EA024253B1 - Литический полипептид с пептидогликангидролазной активностью и его применение против инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями - Google Patents

Литический полипептид с пептидогликангидролазной активностью и его применение против инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями Download PDF

Info

Publication number
EA024253B1
EA024253B1 EA201270322A EA201270322A EA024253B1 EA 024253 B1 EA024253 B1 EA 024253B1 EA 201270322 A EA201270322 A EA 201270322A EA 201270322 A EA201270322 A EA 201270322A EA 024253 B1 EA024253 B1 EA 024253B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
agd
polypeptide
luz
gram
Prior art date
Application number
EA201270322A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201270322A1 (ru
Inventor
Ивс Брирс
Роб Лавинь
Маартен Валмах
Стефан Миллер
Original Assignee
Катхолике Университейт Лёвен, К.У. Лёвен Р Энд Д
Лисандо Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Катхолике Университейт Лёвен, К.У. Лёвен Р Энд Д, Лисандо Аг filed Critical Катхолике Университейт Лёвен, К.У. Лёвен Р Энд Д
Publication of EA201270322A1 publication Critical patent/EA201270322A1/ru
Publication of EA024253B1 publication Critical patent/EA024253B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/926—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase
    • G01N2333/928—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)

Abstract

Заявленное изобретение относится к литическому полипептиду с пептидогликангидролазной активностью, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Кроме того, заявленное изобретение относится к слитым белкам, содержащим упомянутый полипептид и дополнительную пептидную цепь, слитую с упомянутым полипептидом на N- или С-концах. Помимо этого, заявленное изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим упомянутый полипептид или слитый белок, векторам, содержащим упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты и клеткам-хозяин, содержащим либо упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты, либо упомянутые векторы. Дополнительно, заявленное изобретение относится к применению упомянутого полипептида или слитого белка в качестве лекарственного препарата, в частности, для лечения или профилактики инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, средства диагностики, в косметической промышленности или дезинфектанта. Заявленное изобретение также относится к применению упомянутого полипептида или слитого белка для устранения, уменьшения или предотвращения заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, загрязнения оборудования на предприятиях пищевой отрасли, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, изделий медицинского назначения, поверхностей в больницах и хирургических блоках. Кроме того, заявленное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей упомянутые полипептид или слитый белок.

Description

Заявленное изобретение относится к полипептиду с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8ЕО ГО N0: 1 и его фрагментам или производным. Заявленное изобретение также относится к слитым белкам, содержащим упомянутый полипептид и дополнительную удлиненную пептидную цепь, слитую с упомянутым полипептидом на Ν-конце или С-конце. Помимо этого заявленное изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим упомянутые полипептид или слитый белок, векторам, включающим упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты и клеткам-хозяинам, содержащим либо упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты, либо упомянутые векторы. Дополнительно заявленное изобретение относится к применению упомянутых полипептида или слитого белка в качестве медикаментозного препарата, в частности, в лечении или профилактике инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, в качестве средства диагностики или компонента косметического препарата. Заявленное изобретение также относится к применению упомянутых полипептида или слитого белка для обработки или профилактики заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования и помещений на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в медицинских стационарах и хирургических блоках. Помимо этого, заявленное изобретение относится к фармацевтическим или косметическим композициям, содержащим упомянутые полипептид или слитый белок.
Грамотрицательные бактерии обладают внешней мембраной, с отличительным признаком в виде характерного ассиметричного двойного слоя. Внешний мембранный двойной слой состоит из внутреннего одинарного слоя, включающего фосфолипиды (преимущественно, фосфатидил этаноламин), и внешнего одинарного слоя, который по преимуществу состоит из одного гликолипида, липополисахарида (ЛПС). В мире бактерий существует огромное множество структур ЛПС, и структура ЛПС может изменяться в ответ на превалирующие условия окружающей среды. Стабильность слоя ЛПС и взаимодействие между различными молекулами ЛПС главным образом происходят благодаря электростатическому взаимодействию бивалентных ионов (Мд2'. Са2+) с анионными компонентами молекулы ЛПС (фосфатные группы в липиде А, а также внутреннее ядро и карбоксигруппы ΚΌ0). Помимо этого, компактное и упорядоченное расположение гидрофобной группы липида А, характеризуемое отсутствием ненасыщенных жирных кислот, образует жесткую структуру с высокой вязкостью. Это придает ей меньшую проницаемость, предотвращающую от проникновения липофильных молекул, а также дополнительную устойчивость внешней мембраны (ВМ).
Известны различные типы агентов с бактерицидным или бактериостатическим действием, например, антибиотики, эндолизины, антимикробные пептиды и дефензины. Возрастающая микробная устойчивость в отношении антибиотиков, тем не менее, создает проблемы в лечении все большего числа инфекций, вызываемых бактериями, в частности, что касается инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, как например, Ркеиботопак аегидшока и Еп1егоЬас1епасеае.
Эндолизины представляют собой пептидогликангидролазы, кодированные бактериофагами (или бактериальными вирусами). Они синтезируются во время экспрессии поздних генов в литическом цикле мультипликации фагов и опосредуют высвобождение прогенных вирионов из инфицированных клеток путем разрушения бактериального пептидогликана. Они являются либо в(1,4)-гликолазами (лизосимами), трансгликолазами, амидазами или эндопептидазами. Антимикробное применение эндолизинов было предложено еще в 1991 г. Оаккоп (ОВ2243611). Несмотря на то, что способность к уничтожению микробов, наблюдаемая у эндолизинов, известна в течение длительного времени, использование данных энзимов в качестве антимикробных веществ игнорировали по причине успешного и доминирующего применения антибиотиков. Только после обнаружения бактерий с множественной устойчивостью к антибиотикам, стали проявлять интерес к применению эндолизинов в качестве препаратов против патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания у человека. Возникла насущная потребность в разработке совершенно новых классов антибактериальных агентов, и эндолизины, используемые в качестве энизибиотиков - термин-гибрид (энзимы и антибиотики) прекрасно выполняют данную функцию. В 2001, р18сЬей1 и соавторы впервые продемонстрировали терапевтический потенциал эндолизина бактериофага С1 в отношении стрептококков группы А (№1коп е1 а1., 2001). С того времени множество публикаций подтвердили функцию эндолизинов в качестве приемлемого и дополнительного альтернативного средства для контроля бактериальных инфекций, вызываемых в частности грамположительными бактериями. Впоследствии была подтверждена эффективность в качестве энзибиотиков у различных эндолизинов, активных в отношении других грамположительных патогенов, как например 81гер1ососсн5 рпеитошае (ЬоеГПег и соавторы, 2001), ВасШик аШйгасР (8сйисй и соавторы, 2002), 8. ада1асйае (Сйепд и соавторы, 2005) и 81арйу1ососсн5 аигеик (Ка8Йе1 и соавторы, 2007). В настоящее время самую насущную проблему в терапии с использованием эндолизинов представляет нечувствительность грамотрицательных бактерий к экзогенному действию эндолизинов, поскольку внешняя мембрана выполняет функцию щита, защищающего бактерии от проникновения эндолизинов из пептидогликанов. Данное свойство в настоящее время препятствует расширению перечня эффективных эндолизинов, применяемых в отношении важных грамотрицательных патогенов.
Антимикробные пептиды (АМП) представляют широкий спектр малых, катионных, генкодированных пептидных антибиотиков, которые можно обнаружить в практически любом организме.
