JP2023082027A - バイオフィルムの堆積および産生を阻害するための組成物および方法 - Google Patents

バイオフィルムの堆積および産生を阻害するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】バイオフィルムの堆積および産生を阻害するための組成物および方法を提供する。【解決手段】バイオフィルムを分解するおよび／または除去する方法であって、バイオフィルムと、好ましくは融合タンパク質の形態での抗微生物ペプチドとバイオフィルム酵素との組み合わせの有効な量を含む組成物とを接触させることを含む方法である。このバイオフィルムは生物表面上にまたは無生物表面上に存在し得、医学的および非医学的の両方の用途および方法が提供される。一態様では、本発明は、対象（特に口腔）中でのバイオフィルム感染の処置または予防での使用のための組成物を提供する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１６年５月１２日に出願された米国仮出願第６２／３３５，６５０号明細書（この開示全体が、まるで完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから付与された助成金番号Ｒ０１ ＨＬ１０７９０４およびＲ０１ ＨＬ１０９４４２の下で政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、バイオフィルムの堆積および疾患の処置の分野に関する。より具体的には、本発明は、う蝕および他の口腔疾患の処置に有用な組成物および方法を提供する。本発明はまた、生物医学機器をコーティングする方法であって、この生物医学機器上での望ましくないバイオフィルムの堆積を阻害するためにコーティングする方法も提供する。
本発明が関連する技術水準を説明するために、本明細書全体にわたりいくつかの刊行物および特許文献が引用されている。これらの引用のそれぞれは、完全に記載されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれる。
現在のシステムで製造された生物製剤は法外に高価であり、世界人口の大多数にとっては手頃な価格ではない。タンパク質薬剤のコスト（２０１３年では１４００億ドル）は世界中の国々の７５％超のＧＤＰを超えており［Ｗａｌｓｈ ２０１４］、これらの国々は手が届かない。世界人口の３分の１は１日当たり２ドル未満の稼ぎであり、いかなるタンパク質薬剤も買うことができない（例えば、米国の恵まれない集団、高齢者の集団および下層の社会経済的集団）。そのような高コストは、法外に高価な発酵槽中でのタンパク質産生、精製、低温での輸送／貯蔵、短い貯蔵寿命および滅菌送達方法と関連する［Ｄａｎｉｅｌｌ ｅｔ ａｌ ２０１５，２０１６］。
バイオフィルムは、医療機器の表面上に存在する菌体外多糖マトリックスに付着する微生物細胞の複雑な集団により形成される。医療機器の移植と関連するバイオフィルム関連感染は深刻な問題を引き起こし、この機器の機能に悪影響を及ぼす。口腔外科および整形外科で使用される医療用インプラントは、ステンレス鋼およびチタン等の合金を使用して製造されている。細菌付着は周囲組織の損傷と関連し、医療用インプラントの機能不全をもたらすことが多いため、表面特性の改善、バイオインテグレーションの促進、および細菌付着の阻害をするために、様々な物理的技術および化学的技術による医療用インプラントの表面処理が試みられている。
ヒトの多くの感染性疾患はバイオフィルム（例えば口腔中で生じるもの）により引き起こされる［Ｈａｌｌ－Ｓｔｏｏｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍａｒｓｈ，ｅｔ ａｌ ２０１１］。例えば、う蝕（またはう歯）は、唯一の最も蔓延しているバイオフィルム関連口腔疾患であり続け、米国および世界の恵まれない子供および成人を主に悩ませており、毎年８１０億ドル超の支出をもたらす［Ｂｅｉｋｅｒ ａｎｄ Ｆｌｅｍｍｉｇ，２０１１；Ｄｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｋａｓｓｅｂａｕｍ ｅｔ ａｌ，２０１５］。細菌が歯の表面上に蓄積すると、う蝕を引き起こす（う蝕原性）バイオフィルムが発生し、細菌細胞の組織的集団が形成され、この集団は最終的に粘着性であり、菌体外多糖（ＥＰＳ）等の高分子物質で構成された細胞外マトリックス中で絡まる［Ｂｏｗｅｎ ａｎｄ Ｋｏｏ，２０１１］。う蝕原性バイオフィルムを制御するための現在の局所抗微生物治療法は限定されている。クロルヘキシジン（ＣＨＸ）は経口抗微生物療法の「ゴールドスタンダード」と考えられるが、歯の染色および歯石形成等の有害な副作用を有し、毎日の治療的使用には推奨されない［Ｊｏｎｅｓ，１９９７；Ａｕｔｉｏ－Ｇｏｌｄ，２００８］。代替として、いくつかの抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）が、う蝕を引き起こす口腔病原体（例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ））に対して潜在的な抗バイオフィルム効果を伴って現れている［ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５］。
抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）は先天性免疫応答の進化的に保存された成分であり、ヒト等の様々な生物中で天然に見出される。従来の抗生物質と比較して、ＡＭＰによる耐性は発生しにくい。ＡＭＰは細菌、真菌およびウイルスに対して強く活性であり、これらの表面抗原との融合により特定の病原体を標的とするように適合され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ２０１１；ＤｅＧｒａｙ ｅｔ ａｌ ２００１；Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ ２０１５）。線形ＡＭＰは、複雑な二次構造を有するＡＭＰと比較した場合に安定性および抗微生物活性が低い。例えば、レトロサイクリンまたはプロテグリンは、環化された場合に（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００３）またはジスルフィド結合形成によりヘアピン構造を形成する場合に（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０００）高い抗微生物活性もしくは安定性を有する。ＲＣ１０１は、ｐＨ３、４、７および温度２５℃～３７℃でならびに４８時間にわたるヒト膣液中で非常に安定であり（Ｓａｓｓｉ ｅｔ ａｌ ２０１１ａ）、同時に、このＲＣ１０１の抗微生物活性は最大６ヶ月にわたり維持された（Ｓａｓｓｉ ｅｔ ａｌ ２０１１ｂ）。同様に、プロテグリンは塩中でまたはヒト体液中で非常に安定ではある（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ ２００２；Ｍａ ｅｔ ａｌ ２０１５）が、線形化された場合には効力が失われる。複雑な二次構造を有する抗微生物ペプチドのこれらの興味深い特徴により、新規治療薬の開発が促進され得る。しかしながら、十分な量の抗微生物ペプチドの製造の高コストは、この抗微生物ペプチドの臨床開発および商業化の主な障壁である。
本発明によれば、相乗的に作用してバイオフィルム構造体を分解し且つバイオフィルムの堆積を阻害する少なくとも１種の抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）および少なくとも１種のバイオフィルム分解酵素を含む多成分組成物が提供される。ある特定の実施形態では、このＡＭＰは、プロテグリン１、ＲＣ－１０１、および表１中に列挙されたＡＭＰから選択される。このバイオフィルム分解酵素として、例えばムタナーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ＤＮＡアーゼ、ディスペルジン（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎ）Ｂ、グリコシドヒドロラーゼ、および表２中に記載された酵素が挙げられる。ある特定の実施形態では、これらの酵素のコード配列は、植物葉緑体中での発現のためにコドン最適化されている。特に好ましい実施形態では、この少なくとも１種のＡＭＰおよび少なくとも１種のバイオフィルム分解酵素は組換えにより産生されている。特に好ましい実施形態では、このＡＭＰおよびバイオフィルム分解酵素は融合タンパク質として発現されている。この組成物が口腔疾患の処置用である場合、この組成物は、抗生物質、フッ化物、ＣＨＸまたは上記の全てを任意選択でさらに含む。この組成物は、チューインガム、ハードキャンディまたは口腔リンス（ｏｒａｌ ｒｉｎｓｅ）に含まれ得る。本発明の好ましい融合タンパク質として、バイオフィルムの分解のための単独でのまたは組み合わせでの使用のためのＰＧ－１－Ｍｕｔ、ＰＧ－１－Ｄｅｘ、ＰＧ－１－Ｍｕｔ－Ｄｅｘ、ＲＣ－１０１－Ｍｕｔ、ＲＣ－１０１－Ｄｅｘ、ＲＣ－１０１－Ｍｕｔ－Ｄｅｘが挙げられるがこれらに限定されない。特に、表１中に列挙されたＡＭＰはいずれも、上述した融合タンパク質中のＰＧ－１またはＲＣ－１０１のいずれかを置き換えて、この融合タンパク質の殺菌作用を改変し得る、または改善し得る。この融合タンパク質の分解活性を改変するために、上記でおよび本明細書において下記で列挙された酵素は、本発明の融合タンパク質中のＭｕｔ、Ｄｅｘまたは両方を置き換え得る。別の実施形態では、２種の異なるＥＰＳ酵素がこの組成物で用いられる場合、そのような酵素は様々な比（例えば１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８等）で送達され得る。ＭｕｔおよびＤｅｘが例えばガムまたは口腔リンスで一緒に送達される場合、好ましい比は５：１ Ｄｅｘ：Ｍｕｔである。
別の態様では、本発明は、バイオフィルムを分解するおよび／または除去する方法であって、前記バイオフィルムを含む表面と、上記で説明された組成物とを接触させることであり、この組成物は殺菌効果を有し、１種または複数種の望ましくない微生物を含む前記バイオフィルムを低減する、または除去する、接触させることを含み、前記バイオフィルムは、前記低減または除去を必要とする動物対象中にまたは前記動物対象上に存在する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、このバイオフィルムは口腔中に存在する。他の実施形態では、このバイオフィルムは移植された医療機器上に存在する。この方法はまた、尿路中の表面、中耳、前立腺、血管内膜、心臓弁、皮膚、頭皮、爪、歯および創傷内部からなる群から選択される身体の内表面または外表面に存在するバイオフィルムを除去するためにも使用され得る。
さらに別の実施形態では、前記少なくとも１種のＡＭＰおよび前記少なくとも１種のバイオフィルム分解酵素を含む本発明の組成物は植物色素体中で産生されている。この植物はタバコ植物であり得、前記ＡＭＰおよび酵素をコードする配列は、植物色素体中での発現のためにコドン最適化されている。好ましい実施形態では、このＡＭＰおよびバイオフィルム分解酵素は、レタス色素体中に存在する内在性調節エレメントの制御下で、融合タンパク質としてレタス植物中で発現されている。
（図１Ａ－１Ｄ）タバコ葉緑体中で発現されたＧＦＰ融合レトロサイクリン（ＲＣ１０１）およびＧＦＰ融合プロテグリン（ＰＧ１）の精製を示す図である。図１Ａ．抗ＧＦＰ抗体を使用した精製済ＧＦＰ－ＲＣ１０１融合体のウエスタンブロット分析。図１Ｂ．精製済ＧＦＰ－ＲＣ１０１融合体の自然蛍光ゲル。図１Ｃ．抗ＧＦＰ抗体を使用した精製済ＧＦＰ－ＰＧ１融合体のウエスタンブロット。図１Ｄ．精製済ＧＦＰ－ＰＧ１の自然蛍光ゲル。注記－図１Ａ～１Ｄの全ての試料を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法から得られた総タンパク質値に基づいてロードした。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用したデンシトメトリを行い、ＧＦＰ濃度発現レベル、純度および収量を決定した。発現レベルおよび収量を、総タンパク質値に対するＧＦＰ濃度から算出した。収量を、ＧＦＰ濃度に精製後の回収値を乗算して決定した。個々のペプチド収量を、ＧＦＰ収量をモル濃度係数１４（ＧＦＰ ＭＷ対ペプチドＭＷの比）で除算して決定した。富化倍数を、純度％を植物の粗抽出物中の発現％で除算して算出した。 （図２Ａ－２Ｅ）ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および他の口腔微生物に対するＡＭＰ（ＧＦＰ－ＰＧ１およびＧＦＰ－ＲＣ１０１）の抗微生物活性を示すグラフである。細胞生存率を、吸光度（Ａ600nm）および経時的なコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数により決定した。（図２Ａ）様々な濃度のＧＦＰ－ＰＧ１および合成ＰＧ１で処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の時間－死滅曲線（Ａ６００ｎｍ）。（図２Ｂ）各時点でＧＦＰ－ＰＧ１および合成ＰＧ１で処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の生存細胞（ＣＦＵ／ｍｌ）。（図２Ｃ）様々な濃度にてＧＦＰ－ＲＣ１０１で処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の時間－死滅曲線（Ａ６００ｎｍ）。（図２Ｄ）各時点でＧＦＰ－ＲＣ１０１で処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の生存細胞（ＣＦＵ／ｍｌ）。（図２Ｅ）１時間および２時間にわたり１０μｇ／ｍｌにてＧＦＰ－ＰＧ１で処理したＳ．ゴルドニ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、Ａ．ネスルンディ（Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）およびＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の生存細胞（ＣＦＵ／ｍｌ）。 （図２Ａ－２Ｅ）ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および他の口腔微生物に対するＡＭＰ（ＧＦＰ－ＰＧ１およびＧＦＰ－ＲＣ１０１）の抗微生物活性を示すグラフである。細胞生存率を、吸光度（Ａ600nm）および経時的なコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数により決定した。（図２Ａ）様々な濃度のＧＦＰ－ＰＧ１および合成ＰＧ１で処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の時間－死滅曲線（Ａ６００ｎｍ）。（図２Ｂ）各時点でＧＦＰ－ＰＧ１および合成ＰＧ１で処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の生存細胞（ＣＦＵ／ｍｌ）。（図２Ｃ）様々な濃度にてＧＦＰ－ＲＣ１０１で処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の時間－死滅曲線（Ａ６００ｎｍ）。（図２Ｄ）各時点でＧＦＰ－ＲＣ１０１で処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の生存細胞（ＣＦＵ／ｍｌ）。（図２Ｅ）１時間および２時間にわたり１０μｇ／ｍｌにてＧＦＰ－ＰＧ１で処理したＳ．ゴルドニ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、Ａ．ネスルンディ（Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）およびＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の生存細胞（ＣＦＵ／ｍｌ）。 （図３Ａ－３Ｃ）共焦点蛍光およびＳＥＭ撮像により決定した場合のＧＦＰ－ＰＧ１による細菌死滅を示す図である。（図３Ａ）１０μｇ／ｍｌにてＧＦＰ－ＰＧ１で処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のタイムラプス死滅。（図３Ｂ）は、緩衝液のみで処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）細胞からなった、コントロール群。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（赤色）を共焦点顕微鏡で使用して、単一細胞レベルでの経時的な細菌生存率を測定した。ＰＩは細胞非透過性であり、膜が損傷した細胞にのみ侵入し、瀕死の細胞および死滅した細胞ではＤＮＡへのＰＩの結合時に鮮やかな赤色の蛍光が生じる。ＧＦＰ－ＰＧ１を緑色で示す。（図３Ｃ）走査型電子顕微鏡を使用した、１時間にわたり１０μｇ／ｍｌの濃度にてＧＦＰ－ＰＧ１に晒したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の形態観察。赤色の矢印は、凹んだ膜および細胞内成分の放出を示す。 （図４Ａ－４Ｃ）ＧＦＰ－ＰＧ１の単回局所処理によるバイオフィルム形成の阻害を示す図である。この図は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）バイオフィルムの三次元（３Ｄ）レンダリングの代表的な画像を示す。細菌細胞をＳＹＴＯ ９（緑色）で染色し、ＥＰＳをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（赤色）で標識した。３０分という短時間の暴露により、唾液が塗布されたヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）ディスク表面をＧＦＰ－ＰＧ１の単回局所処理で処理した（図４Ｂ）。コントロール群（図４Ａ）を緩衝液のみで処理した。次いで、処理したｓＨＡディスクを、１％（重量／体積）スクロースおよび活発に増殖するＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）細胞（１０5ｃｆｕ／ｍｌ）を含む培養培地に移し、１９時間にわたり３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。バイオフィルムの成長後、このバイオフィルムを２光子共焦点顕微鏡で分析した。（図４Ｃ）プロピジウムモノアジド（ＰＡＭ）処理した、またはこの処理をしていない、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による生存Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）細胞および死滅Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）細胞の割合の定量的分析（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＰＭＡおよびｑＰＣＲの組み合わせ（ＰＭＡ－ｑＰＣＲ）により、インタクトな膜を有する生存細胞を定量する。ゲノムＤＮＡ単離およびｑＰＣＲ定量化の前に、ＰＭＡを添加して死滅細胞のＤＮＡに選択的に架橋させ、それによりＰＣＲ増幅を防止する（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。アスタリスクは、ＧＦＰ－ＰＧ１処理からの値がコントロールと有意に異なることを示す（Ｐ＜０．０５）。 バイオフィルムマトリックスを消化するＥＰＳ分解酵素を示す図である。デキストラナーゼおよびムタナーゼの組み合わせで処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）バイオフィルムでのＥＰＳ分解の代表的なタイムラプス画像。細菌細胞をＳＹＴＯ ９（緑色）で染色し、ＥＰＳをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（赤色）で標識した。白色の矢印は、細菌細胞集団とＥＰＳの酵素分解後の「非被覆」細胞との間の空間の「開口」を示す。 （図６Ａ－６Ｃ）合成ＰＧ１単独によるまたはＥＰＳ分解酵素との組み合わせによるバイオフィルム破壊を示すグラフである。（図６Ａ）ＣＯＭＳＴＡＴを使用した、インタクトなバイオフィルム内でのＥＰＳ分解のタイムラプス定量。（図６Ｂ）ＩｍａｇｅＪによる、単独または組み合わせのいずれかで、合成ＰＧ１およびＥＰＳ分解酵素（Ｄｅｘ／Ｍｕｔ）により処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）バイオフィルムの生存率。（図６Ｃ）合成ＰＧ１の抗バイオフィルム活性はＥＰＳ分解酵素により増強された（Ｄｅｘ／Ｍｕｔ）。アスタリスクは様々な実験群の値が互いに有意に異なることを示す（Ｐ＜０．０５）。 共焦点顕微鏡による、下記の様々なヒト歯周細胞系統：ヒト歯根膜幹細胞（ＨＰＤＬＳ）、上顎骨間葉幹細胞（ＭＭＳ）、ヒト頭頸部扁平上皮細胞がん腫細胞（ＳＣＣ）、歯肉由来間葉間質細胞（ＧＭＳＣ）、成人歯肉ケラチノサイト（ＡＧＫ）および骨芽細胞（ＯＢＣ）での精製済融合タンパク質ＣＴＢ－ＧＦＰ、ＰＴＤ－ＧＦＰ、プロテグリン－１－ＧＦＰ（ＰＧ１－ＧＦＰ）およびレトロサイクリン１０１－ＧＦＰ（ＲＣ１０１－ＧＦＰ）のインビトロでの取込みを示す図である。ヒト細胞系統ＨＰＤＬＳ、ＭＭＳ、ＳＣＣ、ＧＭＳＣ、ＡＧＫおよびＯＢＣの２×１０4個の細胞を一晩にわたり３７℃で８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）中にて培養し、１時間にわたり３７℃にて、それぞれ１％ＦＢＳが補充されたＰＢＳ １００μｌ中で下記の精製済ＧＦＰ融合タンパク質：ＣＴＢ－ＧＦＰ（８．８μｇ）、ＰＴＤ－ＧＦＰ（１３μｇ）、ＰＧ１－ＧＦＰ（１．２μｇ）、ＲＣ１０１－ＧＦＰ（１７．３μｇ）と共にインキュベートした。１０分にわたるＲＴでの２％パラホルムアルデヒドによる固定およびＰＢＳによる３回の洗浄の後、細胞を、ＤＡＰＩを含むアンチフェードマウンティング培地（ａｎｔｉｆａｄｅ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）で染色した。陰性コントロールの場合、細胞を、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で市販のＧＦＰ（２μｇ）と共にインキュベートし、次いで同一条件で処理した。固定された細胞全てを、共焦点顕微鏡を使用して撮像した。緑色の蛍光はＧＦＰ発現を示し、青色の蛍光はＤＡＰＩ標識細胞核を示す。画像を１００倍対物レンズで観察し、少なくとも１０～１５個のＧＦＰ陽性細胞または画像を各細胞系統で観察した。スケールバーは１０μｍを表す。全ての画像研究を３回反復で分析した。 トランスプラストミック（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ）タバコ由来のＧＦＰ融合体の下流処理：温室で栽培されたトランスプラストミックタバコ植物からの精製済ＧＦＰ融合体の生成に関与する様々な工程を示すフロー図である。 （図９Ａ－９Ｂ）ムタナーゼ（図９Ａ）およびデキストラナーゼ（図９Ｂ）に関するベクターおよびコドン最適化配列を示す図である。コドン最適化ムタナーゼ：配列番号１。コドン最適化デキストラナーゼ：配列番号２。 （図９Ａ－９Ｂ）ムタナーゼ（図９Ａ）およびデキストラナーゼ（図９Ｂ）に関するベクターおよびコドン最適化配列を示す図である。コドン最適化ムタナーゼ：配列番号１。コドン最適化デキストラナーゼ：配列番号２。 単独での使用のためのまたは図９のＥＰＳタンパク質を含む融合タンパク質を発現するためのＧＶＧＶＰと融合したＡＭＰのタンデムリピートを発現する葉緑体ベクターを示す模式図である。 新規の精製戦略を示す図であり、逆温度サイクリング精製プロセスが高収量を示す。 （図１２Ａ－１２Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での機能的コドン最適化ムタナーゼの発現を示す図である。図１２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのムタナーゼ発現を示すウエスタンブロットを示す。図１２Ｂは、０．５％ブルーデキストランプレート上に広げられた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を示す。形質転換クローンは、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）中で通常作られる組換えデキストラナーゼを産生し得、コロニー周辺の青色ハロー（ｂｌｕｅ ｈａｌｏ）を消し得る。図１２Ｃは、ペニシリンから商業的に精製された酵素と、青色デキストリンに対する形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の粗溶解物（総タンパク質ローディング）中に存在する組換えデキストラナーゼの分解活性を比較するゲル拡散アッセイを表す。 （図１２Ａ－１２Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での機能的コドン最適化ムタナーゼの発現を示す図である。図１２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのムタナーゼ発現を示すウエスタンブロットを示す。図１２Ｂは、０．５％ブルーデキストランプレート上に広げられた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を示す。形質転換クローンは、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）中で通常作られる組換えデキストラナーゼを産生し得、コロニー周辺の青色ハロー（ｂｌｕｅ ｈａｌｏ）を消し得る。図１２Ｃは、ペニシリンから商業的に精製された酵素と、青色デキストリンに対する形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の粗溶解物（総タンパク質ローディング）中に存在する組換えデキストラナーゼの分解活性を比較するゲル拡散アッセイを表す。 ＡＭＰ／バイオフィルム分解酵素の産生のためのレタス植物の操作工程を示すフロー図である。 チューインガム錠調製物を示す図である。ここではＧＦＰが例示されているが、ＡＭＰ－酵素融合タンパク質（例えば図９および図１０で示されているもの）を含むチューインガムも本発明の範囲内である。 ガム錠を蛍光により評価し、ウエスタンブロットによりＧＦＰの濃度を確認したことを示す図である。（ｉ）ウエスタンブロッティング（ｉｉ）フルオロメーター（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ－Ｔｈｅｒｍｏ；λex ４８５ｎｍ；λem ５３８ｎｍ）に基づくチューインガムからのＧＦＰ放出の定量。市販のＧＦＰ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＭＢ－０７５２）を標準として使用した。チューインガムをタンパク質抽出緩衝液中で粉砕した。 本発明のガム錠からのバイオフィルム分解剤の放出動態を評価するために人工唾液を使用するチューイングシミュレータを示す図である。 チューイングガムから放出されたＧＦＰの定量を示すグラフである。レタス葉中で発現されたＧＦＰの濃度が増加しているガム錠を、人工唾液の存在下にてチューイングシミュレータで評価してＧＦＰ放出動態を決定した。 葉緑体ベクターから発現された酵素を含む粗抽出物は、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅと混合された場合に、商業的酵素と同じくらいＣＦＵ形成の阻害に有効であることを示すグラフである。Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅが補充された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のムタナーゼおよびデキストラナーゼ（比１：５）を使用した、インビトロでのＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）バイオフィルムの酵素的分解。陽性コントロールとして市販のムタナーゼ（バチルス（Ｂａｃｉｏｌｌｕｓ）種由来、Ａｍａｎｏ）およびデキストラナーゼ（ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種由来、Ｓｉｇｍａ）を使用し、粗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物は陰性コントロールとしての役割を果たす。ＣＦＵ／ｍｌを平均±標準偏差として表す（ｎ＝２）。***、Ｐ＜０．００１対大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物。
