋巴从原浓度进行5倍梯度稀释，稀释6个梯度后与等体积假病毒混合，培养48h后检测细胞中荧光素酶的表达量，根据检测到的RLU计算表达H11-D4、Ferritin-H11-D4的蚕血淋巴和Luc对照组蚕血淋巴对病毒进入细胞的抑制率，使用GraphPad Prism 8绘制蚕血淋巴中表达的H11-D4、Ferritin-H11-D4-的中和活性曲线结果表明蚕血淋巴中表达的纳米抗体H11-D4、Ferritin-H11-D4能有效抑制假病毒进入细胞，抑制率随蚕血淋巴稀释度的增大而减小，利用GraphPad Prism 8计算得出，当H11-D4蚕血淋巴稀释至1/564、Fe-H11-D4蚕血淋巴稀释至1/1380时仍具有50%的抑制率，因此蚕血淋巴中H11-D4、Fe-H11-D4的中和滴度分别为1：564、1：1380。根据5.5中测得蚕血淋巴中Fe-H11-D4蛋白的浓度计算出蚕血淋巴中表达的Fe-H11-D4的IC50为2.19 nM。因为没有相应的抗体对H11-D4蛋白进行定量，假设其在蚕体内的表达量与Fe-H11-D4相等，经计算可得蚕体中表达的H11-D4的IC50为12.64 nM。
实验证明，家蚕中表达的融合蛋白具有比原核更高效的中和活性，体现了家蚕杆状病毒表达系统在铁蛋白天然自组装和外源蛋白翻译后加工修饰方面的优势。
表2 家蚕表达的H11-D4、Ferritin-H11-D4中和活性检测
实施例2 H11-D4与Ferritin-H11-D4氨基酸单位点突变后在家蚕真核表达系统中的表达与中和活性检测
一、实验方法
⒈ H11-D4、Ferritin-H11-D4氨基酸序列单位点突变体基因的构建
本发明以H11-D4（SEQ ID NO.2）、Ferritin-H11-D4（SEQ ID NO.4）基因序列为模板，设计多对引物对优化序列进行定点突变，定点突变是利用融合PCR的方法进行，利用点突变试剂盒进行融合PCR实验。
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列分别按照L12A，V25S，A33T，P42L，W54M，S64Y，N78Q，A93G，R104K，D116E，V124S所示的单位点突变方式进行突变，所得突变体命名为H11-D4-M（L12A，V25S，A33T，P42L，W54M，S64Y，N78Q，A93G，R104K，D116E，V124S）；将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列分别按照L182A，V195S，A203T，P212L，W224M，S234Y，N248Q，A263G，R274K，D286E，V294S所示的单位点突变方式进行突变，所得突变体命名为Ferritin-H11-D4-M（L182A，V195S，A203T，P212L，W224M，S234Y，N248Q，A263G，R274K，D286E，V294S）。
⒉ H11-D4、Ferritin-H11-D4单突变氨基酸编码序列的PCR扩增
将上述单突变序列在家蚕真核表达系统中表达。
（1）H11-D4进行单位点突变所需引物：
两侧上下游引物：
F1：CGGGATCCGCCAACATGCAGGTGCAACTGGTTGAAAGC
R1：CGGAATTCTTAGCTGCTAACGGTCACTTGGG’
中间上下游引物：
1.
F: GGTTGAAAGCGGTGGTGGTGCCATGCAGGCTGGTGGTAGC
R: GCTACCACCAGCCTGCATGGCACCACCACCGCTTTCAACC
2.
F: CCTGCGTCTGAGCTGCGCTTCCAGCGGCCGTACCTTCAGC
R: GCTGAAGGTACGGCCGCTGGAAGCGCAGCTCAGACGCAGG
3.
F: GCGGCCGTACCTTCAGCACCACTGCTATGGGCTGGTTCCG
R: CGGAACCAGCCCATAGCAGTGGTGCTGAAGGTACGGCCGC
4.
F: TGGGCTGGTTCCGTCAAGCGCTCGGTAAAGAGCGTGAGTT
R: AACTCACGCTCTTTACCGAGCGCTTGACGGAACCAGCCCA
5.
F: TTCGTTGCTGCTATCCGTATGAGCGGTGGTAGCGCTTACT
R: AGTAAGCGCTACCACCGCTCATACGGATAGCAGCAACGAA
6.