- 1 024253
Различные АМП обладают различными свойствами, многие пептиды в данном классе являются предметом интенсивных научных исследований не только как антибиотики, но также как образцы для создания пептидов, проникающих через клеточную стенку. Несмотря на наличие нескольких схожих свойств (например, катионность, амфипатичность и малый размер), существует огромное разнообразие последовательностей АМП, и в связи с этим предложили как минимум четыре структурные группы (альфаспиральные, бета-складчатые, растянутые и закольцованные) для систематизации всего разнообразия наблюдаемых АМП. Аналогичным образом, по мере появления новых антибиотиков было предложено несколько вариантов механизмов действия, и было доказано, что, например, основной мишенью многих из этих пептидов является клеточная мембрана, в то время, как основной мишенью для других пептидов является проникновение в цитоплазматическую мембрану и нарушение основных функций метаболизма. АМП могут приобретать концентрацию, достаточную для синергического действия, несмотря на отсутствие специфического связывания мишеней; например, путем образования поры в мембране, как, например, в случае многих АМП. Тем не менее, данное явление наблюдается только в модельных фосфолипидных бислоях, а в некоторых случаях концентрация АМП в мембране была настолько высока, что необходимо соотношение одной пептидной молекулы на шесть фосфолипидных молекул. Данные концентрации приближаются (и практически эквивалентны) к состоянию полной мембранной насыщаемости. Поскольку минимальная подавляющая концентрация (МПК) для АМП, как правило, находится в пределах низкого микромолярного диапазона, значимость определения данных значений и их роль в проведении опытов ίη νίνο сопровождается совершенно объяснимым скептицизмом (Ме1о с1 а1., ΝηΙηγο гс\зс\у5. МюгоЪю1оду, 2009, 245). Дефензины представляют собой большую группу малых. катионных, с повышенным содержанием цистеина и аргинина антимикробных пептидов, присутствующих как в позвоночной, так и межпозвоночной тканях. Дефензины подразделяют на пять групп, в соответствии с сеткой размещения цистеинов: растительные. межпозвоночные, α-, β-, и θ-дефензины. Последние три в большинстве случаев встречаются у млекопитающих, α-дефензины представляют собой белки, встречающиеся в нейтрофилах и эпителии ЖКТ. β-дефензины по преимуществу являются наиболее широко встречающимися и вырабатываются лейкоцитами и эпителиальными клетками различных видов. До настоящего времени, θ-дефензины редко обнаруживали, например, в лейкоцитах макак-резусов. Дефензины проявляют активность в отношении бактерий, грибков и многих вирусов с оболочкой и без. Тем не менее, для эффективного уничтожения бактерий необходимы по преимуществу высокие концентрации, например, в микромолярном диапазоне. Активность многих пептидов может снижаться в условиях, приближенных к условиям физиологической соли, бивалентных катионов и сыворотки. В зависимости от содержания гидрофобных аминокислотных остатков, дефензины также проявляют гемолитическую активность.
Таким образом, присутствует необходимость в разработке новых антимикробных агентов, активных в отношении грамотрицательных бактерий.
Нижеследующие фигуры иллюстрируют суть заявленного изобретения.
Фиг. 1 представляет эндолизин 0ВРдрЬУ8 в соответствии с заявленным изобретением. На фиг. 1А представлена аминокислотная последовательность эндолизина 0ВРдрЬУ8 (8Еф ГО N0: 1) в соответствии с заявленным изобретением. На фиг. 1Б представлена первичная структура 0ВРдрЬУ8, содержащая дополнительный Н186-таг (-метку), с результатами функционального анализа с использованием ВЬА8Тр и РГат (программированного амплитудно-частотного модулятора). Прогнозируемый Ν-концевой пептидогликан-связывающий домен (РВЭ. аминокислотные остатки 7-96) обозначен подчеркиванием, а Сконцевой каталитический домен (аминокислотные остатки 126 - 292) лизосом-подобного суперсемейства -курсивом. Полностью аминокислотная последовательность 0ВРдрЬУ8, содержащая дополнительный Н186-таг на С-конце, представлена на фиг. 1Б в 8Еф ГО N0: 47.
Фиг. 2 представляет нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО N0: 101) эндолизина фага ОВР.
Фиг. 3 представляет нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО N0: 3) эндолизина 0ВРдрЬУ8 (8Е0 ГО N0: 1) в соответствии с заявленным изобретением.
Фиг. 4 представляет изображение кумасси-помеченных 8Э8-РАСЕ (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) с результатами экспрессии и очистки немодифицированного эндолизина 0ВРдрЬУ8 (8Е0 ГО N0: 47) и его модифицированного варианта эндолизина РК0ВРдрЬУ8 (8Е0 ГО N0: 49). Дорожка БМХУ относится к размерному маркеру (ЬМ^ лесенка).
Следующие три дорожки относятся к протеиновым фракциям очищенного белка в элюирующем буфере (20 мМ NаН2РО4-NаОН рН 7,4; 0,5 М Ναί'Έ 500 мМ имидазола) после Νι2+ аффинной хроматографии. Дорожка РТ относится к поперечному потоку, а дорожка - к побочным фракциям. На изображении очищенных протеиновых фракций видны единичные вторичные бэнды, что указывает на высокую чистоту рекомбинантных протеинов (>90%).
Фиг. 5, А-Е, представляет графическое изображение антибактериальной активности немодифицированного 0ВРдрЬУ8 (8Е0 ГО N0: 47) и модифицированного РК0ВРдрЬУ8 (8Е0 ГО N0: 49) в различных сочетаниях в отношении некоторых экспоненциально растущих грамотрицательных бактерий после инкубации при комнатной температуре и без встряхивания. Каждый вид грамотрицательных бактерий
- 2 024253 подвергли инкубации в течение 30 мин с составом, содержащим 0,5 мМ ЭДТК, но без эндолизина, с составом, содержащим 1,315 мкМ ^модифицированного ОВР§рЬУ8, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ модифированного РКОВР§рЬУ8, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного ОВР§рЬУ8 и 0,5 мМ ЭДТК и с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного РКОВР§рЬУ8 и 0,5 мМ ЭДТК. На фиг. 5А представлена антибактериальная активность в отношении клеток ЕксйепсЫа сой \УК 6, на фиг. 5Б - антибактериальная активность в отношении клеток 8а1топе11а 1урЫтигшш ЬТ2 (808С № 2317), на фиг. 5В - антибактериальная активность в отношении клеток РкеиДотопак аегидшока РАО1р и на фиг. 5Г - антибактериальная активность в отношении клеток РкеиДотопак аегидшока Вг667, на на фиг. 5Д - антибактериальная активность в отношении клеток РкеиДотопак рийДа 01, а на фиг. 5Е - антибактериальная активность в отношении клеток ВщкйоИепа ркеиДотайег Δ показывает разницу в активности между, соответственно, образцами ОВР§рЬУ8 и РКОВР§рЬУ8. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений.
Фиг. 6 показывает графическое представление хозяинной специфичности немодифицированного ОВР§рЬУ8 (8ЕО ГО ЫО: 47) и модифицированного РКОВР§рЬУ8 (8ЕО ГО ЫО: 49). Каждый вид грамотрицательных бактерий инкубировали в течение 30 мин с композицией, содержащей в каждом случае 1,315 мкМ немодифицированного ОВР§рЬУ8 или модифицированного РКОВР§рЬУ8. На гистограмме представлены значения антибактериальной активности немодифицированного ОВР§рЬУ8 и модифицированного ОВР§рЬУ8 в отношении клеток РкеиДотопак аегидшока РАО1р (РАО1), ЕксйепсЫа сой \УК6 (тек6), ВигкйоМепа ркеиДота11е1 (Берк псевдо), РкеиДотопак аегидшока Вг667 (Вг667), 8а1топе11а 1урЙ1типит ЬТ2 (ЬТ2) и РкеиДотопак риНДа 01 (Рри 01). Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений.
Термин белок в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, синонимично соотносится с термином полипептид. Термин белок в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к линейному полимеру аминокислотных остатков, связанных пептидными связями в специфичной последовательности. Аминокислотные остатки белка могут быть модифицированы, например, ковалентными прикреплениями различных групп, как, например, углеводы и фосфаты. Прочие вещества могут быть более свободно ассоциированы с полипептидными цепочками, как, например, гемы или липиды, приводя к образованию конъюгированных белков, которые также обозначают термином белок, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения. Описаны различные варианты с включением полипептидных цепей, в частности, что касается присутствия альфа-спиральных и бета-складчатых структур. Термин белок в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к четырем классам белков, а именно альфа, бета, альфа/бета и альфа-плюс-бета.
Термин слитый белок, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к продукту экспрессии, являющемуся результатом слияния двух последовательностей нуклеиновых кислот. Такой белок получают, например, в системах экспрессии рекомбинантных ДНК. Помимо этого, термин слитый белою), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к слиянию первой аминокислотной последовательности, как, например, эндолизин, со второй или последующими аминокислотными последовательностями. Вторая или последующие аминокислотные последовательности могут определять домен или прочие участки пептидной цепи. Предпочтительно, вторая или последующие аминокислотные последовательности представляют собой пептидную цепь, в частности, катионный пептид, поликатионный пептид, амфипатичный пептид, 8икй1 пептид, дефензин, гидрофобный пептид, или антимикробный пептид. Более предпочтительно, упомянутые вторая или последующие аминокислотные последовательности чужеродны и по преимуществу не гомологичны с любой областью первой аминокислотной последовательности.