口腔内で生じるもの（例えばう蝕および歯周病）等のヒトにおける多くの感染性疾患は、病原性バイオフィルムにより引き起こされる。う蝕（またはう歯）は、米国中でおよび世界中で唯一の最もコストがかかり且つ蔓延しているバイオフィルム関連口腔疾患であり続けている。う蝕は子供および成人を同様に苦しめ、職場および学校からの欠席につながる緊急治療室の訪問の主な理由である。残念ながら、う蝕の有病率は依然として高く（米国成人人口の９０％超）、う蝕は、子供および青年（特に貧しい社会経済的バックグラウンド出身）を苦しめている最も一般的な慢性疾患であり続けている。さらに、口腔の不健康さが全身的な結果につながって健康全般に影響を及ぼすことが多い。重要なことに、この疾患による破壊（例えばう蝕病原および歯髄感染）を処置するためのコストは、米国だけで４００億ドル／年を超える。フッ化物はう蝕予防の中心である。しかしながら、このフッ化物の広範な使用により、この疾患に対する防御は不完全になる。フッ化物は脱灰の低減および初期う蝕病変の脱灰の増強で有効ではあるが、バイオフィルムに対する効果は限定的である。逆に、う蝕を引き起こすバイオフィルムを制御するための現在の抗微生物治療法はほとんど効果がない。
病原性の口腔バイオフィルムを制御するのに有効な治療法を開発することが早急に必要とされている。本発明によれば、現在の抗バイオフィルム／抗う蝕治療法よりも優れた治療上有効な植物発現生物製剤の低コストの製造および送達のための方法が提供される。
定義：
本明細書で使用される場合、抗微生物ペプチドは、あらゆる細菌活性を有する小さいペプチドである。「ＲＣ－１０１」は、インビトロでのＨＩＶ－１のＴ指向性株およびＭ指向性株による感染からヒトＣＤ４＋細胞を保護し得るおよびヒト頸腟部組織でのＨＩＶ－１感染を予防し得る、レトロサイクリンの類似体（環状オクタデカペプチド）である。ＲＣ－１０１の、腟液の存在下でＨＩＶ－１感染を予防し且つ完全な活性を保持する能力により、ＲＣ－１０１は（特に口腔バイオフィルム中での）他の局所的殺菌剤用途の良好な候補である。ＲＣ－１０１の配列はＰｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１１ Ｊａｎ；９（１）：１００－１１５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
「Ｃ１６Ｇ２」は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対する特異性を有する新規の合成抗微生物ペプチドである。
「プロテグリン－１（ＰＧ）」は、システインリッチの１８残基β－シートペプチドである。プロテグリン－１は、広範囲の微生物（例えば細菌、真菌、ウイルスおよび特にいくつかの臨床的に関連する抗生物質耐性菌）に対して強力な抗微生物活性を有する。例えば、細菌性病原体である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および日和見真菌であるＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）は、実験室での試験ではＰＧにより効果的に死滅する。ＰＧ－１の配列はＰｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１１ Ｊａｎ；９（１）：１００－１１５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
さらなる抗微生物ペプチドとして、下記の表１中に記載されたものが挙げられる。
Figure 2023082027000001
「バイオフィルム」は、定期的に水と接触する表面に付着する複雑な構造体であり、細菌および通常は他の微生物（例えば酵母、真菌および原生動物）であって、これらを包み込む粘液質の保護コーティングを分泌する細菌および他の微生物のコロニーからなる。バイオフィルムは固体または液体の表面上にならびに生体内の柔組織上に生じ得、典型的には従来の消毒方法に対して耐性がある。歯垢、パイプおよびタンクを詰まらせる粘液性皮膜、ならびに水体上の藻類マットはバイオフィルムの例である。バイオフィルムは概して体内では病原性であり、う蝕、嚢胞性線維症および中耳炎等の疾患を引き起こす。
「バイオフィルム分解酵素」としては、限定はなく、菌体外多糖分解酵素、例えばデキストラナーゼ、ムタナーゼ、ＤＮＡｓｅ、エンドヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ディスペルジンＢ、およびグリコシドヒドロラーゼ、例えば１→３）－α－Ｄ－グルカンヒドロラーゼが挙げられるがこれらに限定されず、デキストラナーゼおよびムタナーゼをコードする葉緑体コドン最適化配列の使用が好ましいが、当業者は、当分野における多くの異なるバイオフィルム分解酵素を十分に認識している。本発明の融合タンパク質で使用されるさらなる酵素配列を下記に示す。
本明細書で使用される場合、対象への薬剤、薬物またはペプチドの用語「投与すること」または「投与」は、化合物の対象への導入または送達のあらゆる経路であって、この化合物の意図された機能を果たすような経路を含む。この投与することまたは投与は、任意の適切な経路（例えば経口、局所、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは皮下）または直腸内）により実行され得る。投与することまたは投与は、本人による投与および他人による投与を含む。
本明細書で使用される場合、用語「疾患」、「障害」または「合併症」は、対象における正常な状態からのあらゆる逸脱を指す。
本明細書で使用される場合、用語「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）、「有効な量（ａｍｏｕｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または同類のものは、所望の結果を達成するのに必要な投与量でおよび期間にわたり有効な量を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「阻害する」または「予防する」は、疾患状態に暴露され得るまたは罹患し得るがこの疾患状態の症状をまだ経験していないまたは呈しない対象において、この疾患状態の臨床症状を悪化させないことまたは発症させないこと（例えば疾患の発症を阻害すること）を意味する。
本明細書で使用される場合、遺伝子またはポリヌクレチドの文脈における用語「発現」は、この遺伝子またはポリヌクレオチドのＲＮＡへの転写を含む。この用語はまた、このＲＮＡのその後のポリペプチド鎖への翻訳およびこのポリペプチド鎖のタンパク質への集合も含み得るが必ずしもそうではない。
植物残余物は、目的のタンパク質が発現された植物に由来する１種または複数種の分子（例えば、限定されないがタンパク質およびその断片、ミネラル、ヌクレオチドおよびその断片、植物構成成分等）を含み得る。従って、１種または複数種の検出可能な植物残余物を有する目的の精製済タンパク質を含む組成物と同様に、植物材料全体（例えば、植物の葉、茎、果実等の全体もしくは一部）または粗植物抽出物に関する組成物は高濃度の植物残余物を確実に含むはずである。具体的な実施形態では、この植物残余物はルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ）である。
別の実施形態では、本発明は、インサイチュでの（例えば口腔中での）ならびに外科的移植に有用な生物医学機器（例えばステント、人工関節および同類のもの）上でのバイオフィルム形成の処置または予防のための投与可能組成物に関する。この実施形態では、この機器は、この機器上での望ましくないバイオフィルム堆積を阻害するための組成物でコーティングされている。この組成物は、治療上有効な量の１種または複数種の抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）およびバイオフィルム分解活性を有する１種または複数種の酵素を組み合わせて含み、前記ＡＭＰおよび酵素のそれぞれは植物および植物残余物により発現されており、相乗的に作用して前記バイオフィルムを分解する。ある特定の実施形態では、ＡＭＰおよび酵素は別個のプラスチド形質転換ベクターから発現されている。他の実施形態では、このＡＭＰおよび酵素の両方が単一ベクターから発現されるポリシストロニックコード配列を含むプラスミド形質転換ベクター。
本明細書で教示されたある特定の実施形態に従って発現されたタンパク質は、様々な方法での対象（ヒトまたは動物）への投与によりインビボで使用され得る。本医薬組成物を経口、局所、皮下、筋肉内または静脈内で投与し得るが、経口局所投与が好ましい。
本発明の実施形態により製造された経口組成物は、色素体由来の治療用タンパク質を産生するトランスジェニック植物で製造されている食品の摂取により投与され得る。この植物の可食部またはその一部が食事成分として使用される。この治療用組成物を、所望の投与様式に適した固体または液体のビヒクル、希釈剤および添加剤を使用して古典的な方法で製剤化し得る。経口では、この組成物を、少なくとも１種のビヒクル（例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチン等）と共に、錠剤、カプセル剤、粒剤、散剤、ガムおよび同類のものの形態で投与し得る。目的の治療用タンパク質を植物ホモジネートから任意選択で精製し得る。この調製物を乳化してもよい。この活性成分は、薬学的に許容され且つこの活性成分に適合する添加剤と混合されることが多い。適切な添加剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたは同類のものおよびこれらの組み合わせである。加えて、必要に応じて、この組成物は少量の補助物質（例えば湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤またはアジュバント）を含み得る。好ましい実施形態では、食用の植物、果汁、穀粒、葉、塊茎、茎、種子、根または薬剤製造用トランスジェニック植物の他の植物部分がヒトまたは動物に摂取され、それにより疾患の処置の非常に安価な手段が提供される。
特定の実施形態では、ＡＭＰを発現する葉緑体、バイオフィルム分解酵素ならびにこれらの組み合わせを含む植物材料（例えばレタス材料）をホモジナイズしてカプセル封入する。特定の一実施形態では、このレタス材料の抽出物をカプセル封入する。代替実施形態では、このレタス材料をカプセル封入の前に粉末化する。既に述べているように、このバイオフィルム分解タンパク質を発現後に植物から精製してもよい。
代替実施形態では、投与の便宜のために、本組成物をトランスジェニック植物のジュースと共に提供し得る。前記目的のために、形質転換する植物は特に、通常はジュースの形態で消費されるトマト、ニンジンおよびリンゴからなる食用植物から好ましくは選択される。
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書中で開示されているペプチドの組み合わせを発現する異種遺伝子を含むベクターで形質転換されている形質転換葉緑体ゲノムに関する。
特に興味深いのは、１種もしくは複数種のＡＭＰおよびバイオフィルム分解酵素またはこれらの組み合わせのポリペプチドを発現する異種遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換葉緑体ゲノムである。関連する実施形態では、本発明は、明細書で開示されているペプチドを発現するように形質転換されている少なくとも１つの細胞を含む植物に関する。
本明細書での遺伝子配列への言及は一本鎖または二本鎖の核酸配列を指し、目的のポリペプチドのコード配列またはこのコード配列の相補体を含む。ポリペプチドをコードする縮重核酸配列、ならびにｃＤＮＡと少なくとも約５０、５５、６０、６５、６０、好ましくは約７５、９０、９６または９８％同一である相同ヌクレオチド配列を、本明細書でのポリヌクレオチドの教示に従って使用し得る。２種のポリヌクレオチドの配列間の配列同一性のパーセントを、－１２のギャップオープンペナルティおよび－２のギャップ伸長ペナルティによるアフィンギャップサーチを使用して、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いるＡＬＩＧＮ等のコンピュータプログラムを使用して決定する。生物学的に活性なポリペプチドをコードする核酸配列の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体およびバリアントも有用なポリヌクレオチドである。
上記で説明されている核酸配列のバリアントおよび相同体も有用な核酸配列である。典型的には、当分野で既知であるように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドと既知のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより相同ポリヌクレオチド配列を同定し得る。例えば、下記の洗浄条件：２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温で２回、それぞれ３０分；次いで２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、１回、３０分；次いで２×ＳＳＣ、室温で２回、それぞれ１０分を使用して、最大約２５～３０％の塩基対ミスマッチを含む相同配列を決定し得る。より好ましくは、相同核酸鎖は１５～２５％の塩基対ミスマッチを含み、さらにより好ましくは５～１５％の塩基対ミスマッチを含む。
適切なプローブまたはプライマーを作製してｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングすることにより、本明細書で言及されているポリヌクレオチドの種相同体も同定し得る。相同性が１％低下する毎に二本鎖ＤＮＡのＴｍが１～１．５℃低下することは公知である（Ｂｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１，１２３（１９７３）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件の後で目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列またはその相補体も有用なポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で公知であり且つ理解されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２nd ｅｄ．，１９８９，ａｔ ｐａｇｅｓ ９．５０－９．５１で開示されている。
本発明の実施を容易にするために、下記の材料および方法が提供される。
微生物および増殖条件
本研究では、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９血清型ｃ（ＡＴＣＣ ７００６１０）、アクチノミセス・ネスルンディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）ＡＴＣＣ １２１０４、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）ＤＬ－１およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＳＣ５３１４を使用した。これらの株を選択しており、なぜならば、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）は十分に確立された病原性のう蝕原性細菌だからである［Ａｊｄｉｃ Ｄ ｅｔ ａｌ，２００２］。Ｓ．ゴルドニ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）は歯のバイオフィルムの先駆的生着菌であり、歯のバイオフィルム形成の初期段階ではＡ．ネスルンディ（Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）も検出され、Ａ．ネスルンディ（Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）は根のう蝕の発生と関連している可能性がある［Ｄｉｇｅ Ｉ ｅｔ ａｌ，２００９］。Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）は、ヒトの粘膜表面にコロニーを形成する真菌生物であり、幼児期のう蝕を有する幼児からの歯垢中でも検出される［Ｈａｊｅｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ Ｅ ｅｔ ａｌ，２０１５］。全ての株を、２０％グリセロールを含むトリプシンダイズブロス中で－８０℃にて貯蔵した。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．ゴルドニ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＡ．ネスルンディ（Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）の培養に血液寒天プレートを使用した。Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）にはサブロー寒天プレートを使用した。これらの株全てを、使用前に、１％グルコースが入った、限外ろ過した（１０ｋＤａ分子量カットオフ膜；Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）緩衝トリプトン－酵母抽出物ブロス（ＵＦＴＹＥ；２．５％トリプトンおよび１．５％酵母抽出物、ｐＨ７．０）中で中間指数期（ｍｉｄ－ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）まで増殖させた（３７℃、５％ＣＯ２）。
様々なタグ付きＧＦＰ融合タンパク質を発現するトランスプラストミック系統の作製
ＣＴＢ、ＰＴＤ、レトロサイクリンおよびプロテグリンと融合したＧＦＰを発現するトランスプラストミック植物を、以前の研究［Ｌｉｍａｙｅ ｅｔ ａｌ ２００６；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１３；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ ２０１６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ２０１１］で説明されているように作製した。既に説明されているようにサザンブロットアッセイを使用して、ＧＦＰ融合タンパク質を発現するトランスプラストミック系統を確認した［Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ ２００８］。同様に、ＵＶ照明下で各構築物の葉からの緑色蛍光を可視化することにより、ＧＦＰタグ付きタンパク質の発現を確認した。
タグ融合ＧＦＰタンパク質の精製
これまで行われていた有機抽出およびその後の疎水性クロマトグラフィーにより、トランスプラストミックタバコ由来のＧＦＰ融合体プロテグリン－１（ＰＧ１）およびレトロサイクリン（ＲＣ１０１）の精製を達成した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２０１１）。凍結乾燥させた葉材料 約０．２～１ｇｍを採取し、植物抽出緩衝液（２％フッ化フェニルメチルスルホニルおよび１プロテアーゼ阻害剤のカクテルが補充された０．２Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４Ｍスクロース、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ）１０～２０ｍｌ中で再構成した。この再懸濁液を、１５分毎にボルテックスしてホモジナイズしつつ１時間にわたり氷中でインキュベートした。次いで、このホモジネートを１時間にわたり４℃で７５０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＥ－８０Ｋ最適超遠心分離機）にて沈降させて清澄な溶解物を得た。この溶解物を７０％飽和硫酸アンモニウムおよび１／４体積の１００％エタノールによる前処理にかけ、続いて２分にわたり激しく振盪した（Ｙａｋｈｎｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９８）。この処理済溶液を３分にわたり２１００ｇで沈降させた。上方のエタノール相を集め、このプロセスを１／１６体積の１００％エタノールで繰り返した。プールしたエタノール相を、１／３体積の５Ｍ ＮａＣｌおよび１／４体積の１－ブタノールでさらに処理し、２分にわたり激しくホモジナイズし、３分にわたり２１００ｇで沈降させた。最下相を集め、７ｋＤａ ＭＷＣＯゼバスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にロードし、製造業者の推奨に従って脱塩した。
次いで、脱塩した抽出物を、さらなる精製のための捕捉相の最中に疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。脱塩した抽出物を、ＦＰＬＣユニット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ－ＦＰＬＣシステム）上で実行するＴｏｙｏｐｅａｒｌブチル－６５０Ｓ疎水性相互作用カラム（Ｔｏｓｏｈ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に注入した。このカラムを、２．３カラム体積の塩緩衝液（ｓａｌｔｅｄ ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０％飽和硫酸アンモニウム）で最終２０％塩飽和まで平衡化し、樹脂へのＧＦＰの結合を促進した。これに続いて、５．８カラム体積の塩緩衝液および非塩緩衝液（ｕｎｓａｌｔｅｄ ｂｕｆｆｅｒ）の混合物でカラムを洗浄し、次いで非塩緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶出した。クロマトグラムで観測したピークに基づいてＧＦＰ画分を同定して集めた。集めた画分を、一晩の透析による最終仕上げ工程に供した。透析後、精製済タンパク質を凍結乾燥させて（ｌａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥機）、この最終生成物を濃縮し、次いで－２０℃で貯蔵した。