F: TAGCGCTTACTACGCTGACTATGTGAAGGGTCGTTTCACC
R: GGTGAAACGACCCTTCACATAGTCAGCGTAGTAAGCGCTA
7:
F: TAGCCGTGATAAAGCTAAGCAAACCGTTTACCTGCAGATG
R: CATCTGCAGGTAAACGGTTTGCTTAGCTTTATCACGGCTA
8:
F: CTGAAATACGAAGACACCGGAGTGTACTACTGCGCTCGTA
R: TACGAGCGCAGTAGTACACTCCGGTGTCTTCGTATTTCAG
9:
F: CGCTCGTACCGAGAACGTTAAGAGCCTGCTGAGCGACTAC
R: GTAGTCGCTCAGCAGGCTCTTAACGTTCTCGGTACGAGCG
10:
F: CTACGCGACCTGGCCGTACGAATACTGGGGCCAGGGTACC
R: GGTACCCTGGCCCCAGTATTCGTACGGCCAGGTCGCGTAG
11
F: ATTACTGGGGCCAGGGTACCCAATCTACCGTTAGCAGC
R: AGCTGCTAACGGTAGATTGGGTACCCTGGCCCCAGT
（2）Ferritin-H11-D4进行单位点突变所需引物：
两侧上下游引物：
F2：CGGGATCCGCCAACATGACCAGCCAAGTGCGTCAAAAC
R3：TGCGTAAGATGGGCGCGCCGGGTGGTGGTAGCGGTGGTG
中间上下游引物：
1.
F: GGTTGAAAGCGGTGGTGGTGCCATGCAGGCTGGTGGTAGC
R: GCTACCACCAGCCTGCATGGCACCACCACCGCTTTCAACC
2.
F: CCTGCGTCTGAGCTGCGCTTCCAGCGGCCGTACCTTCAGC
R: GCTGAAGGTACGGCCGCTGGAAGCGCAGCTCAGACGCAGG
3.
F: GCGGCCGTACCTTCAGCACCACTGCTATGGGCTGGTTCCG
R: CGGAACCAGCCCATAGCAGTGGTGCTGAAGGTACGGCCGC
4.
F: TGGGCTGGTTCCGTCAAGCGCTCGGTAAAGAGCGTGAGTT
R: AACTCACGCTCTTTACCGAGCGCTTGACGGAACCAGCCCA
5.
F: TTCGTTGCTGCTATCCGTATGAGCGGTGGTAGCGCTTACT
R: AGTAAGCGCTACCACCGCTCATACGGATAGCAGCAACGAA
6.
F: TAGCGCTTACTACGCTGACTATGTGAAGGGTCGTTTCACC
R: GGTGAAACGACCCTTCACATAGTCAGCGTAGTAAGCGCTA
7:
F: TAGCCGTGATAAAGCTAAGCAAACCGTTTACCTGCAGATG
R: CATCTGCAGGTAAACGGTTTGCTTAGCTTTATCACGGCTA
8:
F: CTGAAATACGAAGACACCGGAGTGTACTACTGCGCTCGTA
R: TACGAGCGCAGTAGTACACTCCGGTGTCTTCGTATTTCAG
9:
F: CGCTCGTACCGAGAACGTTAAGAGCCTGCTGAGCGACTAC
R: GTAGTCGCTCAGCAGGCTCTTAACGTTCTCGGTACGAGCG
10:
F: CTACGCGACCTGGCCGTACGAATACTGGGGCCAGGGTACC
R: GGTACCCTGGCCCCAGTATTCGTACGGCCAGGTCGCGTAG
11
F: ATTACTGGGGCCAGGGTACCCAATCTACCGTTAGCAGC
R: AGCTGCTAACGGTAGATTGGGTACCCTGGCCCCAGT
二、 H11-D4-M、Ferritin-H11-D4-M突变体的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
三、重组质粒pBR-H11-D4-M、pBR-Ferritin-H11-D4-M的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
四、重组杆状病毒rBmBacmid（PPH-H11-D4-M、PPH-Ferritin-H11-D4-M）的构建与扩增
具体实验方法见实施例1。
五、重组病毒的鉴定
具体实验方法见实施例1。
六、重组病毒在家蚕和蚕蛹中的表达
具体实验方法见实施例1。
七、 Western blotting检测
具体实验方法见实施例1。
八、电镜观察
具体实验方法见实施例1。
九、中和试验
具体实验方法见实施例1。
十、实验结果
中和试验得到的中和滴度如表3和表4所示：
表3 H11-D4-M单突变体表达产物的中和滴度
表4 Ferritin-H11-D4-M单突变体表达产物的中和滴度
根据表3-表4数据可以看出，在优化序列的基础上进行氨基酸单位点突变，SEQ IDNO.1所得突变体有4个单突变体 (A33T、W54M、S64Y、R104K)的表达产物对假病毒的中和能力有明显提高; 同样SEQ ID NO.3所得突变体有4个单突变体 (A203T、W224M、S234Y、R274K)对假病毒的中和能力也有明显提高。
根据以上实验结果可以得出进行单突变位点是有效的，因此本实验进一步选取了4个有明显效价提高的单突变位点两两组合进行双位点突变。
实施例3 H11-D4与Ferritin-H11-D4氨基酸双位点突变后在家蚕真核表达系统中的表达与中和活性检测
一、实验方法
⒈ H11-D4、Ferritin-H11-D4氨基酸序列双位点突变体基因的构建
本发明将4种单突变位点(A33T、W54M、S64Y、R104K)两两组合进行双位点突变，双位点突变是在单位点突变序列的基础之上，以H11-D4-M、Ferritin-H11-D4-M作为模板，利用相应的引物，通过融合PCR的方法进行第二位的定点突变，从而获得双位点突变的目的片段，利用点突变试剂盒进行融合PCR实验。
双突变位点为共6种组合：A33T-W54M、A33T-S64Y、A33T-R104K、W54M-S64Y、W54M-R104K、S64Y-R104K，所获得的突变体命名为H11-D4-D、Ferritin-H11-D4-D（A33T-W54M、A33T-S64Y、A33T-R104K、W54M-S64Y、W54M-R104K、S64Y-R104K）。