Помимо этого пептидная цепь в том значении, в котором она трактуется в заявленном изобретении, не относится к Н1к6-тагам, 81гер-тагам, Ανί-тагам, Мус-тагам, 0к1-тагам, Ιδ-тагам, цистеин-тагам, РЬАО-тагам или прочим тагам (меткам), известным из уровня техники, тиоредоксин- или мальтозасвязывающим белкам (МСБ). Термин метка или таг, в отличие от термина пептидная цепочка, используемый в описании заявленного изобретения, относится к пептиду, который применяется для облегчения экспресии и/или аффинной очистки полипептида, для иммобилизации полипептида на поверхности, или для применения в качестве маркера или меченой составляющей для обнаружения полипептида, например, при помощи связывания антител в различных форматах энзим связанного иммуносорбентного метода исследования (ЕБ18А), если только функция построения метки, применяемая для любой из вышеперечисленных фасилитаций, не вызвана положительным зарядом упомянутого пептида. Тем не менее, Ηίκ-метка может, в зависимости от соответствующего показателя рН, быть положительно заряженной, но используется в качестве средства аффинной очистки вследствие своей способности связываться с иммобилизированными бивалентными катионами, а не как пептидная цепочка, в соответствии с заявленным изобретением. Термин пептидная цепь, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к любому типу пептида, связанного с белком, например, с эндолизином. В частности, термин пептидная цепь, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к катионному пептиду, поликатионному пептиду, амфипатичному пептиду, ЗикЫ
- 3 024253 пептиду, дефензину, гидрофобному пептиду, и/или антимикробному пептиду. Тем не менее,
Термин пептид, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к малым полипептидам, состоящим из от примерно 2 до примерно 100 аминокислотных остатков, более предпочтительно, от примерно 4 до примерно 50 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно от примерно 5 до 30 аминокислотных остатков, причем аминогруппа одного аминокислотного остатка соединена пептидной связью с карбоксигруппой другого аминокислотного остатка. Пептид может обладать специфической функцией. Пептид может представлять собой природный пептид или пептид, сконструированный и полученный синтетическим путем. Пептид могут, к примеру, извлекать или получать путем удаления из нативного белка при помощи энзиматического (ферментативного) или химического расщепления, либо могут приготавливать с использованием методов традиционного синтеза пептидов (например, твердофазный синтез) или способов молекулярной биологии (8ее §атЬгоок, 1. с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог Рге88, СоМ 8ргшд НагЬог, Ν.Υ. (1989)). Примерами природных пептидов могут служить антимикробные пептиды, дефензины, §и8Ы пептиды. Примерами синтетически полученных пептидов являются поликатионные, амфипатичные или гидрофобные пептиды. Пептид в описании заявленного изобретения не обозначает Н18-таги (-метки), §1гертаги, белки, связывающие тиоредоксин или мальтозу (МВР) и им подобные, которые используют для очистки или локализации белков.
Термин эндолизин, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к энзиму, применение которого приемлемо для гидролиза клеточных стенок бактерий. Эндолизины состоят как минимум из одного энзим-активного домена (ЭАД), и обладают свойствами как минимум одного из нижеперечисленных компонентов: эндопептидаза, Ν-ацетил-мурамоил-Ь-аланинамидаза (амидаза), Ν-ацетил-мурамидаза, Ν-ацетил-глюкозаминидаза (лизосим) или трансгликолазы. Дополнительно, эндолизины могут включать также энзим-неактивные области, которые могут связываться с клеточной стенкой бактерии-хозяина, так называемые, домены связывания с клеточной стенкой. Эндолизин может состоять из двух или более доменов связывания с клеточной стенкой. Помимо этого, термин эндолизин, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к энзимам, содержащим как минимум один ЭАД, но ни одного домена связывания с клеточной стенкой. Как правило, домен связывания с клеточной стенкой обладает функцией связывания различных компонентов на поверхности бактерии. Предпочтительно, домен связывания с клеточной стенкой представляет собой пептидогликан-связывающий домен, который связывается с пептидогликан-структурой бактерии. Различные домены эндолизина могут связываться доменным линкером.
Термин доменный линкер, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к аминокислотной последовательности, функционирующей в качестве связывающего звена единичные белковые домены друг с другом. Как правило, доменные линкеры не образуют или почти не образуют регулярную вторичную структуру, как, например, альфа-спиральные или бетаскладчатые структуры и могут занимать различные конформации с соответствующим структурным окружением (контекстом). Способы детекции доменного линкера и определения свойств линкерных последовательностей хорошо известны из уровня техники, например, из публикации Вае и соавторов, 2005, Вюш1огта1ю8, 21, 2264-2270 ог Сеогде & Негшда, 2003, Рго1еш Епдшеегшд, 15, 871-879.
Термин дикий тип или дт, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к аминокислотной последовательности эндолизина ΟΒΡ§ρΕΥδ, представлен в §Еф ГО ΝΟ: 86. Нуклеотидная последовательность, кодирующая эндолизин дикого типа ΟΒΡ§ρΕΥδ, представлена в §Еф ГО ΝΟ: 101.
Термин делеция, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к делеции (удалению) 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных остатков из соответствующей стартовой последовательности.
Термины инсерция или аддиция, в том смысле, в котором они используются в описании заявленного изобретения, относятся к инсерции или адциции 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных остатков соответствующей стартовой последовательности.
Термин субституция, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к замене аминокислотного остатка, расположенного на определенной позиции, на другой аминокислотный остаток.
Термин клеточная стенка, используемый в описании заявленного изобретения, относится ко всем компонентам, образующим внешнюю оболочку клетки грамотрицательной бактерии, обеспечивая, таким образом, ее целостность. В частности, термин клеточная стенка в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептидогликану, внешней мембране грамотрицательной бактерии с липополисахаридом, клеточной мембране бактерии, а также к дополнительным слоям на пептидогликане, как, например, капсулы, внешние белковые слои или слаймы.
Термин ЭАД, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к энзим-активному домену эндолизина. ЭАД ответственен за гидролиз бактериальных пептидогликанов. Этот домен обладает как минимум одной энзим-функцией эндолизина. ЭАД также может состоять из более чем одного энзим-активного модуля. Термин ЭАД используется в описании заявленно- 4 024253 го изобретения синонимично с термином каталитический домен.
В описании заявленного изобретения, термин катионный пептид относится к пептиду с положительно заряженными аминокислотными остатками. Предпочтительно, катионный пептид имеет значение рКа (отрицательный десятичный логарифм константы диссоциации) равное 9,0 или выше. Как правило, по крайней мере, четыре аминокислотных остатка катионного пептида могут быть положительно заряженными, например, лизин или аргинин. Термин положительно заряженные относится к боковым цепочкам аминокислотных остатков, которые имеют чистый положительный заряд при физических условиях. Термин катионный пептид, используемый в заявленном изобретении, также относится к поликатионным пептидам.
Термин поликатионный пептид, используемый в описании заявленного изобретения, относится к смоделированным и синтезированным пептидам, состоящих преимущественно из положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности, остатков лизина и/или аргинина. Пептид состоит преимущественно из положительно заряженных аминокислотных остатков, причем как минимум примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или около 100% аминокислотных остатков представляют собой положительно заряженные аминокислотные остатки, в частности остатки лизина и/или аргинина. Те из аминокислотных остатков, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки и/или отрицательно заряженные аминокислотные остатки и/или гидрофобные аминокислотные остатки. Более предпочтительно, те из аминокислотных остатков, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки, в частности серии и/или глицин.
Термин антимикробные пептиды (АМП), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к любому пептиду с микробицидной и/или микробиостатической функциями. Так, например, термин антимикробный пептид, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится, в частности, к любому пептиду с антимикробной, антигрибковой, антимикотической, антипаразитарной, антипротозойной, антивирусной, антиинфекционной, антиконтагиозной и/или бактерицидной, альгицидной, амебоцидной, микробицидной, бактерицидной, фунгицидной, паразитицидной, протозоицидной функцией.
Термин дефензин, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептиду, встречающемуся в животном мире, предпочтительно, у млекопитающих, более предпочтительно, у человека, причем дефензин выполняет важную функцию в механизме внутренней защитной системы организма-хозяина, разрушая чужеродные вещества, как, например, инфекционные бактерии и/или инфекционные вирусы и/или грибки. Дефензин представляет собой микробицидный и/или туморицидный белок, пептид или полипептид типа не-антитело. Примерами дефензинов могут являться дефензины млекопитающих, альфа-дефензины, бета-дефензины, индолицин и магаинины. Термин дефензины, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится как к изолированной форме из клеток животных, так и к синтетически получаемой форме, и также относится к вариантам, которые преимущественно сохраняют цитотоксические свойства своих родительских белков, но чьи последовательности изменили путем инсерции или делеции одного или более аминокислотных остатков.
Термин §Ц8Ы пептид, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к белкам комплементарного контроля с короткими повторениями транскрипции. διίδΐιί модуль ЗикЫ пептидов функционирует как домен взаимодействия белок-белок в различных белках. Доказано, что пептиды, содержащие διίδΐιί домен, показывают антимикробную активность.