精製済ＧＦＰ融合体の定量
ウエスタンブロットベースの方法および蛍光ベースの方法の両方により、ＧＦＰ－ＲＣ１０１およびＧＦＰ－ＰＧ１の定量を実行した。凍結乾燥させた精製済タンパク質を滅菌１×ＰＢＳで再懸濁させ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により総タンパク質を決定した。次いで、精製済タンパク質を、変性タンパク質試料を市販のＧＦＰ標準（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）と一緒に１２％ＳＤＳゲル上ロードすることによりＳＤＳ－ＰＡＧＥ法によって定量し、次いで１：３０００希釈のマウス抗ＧＦＰ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、その後に１：４０００希釈の二次ＨＲＰ共役ヤギ抗マウス抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ）で調べてウエスタンブロッティングを行った。
この精製済タンパク質を、ＧＦＰ蛍光を使用しても定量した。このタンパク質試料を自然条件下にて１２％ＳＤＳゲル上で泳動させた。この泳動後、このゲルをＵＶランプ下に置き、次いで撮像した。ウエスタン法および自然蛍光法の両方でのＧＦＰ濃度を、標準曲線を得るために市販のＧＦＰ標準でＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用する濃度測定分析により決定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で決定した総タンパク質値に対するＧＦＰ定量に基づいて純度を決定した。
ヒト歯周細胞系統による精製済タグ融合ＧＦＰタンパク質の取込み
既に説明されているように（Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ ２０１６）、下記の４種のタグ：ＣＴＢ、ＰＴＤ、ＰＧ１およびＲＣ１０１の取込みを測定するために、様々なヒト歯周細胞系統（例えばヒト歯根膜幹細胞（ＨＰＤＬＳ）、上顎骨間葉幹細胞（ＭＭＳ）、ヒト頭頸部扁平上皮細胞がん腫細胞（ＳＣＣ－１）、歯肉由来間葉間質細胞（ＧＭＳＣ）、成人歯肉ケラチノサイト（ＡＧＫ）および骨芽細胞（ＯＢＣ））において、簡潔に言うと、各ヒト細胞系統細胞（２×１０4個）を一晩３７℃にて８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）中で培養し、続いて１時間にわたり３７℃にて、１％ＦＢＳが補充されたＰＢＳ １００μｌ中で下記の精製済ＧＦＰ融合タグ：ＣＴＢ－ＧＦＰ（８．８μｇ）、ＰＴＤ－ＧＦＰ（１３μｇ）、ＧＦＰ－ＰＧ１（１．２μｇ）およびＧＦＰ－ＲＣ１０１（１７．３μｇ）と共にインキュベートした。１０分にわたるＲＴでの２％パラホルムアルデヒドによる固定およびＰＢＳによる３回の洗浄の後、全ての細胞を、ＤＡＰＩを含むアンチフェードマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）で染色した。陰性コントロールの場合、細胞を、１時間にわたり３７℃にて、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で市販のＧＦＰ（２μｇ）と共にインキュベートした。固定された細胞全てを、共焦点顕微鏡を使用して撮像した。３つの独立した分析において、画像を１００倍対物レンズで観察し、各細胞系統に関して
少なくとも１０～１５個のＧＦＰ陽性細胞を記録した。
抗菌活性の評価
Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するＡＭＰ（Ｇｆｐ－ＰＧ１およびＧｆｐ－ＲＣ１０１）の死滅動態をタイムラプス死滅アッセイで分析した。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）を対数期まで増殖させ、増殖培地で１０5ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。ＧＦＰ－ＰＧ１およびＧＦＰ－ＲＣ１０１をそれぞれ０～１０μｇ／ｍｌおよび０～８０μｇ／ｍｌの濃度でＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）懸濁液に添加した。０時間、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間で試料を採取し、０．８９％ＮａＣｌで連続的に希釈し、次いで寒天プレート上で広げ、４８時間後にコロニーを計数した。各時点で６００ｎｍでの吸光度もチェックした。Ｓ．ゴルドニ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）懸濁液、Ａ．ネスルンディ（Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）懸濁液およびＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）懸濁液を１０μｇ／ｍｌの濃度でＧｆｐ－ＰＧ１と混合し、０時間、１時間および２時間で、ＣＦＵの計数のためにアリコートを取り出した。
Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）細胞の生存率へのＡＭＰの効果もタイムラプス測定により評価した。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）を対数期まで増殖させ、遠心分離（５５００ｇ、１０分）により回収し、ペレットをリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）で１回洗浄し、ＰＢＳで再懸濁させ、１×１０5ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度に調整した。ＧＦＰ－ＰＧ１を１０μｇ／ｍｌの濃度でＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）懸濁液に添加し、２．５μＭヨウ化プロピジウム－ＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を添加して死滅細胞を標識した。混合物５μｌを共焦点撮像用のアガロースパッド上に載せた。１００×（開口数、１．４）油浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ５－ＦＬＩＭ倒立型単一光子レーザー走査顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して共焦点画像を取得した。励起波長はＧＦＰおよびＰＩそれぞれに関して４８８ｎｍおよび５４３ｎｍであった。ＧＦＰ用の放出フィルタは４９５／５４０ ＯｌｙＭＰＦＣ１フィルタであり、ＰＩは５９８／６２８ ＯｌｙＭＰＦＣ２フィルタであった。タイムラプスシリーズのために、同一視野での画像を０分、１０分、３０分および６０分で取得し、ＩｍａｇｅＪ １．４４（Ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｈｔｍｌ）により作成した。
ＡＭＰで処理したＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の形態観察も走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で調べた。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）を対数期まで増殖させ、ＰＢＳで１０5ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。細菌懸濁液を、３７℃で１時間にわたりＧＦＰ－ＰＧ１（１０μｇ／ｍｌの最終濃度）と混合した。処理後、０．４μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタを使用するろ過により細菌を回収した。沈着物を室温で１時間にわたり０．１Ｍカコジル緩衝液（ｐＨ７．４）中の２．５％グルタルアルデヒドおよび２．０％パラホルムアルデヒドで固定し、ＳＥＭ（Ｑｕａｎｔａ ＦＥＧ ２５０，ＦＥＩ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ）観察用に処理した。非処理または緩衝液のみで処理した細菌はコントロールとしての役割を果たした。
抗バイオフィルム活性の評価
十分に特徴付けられたＥＰＳ－マトリックス産生口腔病原体Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９を使用して、唾液が塗布されたヒドロキシアパタイトディスク表面上でバイオフィルムを形成させた。簡潔に言うと、ヒドロキシアパタイトディスク（直径１．２５ｃｍ、表面積２．７±０．２ｃｍ2、Ｃｌａｒｋｓｏｎ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｗｉｌｌｉａｍｓｐｏｒｔ，ＰＡ）に、フィルタ滅菌した清澄なヒト全唾液（ｓＨＡ）を塗布した［Ｘｉａｏ Ｊ ｅｔ ａｌｏ，２０１２］。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）を、１％（重量／体積）グルコースを含むＵＦＴＹＥ培地中で中間指数期まで増殖させた（３７℃、５％ＣＯ2）。各ｓＨＡディスクに、１％（重量／体積）スクロースを含むＵＦＴＹＥ培地１ｍｌ当たり１０5ＣＦＵの活発に増殖するＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）細胞を播種し、１９時間にわたり３７℃および５％ＣＯ2で播種した。播種前に、このｓＨＡディスクを３０分にわたりＧＦＰ－ＰＧ１溶液（１０ｕｇ）で局所的に処理した。共焦点撮像により、３Ｄバイオフィルム構造へのＧＦＰ－ＰＧ１処理の阻害効果を観測した。簡潔に言うと、２．５μＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識デキストランコンジュゲート（１０ｋＤａ；６４７／６６８ｎｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してＥＰＳを標識し、細菌細胞を２．５μＭ ＳＹＴＯ９（４８５／４９８ｎｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）で染色した。２０×（開口数、１．００）水浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ５顕微鏡を使用して撮像を実施した。励起波長は７８０ｎｍであり、ＳＹＴＯ ９用の発光波長フィルタは４９５／５４０ ＯｌｙＭＰＦＥＣ１フィルタであり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７用のフィルタはＨＱ６５５／４０Ｍ－２Ｐフィルタであった。共焦点画像シリーズを各選択位置での光学切断により作成し、ｚ－シリーズ走査のステップサイズは２μｍであった。Ａｍｉｒａ ５．４．１ソフトウェア（Ｖｉｓａｇｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、バイオフィルム構造の３Ｄレンダリングを作成した［Ｘｉａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｋｏｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．２０１０］。
ｓＨＡディスク上で１９時間にわたりＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）により形成されたバイオフィルムへのＰＧ１の効果を調べるために、本発明者らは、最大６０分にわたるバイオフィルムと１）コントロール、２）ＥＰＳ分解酵素のみ、３）ＰＧ１のみ、または４）ＰＧ１およびＥＰＳ分解酵素とのインキュベーション後に、タイムラプス共焦点顕微鏡を使用してＥＰＳ－マトリックスの３Ｄ構造およびインサイチュでの細胞生存率を調べた。ここで使用したＥＰＳ分解酵素はデキストラナーゼおよびムタナーゼであり、これらは、α－１，６グルコシド連結およびα－１，３グルコシド連結を加水分解することにより、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）由来のＥＰＳを消化し得た［Ｈａｙａｃｉｂａｒａ ｅｔ ａｌ．２００４］。ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）から産生されたデキストラナーゼをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から商業的に購入し、トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）から産生されたムタナーゼはＤｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｈ．Ｂｏｗｅｎ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）により親切にも提供された。デキストラナーゼおよびムタナーゼを、バイオフィルムへの適用の前に５：１の比で混合した［Ｍｉｔｓｕｅ Ｆ．Ｈａｙａｃｉｂａｒａ ｅｔ ａｌ．２００４］。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識デキストランコンジュゲートを使用してＥＰＳ－マトリックスを標識し、ＳＹＴＯ ９およびＰＩを使用して生存細胞および死滅細胞を標識した。バイオフィルムを、０分、１０分、３０分および６０分に共焦点蛍光撮像を使用して調べてＡＭＩＲＡ／ＣＯＭＳＴＡＴ／ＩｍａｇｅＪ分析にかけた。共焦点画像の各シリーズにおけるＥＰＳマトリックス、生存細胞および死滅細胞の総バイオマスを、ＣＯＭＳＴＡＴおよびＩｍａｇｅＪを使用して定量した。各時点での生存細菌の総細菌に対する比率を算出し、（０分での生存細胞に対する）生存細胞の生存率をプロットした。時点０分での生存細胞の初期数を１００％であると見なした。時点０分と比較することによりパーセント生存率を決定した。
微生物アッセイ
選択した時点（１９時間）でバイオフィルムを除去し、超音波処理によりホモジナイズし、既に説明されている微生物分析にかけ［Ｘｉａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｋｏｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．２０１０］、本発明者らの超音波処理手順は細菌細胞を死滅させず、さらに最適な分散および最大の回復可能なカウントをもたらす。バイオフィルム懸濁液のアリコートを連続的に希釈し、自動Ｅｄｄｙ Ｊｅｔ Ｓｐｉｒａｌ Ｐｌａｔｅｒ（ＩＵＬ，ＳＡ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を使用して血液寒天プレート上に蒔いた。一方、定量ＰＣＲと組み合わせたプロピジウムモノアジド（ＰＡＭ）（ＰＭＡ－ｑＰＣＲ）を使用して、Ｋｌｅｉｎ ＭＩ他［Ｋｌｅｉｎ ＭＩ ｅｔ ａｌ．２０１２］が説明しているようにＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）細胞生存率を分析した。ＰＭＡおよびｑＣＰＲの組み合わせにより膜がインタクトな細胞（即ち生存細胞）のみが定量され、なぜならば、死滅細胞のＤＮＡおよび細胞外ＤＮＡに架橋したＰＭＡはこのＤＮＡを改変し、この抽出されたＤＮＡのＰＣＲ増幅を阻害するからである。簡潔に言うと、バイオフィルムペレットをＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）５００μｌで再懸濁させた。ピペットを使用して、このバイオフィルム懸濁液を１．５ｍｌ微量遠心管に移し、次いでＰＭＡと混合した。このバイオフィルム懸濁液にＰＭＡ（２０％ジメチルスルホキシド中に２０ｍＭ；Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）１．５μｌを添加した。この管を、時折混合しつつ室温で５分にわたり暗所にてインキュベートした。次に、試料を３分にわたり光に当てた（６００－Ｗハロゲン光源）。光誘起架橋の後、このバイオフィルム懸濁液を遠心分離し（１３，０００ｇ／１０分／４℃）、上清を廃棄した。ペレットをＴＥ １００μｌで再懸濁させ、続いてリゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌストック）１０．９μｌおよびムタニライシン（ｍｕｔａｎｙｌｙｓｉｎ）（５Ｕ／μｌストック）５μｌと共にインキュベートした（３７℃／３０分）。次いで、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。１つの試料当たりのゲノムＤＮＡ １０ピクトグラムおよび陰性コントロール（ＤＮＡなし）を、ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎスーパーミックス（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＣＡ）およびＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）特異的プライマー（１６Ｓ ｒＲＮＡ）によるＭｙｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システムにより増幅させた［Ｋｌｅｉｎ ＭＩ ｅｔ ａｌ ２０１０］。
統計解析
データを平均±標準偏差（ＳＤ）で表す。全てのアッセイを、少なくとも２つの別個の実験にて２回反復で実施した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、試験とコントロールとの間でペアワイズ比較を行った。現在の研究での全ての統計的試験のために選択した有意水準はＰ＜０．０５であった。
下記の実施例は、本発明のある特定の実施形態を説明するために提供される。この実施例は本発明を限定することを決して意図されていない。
実施例Ｉ
トランスプラストミック系統の作製およびキャラクタリゼーション
全ての融合タグ（ＣＴＢ、ＰＴＤ、プロテグリン、レトロサイクリン）をＮ末端で緑色蛍光タンパク質（ｓｍＧＦＰ）に融合させて、これらの融合タグの効率および特異性を評価した。参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／１０１，３８９号明細書で説明されているように、これらの融合タンパク質をコードする融合構築物を葉緑体形質転換ベクター中にクローニングし、次いで、このベクターを使用して目的の植物を形質転換させた。ＧＦＰ融合タンパク質を発現する植物を作製するために、微粒子銃粒子送達系を使用してタバコ葉緑体を形質転換させた。図１Ｂで見られるように、各タグ融合ＧＦＰは同一の調節配列（光により調節されるｐｓｂＡプロモーターおよび５’ＵＴＲ）により駆動され、転写されたｍＲＮＡは３’ｐｓｂＡ ＵＴＲにより安定化される。ｐｓｂＡ遺伝子は最も高度に発現される葉緑体遺伝子であり、従って、本発明者らの研究室ではｐｓｂＡ調節配列を導入遺伝子発現に使用する［７、３４］。発現カセットの葉緑体ゲノムへの組込みを容易にするために、この発現カセットには、天然の葉緑体ゲノム配列と同一である２つの隣接配列（イソロイシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｒｎＩ）遺伝子およびアラニル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｒｎＡ）遺伝子）が隣接する。選択培地から現れた新芽を、ｔｒｎＩおよびｔｒｎＡスペーサー領域での導入遺伝子カセットの特異的組込みに関して調べ、次いでサザンブロット分析により各植物細胞（非形質転換の野生型葉緑体ゲノムの欠如）中の全ての葉緑体ゲノムの形質転換を確認した。そのため、融合タンパク質の抽出前に、全てのＧＦＰ発現カセットの安定した組込みおよび導入遺伝子による葉緑体ゲノムのホモプラスミーを確認した。加えて、ＵＶ光下で緑色蛍光を可視化することにより、ＧＦＰ発現を表現型的に確認した。次いで、確認したホモプラスミー系統を自動型温室に移して栽培してバイオマスを増加させた。
各ＧＦＰタグ付き植物葉材料のバイオマスをスケールアップするために、各ホモプラスミー系統を、温度および湿度を制御した温室中で生育した。完全に成長した成熟葉を深夜に収穫して、光により調節される調節配列により駆動されるＧＦＰ融合タンパク質の蓄積を最大化させた。重量ベースで融合タンパク質の含有量をさらに増加させるために、凍結した葉を真空下で－４０℃にて凍結乾燥させた。タンパク質の濃縮効果に加えて、凍結乾燥により、室温で１年を超えて植物中で発現される治療用タンパク質の貯蔵寿命が増加した［Ｄａｎｉｅｌｌ ｅｔ ａｌ ２０１５；２０１６］。従って、本研究では、ＧＦＰ融合タグタンパク質を発現する、凍結乾燥させて粉末化した植物細胞を、マウスへの経口送達に使用した。
トランスプラストミックタバコからのＧＦＰ融合抗微生物ペプチドの発現および精製
ＧＦＰ融合抗微生物ペプチドＲＣ１０１およびＰＧ１を発現するタバコ葉を温室から収穫し、その後にタンパク質の抽出および精製のために凍結乾燥させた。デンシトメトリに基づいて、ＧＦＰ－ＲＣ１０１の平均発現レベルは粗抽出物中の総タンパク質の８．８％であることが分かり、ＧＦＰ－ＰＧ１の発現は総タンパク質の３．８％であった。発現レベルの差違は以前に報告されたものと同様であった（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ，２０１５）。
浮遊性およびバイオフィルム形成性の両方のＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対する殺菌活性を試験するために、異なる抗微生物ペプチド（ＲＣ１０１およびＰＧ１）に融合したＧＦＰの精製を行った。異なるＧＦＰ融合体を発現する凍結乾燥タバコ材料を抽出およびその後の下流処理（図８を参照されたい）に使用して、完成した精製済産物を得、その後に定量してＧＦＰ融合ペプチドの濃度を決定した。精製したＧＦＰ－ＲＣ１０１およびＧＦＰ－ＰＧ１の定量をウエスタンブロットおよび自然ＧＦＰ蛍光法の両方で行い、精製済ＧＦＰ－ＲＣ１０１は、凍結乾燥葉材料１ｇｍ当たりＧＦＰ １６２４μｇ（ＲＣ１０１ペプチド１１６μｇ）の平均収量で９４％の平均純度を示す（図１Ａおよび図１Ｂ）。ＧＦＰ－ＰＧ１では、両方の方法（図１Ｃおよび図１Ｄ）は凍結乾燥葉材料１ｇｍ当たりＧＦＰ ５８．８μｇ（ＰＧ１ペプチド４．２μｇ）の平均収量で１７％の平均純度を示す。純度の差違は、以前の研究で見られたようにＧＦＰに融合したタグの種類の差違に起因する可能性がある（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ ２０１５，Ｓｋｏｓｙｒｅｖ ｅｔ ａｌ ２００３）。植物抽出物からの精製済ＧＦＰ－ＲＣ１０１および精製済ＧＦＰ－ＰＧ１の富化倍数はそれぞれ１０．６および４．５であった。ウエスタンブロットはまた、６～８ｎｇの範囲のＧＦＰのローディングで、５４ｋＤａ ＧＦＰ二量体と共に、単量体断片に対応する２７ｋＤａでのＧＦＰ標準も示す。ＧＦＰ－ＲＣ１０１ウエスタンブロットでは、融合体の単量体形態および二量体形態に対応する２９ｋＤａおよび５８ｋＤａの断片が明瞭に見える（図１Ａ）。このことは、ＧＦＰの二量体を形成する能力に起因する可能性がある（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，２００７）。ＧＦＰ－ＰＧ１のウエスタンブロット（図１Ｄ）は、既に説明されているように共精製されている可能性がある他の非特異的植物タンパク質に結合したＧＦＰ－ＰＧ１により引き起こされた移動性シフトに起因する可能性がある４０ＫＤａ断片と共に、２９ｋＤａ単量体を明瞭に示す（Ｍｏｒａｓｓｕｔｔｉａ ｅｔ ａｌ ２００２）。ＧＦＰ－ＲＣ１０１およびＧＦＰ－ＰＧ１の自然蛍光（図１Ｂおよび図１Ｄ）は、これらの一部が２７ｋＤａ ＧＦＰ標準サイズ未満で見える多量体バンドを示し、これは、以前の研究で説明されているように各ＧＦＰ断片で電気泳動移動性シフトを引き起こすカチオン性ペプチドへのＧＦＰの融合に起因する可能性がある（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２０１１）。
ＡＭＰの抗菌活性