将双突变后的编码序列进行PCR扩增，扩增引物见实施例2，将上述双突变序列在家蚕真核表达系统中表达。
二、 H11-D4-D、Ferritin-H11-D4-D双突变体的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
三、重组质粒pBR-H11-D4-D、pBR-Ferritin-H11-D4-D的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
四、重组杆状病毒rBmBacmid（PPH-H11-D4-D、PPH-Ferritin-H11-D4-D）的构建与扩增
具体实验方法见实施例1。
五、重组病毒的鉴定
具体实验方法见实施例1。
六、重组病毒在家蚕和蚕蛹中的表达
具体实验方法见实施例1。
七、 Western blotting检测
具体实验方法见实施例1。
八、电镜观察
具体实验方法见实施例1。
九、中和试验
具体实验方法见实施例1。
十、实验结果
中和试验得到的中和滴度如下表所示：
表5 H11-D4双突变体表达产物的中和滴度
表6 Ferritin-H11-D4双突变体表达产物的中和滴度
从表5-6中数据看出在优化序列的基础上进行氨基酸双位点突变所得突变体中突变体A33T-R104K 、W54M-R104K；Ferritin-H11-D4-A203T-R274K、W224M-R274K的中和活性有明显的提高，因此将H11-D4-W54M、R104K、Ferritin-H11-D4-A203T-R274K 、Ferritin-H11-D4-W224M-R274K认为是最优的突变。
利用铁蛋白自组装的特性，本发明将纳米抗体以24聚体的形式成功表达在铁蛋白表面，其中和活性显著高于单独表达的纳米抗体，体现了铁蛋白在多聚蛋白展示方面的优势。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> SARS-CoV-2中和性纳米抗体、自组装铁蛋白融合纳米抗体及制备方法和应用
<130> BJ-2002-220506A-L
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 1
Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr
20 25 30
Ala Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Glu Asn Val Arg Ser Leu Leu Ser Asp Tyr Ala Thr
100 105 110
Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 387
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
atgcaggtgc aactggttga aagcggtggt ggtctgatgc aggctggtgg tagcctgcgt 60
ctgagctgcg ctgtgagcgg ccgtaccttc agcaccgcgg ctatgggctg gttccgtcaa 120
gcgccgggta aagagcgtga gttcgttgct gctatccgtt ggagcggtgg tagcgcttac 180
tacgctgaca gcgtgaaggg tcgtttcacc attagccgtg ataaagctaa gaacaccgtt 240
tacctgcaga tgaacagcct gaaatacgaa gacaccgcgg tgtactactg cgctcgtacc 300
gagaacgttc gtagcctgct gagcgactac gcgacctggc cgtacgatta ctggggccag 360
ggtacccaag tgaccgttag cagctaa 387
<210> 3
<211> 298
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 3
Met Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu
20 25 30
Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe
35 40 45
Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala Glu
50 55 60
Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala
85 90 95
Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu
100 105 110
Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Cys Asp
115 120 125
Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala Ile Lys Glu
130 135 140
Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Pro Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
165 170 175
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
180 185 190
Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Ala Ala Met Gly Trp Phe
195 200 205
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp
210 215 220
Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