Термин амфипатичный пептид, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептидам, имеющим как гидрофильные, так и гидрофобные функциональные группы. Предпочтительно, в контексте описания заявленного изобретения, термин амфипатичный пептид относится к пептиду, имеющему определенное расположение гидрофильных и гидрофобных групп, например, амфипатичные пептиды могут являться альфа-спиральными, с превалирующими неполярными боковыми цепями вдоль одной стороны спирали и полярными остатками вдоль остальной части поверхности.
Термин гидрофобная группа, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к химическим группам, как, например, аминокислотные боковые цепи, которые преимущественно водонерастворимы, но растворимы в масляной фазе, причем растворимость в масляной фазе выше, чем растворимость в воде или водной фазе. В воде, аминокислоты с гидрофобной боковой цепью, взаимодействуют друг с другом для получения неводной среды. Примерами аминокислотных остатков с гидрофобными боковыми цепями являются остатки валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и глицина.
Заявленное изобретение относится к новым антибактериальным агентам, активным в отношении грамотрицательных бактерий, в частности, к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО N0: 1 или ее фрагменты или производные. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО N0: 1 предпочтительно кодируют нук- 5 024253 леотидной последовательностью в соответствии с 8ЕО ГО N0: 3.
Эндолизин 0ВР§рЬУ8 с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 имеет длину в 328 аминокислотных остатков. Он содержит ^концевой домен связывания с клеточной стенкой (СВЭ) и С-концевой энзим-активный домен (ЭАД). Ν-концевой СВЭ представляет собой пептидогликан-связывающий домен (РОВ, аа 7-96) с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 4. С-концевой ЭАД представляет собой каталитический домен (аа 126-292), соотносящийся с каталитическим доменом лизосом-подобного суперсемейства и с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 5. РОВ и каталитический домен эндолизина 0ВР§рЬУ8 соединены доменным линкером.
Таким образом, предпочтительными фрагментами полипептида в соответствии с заявленным изобретением являются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 4 и/или в соответствии с 8Е0 ГО N0: 5. Другой предпочтительный фрагмент полипептида в соответствии с заявленным изобретением содержит аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 69. Фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 69 отличается от полипептида с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 тем, что стартовый остаток метионина был удален.
Производные в соответствии с заявленным изобретением представляют собой полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1, 4, 5 и/или 69, но с дополнительными модификациями и/или альтерациями (изменениями). Такие изменения и/или модификации могут включать мутации, как, например, делеции, инсерции и аддиции, субституции или сочетания вышеупомянутых и/или химические изменения аминокислотных остатков, например, биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, 8Н- или карбоксигрупп. Упомянутые производные в соответствии с заявленным изобретением показывают литическую активность 0ВР§рЬУ8 (8Е0 ГО N0: 1) и/или активность фрагментов в соответствии с заявленным изобретением. Упомянутая активность может находиться на уровне 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или примерно 200% от уровня активности 0ВР§рЬУ8 и/или от уровня активности фрагментов в соответствии с заявленным изобретением. Активность можно измерить опытным путем при помощи методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, как например, чашечный тест определения (гемолиза) или анализ в жидкой среде, которые описаны в публикациях (Впегк с1 а1, 1. Вюсйет. Вюрйук МеОюбк 70: 531-533, (2007)).
Предпочтительные производные в соответствии с заявленным изобретением представляют собой полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 86 и 87. Упомянутые производные отличаются от полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 и 8Е0 ГО N0: 69, соответственно, тем, что остаток лейцина подвергли субституции на остаток гистидина в положениях 325 и 324, соответственно. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 86 предпочтительно кодируют нуклеотидной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0:101.
В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, полипептид, фрагмент и/или производное в соответствии с заявленным изобретением содержат дополнительно таг (метку), как, например, Н1к6-таг, 81гер-таг. Ανί-таг, Мус-таг, Οκΐ-таг, 18-таг, цистеин-таг, РЬАО-таг или прочие таги, известные из уровня техники, на Оконце или на С-конце. В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, упомянутый таг связан с полипептидом, фрагментом и/или производным в соответствии с заявленным изобретением на С-конце. Упомянутый таг может быть связан с полипептидом, фрагментом и/или производным при помощи дополнительных аминокислотных остатков. Упомянутые дополнительные аминокислотные остатки могут состоять из как минимум 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, таг связан с полипептидом, фрагментом и/или производным в соответствии с заявленным изобретением при помощи дополнительных аминокислотных остатков Ьеи-О1и ог Ьук-О1у.
В предпочтительном варианте практического воплощения заявленное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 47 ог 8Е0 ГО N0: 88. Полипептид с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 47 и 8Е0 ГО N0: 88, соответственно, содержит, по сравнению с полипептидом с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 и 8Е0 ГО N0: 86, соответственно, дополнительный С-концевой Н156-таг, связанный с С-концом полипептида с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 и 8Е0 ГО N0: 86, соответственно, при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Ьук-О1у). Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 47 предпочтительно кодируют нуклеотидной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 48. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 88 предпочтительно кодируют нуклеотидной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 89.
Еще одним аспектом заявленного изобретения являются слитые белки, образованные из полипептида, фрагмента и/или производного в соответствии с заявленным изобретением и пептидная цепь, сли- 6 024253 тая с полипептидом, фрагментом и/или производным в соответствии с заявленным изобретением на Νили С-концах.
Пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением предпочтительно связана ковалентной связью с полипептидом, фрагментом и/или производным в соответствии с заявленным изобретением. Предпочтительно, упомянутая пептидная цепь состоит из как минимум 5, более предпочтительно из как минимум 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,
60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или как минимум 100 аминокислотных остатков. Наиболее предпочтительной является пептидная цепь, содержащая от примерно 5 до примерно 100 аминокислотных остатков, от примерно 5 до примерно 50 или от примерно 5 до примерно 30 аминокислотных остатков. Более предпочтительной является пептидная цепь, содержащая от примерно 6 до примерно 42 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 39 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 38 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 31 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 25 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 24 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 22 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 21 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 20 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 19 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 16 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 14 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 12 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 10 аминокислотных остатков или от примерно 6 до примерно 9 аминокислотных остатков. Предпочтительно, пептидная цепь не содержит таг (метку), как, например, Ηίδ-таг, 81гер-таг, Άνί-таг, Мус-таг, Οδΐ-таг, 18-таг, цистеин-таг, РЬАО-таг или прочих таги, известные из уровня техники и никаких тиоредоксин- или мальтоза-связывающих белков (МВР). Тем не менее, пептидная цепь может содержать дополнительно такой таг(и), функцией которых является очищение или локализация белков.
Более предпочтительно, пептидная цепь обладает способностью направлять слитый белок через внешнюю мембрану грамотрицательной бактерии, но также обладает ничтожной или минимальной активностью при введении без слития с полипептидом, фрагментом и/или производным в соответствии с заявленным изобретением. Функция проведения слитого белка через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий обусловлена потенциалом внешней мембраны или ЛПС разрушающей активностью упомянутой пептидной цепи. Для определения, обладает ли пептидная цепь мембрано- или ЛПС разрушающей активностью, упомянутую цепь можно подвергнуть слиянию с полипептидом в соответствии с заявленным изобретением, как, например, описано в примерах в заявленном изобретении. Соответственно, фиксируемая антибактериальная активность слитого белка, состоящего из полипептида в соответствии с заявленным изобретением и пептидной цепи, можно сравнить с полипептидом в соответствии с заявленным изобретением без пептидной цепи, как также описано в примерах в соответствии с заявленным изобретением, и, к примеру, как показано на фиг. 5А-Е и фиг. 6. Предпочтительно упомянутые испытания можно проводить на клетках ЕвсйейсЫа сой \УК6 и/или РвеиДошоиав аегищпова РАО1р, как описано в примерах к заявленному изобретению. В случае, если слитый белок показывает повышенную антибактериальную активность по сравнению с полипептидом в соответствии с заявленным изобретением без упомянутой пептидной цепи, в отношении как минимум одного из испытуемых грамотрицательных бактериальных штаммов, тогда упомянутая пептидная цепь имеет мембрану или обладает ЛПСразрушающей активностью. Предпочтительно, антибактериальная активность (в логарифмических юнитах (=1одюН/^)) полипептида в соответствии с заявленным изобретением повышается как минимум на примерно 5%, более предпочтительно как минимум примерно на 10%, за счет присутствия пептидной цепи, имеющей мембрану или обладающей ЛПС-разрушающей активностью.