本発明者らは、図２（Ａ～Ｅ）に示すように用量反応時間死滅研究を使用してＧＦＰ－ＰＧ１の抗微生物活性を最初に調べた。ＧＦＰ－ＰＧ１は、バイオフィルムを形成することおよびう蝕を引き起こすことが立証されている病原体であるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）に対する強力な抗菌活性を示し、低濃度にて１時間以内にこの細菌細胞を急速に死滅させる（図２Ａ）。ＧＦＰ－ＰＧ１はまた、初期口腔生着菌ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびアクチノミセス・ネスルンディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）も死滅させたが、試験した濃度ではカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対して示す抗真菌活性は限定されていた（図２Ｅ）。タイムラプス共焦点撮像は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の生存率が非処理コントロール（図３Ｂ）と比較して図３Ａで示すように１０分という早さで影響を受けることを示す。ＳＥＭ撮像から、細胞内成分の放出および不規則な細胞形態を引き起こすＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）膜表面の破壊が明らかになり、非処理の細菌は、いかなる目に見える細胞溶解または残骸もなくインタクトで滑らかな表面を示した（図３Ｃ）。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するＧＦＰ－ＰＧ１の抗微生物効力が示されたことから、本発明者らは、この抗微生物ペプチドのバイオフィルム形成を予防するまたは既に形成されたバイオフィルムを破壊する可能性を調べた。
ＡＭＰによるバイオフィルム開始の阻害
病原性口腔バイオフィルムの形成の予防は困難であり、なぜならば薬物は局所適用の後で治療効果を発揮する必要があるからである。ＧＦＰ－ＰＧ１がバイオフィルムの開始を妨害し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、唾液が塗布されたアパタイト（ｓＨＡ）表面（歯代用物）を３０分にわたるＧＦＰ－ＰＧ１の単回局所処理で処理し、次いでう蝕原性（スクロースリッチ）条件下にて、活発に増殖するＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）細胞と共にインキュベートした。本発明者らは、ＧＦＰ－ＰＧ１処理ｓＨＡ表面上でのＥＰＳ－マトリックスの最小限の蓄積を伴うＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）によるバイオフィルム形成の実質的な障害を観察した（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ほとんどの接着細胞集団はコントロールと比較してほぼ生存不能であり（図４Ａ）、このことから、局所的で短期間の暴露にもかかわらず、バイオフィルム開始へのＧＦＰ－ＰＧ１の強力な効果が実証された。
ＥＰＳ分解酵素と一緒でのまたはＥＰＳ分解酵素なしでのＡＭＰによる、既に形成されたバイオフィルムの破壊
表面上で形成されたバイオフィルムの破壊は困難である。う蝕原性バイオフィルムの破壊は特に困難であり、なぜならば、病原性細菌（例えばＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））の集団に絡み付いて保護する周囲の菌体外多糖（ＥＰＳ）リッチマトリックスに起因して薬物はこの集団に到達できないことが多いからである［Ｂｏｗｅｎ ａｎｄ Ｋｏｏ，２０１１］。ＥＰＳ分解酵素（例えばデキストラナーゼおよびムタナーゼ）は、う蝕原性バイオフィルムのマトリックスの消化を助ける可能性がある。本発明者らは、細胞生存率に影響を及ぼすことなくＥＰＳマトリックス破壊に必要なデキストラナーゼおよび／またはムタナーゼを最初に最適化した（データは示さない）。図５に示すように、デキストラナーゼおよびムタナーゼの組み合わせは、ＥＰＳ（赤色）と、細菌細胞集団（緑色）および「非被覆」細胞（矢印を参照されたい）の間の「オープンスペース」（矢印を参照されたい）とを消化し得る。そのため、ＧＦＰ－ＰＧ１とＥＰＳ分解酵素との組み合わせは、全体的な抗バイオフィルム効果を相乗的に増強する。
この概念を調査するために、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）バイオフィルムをｓＨＡ表面上で予め形成させ、単独または組み合わせのいずれかでＧＦＰ－ＰＧ１およびＥＰＳ分解酵素（Ｄｅｘ／Ｍｕｔ）により局所的に処理した。タイムラプス共焦点撮像および定量的コンピュータ解析を行い、ＥＰＳ－マトリックス分解およびバイオフィルム内での生存／死滅細菌細胞を分析した（図６Ａ）。この酵素－ペプチドの組み合わせは、ＧＦＰ－ＰＧまたはＤｅｘ／Ｍｕｔ単独のいずれかと比較した場合に、細菌死滅を増加させつつＥＰＳ－マトリックスの６０％超を分解した。これらの発見を、コロニー形成単位を測定することによる標準的な培養アッセイによりさらに検証した。Ｄｅｘ／Ｍｕｔと組み合わせたＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）バイオフィルムに対するＰＧの抗菌活性は、いずれか一方のみと比べて有意に増強された。Ｄｅｘ／Ｍｕｔのみの局所暴露はバイオフィルム細胞生存率への影響を示さなかったが、ＧＦＰ－ＰＧ１のみは限定された死滅活性を示した（図６Ｂ）。まとめると、データは、確立されたバイオフィルムに対するＧＦＰ－ＰＧ－１の抗微生物効果を相乗的に増強する、この組み合わされたアプローチの可能性を実証する（図６Ｃ）。
ヒト歯周細胞による、様々なタグと融合したＧＦＰの取込み
精製済ＧＦＰ融合タンパク質は、ヒト培養細胞（例えばＨＰＤＬＳ、ＭＭＳ、ＳＣＣ－１、ＧＭＳＣ、ＡＧＫおよび骨芽細胞（ＯＢＣ））と共にインキュベートした場合に興味深い結果を示した。各細胞系統について１つの代表的な画像のみを提示するが、取込み研究を３回反復で実施し、共焦点顕微鏡下で少なくとも１０～１５個の画像を記録した。融合タグがないと、試験したいずれのヒト細胞系統にもＧＦＰが侵入しなかった。ＣＴＢ－ＧＦＰおよびＰＴＤ－ＧＦＰの両方は、これらの局在化パターンは異なっていたが、試験した細胞型全てに効率的に侵入した。ＣＴＢ－ＧＦＰとのインキュベーションでは、ＧＦＰシグナルは、ＨＰＤＬＳＣおよびＭＭＳＣの末梢、ＳＳＣ－１中の、ＡＧＫ中の、ＯＢＣ中の一様に小さい細胞質点、およびＧＭＳＣ中の大きな細胞質フォーカス（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｏｃｕｓ）に主に局在化した。ＰＴＤ－ＧＦＰを、ＭＭＳＣ中の小さい細胞質フォーカスとして、ＨＰＤＬＳＣ中の、ＧＭＳＣ中の、ＡＧＫ中の、ＯＢＣ中の様々なサイズの細胞質点として、ならびにＳＳＣ－１細胞の細胞質および末梢の両方で観測された。ＰＧ１－ＧＦＰは、試験したヒト細胞全てへの侵入において最も効率的なタグであり、なぜならば、ＧＦＰは、あらゆる他の融合タンパク質と比べて１０倍低い濃度で局在化し得たからである。ＰＧ１－ＧＦＰは、もっぱらＨＰＤＬＣＳ細胞、ＳＣＣ－１細胞、ＧＭＳＣ細胞およびＡＧＫ細胞で細胞質局在化を示し、ＭＭＳＣでは末梢およびサイトゾルの両方に局在化したが、ＯＢＣの末梢にのみ局在化した。ＲＣ１０１－ＧＦＰは、ＳＳＣ－１、ＧＭＳＣ、ＡＧＫおよびＯＢＣでは局在化したが、ＨＰＤＬＳＣでの局在化はごくわずかであり、ＭＭＳＣ細胞では検出不能であった。
考察および結論
う蝕原性口腔バイオフィルムの構築は、細胞外ＥＰＳマトリックスが発達するにつれて、病原性細菌が表面（歯）上にどのように蓄積されるかの主な例である。う蝕原性バイオフィルム形成の予防は、局所処置による歯表面上での細菌蓄積の破壊を必要とする。クロルヘキシジン（ＣＨＸ）は局所抗微生物療法の「ゴールドスタンダード」と見なされている（Ｆｌｅｍｍｉｇ ａｎｄ Ｂｅｉｋｌｅｒ ２０１１；Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ ２０１１；Ｃａｕｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ ２００１）。ＣＨＸは唾液中のミュータンス連鎖球菌レベルを効率的に抑制するが、ＣＨＸは歯の汚れおよび歯石形成等の有害な副作用を有し、日々の予防または治療的使用には推奨されていない（Ａｕｔｉｏ－Ｇｏｌｄ ２００８）。代替として、いくつかの抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）が開発されて口腔細菌に対して試験されており、（浮遊細胞に対する効果は減少しているが）バイオフィルムに対して潜在的な効果を示している（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１２により概説されている）。残念ながら、これらの研究のほとんどは、臨床的に使用されているような局所処置レジメンではなくＡＭＰへの連続的な長期バイオフィルム暴露（数時間）を使用して抗バイオフィルム効率を試験した。さらに、合成ＡＭＰは製造コストが高く、歯科用途には負担しきれないものになっている。ここで、本発明者らは植物により産生されるＡＭＰが、歯代用物表面の単回で短期の局所処理により、バイオフィルム形成の制御において強力な効果を示すことを示した。
発生したう蝕原性バイオフィルムは、バイオフィルムの処理および除去を非常に困難にするＥＰＳマトリックスに埋まった細菌を特徴とする（Ｐａｅｓ Ｌｅｍｅ ｅｔ ａｌ ２００６；Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ ２０１３）。ＥＰＳリッチマトリックスは、微生物の付着、凝集および保護ならびに拡散の妨害を容易にする（Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ ２０１３；Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ ２０１０。ＥＰＳマトリックスはバイオフィルム中に空間的な且つ微小環境的な不均一性（病原体の増殖および抗菌剤に対する保護を局所的に調節する）を作り、歯の表面上でのバイオフィルムの強固な付着を保証する高度に粘着性の足場も作る（Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ ２０１０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。ＣＨＸは、形成されたう蝕原性バイオフィルムに対する効果がはるかに低い（Ｈｏｐｅ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，２００４；Ｖａｎ Ｓｔｒｙｄｏｎｃｋ ｅｔ ａｌ ２０１２；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＥＰＳは、不溶性（α１、３連結グルコースの含有量が高い）グルカンと可溶性（大部分がα１，６連結グルコース）グルカンとの混合物から主に構成されている（Ｂｏｗｅｎ ａｎｄ Ｋｏｏ ２０１１）。そのため、バイオフィルムを破壊してう蝕を予防するためにＥＰＳマトリックス分解性のデキストラナーゼまたはムタナーゼ（真菌由来）を使用する可能性が探求されており、市販の店頭薬口腔洗浄薬（例えばＢｉｏｔｅｎｅ ＰＢＦ）に含まれている。しかしながら、酵素単独の局所適用は、抗菌作用の欠如および口腔中での酵素活性の低下におそらく起因して（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ ２０００）、臨床的に中程度の抗バイオフィルム／抗う蝕効果を生じている（Ｈｕｌｌ １９８０）。興味深いことに、近年のインビトロ研究は、融合したデキストラナーゼおよびムタナーゼから構成されているキメラグルカナーゼは、どちらかの酵素単独と比べて歯垢－バイオフィルムの破壊でより効果的であることを示している（Ｊｉａｏ ｅｔ ａｌ ２０１４）。しかしながら、おそらく費用および製剤化と関連する困難さに起因して、抗微生物剤と両方のＥＰＳ－マトリックス分解酵素とを組み合わせて単回の治療システムにするアプローチは未だ開発されていない。本研究では、本発明者らは、ＰＧ１はマトリックス分解酵素と共に相乗的に且つ効率的に作用してう蝕原性バイオフィルムを破壊することを実証している。この実行可能で効果的な局所用抗バイオフィルムアプローチは、ＥＰＳ消化酵素と組み合わされた抗微生物ペプチドを使用して同時にバイオフィルムマトリックスの足場を破壊し且つ埋まっている細菌を死滅させ得る。
ＧＦＰ融合体を伴うプロテグリンによる高レベルの抗微生物活性の保持は、バイオフィルムの破壊を超えて、口腔の健康を増進するための多くの臨床適用への扉を開く。バイオフィルムの破壊に加えて、歯肉組織での創傷治癒の増強は重要な臨床的必要性である。本発明者らは近年、プロテグリンおよびレトロサイクリンの両方がヒト肥満細胞に侵入して創傷治癒プロセスにおける重要なステップである脱顆粒を誘発し得ることを報告した（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ ２０１５）。従って、抗微生物ペプチドであるプロテグリンおよびレトロサイクリンは、バイオフィルム中の細菌の死滅で重要な役割を果たし且つ肥満細胞の脱顆粒を介して創傷治癒を開始する。加えて、細胞付着を増強し、骨形成、血管新生、骨再生、骨芽細胞または内皮細胞の分化を刺激するためには、成長ホルモンまたは他のタンパク質を効率的に送達することが重要である。既に同定された細胞透過性ペプチドにはいくつかの制限がある。ＣＴＢは、偏在するＧＭ１受容体を介して全ての細胞型に侵入し、これにはＣＴＢの五量体形態が必要される。その一方で、ＰＴＤは免疫細胞に侵入しない（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ ２０１６）。
本研究では、本発明者らは、ＰＧ１－ＧＦＰまたはＲＣ１０１－ＧＦＰの歯周細胞および歯肉細胞に侵入する能力を試験した。ＰＧ１－ＧＦＰは歯周または歯肉のヒト細胞への侵入において最も効率的なタグであり、なぜならば、ＧＦＰシグナルはあらゆる他の融合タンパク質と比べて１０倍低い濃度であっても検出され得たからである。細胞内局在化に多少の変化があったが、ＰＧ１－ＧＦＰはＨＰＤＬＳＣ、ＳＣＣ－１、ＧＭＳＣ、ＡＧＫ、ＭＭＳＣおよびＯＢＣに効率的に侵入した。対照的に、ＲＣ１０１－ＧＦＰはＳＣＣ－１、ＧＭＳＣ、ＡＧＫおよびＯＢＣに侵入したが、ＨＰＤＬＳＣ細胞およびＭＭＳＣ細胞でのＲＣ１０１－ＧＦＰの局在化は乏しかった、または検出不能であった。従って、本研究は、口腔の健康を増進するための骨芽細胞、歯根膜細胞、歯肉上皮細胞または線維芽細胞への薬物の送達でのプロテグリンの新規の役割を同定している。
機械的粉砕により、植物細胞中で合成されたタンパク質薬物を放出することが実行可能であり、チューインガムに埋め込まれた凍結乾燥植物細胞に生体カプセル封入された（ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）タンパク質薬物は、より長い持続期間のために、それらの緩慢な且つ徐放のための薬物送達を理想的な様式を提供する。これにより、現在の口腔リンス製剤の主要な制限（歯肉／歯の表面上での抗微生物剤の接触の短い持続期間）が克服される。
局所適用を超えて、植物細胞中で発現されたプロテグリンと融合したタンパク質薬物は、非侵襲的様式で歯肉組織のより深い組織へと経口送達されて患者の服薬遵守を増加させ得る。植物に生体カプセル封入されたタンパク質薬物は、その効力を失うことなく室温で何年にもわたり貯蔵され得る（Ｓｕ ｅｔ ａｌ ２０１５；Ｄａｎｉｅｌｌ ｅｔ ａｌ ２０１６）。現在のタンパク質薬物の高コストは、法外に高価な発酵、精製、低温での輸送／貯蔵、短い品質保証期間および滅菌送達方法に起因する。

これらの課題は全て、口腔の健康を増進するためにこの新規の薬物送達概念を使用することで解消される可能性がある。タンパク質薬物の製造のための植物細胞の近年のＦＤＡ承認（Ｗａｌｓｈ ２０１４）は、この新規の概念の臨床上での進歩にとって良い兆候である。
参考文献
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Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＢＷ，Ｈｅ Ｙ，Ｒｅｎ Ｙ，Ｚｅｒｄｏｕｍ Ａ，Ｌｉｂｅｒａ ＭＲ，Ｓｈａｒｍａ ＰＫ，ｖａｎ Ｗｉｎｋｅｌｈｏｆｆ ＡＪ，Ｎｅｕｔ Ｄ，Ｓｔｏｏｄｌｅｙ Ｐ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｉ ＨＣ，Ｂｕｓｓｃｈｅｒ ＨＪ．２０１５．Ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｂｉｏｆｉｌｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｃｅ ｔｏ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ３９：２３４－２４５．
Ｌａｋｓｈｍｉ ＰＳ，Ｖｅｒｍａ Ｄ，Ｙａｎｇ Ｘ，Ｌｌｏｙｄ Ｂ，Ｄａｎｉｅｌｌ Ｈ．２０１３．Ｌｏｗ ｃｏｓｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｃａｐｓｕｌｅｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，ｂｉｏ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．８：ｅ５４７０８．
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Ｌｅｅ ＳＢ，Ｌｉ Ｂ，Ｊｉｎ Ｓ，Ｄａｎｉｅｌｌ Ｈ．２０１１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｒｅｔｒｏｃｙｃｌｉｎ－１０１ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ－１ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．９：１００－１５．
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実施例ＩＩ
ＡＭＰ、バイオフィルム分解酵素およびこれらの融合タンパク質を発現する葉緑体ベクターの作製
抗微生物剤が、微生物の集団に絡み付いて保護する周囲の細胞外マトリックス内に存在するこの集団に到達しないことが多いことから、バイオフィルム関連感染の効果的な処置は、問題がある。さらに、バイオフィルム関連の口腔疾患および口腔の健康の維持に対する新規の治療法の開発は、対費用効果が高く且つ容易に利用可能であることが必要である。
試薬の継続的な供給を確保するために、デキストラナーゼ／ムタナーゼおよびプロテグリン／レトロサイクリンを、タバコおよび他の植物（例えばレタス）の葉緑体中で独立しておよび融合タンパク質として発現させる。タンパク質が産生されて低コスト精製戦略で使用されるだろう。タバコ植物は百万もの種子を生じ、そのため生産を容易にスケールアップさせることが実行可能である。１エーカーのタバコから最大４０メートルトンのバイオマスが生産され、ＡＭＰ、酵素およびこれらをコードする融合構築物の低コストで大規模な生産が容易になる。別のアプローチでは、これらのタンパク質をレタス等の食用植物中で産生させる。
いくつかのデキストラナーゼ（Ｄｅｘ）およびムタナーゼ（Ｍｕｔ）が真菌および細菌から単離されてそれらの酵素活性について特徴付けられている。最適なデキストラナーゼ酵素およびムタナーゼ酵素は、ヒト口腔環境に適した酵素特性を有するべきである。短期間の口腔処置に基づくと、両方のタイプのＥＰＳ（デキストランおよびムタン）に対する、歯垢－バイオフィルムへの強い結合／保持特性および触媒活性が非常に望ましい。市販のデキストラナーゼ含有口腔洗浄薬（例えばＢｉｏｔｅｎｅ）に添加される酵素は、真菌（ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種およびケトミウム・エラチカム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｅｒｒａｔｉｃｕｍ））に主に由来する。しかしながら、真菌性デキストラナーゼは、細菌性デキストラナーゼ（３５～４０℃）と比べて高い温度最適条件（５０～６０℃）を示す。さらに、細菌性デキストラナーゼは口腔温度（約３７℃）でより安定で且つより効果的であり、う蝕予防に適している。近年、アルスロバクター種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）株Ａｒｔｈ４１０由来のデキストラナーゼは、真菌性デキストラナーゼと比較した場合に、口腔内でおよびう蝕原性バイオフィルム中で見出される最適な温度（３５～４５℃）およびｐＨ値（ｐＨ５～７）で優れたデキストラン分解特性を示した。加えて、細菌性デキストラナーゼの局所適用は、真菌性デキストラナーゼ（ｄｅｘｔｒａｎｓｅ）と比べてインビボでのう蝕の低減で、より効果的である。同様に、パエニバチルス種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）株ＲＭ１由来の細菌性ムタナーゼは、３分にわたるバイオフィルムとの最初のインキュベーションに続いて、このムタナーゼの除去後であっても、６時間のインキュベーションによりバイオフィルムが効果的に分解されたこと示す。
また、他の微生物種と比較した場合に、ＲＭ１ムタナーゼはバイオフィルム分解特性の増強を示す。特に、真菌性酵素はグリコシル化を必要とし、このグリコシル化は葉緑体中での真菌性酵素の発現を妨げる。
加えて、ヒト系での糖タンパク質の免疫原性は、さらなる規制上の懸念を生じさせる場合がある。従って、本発明は、葉緑体中での発現のための細菌性デキストラナーゼおよび細菌性ムタナーゼの使用を含む。
葉緑体中でのＡｒｔｈ４１０デキストラナーゼおよびＲＭ１ムタナーゼタンパク質の産生を増加させるために、両方の配列は葉緑体発現にコドン最適化されている。図９Ａおよび図９Ｂを参照されたい。
レトロサイクリンおよびプロテグリン。
ＡＭＰの合成を最大化し且つ毒性を低減するために、図１０に示すようにプロテアーゼ開裂部位により分離された、ＰＧ１またはＲＣ１０１の１０個のタンデムリピートを用いる。発現遺伝子の各コピーに関して、ＰＧ１またはＲＣ１０１の１０個の機能的コピーが作られる。この目的のために、本発明者らはタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼを選択しており、このプロテアーゼは、高い特異性および７個のアミノ酸からなる短い開裂部位を有する。あるいは、フリン開裂部位も用い得る。このベクターを、バイオフィルム分解酵素をコードする核酸を含むようにも操作し得る。このコード領域を、ＡＭＰを発現するために利用されるプロモーター下で発現させ得る、または第２のプロモーター領域に作動可能に連結されたベクターに連結し得る。バイオフィルム分解酵素コード配列はまた、この酵素の放出を容易にするためにＴＥＶプロテアーゼ開裂部位も含み得る。このアプローチにより、化学的開裂方法と比べて安全できれいな選択肢が提供される。最も重要なことに、融合タンパク質中の個々のＰＧ１ペプチドは開裂前に二次構造体を形成せず、そのため宿主産生系にとって致命的であり得る機能的ペプチドの蓄積が回避される。実施例Ｉで開示された方法を使用して、開裂したＰＧ１／ＲＣ１０１、バイオフィルム分解酵素またはこれらの融合タンパク質の抗微生物活性を使用してバイオフィルムを分解し得る。
上記で述べたように、ＡＭＰ／バイフィルム分解酵素をコードする配列を、ｐＬＤ等の葉緑体形質転換ベクターへの挿入前に任意選択でコドン最適化する。葉緑体形質転換は二重相同組換え事象に依存する。従って、葉緑体ベクターは、目的の異種タンパク質をコードする発現カセットに隣接する、葉緑体ゲノムに対する相同領域を含み、この相同領域は、いかなる機能的遺伝子も破壊することなく葉緑体ゲノムの遺伝子間スペーサー領域への導入遺伝子カセットの挿入を容易にする。任意の遺伝子間スペーサー領域を使用して導入遺伝子を挿入する可能性があるが、導入遺伝子の組込みに最も一般的に使用される部位は（ｒｒｎオペロン中の）ｔｒｎＩ－ｔｒｎＡ遺伝子間の転写的に活性な遺伝子間領域であり、葉緑体ゲノムのＩＲ領域内に位置する（図１０）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と葉緑体との間での同様のタンパク質合成機序により、コドン最適化の効率を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でも評価し得、次いで植物を作製し得る。両方の系を、ＡＭＰ、バイオフィルム分解酵素またはこれらの融合タンパク質の発現ならびにＡＭＰまたは酵素活性の精製および評価に使用する可能性がある。
精製戦略
疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ；ＴＯＳＯＨ Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ｍ）を使用して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合したＰＧ１を精製し得る。ＧＦＰはＨＩＣに選択的に結合し、Ｒｃ１０１／ＰＧ１を＞９０％の純度まで促進する。高価なＨＩＣクロマトグラフィー法の使用にもかかわらず、回収率は非常に悪い（＜２０％）。この問題に取り組んで収率を高めるために、エラスチン様バイオポリマーを有するＰＧ１の１０個のタンデムリピート（ＧＶＧＶＰ（配列番号１１）；図１０）をベクターに遺伝子操作する。このバイオポリマーは、このバイオポリマーの逆転移温度（Ｔｔ）を超えて温度が上昇すると溶液から沈殿するという独特な熱的性質を有する。ＧＶＧＶＰは、Ｔｔ未満では可溶性単量体状態に留まり、Ｔｔを超えると不溶性凝集体を形成する。可溶性状態から不溶性状態へのこの相転移は溶液の温度を変更することにより可逆的であり、これによりタンパク質精製が容易になる。その後、融合タンパク質を、Ｔｔ未満に冷却することにより再び可溶化させて、図１１に示すように共沈殿したあらゆる不溶性混入物を除去する。加熱（３７℃）および冷却（４℃）のプロセスは逆転移サイクリング（ＩＴＣ）として既知であり、３～５回のラウンドのＩＴＣを実施することにより高度に精製されたタンパク質が得られる（＞９８％純度、図１１）。