225 230 235 240
Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
245 250 255
Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Glu Asn
260 265 270
Val Arg Ser Leu Leu Ser Asp Tyr Ala Thr Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp
275 280 285
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
290 295
<210> 4
<211> 897
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
atgaccagcc aagtgcgtca aaactaccac caggacagcg aagcggctat caaccgtcaa 60
attaacctgg agctgtacgc tagctacgtg tacctgagca tgagctacta cttcgatcgt 120
gacgatgttg cgctgaaaaa cttcgctaag tacttcctgc accagagcca cgaagagcgt 180
gaacacgcgg agaaactgat gaagctgcag aaccaacgtg gtggccgtat cttcctgcaa 240
gacattaaaa agccggattg cgacgattgg gaaagcggtc tgaacgcgat ggaatgcgct 300
ctgcacctgg agaagaacgt taaccagagc ctgctggagc tgcacaaact ggcgaccgac 360
aagaacgatc cgcacctgtg cgacttcatc gaaacccact acctgaacga gcaagtgaaa 420
gctattaagg aactgggcga tcacgttacc aacctgcgta agatgggcgc gccgggtggt 480
ggtagcggtg gtggcggtag cggcggtggc agccaggtgc aactggttga aagcggtggt 540
ggtctgatgc aggctggtgg tagcctgcgt ctgagctgcg ctgtgagcgg ccgtaccttc 600
agcaccgcgg ctatgggctg gttccgtcaa gcgccgggta aagagcgtga gttcgttgct 660
gctatccgtt ggagcggtgg tagcgcttac tacgctgaca gcgtgaaggg tcgtttcacc 720
attagccgtg ataaagctaa gaacaccgtt tacctgcaga tgaacagcct gaaatacgaa 780
gacaccgcgg tgtactactg cgctcgtacc gagaacgttc gtagcctgct gagcgactac 840
gcgacctggc cgtacgatta ctggggccag ggtacccaag tgaccgttag cagctaa 897
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 5
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
Claims (6)
1.SARS-CoV-2中和性纳米抗体的突变体，其特征在于，所述突变体选自（1）或者（2）中的任何一种：(1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照R104K单位点进行突变所获得的突变体；（2）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W54M-R104K进行双位点突变得到的突变体。
2.一种自组装铁蛋白融合纳米抗体，其特征在于，将权利要求1所述的突变体与单体铁蛋白亚基融合在一起得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体。
3.根据权利要求2所述的自组装铁蛋白融合纳米抗体，其特征在于，将权利要求1所述的突变体与单体铁蛋白亚基的C端通过linker融合在一起得到自组装铁蛋白融合纳米抗体；所述单体铁蛋白亚基包括但不限于细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；所述linker的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。
4.一种自组装铁蛋白融合纳米抗体的突变体，其特征在于，所述突变体选自（1）或（2）中的任何一种：(1) 将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列按照R274K单位点进行突变获得的突变体；（2）将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列按照W224M-R274K进行双位点突变获得的突变体。
5.一种制备权利要求1所述的突变体、权利要求2或3所述的自组装铁蛋白融合纳米抗体或权利要求4所述自组装铁蛋白融合纳米抗体的突变体的方法，包括：（1）构建含有权利要求1所述的突变体、权利要求2或3所述的自组装铁蛋白融合纳米抗体或权利要求4所述自组装铁蛋白融合纳米抗体的突变体的编码基因的原核表达载体或真核表达载体；将所构建的原核表达载体或真核表达载体在宿主细胞中进行表达，将所表达的重组蛋白纯化、复性、去除内毒素，即得。
6.一种预防或治疗新型冠状病毒的药物组合物，包括有效量的活性成分和药物上可接受的佐剂或辅料，其特征在于，所述的活性成分选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)权利要求1所述的突变体；
(2)权利要求2或3所述的自组装铁蛋白融合纳米抗体；
(3)权利要求4所述的自组装铁蛋白融合纳米抗体的突变体。
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