В одном из аспектов заявленного изобретения, слитая пептидная цепь представляет собой амфипатичный пептид, который содержит один или более положительно заряженных аминокислотных остатков лизина, аргинина и/или гистидина, в сочетании с одним или более гидрофобными аминокислотными остатками валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и/или глицина. Боковые цепи аминокислотных остатков предпочтительно ориентированы с учетом того, что катионные и гидрофобные поверхности упорядочены в кластеры на противоположных сторонах пептида. Предпочтительно, более, чем примерно 30, 40, 50, 60 или 70% аминокислотных остатков в упомянутом пептиде являются положительно заряженными аминокислотами. Предпочтительно, более, чем примерно 30, 40, 50, 60 или 70%, аминокислотных остатков в упомянутом пептиде являются гидрофобными аминокислотными остатками. Предпочтительно, амфипатичный пептид слит с Ν-концом и/или С-концом полипептида, фрагмента и/или производного в соответствии с заявленным изобретением, обладающими способностью разрушать клеточную стенку, повышая таким образом амфипатичность упомянутых белков.
В предпочтительном варианте практического воплощения, как минимум примерно 30, 40, 50, 60 или 70% упомянутых аминокислотных остатков амфипатичного пептида являются остатками либо аргинина, либо лизина и/или как минимум 30, 40, 50, 60 или 70% упомянутых аминокислотных остатков амфипатичного пептида являются остатками гидрофобных аминокислот валина, изолейцина, лейцина, ме- 7 024253 тионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и/или глицина.
Предпочтительными амфипатичными пептидами являются ΡΙοιιΐΌοίύίη в соответствии с 8Е0 ГО N0:6, Сесгорш Р1 в соответствии с 8Е0 ГО N0:7, ВиГопп II в соответствии с 8Е0 ГО N0:8, ВиГопп I в соответствии с 8Е0 ГО N0:19 и Мадагшп в соответствии с 8Е0 ГО N0:10. Более предпочтительными амфипатичными пептидами являются СаГОеМюше, например, ЬЬ-37 в соответствии с 8Е0 ГО N0:11.
В другом аспекте заявленного изобретения слитая пептидная цепь представляет собой антимикробный пептид, который содержит номинальный положительный заряд и примерно 50% гидрофобных аминокислотных остатков. Антимикробные пептиды являются амфипатичными. с длиной примерно от 12 до примерно 50 аминокислотных остатков.
Предпочтительные антимикробные пептиды приведены в нижеследующей таблице.
Пептид Последовательность
ЬЬ-37 ЬЬСОРРККЗКЕЫСКЕГКИУрЩКВГЬЕНЬУРКТЕЗ 8ΕΡΠ3ΝΟ: 11
8МАР-29 ΚΟΓΚΚΙ.ΟΚΚΪΑΗΟνΚΚΥΟΡΤνΓΚΙΙΚΙΛΟ ЗЕр Ю N0: 12
Ιηάοϋοκϋη ΙίΡν/ΚΎΡ’λ'ν,'Ρ'Λ'ΚΚ. 8ΕΡΙΟΝΟ: 13
Рго1е£пп КООКЬСУСКККРСУСУОК 8Ер ΙϋΝΟ: 14
Сесгорш Р1 ЗЗУЬ8КТАКК1,ЕХ8АККК13ЕС1А1А1рОСРК ЗЕр ГО N0:7
Ма^ашт ОЮКРЬН8АККРОКАРУОЕ1МЫ8 ЗЕр ГО N0: 10
РкигоскНп СЗУСЗРРККААНУСКНУОКААЬТНУЬ ЗЕр Ю N0:6
Сесгорш А (А.ае^урП) ООЬККЬОККЬЕОАОККУРЫААЕКАЬРУУАОАКАЬКК ЗЕр ГО N0:15
Сесгорш А (Ц. те1апо8аЯег) ОУАКЫаКЩЕЕУСрНТРЮАПрСЬСНРррААМУААТ АКС ЗЕр ГО N0: 16
ВиГогт II ТК88КАСЬрРРУСКУНКЬЬКК ЗЕр ГО N0:8
ЗагсоГохт IА С'УЕККЮККТЕКУСрНТКОАПрС.ЬОТАррА.АЧУАЛТ АК ЗЕрЮЖ): 17
АзсарЫпе О1ЫЭ5ИКСААККЫК.ТУА8ШАЫр ЗЕр ГОЖ): 50
Аргёаесте ΑΝΚΡνΥΙΡΡΡΚΡΡΗΡΚΙ. ЗЕр ГО N0:51
ΝίβΓοαίηβ СЬЬЗКУЬОУОККУЬСОУЗСЬУС ЗЕр ГО N0:52
Рзеи<1т 1 ϋίΝΤίΚΚνρραυΐΕΑΙΚ.υΝΝΗνθ 8Е0ГОЖ): 53
Рага&т 1 КОКОКрОСКУКАКАКТКЗЗ ЗЕр ΙΟ N0:72
Ьусогохш 1У.ЪТЛЬК1ЬОКНАУККЬАКррЬЗКЬ 3ΕΟΙΟΝΟ:73
Капакхт РЬОСЫУРАМГСАУТККС ЗЕрГОЖ): 117
МейПт ОЮАУЬКУЬТ ТОЬРАЫЗТО ККККрр ЗЕр ГО N0: 119
Еще в одном аспекте заявленного изобретения слитая пептидная цепь представляет собой 8изЫ пептид, описанный в публикации Όίη§ ГО, Ы Р, Но В Се11 Мо1 ЫГе 8с1. 2008 Арг;65(7-8): 1202-19. Тйе 8изЫ рерйбез: з1гис1ига1 сНагасЮп/айоп апб тобе оГ асйоп адашз! Сгат-педайуе Ъас!епа.
Предпочтительные 8из1й пептиды - это 8ι.ΐ3ΐιί пептиды 81 и 83 и их производные; РА8ЕВ I. 2000 8ер;14(12): 1801-13.
В еще одном аспекте заявленного изобретения слитая пептидная цепь представляет собой дефензин, предпочтительно СаШеНшбше, Сесгорш Р1, Сесгорш А или Мада1шп II.
В еще одном аспекте заявленного изобретения слитая пептидная цепь представляет собой гидрофобный пептид, предпочтительно содержащий аминокислотную последовательность Рйе-Рйе-Уа1-А1аРго (8Е0 ГО N0: 18).
Специфические примеры предпочтительных пептидных цепей приведены в нижеследующей таблице.
А1рЬа4 ΡΝΚΑΚΚνίΤΤΡΚΤ 8Ε()Ι!)ΝΟ: 68
Ατίΐΐγβΐηΐ ОРР1РАУ1ЬР81АРЬГУР 8Ε0ΙϋΝΟ:70
АгШумп2 ОКРО\УЫККАЕУРККЫК.КРЕКК1.Л 8Ε0ΙΟΝΟ:71
ЧУЬВШ вариант κκ\ννκκνκρ.νκκ\ννκκννκ.ννκκ\ννκκ δΕφΙΟΝΟ: 118
В одном из аспектов заявленного изобретения, слитая пептидная цепочка является катионным и/или поликатионным пептидом, который состоит из одного или более положительно заряженных аминокислотных остатков лизина, аргинина и/или гистидина, в частности, лизина и/или аргинина. Предпочтительно, более 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% аминокислотных остатков в упомянутой пептидной цепочке представляют собой положительно заряженные аминокислотные остатки, в частности остатки лизина и/или аргинина. Наиболее предпочтительными являются пептидные цепочки, состоящие из примерно 100% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков аргинина и/или лизина, причем предпочтительно примерно от 60% до примерно 70% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки лизина и примерно от 30% до примерно 40% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки аргинина. Более предпочтительной является пептидная цепочка, состоящая из примерно 100% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков аргинина и/или лизина, причем
- 8 024253 предпочтительно от примерно 64% до примерно 68% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки лизина и примерно от 32% до примерно 36% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки аргинина. Также предпочтительными являются пептидные цепочки, состоящие либо только из аргинина, либо только лизина.
Наиболее предпочтительными являются катионные и/или поликатионные пептидные цепочки, состоящие как минимум из одного мотива в соответствии с 8ЕО ГО N0: 19 (КККККК). В частности, катионные пептидные цепочки, состоящие из как минимум 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 мотивов в соответствии с 8Е0 ГО N0: 19 (КККККК) являются предпочтительными. Более предпочтительны - катионные пептидные цепочки, состоящие из как минимум ККК мотива (лизин-аргинин-лизин), предпочтительно из как минимум 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или 33 ККК мотивов.