代替アプローチでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現のためにシグナルペプチドをデキストラナーゼまたはムタナーゼと融合させ、このシグナルペプチドにより酵素が細胞外培地に分泌される。加えて、分泌タンパク質は、この分泌タンパク質がジスルフィドイソメラーゼ、フォルダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）およびシャペロンが存在する周辺質環境を通過する最中に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の２つの膜系を通過するはずである。従って、分泌タンパク質の正確な折り畳みおよびジスルフィド結合形成が酵素により容易になり、タンパク質の生物学的活性が増強される（ＡＭＰにとって理想的）。この産生戦略の別の利点は、組換えタンパク質の安定性の増強に役立つ、培養培地中での低レベルのタンパク質分解活性である。この分泌タンパク質のシグナル配列は輸送プロセスの最中に開裂され、天然タンパク質にとって真のＮ末端が作られる。タンパク質を細胞外培地へと移動させるのに有用ないくつかの分子（例えばＴＡＴ依存性経路、ＳＲＰ依存性経路またはＳｅｃＢ－依存性経路）が存在する。しかしながら、独立して機能するのではなく、様々な経路が互いに密接に相互作用する。ＳＲＰ依存性経路およびＳｅｃＢ依存性経路の両方が単一タンパク質の標的化で一緒に機能し得る。また、Ｓｅｃ欠乏条件下では、Ｓｅｃ経路の基質の移行をＴＡＴ系により救出し得る。
多数のシグナル配列の中でも、外膜プロテインＡ（ＯｍｐＡ）およびＳｅｑＸ（ｌａｃＺ由来）シグナルペプチドは優れた輸送機能を示し、それぞれ最大４ｇ／Ｌおよび１ｇ／Ｌで細胞外培地中に融合タンパク質を輸送し得る。従って、これらのシグナル配列を、Ａｒｔｈ ４１０ ＤｅｘおよびＲＭ１ Ｍｕｔの細胞外環境への効率的な輸送に使用する。培地に輸送されたデキストラナーゼおよびムタナーゼの蓄積をタンパク質定量および酵素アッセイで測定する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのこれらのタンパク質の発現に成功している。図１２に示すウエスタンブロット結果を参照されたい。こられの配列を含む葉緑体ベクターをタバコまたはレタスの葉に打ち込み、デキストラナーゼ（ｅｘｔｒａｎａｓｅ）／ムタナーゼ／ＡＭＰタンパク質の大規模産生が可能な植物を作製する。大規模バイオマスの収穫後、葉を凍結乾燥させて室温で貯蔵する。別のアプローチでは、臨床的に証明された抗う蝕化合物（例えばフッ化物２５０ｐｐｍ）および広域殺菌剤クロルヘキシジン０．１２％を含有させて、これらの薬剤が効力を増大させるかどうかを評価し得る。
ＡＭＰ－酵素の組み合わせは、インビボでのう蝕原性バイオフィルム形成および空洞形成の発生を効率的に妨げる。さらに、ＡＭＰ－酵素融合タンパク質は、抗微生物療法およびう蝕予防に関して現在の化学療法よりも優れているように見える。
既に述べたように、有効なＡＭＰ－酵素（独立してまたは組み合わせで）を、大規模ＧＬＰ産生および安定性の評価のために、内在性レタス調節エレメントの制御下にてレタス葉緑体中で発現させ得る。重要な利点は、法外に高価な精製プロセスの排除による、より低い製造コストである。ＡＭＰ／酵素を発現する凍結乾燥葉材料を、これらの完全性および機能性を維持しつつ数ヶ月または数年にわたり周囲温度で貯蔵し得る。図１３を参照されたい。長期貯蔵に加えて、タンパク質薬物濃度の増加および微生物混入の低減は他の利点である。凍結乾燥後のレタス葉は、新鮮な葉と比較した場合にタンパク質薬物濃度の２０～２５倍の増加を示しており、それにより経口送達または局所送達に使用される材料の量が低減された。凍結乾燥の後、植物材料をチューインガムに組み込んで、この植物材料に含まれるバイオフィルム分解組成物を送達し得る。
ＡＭＰ／酵素またはこれらの融合体を製造する工程を図１２に示す。本発明のタンパク質の発現に有用なレタス葉緑体ベクターは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／０５９，３７６号明細書で既に説明されている。レタス葉緑体中でのプロインスリンの様な治療用タンパク質の場合には総タンパク質の最大７０％の発現レベルが、この系を使用して達成され得る。
食用植物中で発現されたＡＭＰ－酵素は、口腔疾患の処置ならびにう蝕形成の予防および阻害に使用される場合に好ましくは経口的に（局所的に）送達される。口腔内での植物細胞の溶解を増強するために、ＡＭＰ／酵素発現植物細胞を、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３９６，３８２号明細書で説明されている細胞壁分解酵素を発現する植物細胞と任意選択で混合する。
チューインガム錠調製物を図１４に示す。目的のタンパク質の例としてＧＦＰを使用した場合には、このデータはチューインガム錠に組み込まれ得るＧＦＰの量を示す。ＧＦＰレベルを蛍光およびウエスタンブロットの両方で評価した。結果を図１５に示す。本発明者らは、図１６に示すチューイングシミュレータおよび人工唾液を用いて、ＧＦＰを含むガム錠からのＧＦＰ放出動態を評価した。図１７は、組換えレタス中に存在する様々な量のＧＦＰを含むガム錠からの経時的な放出動態を説明するグラフを示す。
これらのデータから、本発明のＡＭＰ－酵素融合タンパク質を含むガム錠は、細菌の死滅および歯垢またはバイオフィルムの分解を達成するのに適した期間にわたり活性物質を送達することが明らかである。しかしながら、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ等の口腔リンスも用いて本発明のＡＭＰ－酵素融合タンパク質または組み合わせを送達し得る。図１８は、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅと混合された本発明の酵素を含む粗抽出物が、調製するのに非常にコストが嵩む、商業的に製造されて精製された酵素と同じくらい効果的であることを示す。このデータから、様々な組み合わせ（異なる比率および量の両方）での二重酵素が用量依存的にＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）バイオフィルムのバイオマスを著しく低減したことが明らかである。様々な組み合わせの中でも２５Ｕ Ｄｅｘおよび５Ｕ Ｍｕｔ（５：１，Ｄｅｘ：Ｍｕｔ比）が最も効果的であり、１２０分以内に総バイオマスの８０％超が分解された。さらなる実験により、５：１のＤｅｘ／Ｍｕｔ活性比が、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅによる、ＥＰＳ分解および細菌の死滅の両方に関して最高の有効性を示すことを確認した。エキサイティングなことに、二重酵素による前処置により、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅに媒介される細菌の死滅の有効性が劇的に増強された（ビヒクルによる前処置およびＬｉｓｔｅｒｉｎｅに対して＞３対数減少）。第３の酵素の含有により、全体的な抗バイオフィルム活性がさらに増強された。さらに、混合種モデルからの結果は、酵素による前処置の後にＬｉｓｔｅｒｉｎｅを使用した場合に、二重酵素の組み合わせが全体的な抗菌活性を増強し得るだけでなく、（共生／プロバイオティックＳ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）の割合を増加させつつ）Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）優性の標的化減少も誘導し得ることも示した。従って、酵素＋Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ戦略は、病原体Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）を選択的に標的とし、その一方で共生Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）の割合を増加させ、それにより混合種バイオフィルム内の微小生態学的不均衡を予防すべきである。
ＡＭＰは、抗微生物活性に加えて、先天免疫および創傷治癒を刺激する能力を有する。このＡＭＰの抗微生物特性に加えてこのＡＭＰの新規の肥満細胞宿主防御特徴を利用することにより、このＡＭＰの臨床的応用が拡大される。バイオフィルムに関連するう蝕は、局所用治療薬の開発の最も挑戦的なモデルである。開発された場合には、そのような局所薬剤送達を他のバイオフィルムに容易に適合させ得、なぜならば、マトリックス形成は多くの他のバイオフィルム関連疾患での薬効を妨げるからである。マトリックスは全てのバイオフィルムに固有であり、そのため、この適用は口腔内のバイオフィルムを超える。本明細書で説明されているバイオフィルム阻害組成物を、疾患の処置のために人体に挿入されたコーティングステント、人工関節、インプラント、バルブおよび他の医療機器でも用い得る。
上記で論じたように、ＡＭＰ／酵素またはこれらを発現する葉を、口腔疾患の処置のためのこれらの効果的な局所適用のためにチューインガムに組み込み得る。本組成物を、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ等の口腔リンスにも組み込み得る。既に述べたように、そのようなガムまたは口腔リンスに、フッ化物またはＣＨＸ等の他の抗う蝕剤を含めてもよい。
下記の表２中の参考文献は、様々な生物学的供給源に由来する多くの異なるムタナーゼを説明する。これらの参考文献のそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2023082027000002
本発明の実施で有用なさらなるバイオフィルム分解酵素コード配列として下記が挙げられるがこれらに限定されない。
Ｉ）パエニバチルス・ヒュミカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｕｍｉｃｕｓ）ＮＡ１１２３
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＢ４８９０９２も参照されたい
Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ４８９０９２
全長：１，１４６
質量（Ｄａ）：１１９，００７
参考文献：Ｏｔｓｕｋａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５ Ｊａｎ；５９（１）：２８－３６．
２．パエニバチルス・ヒュミカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｕｍｉｃｕｓ）ＮＡ１１２３由来のムタナーゼのタンパク質配列
＞ｇｉ｜２５７１５３２６５｜ｄｂｊ｜ＢＡＩ２３１８７．１｜ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍｕｔａｎａｓｅ［Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｕｍｉｃｕｓ］
MRIRTKYMNWMLVLVLIAAGFFQAAGPIAPATAAGGANLTLGKTVTASGQSQTYSPDNVKDSNQGTYWESTNNAFPQWIQVDLGASTSIDQIVLKLPSGWETRTQTLSIQGSANGSTFTNIVGSAGYTFNPSVAGNSVTINFSAASARYVRLNFTANTGWPAGQLSELEIYGATAPTPTPTPTPTPTPTPTPTPTPTVTPAPSATPTPTPPAGSNIAVGKSITASSSTQTYVAANANDNNTSTYWEGGSNPSTLTLDFGSNQSITSVVLKLNPASEWGTRTQTIQVLGADQNAGSFSNLVSAQSYTFNPATGNTVTIPVSATVKRLQLNITANSGAPAGQIAEFQVFGTPAPNPDLTITGMSWTPSSPVESGDITLNAVVKNIGTAAAGATTVNFYLNNELAGTAPVGALAAGASANVSINAGAKAAATYAVSAKVDESNAVIEQNEGNNSYSNPTNLVVAPVSSSDLVAVTSWSPGTPSQGAAVAFTVALKNQGTLASAGGAHPVTVVLKNAAGATLQTFTGTYTGSLAAGASANISVGSWTAASGTYTVSTTVAADGNEIPAKQSNNTSSASLTVYSARGASMPYSRYDTEDAVLGGGAVLRTAPTFDQSLIASEASGQKYAALPSNGSSLQWTVRQGQGGAGVTMRFTMPDTSDGMGQNGSLDVYVNGTKAKTVSLTSYYSWQYFSGDMPADAPGGGRPLFRFDEVHFKLDTALKPGDTIRVQKGGDSLEYGVDFIEIEPIPAAVARPANSVSVTEYGAVANDGKDDLAAFKAAVTAAVAAGKSLYIPEGTFHLSSMWEIGSATSMIDNFTVTGAGIWYTNIQFTNPNASGGGISLRIKGKLDFSNIYMNSNLRSRYGQNAVYKGFMDNFGTNSIIHDVWVEHFECGMWVGDYAHTPAIYASGLVVENSRIRNNLADGINFSQGTSNSTVRNSSIRNNGDDGLAVWTSNTNGAPAGVNNTFSYNTIENNWRAAAIAFFGGSGHKADHNYIIDCVGGSGIRMNTVFPGYHFQNNTGITFSDTTIINSGTSQDLYNGERGAIDLEASNDAIKNVTFTNIDIINAQRDGVQIGYGGGFENIVFNNITIDGTGRDGISTSRFSGPHLGAAIYTYTGNGSATFNNLVTRNIAYAGGNYIQSGFNLTIK（配列番号１２）
３．パエニバチルス・ヒュミカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｕｍｉｃｕｓ）ＮＡ１１２３由来のｍＲＮＡの配列
＞ｇｉ｜２５７１５３２６４｜ｄｂｊ｜ＡＢ４８９０９２．１｜Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｕｍｉｃｕｓ ｍｕｔ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍｕｔａｎａｓｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ
1 aaaggaggat cgccaaccaa tcatcccagc aaagaaggtg atggcagccc aagaattgaa
61 agcgctttga atttggaata tacggatttg gccgacctgc tgattcagtc gtattcaagc
121 gattatgccg cgaaccaatc gaacccgagg aggactataa tgcgtatccg cactaaatat
181 atgaactgga tgttggtgct cgtcctgatc gccgccggct tcttccaggc tgccggcccc
241 atcgctcccg ccaccgctgc aggaggcgcg aatctgacgc tcggcaaaac cgtcaccgcc
301 agcggccagt cgcagacgta cagccccgac aatgtcaagg acagcaatca gggaacttac
361 tgggaaagca cgaacaacgc cttcccgcag tggatccaag tcgaccttgg cgccagcacg
421 agcatcgacc agatcgtgct caagcttccg tccggatggg agactcgtac gcaaacgctc
481 tcgatacagg gcagcgcgaa cggctcgacg ttcacgaaca tcgtcggatc ggccgggtat
541 acattcaatc catccgtcgc cggcaacagc gtcacgatca acttcagcgc tgccagcgcc
601 cgctacgtcc gcctgaattt cacggccaat acgggctggc cagcaggcca gctgtcggag
661 cttgagatct acggagcgac ggcgccaacg cctactccca cgcctactcc aacaccaacg
721 ccaacgccaa caccaacgcc aacccctaca gtaacccctg cgccttcggc cacgccgact
781 ccgactcctc cggcaggcag caacatcgcc gtagggaaat cgattacagc ctcttccagc
841 acgcagacct acgtagctgc aaatgcaaat gacaacaata catccaccta ttgggaggga
901 ggaagcaacc cgagcacgct gactctcgat ttcggttcca accagagcat cacttccgtc
961 gtcctcaagc tgaatccggc ttcggaatgg gggactcgca cgcaaacgat ccaagttctt
1021 ggagcggatc agaacgccgg ctccttcagc aatctcgtct ctgcccagtc ctatacgttc
1081 aatcccgcaa ccggcaatac ggtgacgatt ccggtctccg cgacggtcaa gcgcctccag
1141 ctgaacatta cggcgaactc cggcgcccct gccggccaga ttgccgagtt ccaagtgttc
1201 ggcacgccag cgcctaatcc ggacttgacc attaccggca tgtcctggac tccgtcttct
1261 ccggtcgaga gcggcgacat tacgctgaac gccgtcgtca agaacatcgg aactgcagct
1321 gcaggcgcca cgacggtcaa tttctacctg aacaacgaac tcgccggcac cgctccggta
1381 ggcgcgcttg cggcaggagc ttctgcaaat gtatcgatca atgcaggcgc caaagcagcc
1441 gcaacgtatg cggtaagcgc caaagtcgac gagagcaacg ccgtcatcga gcagaatgaa
1501 ggcaacaaca gctactcgaa cccgactaac ctcgtcgtag cgccggtgtc cagctccgac
1561 ctcgtcgccg tgacgtcatg gtcgccgggc acgccgtcgc agggagcggc ggtcgcattt
1621 accgtcgcgc ttaaaaatca gggtacgctg gcttccgccg gcggagccca tcccgtaacc
1681 gtcgttctga aaaacgctgc cggagcgacg ctgcaaacct tcacgggcac ctacacaggt
1741 tccctggcag caggcgcatc cgcgaatatc agcgtgggca gctggacggc agcgagcggc
1801 acctataccg tctcgacgac ggtagccgct gacggcaatg aaattccggc caagcaaagc
1861 aacaatacga gcagcgcgag cctcacggtc tactcggcgc gcggcgccag catgccgtac
1921 agccgttacg acacggagga tgcggtgctc ggcggcggag ctgtcctgag aacggcgccg
1981 acgttcgatc agtcgctcat cgcttccgaa gcatcgggac agaaatacgc cgcacttccg
2041 tccaacggct ccagcctgca gtggaccgtc cgtcaaggcc agggcggtgc aggcgtcacg
2101 atgcgcttca cgatgcccga cacgagcgac ggcatgggcc agaacggctc gctcgacgtc
2161 tatgtcaacg gaaccaaagc caaaacggtg tcgctgacct cttattacag ctggcagtat
2221 ttctccggcg acatgccggc tgacgctccg ggcggcggca ggccgctctt ccgcttcgac
2281 gaagtccact tcaagctgga tacggcgttg aagccgggag acacgatccg cgtccagaag
2341 ggcggtgaca gcctggagta cggcgtcgac ttcatcgaga tcgagccgat tccggcagcg
2401 gttgcccgtc cggccaactc ggtgtccgtc accgaatacg gcgctgtcgc caatgacggc
2461 aaggatgatc tcgccgcctt caaggctgcc gtgaccgcag cggtagcggc cggaaaatcc
2521 ctctacatcc cggaaggcac cttccacctg agcagcatgt gggagatcgg ctcggccacc
2581 agcatgatcg acaacttcac ggtcacgggt gccggcatct ggtatacgaa catccagttc
2641 acgaatccca atgcatcggg cggcggcatc tccctgagaa tcaaaggaaa gcttgatttc
2701 agcaacatct acatgaactc caacctgcgt tcccgttacg ggcagaacgc cgtctacaaa
2761 ggctttatgg acaatttcgg cactaattcg atcatccatg acgtctgggt cgagcatttc
2821 gaatgcggca tgtgggtcgg cgactacgcc catactcctg cgatctatgc gagcgggctc
2881 gtcgtggaaa acagccgcat ccgcaacaat cttgccgacg gcatcaactt ctcgcaggga
2941 acgagcaact cgaccgtccg caacagcagc atccgcaaca acggcgatga cggcctcgcc
3001 gtctggacga gcaacacgaa cggcgctccg gccggcgtga acaacacctt ctcctacaac
3061 acgatcgaga acaactggcg cgcggcggcc atcgccttct tcggcggcag cggccacaag
3121 gctgaccaca actacatcat cgactgtgtc ggcggctccg gcatccggat gaatacggtg
3181 ttcccaggct accacttcca gaacaacacc ggcatcacct tctcggatac gacgatcatc
3241 aacagcggca ccagccagga tctgtacaac ggcgagcgcg gagcgattga tctggaagct
3301 tccaacgacg cgatcaaaaa cgtcaccttc accaacatcg acatcatcaa tgcccagcgc
3361 gacggcgttc agatcggcta tggcggcggc ttcgagaaca tcgtgttcaa caacatcacg
3421 atcgacggca ccggccgcga cgggatatcg acatcccgct tctcgggacc tcatcttggc
3481 gcagccatct atacgtacac gggcaacggc tcggcgacgt tcaacaacct ggtgacccgg
3541 aacatcgcct atgcaggcgg caactacatc cagagcgggt tcaacctgac gatcaaatag
3601 gctgcaaaaa aaaggaagct cctcggagct tccttttttt（配列番号１３）
ＩＩ）パエニバチルス・カードラノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＭＰ－１
１．パエニバチルス・カードラノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＭＰ－１由来のムタナーゼの一般情報
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＨＱ６４０９４４
Ｇｅｎｂａｎｋ ＨＱ６４０９４４；全長：１，２６１；質量（Ｄａ）：１３１，６３１
参考文献：Ｐｌｅｓｚｃｚｙｎｓｋａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２０１２ Ｎｏｖ；８６（１）：６８－７４．
２．パエニバチルス・カードラノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＭＰ－１由来のムタナーゼのタンパク質配列
＞ｇｉ｜３１５２０１２６１｜ｇｂ｜ＡＤＴ９１０６３．１｜ａｌｐｈａ－１，３－ｇｌｕｃａｎａｓｅ［Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ］
MRNKYVTWTLALTMLFSSFFLAVGPNKVVHAAGGTNLALGKNVTASGQSQTYSPNNVKDSNQSTYWESTNNAFPQWIQVDLGATTSIDQIVLKLPAGWGTRTQTLAVQGSTDGSSFTNIVGSAGYVFNPAVANNAVTINFSAASTRYVRLNVTANTAWPAAQLSEFEIYGAGGTTTPPTTPAGTYEAESAALSGGAKVNTDHTGYTGTGFVDGYWTQGATTTFTANVSAAGNYDVTLKYANASGSAKTLSVYVNGTKIRQTTLASLANWDTWGTKVETLSLNAGNNTIAYKYEASDSGNVNIDSIAVAPSTSTPVDPEPPITPPTGSNIAIGKAISASSNTQAFVAANANDNDTNTYWEGGAASSTLTLDLGANQNVTSIVLKLNPSSAWSTRTQTIQVLGHNQSTTTFSNLVSSQSYTFNPATGNSVTIPVTATVKRLQLSITANSGSGAGQIAEFQVYGTPAPNPDLTITGMSWTPASPIETDAVTLNATVKNSGNADAPATTVNFYLNNELVGSSPVGALAAGASSTVSLNVGTKTAATYAVSAKVDESNSIIEQNDANNSYTNASSLVVAPVASSDLVGATTWTPSTPVAGNAIGFMVNLKNQGTIASASGAHGITVVVKNAAGAALQSFSGTYSGAIAAGASVNVTLPGTWTAVNGSYTVTTTVAVDANELTNKQGNNVSTSNLVVYAQRGASMPYSRYDTEDATRGGGATLQTAPTFNQAQIASEASGQSYIALPSNGSSAQWTVRQGQGGAGVTMRFTMPDSTDGMGLNGSLDVYVNGVKVKTVSLTSYYSWQYFSGDMPGDAPSAGRPLFRFDEVHWKLDTPLQPGDTIKIQKGNGDSLEYGIDFLEIEPVPTAIAKPANSLSVTEYGAVANDGQDDLAAFKATVTAAVAAGKSVYIPAGTFNLSSMWEIGSANNMINNITITGAGYWHTNIQFTNPNAAGGGISLRISGQLDFSNVYMNSNLRSRYGQNAIYKGFMDNFGTNSKIHDVWVEHFECGMWVGDYAHTPAIYATGLVVENSRIRNNLADGINYSQGTSNSIVRNSSIRNNGDDGLAVWTSNTNGAPAGVNNTFSYNTIENNWRAGGIAFFGGGGHKADHNLIVDTVGGSGIRMNTVFPGYHFQNNTGITFSDNTLINTGTSQDLYNGERGAIDLEASNDAIKNVTFTNIDIINTQRDAIQFGYGGGFENIVFNNININGTGLDGVTTSRFAGPHKGAAIYTYTGNGSATFNNLTTSNVAYPGLNFIQQGFNLVIQ（配列番号１４）
３．パエニバチルス・カードラノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＭＰ－１由来のｍＲＮＡの配列
1 atgcgcaaca agtatgtcac atggacgctc gccctgacga tgctattttc gagcttcttc
61 cttgcagtag gtcccaacaa ggtcgttcac gcagcaggcg gaacgaattt agcgctcggc
121 aaaaacgtta cggcaagcgg ccaatcgcaa acgtatagtc ccaacaatgt aaaagacagc
181 aatcaatcga cgtactggga aagcacgaac aatgcattcc cgcaatggat tcaagtagac
241 ttaggcgcaa cgacgagcat tgaccaaatc gtactgaagc tgcccgctgg atggggtacg
301 cgtacgcaaa cgttagctgt tcaaggaagc acggacggtt cctcgttcac gaatatcgtg
361 ggctccgcag gctatgtatt taatcctgct gttgccaata acgccgttac gattaacttc
421 tctgctgcaa gcacgcgtta tgttcgtctg aacgtaacag cgaacacggc ttggccagca
481 gcgcagctgt ccgaattcga gatttatggc gctggcggca cgacgacgcc tccaacaacg
541 ccagcaggca catatgaagc tgaatccgca gcattgtccg gcggtgcgaa agtgaacacg
601 gatcataccg gctacacggg tacgggcttt gttgacggct actggacaca aggcgcgaca
661 acgacgttca cggctaacgt gtccgcagct ggcaactatg acgttacatt gaaatatgcc
721 aacgcaagcg gcagtgccaa gacgctaagc gtttacgtca acggcacgaa gattcgccag
781 acgacgctgg caagcctggc aaactgggac acttggggca cgaaggttga gacgctgagc
841 ttgaatgccg gcaataatac gattgcatac aagtatgagg ctagcgactc gggcaacgtg
901 aatatcgact ccattgccgt ggcgccatcg acttcgacac cggtagatcc agaaccgccg
961 atcacgccgc caacgggcag caatatcgca atcggcaaag cgatcagcgc atcttcgaat
1021 acgcaagcat tcgtagctgc caacgcgaac gataacgata cgaacacgta ctgggaaggc
1081 ggagctgcat cgagcacgct gacgctggat cttggcgcga accaaaatgt aacctcgatc
1141 gtgctgaagc tgaatccttc ttcggcatgg agcacgcgta cgcaaacgat ccaagtgctt
1201 ggccacaacc aaagcacgac gacgttcagc aatctggtat cttcgcaatc gtatacgttc
1261 aatcctgcaa cgggcaactc cgtgacgatt ccggttacgg caacagttaa gcgcttgcag
1321 ctgagcatta cggcgaactc gggttccggc gctggtcaaa ttgcggaatt ccaagtgtat
1381 ggaacgccgg caccaaaccc agacctgacg atcacaggca tgtcctggac gcctgcttcg
1441 ccaattgaaa cggatgcagt tacgctgaat gcaacggtta aaaacagcgg aaatgcagac
1501 gctcctgcaa cgacggtaaa cttctacctg aacaatgagc tcgtaggctc ctcgccagtt
1561 ggcgcacttg ctgcaggcgc ttcctcgacg gtttcgctga atgttggtac gaaaacggct
1621 gcaacttatg cagttagcgc gaaagtcgat gagagcaatt cgattatcga gcaaaatgat
1681 gcgaacaaca gttatacgaa cgcatcctcg ctcgtcgtcg ctcctgtcgc aagctctgac
1741 ttggttggcg cgacgacgtg gacgcctagc acgccggttg ccggcaatgc aattggcttc
1801 atggtaaatc ttaaaaacca aggaacgatt gcatctgcaa gcggcgcgca tggcattaca
1861 gttgtcgtga aaaatgccgc aggcgctgcg ctccaatcgt tcagcggcac ctacagcgga
1921 gcaatcgcag ctggcgcatc cgttaacgta accctgccag gtacgtggac ggctgtgaat
1981 ggcagctaca cggtaacgac aacggttgct gtcgatgcta acgagctgac gaacaaacaa
2041 gggaacaacg taagcacttc gaacctcgtt gtttatgcac aacgtggcgc aagcatgcct
2101 tacagccgtt atgacacgga agacgctaca cgtggcggcg gtgcaacgct gcaaaccgca
2161 ccaaccttca accaagcgca aatcgcttcg gaagcatccg gacaaagcta tatcgcgctg
2221 ccttcgaacg gctcctccgc acaatggacg gtccgtcaag gacaaggcgg agctggcgtt
2281 acgatgcgct tcacgatgcc ggattcgact gacggtatgg gtttgaacgg ttcgctcgac
2341 gtttatgtca acggcgttaa agtaaaaacg gtatcgctca cgtcctacta cagctggcag
2401 tatttctcgg gcgatatgcc tggcgatgcg ccgtccgctg gccgtccgtt gttccgcttt
2461 gacgaagtac actggaagct tgacacgcct cttcaaccag gcgacacgat caaaatccaa
2521 aaaggcaacg gagatagcct ggaatacggc attgacttcc tcgaaatcga gccggttcca
2581 acagcaatcg ctaaacctgc caactcgctt tccgttacgg agtatggcgc tgtagcaaac
2641 gatggccaag acgaccttgc cgcattcaaa gcaacggtta cggctgcagt tgctgctggc
2701 aaatccgttt acattcctgc tggcacgttc aatctgagca gcatgtggga aatcggatcg
2761 gctaacaaca tgatcaacaa cattacgatt acaggcgcag gctactggca tacgaacatt
2821 caattcacga atccgaatgc agcaggcggc ggcatttcgc tccggatttc cggacagctt
2881 gatttcagca atgtttacat gaactccaac ctgcgttcgc gttatggtca aaatgcgatt
2941 tacaaaggct tcatggacaa cttcggcaca aactccaaaa tccatgacgt atgggttgag
3001 cacttcgagt gcggcatgtg ggtaggcgat tacgcgcata cgccagcgat ctatgcaacg
3061 ggtcttgtcg ttgaaaacag ccggattcgc aacaaccttg cagacggcat caactactcg
3121 caaggcacga gcaattcgat cgtacgcaac agcagtatcc gcaataacgg tgatgacggt
3181 ctggcggttt ggacgagtaa cacgaatggc gcgccagcag gcgtgaacaa cacgttctcg
3241 tacaacacga tcgaaaacaa ctggcgtgca ggcggtatcg cattcttcgg cggcggcggc
3301 cacaaggctg accacaacct gatcgttgat acggttggcg gctccggcat ccggatgaac
3361 acggtattcc caggctacca cttccaaaac aacacgggta ttacgttctc cgacaacacg
3421 ctgatcaaca caggcacaag ccaagatttg tacaacggcg agcgcggtgc gatcgatctc
3481 gaagcatcga acgatgcaat caagaacgtc acgttcacga acatcgacat catcaacacc
3541 cagcgcgatg cgatacaatt cggctacggc ggcggattcg agaacatcgt atttaacaac
3601 attaacatta acggtacggg gcttgacggc gttacaacct cacggtttgc tggaccgcat
3661 aaaggtgctg caatctacac gtacacgggc aatggctctg caacgttcaa taacctgacg
3721 acgagcaacg tggcatatcc aggcttgaat ttcattcagc aaggctttaa tctggtgatc
3781 cagtag（配列番号１５）
ＩＩＩ）パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種株ＲＭ１．
１．ムタナーゼの一般情報
Ｇｅｎｂａｎｋ Ｅ１６５９０；全長：１，２９１；質量（Ｄａ）：１３５ｋＤ
参考文献：Ｓｈｉｍｏｔｓｕｕｒａ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８ Ｍａｙ；７４（９）：２７５９－６５．
２．パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種株ＲＭ１由来のムタナーゼのタンパク質配列
Figure 2023082027000003
 ムタナーゼＲＭ１の推定アミノ酸配列。シグナルペプチド領域に下線を引き、リンカー領域を四角に囲む。矢印は、このタンパク質のＮ末端ドメイン用の開裂部位を示す。ＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ１６５９０として登録された。（配列番号１６）
３．パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種株ＲＭ１由来のｍＲＮＡの配列
1 cccgggtacc agacctatcg ggaaaaacgc gagcggccct tcgcgcctta tgcgctacgg
61 acggtgctgg cgggcggttt gtttttcatc atcattcccc tgatgatcta cacggcatcg
121 tatatcccgt ttttgctcgt gccgggtccc ggacacgggt tgaaagacgt cgtctccgcc
181 cagaagttca tgttcaatta tcatagccgg cttaacgcca cccacccatt ctcgtcgctg
241 tggtgggagt ggcctctcat ccgcaagccg atctggtatt acggagccgc ggaattggcg
301 ccgggaaaaa tggcgagcat cgtgggcatg ggcaatccgg cggtgtggtg gacgggaacg
361 attgcggtaa tcgcggccct tcgctcggcc tggaagaagc gggaccggag catgaccgtc
421 gtcttcgttg gaatcgcctc gtcttatctt ccgtgggttt tcgtatccag actcaccttt
481 atttatcact ttttcgcttg cgttccgttt ctcgttcttt gcatcgttta ttggattcga
541 aaaatggaat agcgtaagcc gggatatcgg attgcgacgc tcctttacgc aggcgcggtt
601 ctggtgctgt tcattttgtt ttacccgatt ttgtcgggga ccgaaataga cgtttcttac
661 gcggaccgcg ttctgaagtg gttcggcggg tggatttttc acgggtaagc gagcgttgga
721 agcaaggaag ggaaggaaga cgagcgtctc cttcccgaaa tccatccaat atcttgaaat
781 tgcatacatt tttcgtaaga ttgcttctta tctgtctccc tcccctgttc ttataatggg
841 ggtatcccaa cgaaaggagg gtttgtaagc gctgtcagcs tgtttgccga aagttctcgc
901 atttgctgac ctacactttg aggaggagga atttaatgcg ctgcaaattt gtcgcatggt
961 cgcttgttac agccatgctg atggccagtt tgctgacggc tgtaggaccg ttcggccccg
1021 cttccgccgc gggaggaccg aatctgacgc cgggcaaacc cattacggcg agcggccaat
1081 cccaaaccta cagccctcag aacgtaaaag acggcaatca aaatacgtat tgggaaagca
1141 cgaacaacgc gttcccgcaa tggattcaag tggatttggg cgcaagcacg ggcatcgacc
1201 aaattgtgct gaagctgccc gcaagctggg aagcgcgcac gcaaacgctg gccgttcaag
1261 gcagcttgaa cggttcgacg ttcacggaca ttgtcggctc cgccaattat gtattcagtc
1321 cgtctgtcgg gaacaacacg gttacgatca actttaccgc gaccagcacg cgctacgtgc
1381 gcttgtatgt aacggccaac acgggctggc cggcggcgca gctgtccgaa ttcgaaattt
1441 acggctccgg cgaccagacg ccggcgcctg atacgtatca agccgaatcc gcggctctgt
1501 ccggcggcgc gaaagtcaac acggaccatg ccggatatat cggcacgggc tttgttgacg
1561 gttactggac gcaaggcgcg acgacgacct tttcggtcaa cgcgccgacg gcgggcaact
1621 acgatgtaac gctgaggtac ggcaacgcaa ccggcagcaa caaaacggta agcctctacg
1681 tcaatggagc gaagattcgc cagaccacgc tgcccagcct gcctaactgg gattcatgga
1741 gcagcaagac ggagacgctt aacctgaatg caggcagcaa caccattgcg tacaaatacg
1801 acccgggcga ttccggcaac gtcaatcttg accaaatcac ggtcgaagcg tcgacttcaa
1861 cgcctactcc tactccatcc cctactccta cacctacgcc aacgccgacg cctacgccta
1921 cgcctacacc cacacctact ccgaccccga cgcctacgcc tacacctaca cctacaccta
1981 cgccgacgcc tcctccgggc ggcaacatcg ccatcggcaa atcgatttcc gcatcctccc
2041 acacgcagac gtacgttgcg gagaacgcga acgataacga tgtcaacacg tactgggaag
2101 gcggcggcaa tccgagcacg ctgacgctcg atctcggagc gaactacaat attacgtcca
2161 tcgtgctgaa gctgaacccg tcctcgatat gggctgcgcg tacgcaaacg attcaagtgc
2221 tcggacacga tcagaacacg acgaccttca gcaatctggt ctcggcgaaa tcgtactcgt
2281 tcgatccggc ctccggcaat actgtgacca ttccggttac ggcgacggtg aaacgtttgc
2341 agttgaacat tacgtcgaac tccggcgccc cggccggaca agtcgccgag ttccaggtgt
2401 tcggcacgcc tgcgccgaat ccggacctga cgattaccgg catgtcctgg tcgccttctt
2461 ctccggttga gaccgacgcc attacgctaa acgcaacggt gaagaacaac gggaatgcca
2521 gcgccgcggc gaccaccgtc aatttctacc tgaacaacga gctggcgggt tccgcgccgg
2581 tagccgcgct ggcggcaggc gcttcggcaa cggtgccgct gaatgtcggc gcgaaaaccg
2641 ccgcgacata cgcggtcggc gccaaagtag acgagagcaa cgcggtcatc gagctgaacg
2701 agtcgaacaa cagctacacg aatccggctt cactcgttgt ggcccccgtt tccagctcgg
2761 atctggtggg cacggtttcg tggacgccga gcactccgat tgccaacaat gccgtttctt
2821 ttaacgtaaa tcttaaaaat caaggaacga ttgcttccgc cggcgggtct cacggcgtga
2881 cggtcgtgct taaaaatgct tccggttcga ccgttcaaac gttcagcggt tcctataccg
2941 gcagcctggc tccgggagcg tccgtcaaca tcacccttcc ggggacctgg acggcggcag
3001 ccggcagcta cacggtaacg gccaccgttg cggcagacgc caacgaactt ccgatcaagc
3061 aagccaacaa cgcgaacacc gcaagcctga ccgtatattc cgcccgcggc gcgagcatgc
3121 cgtacagccg gtatgacacc gaggacgcca ccctcggcgg cggcgccacg ctgaagtccg
3181 cgccgacatt cgatcaggcg cttacggcat cggaagccac cggccaactc tatgcggcgc
3241 tgccctcgaa cggctcctat cttcaatgga ccgtcagaca gggtcagggc ggcgcaggcg
3301 tgacgatgag atttacgatg cccgactcgg cggacggcat gggattaaac ggttcgctag
3361 acgtttacgt caacggcacc aaagtcaaaa ccgtatcgct gacctcctac tacagctggc
3421 agtatttctc gggcgatatg cccggagacg ctcccagcgc gggccgtccg ctcttccgct
3481 ttgacgaagt gcactggaag ctggatactc cgctcaaacc cggagacacg attcgcatcc
3541 agaagaacaa cggcgacagc ctggaatacg gtgtcgactt tattgaaatc gaaccggttc
3601 cggctgcgat ctcccgtccg gccaactcgg tttccgtaac ggattacggc gctgtgccga
3661 acgacggaca ggacgatctc accgccttta aagccgccgt aaacgcggcg gtcgcatccg
3721 acaagatctt gtacattccg gaaggaacgt tccacctcgg caacatgtgg gagatcggtt
3781 ccgtcagcaa catgatcgat cacattacga ttacgggagc cggtatctgg tatacgaaca
3841 tccagtttac caacgccaat ccggcgtccg gcggcatctc gctccggatt acgggcaagc
3901 ttgatttcag caacgtgtac ctcaactcca atttgcggtc gcggtatggt caaaatgcgg
3961 tttacaaagg ctttatggac aacttcggga ccaattccgt catccgcgac gtctgggtcg
4021 agcacttcga atgcggcttc tgggtcgggg actacgggca tacgccggcg atccgcgcga