В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, катионная пептидная цепочка состоит, помимо положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина и/или аргинина, из нейтрально заряженных аминокислотных остатков, в частности из остатков глицина и/или серина. Предпочтительными являются катионные пептидные цепочки, состоящие из примерно от 70% до примерно 100%, или от примерно 80% до примерно 95%, или от примерно 85% до примерно 90% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина, аргинина и/или гистидина, более предпочтительно, остатков лизина и/или аргинина и примерно от 0% до примерно 30%, или примерно от 5% до примерно 20%, или примерно от 10% до примерно 20% нейтрально заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков глицина и/или серина. Предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие из примерно от 4% до примерно 8% остатков серина, из примерно от 33% до примерно 36% остатков аргинина и от примерно 56% до примерно 63% остатков лизина. Наиболее предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие из как минимум одного мотива в соответствии с 8Е0 ГО N0: 40 (ККХКК), причем X является любой другой аминокислотой, кроме лизина, аргинина и гистидина. Наиболее предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие из как минимум одного мотива в соответствии с 8Е0 ГО N0: 41 (КК8КК). Более предпочтительны - катионные цепочки, состоящие из как минимум 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или примерно 20 мотивов в соответствии с 8Е0 ГО N0: 40 (ККХКК) или 8Е0 ГО N0: 41 (КК8КК).
Также предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие из примерно от 9 до примерно 16% остатков глицина, от примерно 4 до примерно 11% остатков серина, от примерно 26 до примерно 32% остатков аргинина и примерно от 47 до примерно 55% остатков лизина. Наиболее предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие из как минимум одного мотива в соответствии с 8Е0 ГО N0: 42 (ККС8С). Более предпочтительными являются катионные цепочки, состоящие из как минимум примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или примерно 20 мотивов в соответствии с 8Е0 Ю N0: 42 (ККС8С).___
Пептидная цепочка Длина Последователь ность, №:
КККККК 6 8Е<3 ГО ΝΟ: 19
ккккккккк 9 8ΕΓ) ГО ΝΟ: 20
ккккккккк 9 8ΕΟΠ3ΝΟ:21
кккккккк 8 8Εζ> ГО ΝΟ: 22
кккккккккк 10 8Е<3 ГО ΝΟ: 23
кккккккккккк 12 5Εζ>ΙΓ)ΝΟ:24
кккккккккккккк 14 8Е0 ГО N0:25
кккккккккккккккк 16 8Е(3 ГО ΝΟ: 26
ккккккккккккккккккк 19 8Е<3 ГО ΝΟ: 27
ккккккккккккккккккк 19 8Е0 ГО ΝΟ: 28
ккккккккккккккккккк 19 3Εζ)ΙΏΝΟ:29
ΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚ8ΚΚΚΚΚΚΚΚΚ 20 8Е0 ГО ΝΟ: 30
ККККККККККККККККККККК 21 8ΕΟΙΟΝΟ:31
ккккккккккккккккккккк 21 8ΕΟΙΟΝΟ: 32
ККККККККККО8ОККККККККК 22 8Е<3 ГО ΝΟ: 33
ККККККККККО8С8ОККККККККК 24 5ΕΓΙΠ3ΝΟ: 34
ККККККККККККККККККККККККК 25 8ΕΟΙΟΝΟ: 35
КККККККККК8КККККККККК8ККККККККК 31 3Ε0ΙΟΝΟ: 36
ККККККККККО8О8СКККККККККО8О8ОККККККККК 38 8Ер ГО ΝΟ: 37
ККККККККККККККККККККККККККККККККККККККК 39 8Ε<2 ГО ΝΟ: 38
КККККККККК8КККККККККК8КККККККККК8ККККККККК 42 ЗЕ<3 ГО ΝΟ: 39
В другом варианте предпочтительного воплощения заявленного изобретения катионная пептидная цепочка состоит, помимо положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина и/или аргинина, из гидрофобных аминокислотных остатков, в частности остатков валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и/или глицина, более предпочтительно из остатков аланина, валина, лейцина, изо- 9 024253 лейцина, фенилаланина, и/или триптофана. Предпочтительными являются катионные пептидные цепочки, состоящие из примерно от 70% до примерно 100%, или примерно от 80% до примерно 95%, или от примерно 85% до примерно 90% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина и/или аргинина и от примерно 0% до примерно 30%, или от примерно 5% до примерно 20%, или от примерно 10% до примерно 20% гидрофобных аминокислотных остатков, остатков валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и/или глицина.
Наиболее предпочтительными являются пептидные цепочки, выбираемые из группы, состоящей из следующих последовательностей.
Особенно предпочтительным является слитый белок, содержащий полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением, и пептидная цепь с аминокислотной последовательностью в соответствии с 5>ЕО ГО N0: 20. Более предпочтительны слитые белки с аминокислотной последовательностью в соответствии с 5>ЕО ГО N0: 43 и 5>Е0 ГО N0: 115. Также предпочтительны слитые белки с аминокислотной последовательностью в соответствии с 5>Е0 ГО N0: 49 и 5>Е0 ГО N0: 116. Слитые белки с аминокислотной последовательностью в соответствии с 5>Е0 ГО N0: 49 и 5>Е0 ГО N0: 116, соответственно, содержащие, по сравнению со слитыми белками с аминокислотной последовательностью в соответствии с 5>Е0 ГО N0: 43 и 5>Е0 ГО N0: 115, соответственно, дополнительный С-концевой Н186-таг, связанный с С-концом слитого белка с аминокислотной последовательностью в соответствии с 5>Е0 ГО N0: 43 и 5>Е0 ГО N0: 115, соответственно, при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Ьу8-01у). Слитые белки с аминокислотной последовательностью в соответствии с 5>Е0 ГО N0: 43 и 5>Е0 ГО N0: 115 и 5>Е0 ГО N0: 49 и 5>Е0 ГО N0: 116, соответственно, отличаются тем, что каждый из слитых белов с аминокислотной последовательностью в соответствии с 5ЕО ГО
N0: 115 и 5>Е0 ГО N0: 116 имеет субституцию остатка лейцина на остаток гистидина в позиции
336.
Еще в одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения, пептидные цепи слитого белка в соответствии с заявленным изобретением содержат модификации и/или альтерации аминокислотных последовательностей. Такие альтерации и/или модификации могут содержать мутации, как, например, делеции, инсерции и аддиции, субституции или сочетания вышеперечисленных и/или химические изменения аминокислотных остатков, биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, 8Н- или карбоксильных групп.
Вышеописанный слитый белок в соответствии с заявленным изобретением состоит из:
(а) полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением, и (б) пептидной цепи, слитой с упомянутыми полипептидом, фрагментом, производным и/или слитым белком на N или С-конце, и, факультативно (в) тага, например, Н|86-тагов. §1тер-тагов, Άνί-тагов, Мус-тагов, 081-тагов, Ιδ-тагов, еу81еш-тагов, РЕАО-тагов или прочих тагов, известных из уровня техники, на N или С-конце.
В случае, если пептидная цепь слита с полипептидом, фрагментом и/или производным в соответствии с заявленным изобретением на С-конце, слитый белок содержит дополнительный таг, предпочтительно на Оконце. В наиболее предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, пептидная цепь слита с полипептидом, фрагментом и/или производным в соответствии с заявленным изобретением на Оконце. В случае, если упомянутый слитый белок содержит дополнительный таг, данный таг предпочтительно расположен на С-конце.
Два и три компонента слитого белка, соответственно, как описано выше, могут быть связаны друг с другом при помощи дополнительных аминокислотных остатков, например, вследствие клонирования. Кроме того, пептидная цепь может быть соединена со стартовым метиониновым остатком слитого белка при помощи дополнительных аминокислотных остатков. Упомянутые дополнительные аминокислотные остатки могут состоять, как минимум, из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, пептидная цепь соединена с полипептидом, фрагментом и/или производным в соответствии с заявленным изобретением при помощи дополнительных аминокислотных остатков 01у-8ет или 01у-01у-8ет. Дополнительные аминокислотные остатки, соединенные со стартовым метиониновым остатком и пептидной цепью предпочтительно представляют собой 01у-8ет. В случае, если слитый белок дополнительно содержит таг, полипептид, фрагмент и/или производное в соответствии с заявленным изобретением предпочтительно связаны с упомянутым тагом при помощи дополнительных аминокислотных остатков Ьеи-01и или Ьу801у.
Перечень наиболее предпочтительных слитых белков в соответствии с заявленным изобретением приведены в первом столбце нижеследующей таблицы, со стартовым остатком метионина на Оконце (второй столбец таблицы) и завершающим факультативным тагом на С-конце (последний столбец таблицы).