4081 gcgggctgct gattgaaaac agccgaatcc gcaacaacct ggccgatggc gtcaacttcg
4141 cccaagggac cagcaattcg accgtacgca acagcagcct gcgcaacaac ggcgacgacg
4201 cccttgccgt atggacgagt aatacgaacg gcgcgcccga aggcgtaaac aataccttct
4261 cgtacaacac catcgaaaac aactggcgcg cgggaggcat cgccttcttc ggaggaagcg
4321 gacacaaggc cgaccacaac tacatcgtcg actgcgtcgg cggttccggc atccggatga
4381 acaccgtgtt ccccggatac cacttccaga acaataccgg cattgtgttc tcggacacga
4441 ccatcgtcaa ctgcggcacg agcaaagacc tatacaacgg cgaacgcggc gccatcgatc
4501 tggaagcttc gaacgacgcc atccggaacg tgacgtttac caacatcgat attatcaact
4561 ctcagcgcga tgcgatccag ttcggttacg gcggcggctt caccaacatc gtgttcaaca
4621 acatcaacat taacggaacc ggtcttgacg gcgtaaccac ctcgcggttc tcgggaccgc
4681 atctgggcgc ggcgatcttc acctataccg gcaacggctc cgccacgttc aacaatctga
4741 ggaccagcaa tatcgcttac cccaatctgt attacatcca gagcgggttc aatctgatca
4801 tcaataatta gatatctggg cccgtctgcg ggggaggaac tcttcggagc tcgaattcgt
4861 aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca
4921 tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat
4981 taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa ctgtcgtgcc agctgcatta
5041 atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcsg tttkcgtatt gggcgccctt（配列番号１７）
ＩＶ）トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）（ＣＣＭ Ｆ－４７０）
１．トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来のムタナーゼの一般情報
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ８ＷＺＭ７も参照されたい 全長：６３５
質量（Ｄａ）：６７，７２６
最終変更：２００２年３月１日－ｖ１
Ｃｈｅｃｋｓｕｍ：ｉＢＢ０Ｄ８６４Ｅ２Ｆ４３２Ｃ５８
２．トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来のムタナーゼのタンパク質配列
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ８ＷＺＭ７．ｆａｓｔａ）
＞ｔｒ｜Ｑ８ＷＺＭ７｜Ｑ８ＷＺＭ７＿ＴＲＩＨＡ Ａｌｐｈａ－１，３－ｇｌｕｃａｎａｓｅ ＯＳ＝Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ＧＮ＝ｐ３ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１
MLGVFRRLRLGALAAAALSSLGSAAPANVAIRSLEERASSADRLVFCHFMIGIVGDRGSS
ADYDDDMQRAKAAGIDAFALNIGVDGYTDQQLGYAYDSADRNGMKVFISFDFNWWSPGNA
VGVGQKIAQYANRPAQLYVDNRPFASSFAGDGLDVNALRSAAGSNVYFVPNFHPGQSSPS
NIDGALNWMAWDNDGNNKAPKPGQTVTVADGDNAYKNWLGGKPYLAPVSTWVFNHFGPEV
SYSKNWVFPSGPLIYNRWQQVLQQGFPRVEIVTWNDYGESHYVGPLKSKQFHDGNSKWVN
DMPHDGFLDLSKPFIAAYKNRDTDISKYVQNEQLVYWYRRNLKALDCDATDTTSNRPANN
GSGNYFEGRPDGWQTMDDTVYVAALLKTAGSVTVTSGGTTQTFQANAGANLFQIPASIGQ
QKFALTRNGQTVFSGTSLMDITNVCSCGIYNFNPYVGTIPAGFDDPLQADGLFSLTIGLH
VTTCQAKPSLGTNPPVTSGPVSSLPASSTTRASSPPPVSSTRVSSPPVSSPPVSRTSSAP
PPPGNSTPPSGQVCVAGTVADGESGNYIGLCQFSCNYGYCPPGPCKCTAFGAPISPPASN
GRNGCPLPGEGDGYLGLCSFSCNHNYCPPTACQYC（配列番号１８）
３．ｍＲＮＡの配列（トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ／ｄａｔａ／ｖｉｅｗ／ＡＪ２４３７９９＆ｄｉｓｐｌａｙ＝ｆａｓｔａ）
＞ＥＮＡ｜ＡＪ２４３７９９｜ＡＪ２４３７９９．１ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ａｌｐｈａ－１，３－ｇｌｕｃａｎａｓｅ（ｐ３ ｇｅｎｅ）
ATGTTGGGCGTTTTCCGCCGCCTCAGGCTCGGCGCCCTTGCCGCCGCAGCTCTGTCTTCT
CTCGGCAGTGCCGCTCCCGCCAATGTTGCTATTCGGTCTCTCGAGGAACGTGCTTCTTCT
GCTGACCGTCTCGTATTCTGTCATTTCATGATTGGGATCGTGGGTGACCGTGGCAGCTCG
GCAGATTATGATGACGATATGCAACGTGCCAAAGCCGCTGGCATTGACGCCTTCGCCCTG
AACATCGGCGTTGACGGCTATACCGACCAGCAGCTCGGCTATGCCTATGACTCTGCCGAT
CGTAATGGCATGAAAGTCTTCATTTCATTTGATTTCAACTGGTGGAGCCCCGGCAATGCA
GTTGGTGTTGGCCAGAAGATTGCGCAGTATGCCAACCGCCCTGCCCAGCTGTATGTCGAC
AACCGGCCATTCGCCTCTTCCTTCGCCGGTGACGGTCTGGATGTAAATGCGTTGCGCTCT
GCTGCAGGCTCCAACGTTTACTTTGTGCCCAACTTCCACCCTGGTCAATCTTCCCCCTCC
AACATTGATGGCGCCCTTAACTGGATGGCCTGGGATAATGATGGAAACAACAAGGCACCC
AAGCCGGGCCAGACTGTCACAGTGGCAGACGGTGACAACGCTTATAAGAATTGGTTGGGT
GGCAAGCCTTACCTGGCGCCTGTCTCAACTTGGGTTTTCAACCATTTCGGGCCCGAAGTT
TCATATTCCAAGAACTGGGTTTTCCCAAGTGGGCCTCTGATCTATAACCGGTGGCAACAA
GTCTTGCAGCAAGGGTTCCCAAGGGTTGAGATCGTTACCTGGAATGACTACGGGGAATCT
CACTACGTCGGTCCCCTGAAGTCTAAGCAATTTCATGATGGGAACTCCAAATGGGTCAAT
GATATGCCCCACGATGGATTCCTGGATCTTTCGAAGCCGTTCATAGCCGCATATAAAAAC
AGGGATACCGACATCTCCAAGTATGTTCAAAATGAGCAGCTTGTTTACTGGTACCGCCGC
AACTTAAAGGCACTGGACTGTGACGCCACCGACACAACCTCTAACCGCCCGGCTAACAAT
GGAAGCGGCAATTACTTTGAGGGACGCCCCGATGGTTGGCAAACTATGGATGATACGGTT
TACGTGGCGGCACTTCTCAAGACTGCCGGTAGCGTCACGGTCACGTCTGGTGGCACCACT
CAAACGTTCCAGGCCAACGCCGGAGCCAATCTCTTCCAAATCCCGGCCAGCATCGGCCAG
CAAAAGTTTGCTCTGACTCGTAACGGTCAGACCGTCTTTAGCGGAACCTCATTGATGGAT
ATCACCAACGTTTGCTCTTGCGGTATCTACAACTTCAACCCATATGTTGGCACCATTCCT
GCCGGCTTTGACGACCCTCTTCAGGCTGACGGTCTTTTCTCTTTGACCATCGGATTGCAC
GTCACAACTTGTCAGGCCAAGCCATCTCTTGGAACTAACCCTCCTGTCACTTCCGGCCCT
GTGTCCTCGCTTCCAGCTTCCTCCACCACCCGCGCATCCTCGCCGCCTCCTGTTTCTTCA
ACTCGTGTCTCTTCTCCCCCTGTCTCTTCCCCTCCAGTTTCTCGCACCTCTTCTGCCCCT
CCCCCTCCGGGCAACAGCACGCCGCCATCGGGTCAGGTTTGCGTTGCCGGCACCGTTGCC
GACGGCGAGTCTGGCAACTACATCGGCCTGTGCCAATTCAGCTGCAACTACGGTTACTGC
CCACCAGGACCGTGTAAGTGCACCGCCTTTGGTGCTCCCATCTCGCCACCGGCATCCAAC
GGCCGCAACGGCTGCCCTCTGCCGGGAGAAGGCGATGGTTATCTGGGCCTGTGCAGTTTC
AGTTGTAACCATAATTACTGCCCGCCAACGGCATGTCAATACTGCTAGGAGGGATCAATC
TCAGTATGAGTATATGGAGGCTGCTGAAGGACCAATTAGCTGTTCTTATCGGCAGACGAA
ACCCATAGAGTAAGAAGTTAAATAAAATGCAATTAATGTGTTTTCAAAAAAAAAAAAAAA
A（配列番号１９）
（トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）は真菌であることからポリＡテールが存在する）
Ｖ）トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）
１．トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来のムタナーゼの一般情報
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ８ＷＺＭ７も参照されたい；
２．トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来のムタナーゼのタンパク質配列
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ８ＷＺＭ７．ｆａｓｔａを参照されたい）
＞ｔｒ｜Ｑ８ＷＺＭ７｜Ｑ８ＷＺＭ７＿ＴＲＩＨＡ Ａｌｐｈａ－１，３－ｇｌｕｃａｎａｓｅ ＯＳ＝Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ＧＮ＝ｐ３ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１
MLGVFRRLRLGALAAAALSSLGSAAPANVAIRSLEERASSADRLVFCHFMIGIVGDRGSS
ADYDDDMQRAKAAGIDAFALNIGVDGYTDQQLGYAYDSADRNGMKVFISFDFNWWSPGNA
VGVGQKIAQYANRPAQLYVDNRPFASSFAGDGLDVNALRSAAGSNVYFVPNFHPGQSSPS
NIDGALNWMAWDNDGNNKAPKPGQTVTVADGDNAYKNWLGGKPYLAPVSTWVFNHFGPEV
SYSKNWVFPSGPLIYNRWQQVLQQGFPRVEIVTWNDYGESHYVGPLKSKQFHDGNSKWVN
DMPHDGFLDLSKPFIAAYKNRDTDISKYVQNEQLVYWYRRNLKALDCDATDTTSNRPANN
GSGNYFEGRPDGWQTMDDTVYVAALLKTAGSVTVTSGGTTQTFQANAGANLFQIPASIGQ
QKFALTRNGQTVFSGTSLMDITNVCSCGIYNFNPYVGTIPAGFDDPLQADGLFSLTIGLH
VTTCQAKPSLGTNPPVTSGPVSSLPASSTTRASSPPPVSSTRVSSPPVSSPPVSRTSSAP
PPPGNSTPPSGQVCVAGTVADGESGNYIGLCQFSCNYGYCPPGPCKCTAFGAPISPPASN
GRNGCPLPGEGDGYLGLCSFSCNHNYCPPTACQYC（配列番号２０）
３．ｍＲＮＡの配列（トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ） さらなる情報をｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ／ｄａｔａ／ｖｉｅｗ／ＡＪ２４３７９９＆ｄｉｓｐｌａｙ＝ｆａｓｔａで見出し得る）
＞ＥＮＡ｜ＡＪ２４３７９９｜ＡＪ２４３７９９．１ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ａｌｐｈａ－１，３－ｇｌｕｃａｎａｓｅ（ｐ３ ｇｅｎｅ）
ATGTTGGGCGTTTTCCGCCGCCTCAGGCTCGGCGCCCTTGCCGCCGCAGCTCTGTCTTCT
CTCGGCAGTGCCGCTCCCGCCAATGTTGCTATTCGGTCTCTCGAGGAACGTGCTTCTTCT
GCTGACCGTCTCGTATTCTGTCATTTCATGATTGGGATCGTGGGTGACCGTGGCAGCTCG
GCAGATTATGATGACGATATGCAACGTGCCAAAGCCGCTGGCATTGACGCCTTCGCCCTG
AACATCGGCGTTGACGGCTATACCGACCAGCAGCTCGGCTATGCCTATGACTCTGCCGAT
CGTAATGGCATGAAAGTCTTCATTTCATTTGATTTCAACTGGTGGAGCCCCGGCAATGCA
GTTGGTGTTGGCCAGAAGATTGCGCAGTATGCCAACCGCCCTGCCCAGCTGTATGTCGAC
AACCGGCCATTCGCCTCTTCCTTCGCCGGTGACGGTCTGGATGTAAATGCGTTGCGCTCT
GCTGCAGGCTCCAACGTTTACTTTGTGCCCAACTTCCACCCTGGTCAATCTTCCCCCTCC
AACATTGATGGCGCCCTTAACTGGATGGCCTGGGATAATGATGGAAACAACAAGGCACCC
AAGCCGGGCCAGACTGTCACAGTGGCAGACGGTGACAACGCTTATAAGAATTGGTTGGGT
GGCAAGCCTTACCTGGCGCCTGTCTCAACTTGGGTTTTCAACCATTTCGGGCCCGAAGTT
TCATATTCCAAGAACTGGGTTTTCCCAAGTGGGCCTCTGATCTATAACCGGTGGCAACAA
GTCTTGCAGCAAGGGTTCCCAAGGGTTGAGATCGTTACCTGGAATGACTACGGGGAATCT
CACTACGTCGGTCCCCTGAAGTCTAAGCAATTTCATGATGGGAACTCCAAATGGGTCAAT
GATATGCCCCACGATGGATTCCTGGATCTTTCGAAGCCGTTCATAGCCGCATATAAAAAC
AGGGATACCGACATCTCCAAGTATGTTCAAAATGAGCAGCTTGTTTACTGGTACCGCCGC
AACTTAAAGGCACTGGACTGTGACGCCACCGACACAACCTCTAACCGCCCGGCTAACAAT
GGAAGCGGCAATTACTTTGAGGGACGCCCCGATGGTTGGCAAACTATGGATGATACGGTT
TACGTGGCGGCACTTCTCAAGACTGCCGGTAGCGTCACGGTCACGTCTGGTGGCACCACT
CAAACGTTCCAGGCCAACGCCGGAGCCAATCTCTTCCAAATCCCGGCCAGCATCGGCCAG
CAAAAGTTTGCTCTGACTCGTAACGGTCAGACCGTCTTTAGCGGAACCTCATTGATGGAT
ATCACCAACGTTTGCTCTTGCGGTATCTACAACTTCAACCCATATGTTGGCACCATTCCT
GCCGGCTTTGACGACCCTCTTCAGGCTGACGGTCTTTTCTCTTTGACCATCGGATTGCAC
GTCACAACTTGTCAGGCCAAGCCATCTCTTGGAACTAACCCTCCTGTCACTTCCGGCCCT
GTGTCCTCGCTTCCAGCTTCCTCCACCACCCGCGCATCCTCGCCGCCTCCTGTTTCTTCA
ACTCGTGTCTCTTCTCCCCCTGTCTCTTCCCCTCCAGTTTCTCGCACCTCTTCTGCCCCT
CCCCCTCCGGGCAACAGCACGCCGCCATCGGGTCAGGTTTGCGTTGCCGGCACCGTTGCC
GACGGCGAGTCTGGCAACTACATCGGCCTGTGCCAATTCAGCTGCAACTACGGTTACTGC
CCACCAGGACCGTGTAAGTGCACCGCCTTTGGTGCTCCCATCTCGCCACCGGCATCCAAC
GGCCGCAACGGCTGCCCTCTGCCGGGAGAAGGCGATGGTTATCTGGGCCTGTGCAGTTTC
AGTTGTAACCATAATTACTGCCCGCCAACGGCATGTCAATACTGCTAGGAGGGATCAATC
TCAGTATGAGTATATGGAGGCTGCTGAAGGACCAATTAGCTGTTCTTATCGGCAGACGAA
ACCCATAGAGTAAGAAGTTAAATAAAATGCAATTAATGTGTTTTCAAAAAAAAAAAAAAA
A（配列番号２１）
（トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）は真菌であることからポリＡテールが存在する）
ペニシリウム・ミニオルテウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｉｎｉｏｌｕｔｅｕｍ）由来のデキストラナーゼ（Ｄｅｘ）遺伝子
ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ４１５６２．１
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｌ４１５６２．１）
成熟タンパク質は、６７ＫＤのＭＷを有する５７４個のアミノ酸を有する。最適な反応条件はｐＨ５．５および４０℃である。ｐＨ範囲は３～６である。
アミノ酸配列
MATMLKLLALTLAISESAIGAVMHPPGNSHPGTHMGTTNNTHCG
ADFCTWWHDSGEINTQTPVQPGNVRQSHKYSVQVSLAGTNNFHDSFVYESIPRNGNGR IYAPTDPPNSNTLDSSVDDGISIEPSIGLNMAWSQFEYSHDVDVKILATDGSSLGSPS
DVVIRPVSISYAISQSDDGGIVIRVPADANGRKFSVEFKTDLYTFLSDGNEYVTSGGS
VVGVEPTNALVIFASPFLPSGMIPHMTPDNTQTMTPGPINNGDWGAKSILYFPPGVYW MNQDQSGNSGKLGSNHIRLNSNTYWVYLAPGAYVKGAIEYFTKQNFYATGHGILSGEN
YVYQANAGDNYIAVKSDSTSLRMWWHNNLGGGQTWYCVGPTINAPPFNTMDFNGNSGI
SSQISDYKQVGAFFFQTDGPEIYPNSVVHDVFWHVNDDAIKIYYSGASVSRATIWKCH
NDPIIQMGWTSRDISGVTIDTLNVIHTRYIKSETVVPSAIIGASPFYASGMSPDSRKS
ISMTVSNVVCEGLCPSLFRITPLQNYKNFVVKNVAFPDGLQTNSIGTGESIIPAASGL
TMGLNISNWTVGGQKVTMENFQANSLGQFNIDGSYWGEWQIS（配列番号２２）
ＤＮＡ配列
1 ggcatagtaa tcccgacagc cgagtatgat ggagcttctt cggataatga tagcgccacc
61 agaccttgct tgagctggag agctaaaaca ttaaacgcca cacgaccaac actctcatta
121 gttgcgatag atgatgctcg gagctgttga aactcagaaa ttccttctat gcggggtctc
181 caagatcgat cctgggggat gtgaatacta cggtggacct aattgacgcc ttgacaggtg
241 atgttaagcg aaccaaggaa gaataatctg gggctagatg aagatgttga gctgtaaggt
301 acggtacgtt cctattggct ttatcggagc ttctccgggt tactcagtct ttccgggagc
361 atgatcattt ttgtattgtc caatagtaag cagaaactga gagccaccac aaactcaaaa
421 cctcggtagc gaagtttccc ggaaccagtc aggattctca gaaactgtgc tcgtgttgcg
481 gggaatccgc attctacgtc gtctggagca aggaaatgtt cgtgctggat tgaggaggat
541 aggtaggttg gagaatctct tcagctaacc aatctataag catgctccgg taacctttag
601 agtttcacat tcaacgtaat ttccaagata gccagagcgt ccttgaatta ctatgtagaa
661 atcctaaaat ttcccctgta aaatgcaagt caacgagatg cgtgccctca atgtctctcg
721 gcgctacccc ggaaatgatg cataaggcca agaatgtcac ccggtaactt tttcttcaga
781 atatcctaag atttccatca aacacagtcg aataggtcaa tgctcgcgag agactttctg
841 ccttcactct acgtcctact catagaagtt caacggctca attccggggt aatctagagt
901 ttggacctca agggagatgt tgcaacaaat tgtactagaa cgatgcgctt gctttccaat
961 acagtagttg acttcatata gcttccaaca aaagggatgg ggatgaaggc tctatagcga
1021 gaagtctata agaaagtgtc ctcatacctg tatctctcag tcgttcgaga acaatcccgg
1081 aaactatctt atcttgcgag aaagaagaca atatctcaaa cttatggcca caatgctaaa
1141 gctacttgcg ttgacccttg caattagcga gtccgccatt ggagcagtca tgcacccacc
1201 tggcaattct catcccggta cccatatggg cactacgaat aatacccatt gcggcgccga
1261 tttctgtacc tggtggcatg attcagggga gatcaatacg cagacacctg tccaaccagg
1321 gaacgtgcgc caatctcaca agtattccgt gcaagtgagc ctagctggta caaacaattt
1381 tcatgactcc tttgtatatg aatcgatccc ccggaacgga aatggtcgca tctatgctcc
1441 caccgatcca cccaacagca acacactaga ttcaagtgtg gatgatggaa tctcgattga
1501 gcctagtatc ggccttaata tggcatggtc ccaattcgag tacagccacg atgtagatgt
1561 aaagatcctg gccactgatg gctcatcgtt gggctcgcca agtgatgttg ttattcgccc
1621 cgtctcaatc tcctatgcga tttctcagtc tgacgatggt gggattgtca tccgggtccc
1681 agccgatgcg aacggccgca aattttcagt tgagttcaaa actgacctgt acacattcct