- 10 024253
Слитый белок в соответствии с заявленным Первый аминокислотный Дополни- тельные амино- Пептидная Дополни- тельные амино- Полипептид, фрагмент, производное в соответствии с заявленным Дополни- тельные амино- Таг
изобретением остаток кислотные цепь кислотные изобретением кислотные (С-
(ЗЕОГО N0;) (Ν-концевой) остатки (ЗЕф ГОЖ):) остатки (8ЕО Ю ΝΟ:) остатки концевой)
ЗЕф:43 Ме1 - 8Еф:20 01у-8ег ЗЕф: 69 - -
ЗЕф:49 Ме1 - ЗЕф: 20 О1у-8ег ЗЕф: 69 Ьу8-О1у Ш56-1а§
ЗЕф. 54 Мег - ЗЕф: 50 01у-8ег ЗЕф: 87 - -
ЗЕф: 55 ММ - ЗЕф: 50 О1у-8ег ЗЕф: 87 Ьеи-О1и Н136-1аё
8Еф: 56 Ме1 - ЗЕф: 51 01у-8ег ЗЕф: 87 - -
ЗЕф: 57 Ме1 - ЗЕф: 51 01у-8ег ЗЕф: 87 Ьеи-СНи Н18е-(а§
ЗЕф:58 Ме1 - ЗЕф: 52 О1у-8ег ЗЕф: 87 -
ЗЕф:59 Ме1 - ЗЕф: 52 01у-8ег ЗЕф: 87 1,еи-О1и Н186-1аё
ЗЕф:60 Ме1 - ЗЕф: 53 01у-8ег ЗЕф: 87 -
ЗЕф: 61 Μεΐ - ЗЕф: 53 С1у-8ег ЗЕф: 87 Ьеи-С1и Н136-1аВ
ЗЕф: 62 ММ - ЗЕф: 17 С1у-8ег ЗЕф: 87 -
ЗЕф: 63 Ме1 - ЗЕф: 17 С1у-8ег ЗЕф: 87 Ьеи-С1и Н18б-1ав
ЗЕф: 64 ММ - ЗЕф: 12 01у-8ег ЗЕф: 87 - -
ЗЕф: 65 Ме1 - ЗЕф: 12 О1у-3ег ЗЕф: 87 Ееи-СНи Н186-1аё
ЗЕф: 66 Ме1 - ЗЕф: 15 С1у-8ег ЗЕф: 87 - -
ЗЕф: 67 Ме1 - ЗЕф: 15 О1у-8ег ЗЕф: 87 Ьеи-СНи Н136-1аё
ЗЕф: 74 Ме1 О1у-3м ЗЕф: 68 О1у-3ег- 8ег ЗЕф: 87
ЗЕф: 75 Ме1 01у-8ег ЗЕф: 68 С1у-3м- Зег ЗЕф: 87 Ьуз-61у Н136-1аё
ЗЕф: 76 Ме1 01у-8ег ЗЕф: 69 О1у-5ег- 8ег ЗЕф: 87
ЗЕф: 77 Ме( 01у-8ег ЗЕф: 69 О1у-3ег- 8м ЗЕф: 87 Ьуз-О1у Н136-1ай
ЗЕф: 78 Ме1 О1у-3ег ЗЕф: 70 О1у-8ег- 8ег ЗЕф: 87
ЗЕф; 79 Ме1 С1у-5ег ЗЕф: 70 С1у-3ег- 8ег ЗЕф: 87 Ьуз-СНу ШЗб-1ай
ЗЕф: 80 Ме1 О1у-3ег ЗЕф: 71 С1у-8ег- 8м- ЗЕф: 87
ЗЕф: 81 Ме1 С1у-5м ЗЕф: 71 01у-8ег- Зег ЗЕф: 87 Ьуз-01у Н186-1ав
ЗЕф: 82 Ме( О1у-8м ЗЕф: 72 01у-8ег- 8ег ЗЕф: 87
ЗЕф: 83 Ме1 С1у-8м ЗЕф: 72 61у-8ег- 8ег ЗЕф: 87 Ьуз-О1у Н186-1ав
ЗЕф: 84 Μεΐ О1у-8ег ЗЕф: 73 01у-8ег- 8м ЗЕф: 87
ЗЕф: 85 Ме1 С1у-8ег ЗЕф: 73 С1у-8и- Зм ЗЕф: 87 Ьу5-О1у Н186-ид
ЗЕф: 115 ММ - ЗЕф: 20 О1у-3ег ЗЕф: 87 - -
ЗЕф: 116 Ме1 - ЗЕф: 20 О1у-3м ЗЕф: 87 Ьу5-О1у Н18б-1а§
Помимо вышеописанного, заявленное изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением. В особенности, предпочтительной является изолированная молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с 8ЕО ГО N0: 2, 3, 48, 89 ог 101. Заявленное изобретение также относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с заявленным изобретением. Упомянутый вектор может быть применим в конститутивной или индуцируемой экспрессии упомянутых полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением.
Заявленное изобретение также относится к способу получения описанных полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка из микроорганизма, как, например, генетически модифицированная приемлемая клетка-хозяин, которая экспрессирует упомянутые полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок. Упомянутая клетка-хозяин может представлять собой микроорганизм, как, например, бактерия или дрожжевая клетка, или клетка животного, например, млекопитающего, в частности, человека. В одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения, клетка-хозяин представляет собой клетку ЕзсйепсЫа сой. Клетку-хозяина могут выбирать вследствие чисто биологических параметров, например, выход, растворимость, затраты, и пр., но также и по медицинских параметрам, например, непатогенные бактерии или дрожжи, клетки организма человека. В другом из аспектов, заявленное изобретение относится к способу генетической трансформации приемлемой клетки-хозяина с целью получения полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением, при котором клетку-хозяина генетически модифицируют путем введения в клеткухозяин генетического материала, кодирующего упомянутые полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок, и последующих трансляции и экспрессии с использованием методов генной инженерии, известных специалистам в данной области.
- 11 024253
Еще в одном из аспектов заявленное изобретение относится к композиции, предпочтительно, фармацевтической композиции, содержащей полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяин, трансформированный с использованием молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением.
В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения композиция дополнительно содержит агенты, пермеабилизирующие внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, как, например, хелаты металлов, как-то ЭДТК, ТРИС, молочная кислота, лактоферрин, полимиксин, лимонная кислота и/или другие вещества, как описано в публикации Уаага (Адейк (На1 шсгеаке 1Нс регтеаЬййу оТ (Не оШег тешЪгапе. Уаага Μ. ΜιογοΗιοΙ. Кеу. 1992 8ер; 56 (3):395-441). Предпочтительными также являются композиции, содержащие сочетания вышеупомянутых пермеабилизирующих агентов. Особенно предпочтительной является композиция, содержащая от примерно 10 мкМ до примерно 100 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 50 мкМ до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до примерно 2 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до 1 мМ ЭДТК. Также предпочтительной является композиция, содержащая от примерно 0,5 мМ до примерно 2 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 1 мМ ЭДТК и дополнительно от примерно 10 до примерно 100 мМ ТРИС.
Заявленное изобретение также относится к полипептиду, фрагменту, производному и/или слитому белку в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением для применения в качестве медикаментозного препарата. В другом аспекте заявленное изобретение относится к применению полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением для применения в производстве медикаментозного препарата для лечения и/или профилактики расстройств, заболеваний и прочих дисфункций, ассоциируемых с грамотрицательными бактериями. В частности, применение для лечения и/или профилактики расстройств, заболеваний и пр.дисфункций, которые могут быть вызваны грамотрицательными бактериями, бактериальными группами, семействами, родами или видами, содержащими штаммы, патогенные для человека или животных, а именно Еп1егоЬас1ег1асеае (ЕксНепсЫа, в особенности Е. сой, 8а1топе11а, 8Н1де11а, СИгоЬайег, ЕфуагбыеПа, ЕйегоЬайег, НаТта, К1еЬк1е11а, в особенности К. рпеитошае, Могдапе11а, Рго1еик, РгоуИепаа, 8еггаИа, Уегыша), Ркеиботопабасеае (Ркеиботопак, в особенности Р. аегидшока, ВигкНоМепа, 81епо1горНотопак, 8Нетапе11а, 8рН1пдотопак, Сотатопак), №1ккепа, Могахе11а, У1Ьгю, Аеготопак, Вгисе11а, РгапсйеНа, Вогбе1е11а, Еедюпе11а, Ваг!опе11а, Сох1е11а, НаеторННик, Рак1еиге11а, МаппНе1т1а, АйшоЬасШик, Оагбпеге11а, 8р1госНае1асеае (Тгеропета и ВоггеНа), ЬерЮкрйасеае, Сатру1оЬайег, НеНсоЬайег, 8рш11ит, 81гер1оЬасШик, ВайегоМасеае (Вайего1бек, РикоЬайепит, Ргеуо1е11а, РогрНуготопак), Асше1оЬас1ег, в особенности А. Ьаитапп. В частности, для лечения и/или профилактики расстройств, заболеваний и прочих дисфункций, вызываемых Ркеиботопак аегидТ пока, Ркеиботопак риНба, ВигкНоМепа ркеибота11ек Е. соН и/или 8а1топе11а 1урЫтцгшт.
Заявленное изобретение также относится к медикаментозному препарату, содержащему полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением.