1741 ctctgatggc aacgagtacg tcacatcggg aggcagcgtc gtcggcgttg agcctaccaa
1801 cgcacttgtg atcttcgcaa gtccgtttct tccttctggc atgattcctc atatgacacc
1861 cgacaacacg cagaccatga cgccaggtcc tatcaataac ggcgactggg gcgccaagtc
1921 aattctttac ttcccaccag gtgtatactg gatgaaccaa gatcaatcgg gcaactcggg
1981 gaagttagga tctaatcata tacgtctaaa ctcgaacact tactgggtct accttgcccc
2041 cggtgcgtac gtgaagggtg ctatagagta ttttaccaag cagaacttct atgcaactgg
2101 tcatggtatc ctatcgggtg aaaactatgt ttaccaagcc aatgccggcg acaactacat
2161 tgcagtcaag agcgattcaa ccagcctccg gatgtggtgg cacaataacc ttgggggtgg
2221 tcaaacatgg tactgcgttg gcccgacgat caatgcgcca ccattcaata ctatggattt
2281 caatggaaat tctggcatct caagtcaaat tagcgactat aagcaggtgg gagccttctt
2341 cttccagacg gatggaccag aaatatatcc caatagtgtc gtgcacgacg tcttctggca
2401 cgtcaatgat gatgcaatca aaatctacta ttcgggagca tctgtatcgc gggcaacgat
2461 ctggaaatgt cacaatgacc caatcatcca gatgggatgg acgtctcggg atatcagtgg
2521 agtgacaatc gacacattaa atgttattca cacccgctac atcaaatcgg agacggtggt
2581 gccttcggct atcattgggg cctctccatt ctatgcaagt gggatgagtc ctgattcaag
2641 aaagtccata tccatgacgg tttcaaacgt tgtttgcgag ggtctttgcc cgtccctatt
2701 ccgcatcaca ccccttcaga actacaaaaa ttttgttgtc aaaaatgtgg ctttcccaga
2761 cgggctacag acgaatagta ttggcacagg agaaagcatt attccagccg catctggtct
2821 aacgatggga ctgaatatct ccaactggac tgttggtgga caaaaagtga ctatggagaa
2881 ctttcaagcc aatagcctgg ggcagttcaa tattgacggc agctattggg gggagtggca
2941 gattagctga attccagctc tcggagcgcg tgagtgcttc tacccgctcc tttacccttg
3001 tcgagagata aaggcataag ttagctcatg tgaaggcgat ttcagttcat tctctctttt
3061 tggagcttat ttcctgttcg accaattgtg acaccaactt gcctttcaaa agacgtggac
3121 gatatgtgta cggtaatcag tcaaatgaac gtcaacattc atttaataag gacatttcca
3181 ggtttcctta ctctgtcgat tatgcctaac tcgggttgat gtcttgtcag gatggaaaat
3241 ctcgttgtgt acttccagtg aaatgggcag ggctaagccc taaaccctaa cgcatacaat
3301 ttgtaggcac ctacccatgt aagttcacac ccagtcgact tataagtcta gatatttatg
3361 ctatgcaggc tctggaatga tttacattcc atgctataca tagttatttg caagaatttg
3421 cagacgagat aaaaatcaat ggacgaataa tcacgcatta ctccacaggc tcatgccacg
3481 gagcaagggt tcccccgaat ctaggccaga ccgggatgat attcaaccga ttctttttgc
3541 agtaactatc tccgtacgag ctgcacgagc taaacggatt atataaaggt gctaactgag
3601 cattggatcc gtcagttata tgaaatgca（配列番号２３）
２．ペニシリウム・アクレアタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｃｕｌｅａｔｕｍ）（タラロマイセス・アクレアツス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ａｃｕｌｅａｔｕ）株ｚ０１）由来のデキストラナーゼ（Ｄｅｘ）遺伝子
ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ９９９６４６．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＫＦ９９９６４６．１）
最適ｐＨは約５である。ｐＨ範囲は３～６である。
アミノ酸配列
MATMLKLLTLALAISESAIGAVLHPPGSSHPSTRTDTTNNTHCG
ADFCTWWHDSGEINTQTPVQPGNVRQSHKYSVQVSLAGANNFQDSFVYESIPRNGNGR
IYAPTDPPNSNTLDSSVDDGISIEHSIGLNMAWSQFEYSQDVDIKILAADGSSLGSPS
DVVIRPVSISYAISQSDDGGIVIRVPADANGRKFSVEFKNDPYTFLSDGNEYVTSGGS
VVGVEPTNALVIFASPFLPSGMIPHMTPDNTQTMTPGPINNGDWGSKSILYFPPGVYW
MNQDQSGNSGKLGSNHIRLNSNTYWVYFAPGAYVKGAIEYFTKQNFYATGHGVLSGEN
YVYQANAGENYVAVKSDSTSLRMWWHNNLGGGQTWYCVGPTINAPPFNTMDFNGNSGI
SSQISDYKQVGAFFFQTDGPEIYPNSVVHDVFWHVNDDAIKIYYSGASVSRATIWKCH
NDPIIQMGWTSRDISGVTIDTLNVIHTRYIKSETVVPSAIIGASPFYASGMSPDSSKS
ISMTVSNVVCEGLCPSLFRITPLQNYKNFVVKNVAFPDGLQTNSIGTGESIIPAASGL
TMGLDISNWSVGGQKVTMQNFQANSLGQFDIDGSYWGEWQIN（配列番号２４）
ＤＮＡ配列
1 atggccacaa tgctaaagct acttacgttg gcccttgcaa ttagcgagtc tgccattgga
61 gcagtcctgc acccacctgg cagttctcat cccagtaccc gtacggacac tacgaataat
121 acccattgcg gtgccgactt ctgtacctgg tggcatgatt caggcgagat caacacacag
181 acacctgtcc aaccggggaa cgtgcgccaa tctcacaagt attccgtaca agtgagccta
241 gctggtgcga acaactttca ggactccttt gtatatgaat cgatccctcg gaacggaaat
301 ggtcgcatct atgctcccac cgatccaccc aacagcaaca cactagattc aagtgttgat
361 gatggaatct cgattgaaca tagtattggc ctcaatatgg catggtccca attcgagtac
421 agccaggatg tcgatataaa gatcctggcc gctgatggct catcgttggg ctcaccaagt
481 gatgttgtta ttcgccccgt ctcaatctcc tatgcaattt ctcaatccga cgatggcgga
541 attgtcattc gggtcccagc cgatgcgaac ggccgcaaat tttcagtcga gttcaaaaat
601 gacccgtaca cgttcctctc tgacggcaac gagtacgtca catcgggagg cagcgttgtc
661 ggcgttgagc ctaccaacgc acttgtgatc ttcgcaagcc cgtttcttcc gtcaggcatg
721 attcctcata tgacacccga caacacgcag accatgacac caggacctat caataacggc
781 gactggggct ccaagtcaat tctttatttc ccaccgggcg tatactggat gaaccaagat
841 caatcaggca actcggggaa attaggatct aatcatatac gcctgaactc gaacacctac
901 tgggtctact ttgccccagg tgcgtacgtg aagggtgcta tagagtattt caccaagcag
961 aacttctatg caactggtca tggtgtccta tcgggtgaaa actatgttta ccaagccaat
1021 gctggcgaaa actacgttgc ggtcaagagc gattcgacta gcctccggat gtggtggcac
1081 aataacctgg gaggtggaca aacatggtac tgcgttgggc ctacgatcaa tgcgccgcca
1141 tttaacacaa tggatttcaa tggaaattcc ggtatctcaa gtcaaattag cgactataag
1201 caggtgggag ctttcttctt tcagacggat ggaccagaaa tttatcccaa tagtgtcgtg
1261 cacgacgtct tctggcatgt caatgatgat gcaatcaaaa tctactattc cggagcatct
1321 gtctcgcggg caacgatctg gaaatgtcac aacgatccaa tcatccagat gggatggacg
1381 tctcgggata tcagtggagt gacaatcgac acattgaatg tcatccacac ccgctacatc
1441 aagtcggaga cggtggtgcc ttcggctatc attggggctt ctccattcta tgcaagtggg
1501 atgagtcctg attcaagcaa gtctatatcc atgacggttt caaacgttgt ctgcgaggga
1561 ctttgcccgt ctctgttccg aatcacacct ttacagaact acaagaattt tgttgtcaaa
1621 aatgtggctt tcccagatgg gctacagacg aatagtattg gcacgggaga aagcattatt
1681 ccagccgcat ctggtctaac gatgggactg gatatctcca actggtctgt tggtggtcag
1741 aaggtgacta tgcagaactt tcaagccaat agtctggggc aattcgacat tgacggcagc
1801 tattgggggg agtggcagat taactagctg aataatattg cagctttcag ggcgcatgag
1861 tgcttgtacc cgctccttta cccttgtc（配列番号２５）
３．デキストラナーゼに関するペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）ｄｅｘＡ遺伝子
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ２７２０６６．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／７８０１１６６）
最適ｐＨは約５．５である。最適温度は６０℃である。ｐＨ範囲は５～７．５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ００３２９５９２９８００１２７７）
アミノ酸配列
MATMLKLLALTLAISESAIGAVMHPPGVSHPGTHTGTTNNTHCG
ADFCTWWHDSGEINTQTPVQPGNVRQSHKYSVQVSLAGTNNFHDSFVYESIPRNGNGR
IYAPTDPSNSNTLDSSVDDGISIEPSIGLNMAWSQFEYSQDVDIKILATDGSSLGSPS
DVVIRPVSISYAISQSNDGGIVIRVPADANGRKFSVEFKNDLYTFLSDGNEYVTSGGS
VVGVEPTNALVIFASPFLPSGMIPHMKPHNTQTMTPGPINNGDWGAKSILYFPPGVYW
MNQDQSGNSGKLGSNHIRLNSNTYWVYLAPGAYVKGAIEYFTKQNFYATGHGVLSGEN
YVYQANAGDNYVAVKSDSTSLRMWWHNNLGGGQTWYCVGPTINAPPFNTMDFNGNSGI
SQISDYKQVGAFFFQTDGPEIYPNSVVHDVFWHVNDDAIKIYYSGASVSRATIWKCH
NDPIIQMGWTSRDISGVTIDTLNVIHTRYIKSETVVPSAIIGASPFYASGMSPDSSKS
ISMTVSNVVCEGLCPSLFRITPLQNYKNFVVKNVAFPDGLQTNSIGTGESIIPAASGL
TMGLNISSWTVGGQKVTMENFQANSLGQFNIDGSYWGEWQISRISSSQSA
（配列番号２６）
ＤＮＡ配列
1 atggccacaa tgctaaagct acttgcgttg acccttgcaa ttagcgagtc cgccattgga
61 gcagtcatgc acccacctgg cgtttctcat cccggtaccc atacgggcac tacgaataat
121 acccattgcg gcgccgactt ctgtacctgg tggcatgatt caggggagat caacacgcag
181 acacctgtcc aaccagggaa cgtgcgccaa tctcacaagt attccgtgca agtgagtcta
241 gctggtacaa acaactttca tgactccttt gtatatgaat cgatcccccg gaacggaaat
301 ggtcgcatct atgctcccac cgatccatcc aacagcaaca cattagattc aagcgtggat
361 gatggaatct cgattgagcc tagtatcggc ctcaatatgg catggtccca attcgagtac
421 agccaggatg tcgatataaa gatcctggca actgatggct catcgttggg ctcaccaagt
481 gatgttgtta ttcgccccgt ctcaatctcc tatgcgattt ctcagtccaa cgatggcggg
541 attgtcatcc gggtcccagc cgatgcgaac ggccgcaaat tttcagtcga attcaaaaat
601 gacctgtaca ctttcctctc tgatggcaac gagtacgtca catcgggagg tagcgtcgtc
661 ggcgttgagc ctaccaacgc acttgtgatc ttcgcaagtc cgtttcttcc ttctggcatg
721 attcctcata tgaaacccca caacacgcag accatgacgc caggtcctat caataacggc
781 gactggggcg ccaagtcaat tctttacttc ccaccaggtg tatactggat gaaccaagat
841 caatcgggca actcgggtaa attaggatct aatcatatac gtctaaactc gaacacttac
901 tgggtctacc ttgcccccgg tgcgtacgtg aagggtgcta tagagtattt caccaagcaa
961 aacttctatg caactggtca tggtgtccta tcaggtgaaa actatgttta ccaagccaat
1021 gctggcgaca actatgttgc agtcaagagc gattcgacca gcctccggat gtggtggcac
1081 aataaccttg ggggtggtca aacatggtac tgcgttggcc cgacgatcaa tgcgccacca
1141 ttcaacacta tggatttcaa tggaaattct ggcatctcaa gtcaaattag cgactataag
1201 caggtgggag ccttcttctt ccagacggat ggaccagaaa tctatcccaa tagtgtcgtg
1261 cacgacgtct tctggcacgt caatgatgat gcaatcaaaa tctactattc gggagcatct
1321 gtatcgcggg caacgatctg gaaatgtcac aatgacccaa tcatccagat gggatggaca
1381 tctcgggata tcagtggagt gacaatcgac acattaaatg ttattcacac ccgctacatc
1441 aaatcggaga cggtggtgcc ttcggctatc attggggcct ctccattcta tgcaagtggg
1501 atgagtcccg attcaagcaa gtccatatcc atgacggttt caaacgttgt ttgcgagggt
1561 ctttgcccgt ccctgttccg catcacaccc ctacagaact acaaaaattt tgttgtcaaa
1621 aatgtggctt tcccagatgg gctacagaca aatagtattg gcacaggaga aagcattatt
1681 ccagccgcat ctggtctaac gatgggacta aatatctcca gctggactgt tggtggacaa
1741 aaagtgacaa tggagaactt tcaagccaat agcctggggc agttcaatat tgacggcagc
1801 tattgggggg agtggcagat tagtcgaatt tccagctctc agagcgcgtg agtgcttcta
1861 cccgctcctt tacccttgtc gaaggatcaa ggcataagtt agctcatgtg aaggcgattt
1921 cagttcattc tctctttttt ggagctcatt tccttttcga ccaattgtga caccaaattg
1981 ccatgtgtac tgtaattggt caaatgaacg ttaaccttcg atttaatatg gacatttcca
2041 ggtttcctta ctctgtcgat tatgcctaac tcgggttgat gtcttgtcag gatgaaaatc
2101 tcgttgtcat gtacttcgag tgaaatgggc agggctaacc cctaagccct aacgcccaat
2161 cgacttataa gtctagatgt ttatgctatg caggctctgg aatgatttac attccatgct
2221 ataca（配列番号２７）
本発明の好ましい実施形態のうちのいくつかを上記で説明しており且つ具体的に例示しているが、本発明をそのような実施形態に限定することは意図されていない。下記の特許請求の範囲に説明されているように、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなくそのような実施形態に様々な改変を行い得る。

Claims (24)

  1. 相乗的に作用してバイオフィルム構造体を分解し且つバイオフィルムの堆積を阻害する少なくとも１種の抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）および少なくとも１種のバイオフィルム分解酵素を含む多成分組成物であって、前記組成物の送達のために生物学的に許容される担体を含む組成物。
  2. 前記ＡＭＰは、プロテグリン１、ＲＣ－１０１、および表１中に列挙されたＡＭＰから選択される、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記バイオフィルム分解酵素は、ムタナーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ＤＮＡアーゼ、ディスペルジンＢ、グリコシドヒドロラーゼ、および表２中に列挙された酵素から選択される、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ＡＭＰおよび前記バイオフィルム分解酵素は組換えにより産生され且つ融合タンパク質を形成する、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記組成物は、ムタナーゼおよびデキストラナーゼを含む２種のバイオフィルム分解酵素を含み、前記ＡＭＰはＰＧ－１である、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記組成物中での前記デキストラナーゼ対ムタナーゼの比は５：１である、請求項５に記載の組成物。
  7. グルコアミラーゼをさらに含む請求項６に記載の組成物。
  8. 抗微生物剤／抗生物質をさらに含む請求項１に記載の組成物。
  9. フッ化物および、またはＣＨＸをさらに含む請求項１に記載の組成物。
  10. 前記担体はチューインガムである、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記担体は口腔リンスである、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記担体は生物学的に適合する緩衝液である、請求項１に記載の組成物。
  13. 請求項１、５または６に記載の組成物を含むチューインガム。
  14. 請求項１、５または６に記載の組成物を含む口腔リンス。
  15. Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅを含む請求項１１に記載の口腔リンス。
  16. バイオフィルムを分解するおよび／または除去する方法であって、前記バイオフィルムを含む表面と、請求項１に記載の多成分組成物とを接触させることを含み、前記組成物は殺菌効果を有し、１種または複数種の望ましくない微生物を含む前記バイオフィルムを相乗的に低減する、または除去する、前記バイオフィルムは、前記低減または除去を必要とする動物対象中にまたは前記動物対象上に存在する場合の、方法。
  17. バイオフィルムを分解するおよび／または除去する方法であって、前記バイオフィルムを含む表面と、請求項５に記載の多成分組成物とを接触させることを含み、前記組成物は殺菌効果を有し、１種または複数種の望ましくない微生物を含む前記バイオフィルムを相乗的に低減する、または除去する、前記バイオフィルムは、前記低減または除去を必要とする動物対象中にまたは前記動物対象上に存在する場合の、方法。
  18. バイオフィルムを分解するおよび／または除去する方法であって、前記バイオフィルムを含む表面と、請求項６に記載の多成分組成物とを接触させることを含み、前記組成物は殺菌効果を有し、１種または複数種の望ましくない微生物を含む前記バイオフィルムを相乗的に低減する、または除去し、前記バイオフィルムは、前記低減または除去を必要とする動物対象中にまたは前記動物対象上に存在する場合の、方法。
  19. 前記バイオフィルムは口腔中に存在する、請求項１６、１７または１８に記載の方法。
  20. 前記バイオフィルムは移植された医療機器上に存在する、請求項１６、１７または１８に記載の方法。
  21. 前記バイオフィルムは、尿路中の表面、中耳、前立腺、血管内膜、心臓弁、皮膚、頭皮、爪、歯および創傷内部からなる群から選択される身体の内表面または外表面に存在する、請求項１６、１７または１８に記載の方法。
  22. 前記ＡＭＰおよび前記酵素は植物色素体中で産生されており、前記組成物は植物残余物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  23. 前記植物はタバコまたはレタス植物である、請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記少なくとも１種のＡＭＰおよび前記少なくとも１種の酵素は融合タンパク質としてレタス植物中で発現されている、請求項２１に記載の組成物。
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