Еще в одном из аспектов, заявленное изобретение относится к способу лечения заболеваний, расстройств или прочих дисфункций у пациентов в состоянии необходимости терапии и/или профилактики, причем способ предусматривает введение пациенту эффективной дозы полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или эффективного количества хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением или композицию в соответствии с заявленным изобретением. Пациент может являться человеком или животным.
В частности упомянутый способ лечения могут применять для лечения и/или профилактики инфекций кожи, мягких тканей, респираторной системы, легких, пищеварительного тракта, глаз, ушей, зубов, носоглотки, рта, костной системы, влагалища, осложнений в виде раневых поверхностей при бактериемии и/или эндокардите, вызываемых грамотрицательными бактериями, в частности, вышеперечисленными грамотрицательными бактериями.
Дозировка и путь введения, используемые в способе лечения (или профилактики) в соответствии с заявленным изобретением зависит от специфики заболевания/локализации инфекции. Путь введения, например, может быть пероральный, наружный, внутриносовой, парентеральный, внутривенный, ректальный или другие.
Для введения полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заяв- 12 024253 ленным изобретением и/или эффективного количества хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением или композицию в соответствии с заявленным изобретением, в место локализации (или возможного распространения инфекции), применяют такую форму упаковки, которая защищает активные компоненты от воздействий внешних факторов, таких как протеазы, окисление, иммунный ответ и т.п., вплоть до достижения ими очага инфекции. Следовательно, лекарственная форма может представлять собой капсулу, драже, таблетку, порошок, суппозиторий, эмульсию, гель, лосьон, крем, мазь, инъекционный раствор, сироп, спрей, состав для ингаляций или любую другую приемлемую по медицинским показаниям упаковку. Предпочтительно, фармацевтическая композиция может содержать подобранные носители, стабилизаторы, красители, буферы или другие подходящие реагенты. Например, для местного нанесения лекарственная форма может представлять собой лосьон, крем, гель, мазь или пластырь, для назофарингального применения - физраствор для интраназального нанесения при помощи спрея.
Предпочтительно полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением используют как компонент терапии или профилактики, в случае, если инфекция вызвана мультирезистентными бактериальными штаммами, в частности, штаммами, устойчивыми к одному или более из следующей группы антибиотиков: стрептомицин, тетрациклин, цефалотин, гентамицин, цефатоксин, цефалоспорин, цефтазидим или имипенем. Кроме этого, полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением применяют как компонент терапии путем введения в сочетании с традиционными антибактериальными препаратами, такими как антибиотики, лантибиотики, бактериоцины или эндолизины и т.п.
Заявленное изобретение также относится к фармацевтическому препарату, содержащему одно или более отделений, причем как минимум одно отделение содержит один или более полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или один или более хозяинов, трансформированных с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением, или композицию в соответствии с заявленным изобретением.
В другом аспекте практической реализации заявленное изобретение относится к процессу приготовления фармацевтической композиции, причем данный процесс включает добавление путем смешивания одного или более полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или один или более хозяев, трансформированных с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением, с фармацевтически приемлемым растворителем, эксципиентом или носителем.
В более расширенном аспекте композиция в соответствии с заявленным изобретением представляет собой косметическую композицию. Некоторые виды бактерий могут вызывать раздражение на открытых участках тела пациента, например, на кожном покрове. Для предотвращения появления таких раздражений кожного покрова или вероятного патогенного влияния упомянутых бактериальных организмов, представляется возможным применение специальных косметических составов, которые содержат достаточное количество полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением для разрушения уже размножившихся или потенциально опасных очагов инфекции, вызванных грамотрицательными бактериями.
В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к применению полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением в качестве средства диагностики в здравоохранении, пищевой и природоохранной промышленности, в частности в качестве средства диагностики для диагностирования бактериальных инфекций, вызванных в частности грамотрицательными бактериями. Полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно применять в качестве инструмента направленного разрушения патогенных бактерий, в особенности грамотрицательных патогенных бактерий. Разрушению бактериальных стенок слитым белком в соответствии с заявленным изобретением можно способствовать путем добавления детергентов, как например Тгйоп Х-100 или других добавок, которые ослабляют клеточную защиту бактерий, например, полимиксин В. Специально направленное разрушение клеток небходимо как начальный этап последующего направленного уничтожения бактерий с использованием НК-методов, как например, полимеразная цепная реакция (ПЦР), гибридизация нуклеиновой кислоты или амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот, иммунобиологических методов, например, ΙΜ8, иммунофлюоресценции или анализ ЕЬГЗЛ, или методов, основанных на распознавании клеточного материала бактерий, как то энзим-анализы с использованием протеинов, чувствительных к определенным группам или видам бактерий (например, β-галактоидаза для энтеробактерий, коагулаза для коагулаз-позитивных штаммов).
В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к использованию полипептида, фрагмента, производного и/или слитого белка в соответствии с заявленным изобретением, для устранения, уменьшения и/или профилактики заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, обо- 13 024253 рудования на пищеперерабатывающих предприятиях, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, как, например, полки и места хранения пищевых продуктов, а также в любой другой области, где присутствует вероятность заражения пищевых продуктов, медицинского инструментария или прочих поверхностей в клиниках и хирургических блоках патогенными, потенциально болезнетворными и пр. нежелательными бактериями.
В частности, полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно применять в профилактических целях в качестве обеззараживающего средства. Такое обеззараживающее средство можно использовать до или после хирургических вмешательств, или, например, во время гемодиализа. Кроме того, слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно применять как компонент терапии у недоношенных детей, пациентов с ослабленной иммунной реакцией, или пациентов с протезными устройствами. Данную терапию можно проводить как профилактику, так и в острый период. В этом же контексте внутрибольничные инфекции, в особенности вызванные резистентными к антибиотикам штаммами, как например, бактериями Ркеийотоиак аегцдшока (РОКР), Лс1пе1оЬас1ег и энтеробактерии, как, например Е.соП, 8а1тоие11а, 8Ыде11а, СйгоЬас1ег, ЕфуагйОеПа, Еи1егоЬас1ег, НаРта, КПеЬОеПа, Могдапе11а, Рго1еи5, РгоуМеиаа, 8еггайа и УегОша можно лечить — как профилактически, так и в стадии острого обострения - с использованием модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением. В связи с этим, полипептид, фрагмент, производное и/или слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно использовать в качестве дезинфицирующего средства, а также в сочетании с другими ингредиентами в составе дезинфицирующего раствора, как, например, детергенты, поверхностно-активные вещества, растворители, антибиотики, лантибиотики или бактериоцины.
Следующие по тексту примеры носят иллюстративный характер и не являются ограничительными касательно сути заявленного изобретения. Если не указано иначе, в нижеследующих примерах использованы стандартные методики, принятые в молекулярной биологии, как, например, описано в издании 8атЬгоск е1 а1., 1989, Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога1огу Маииа1, 2ий еДШои, СоМ 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, Со1й 8рг1ид НагЬог, №ν Уогк.
Пример 1. Модифицированные варианты эндолизина Ркеийотоиак риййа рйаде ОВР.
0ВР§рЬУ8 с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 представляет собой модульный эндолизин из 332 аминокислотных остатков, полученных из Ркеийотоиак риййа фага ОВР с предполагаемым Ν-концевым доменом связывания с пептидогликаном и С-концевым каталитическим доменом хитиназы. 0РВ§рЬУ8 с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 47 содержит, по сравнению с 0ВР§рЬУ8 с с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1, дополнительный С-концевой Н186-таг, связанный с С-концом при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Ьу8-О1у).
Очищенную геномную ДНК фага ОВР использовали в качестве матрицы для амплификации открытой рамки считывания (ОРС, 0КР) 0ВР§рЬУ8 в стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР, РСК) с РРи полимеразой (РегтеШак, 0тапо, Саиайа) при следующих параметрах ПЦР:
95°С 2’
95°С30” 56°С 30” 72°С 2’30” циклов
72°С 10’
4°С оо
Для этого использовали стандартный 5' праймер (5' АТОАААААТАОСОАОААОААТ 3' (8Е0 ГО N0: 44)) и стандартный 3' праймер (5' ААСТАТТССОАОТОСТТТСТТТОТ 3' (8ЕО ГО N0: 45)). Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей 0ВР§рЬУ8 с генным фрагментом, кодирующим поликатионный 9-мерный пептид Еу8-Аг§-Еу8-Еу8-Аг§-Еу8-Еу8-Аг§-Еу8- (8Е0 ГО N0: 20) применили хвост ПЦР с удлиненным 5' праймером (с аналогичными упомянутой выше стандартной ПЦР параметрами) (5'АТОООАТССАААСОСААОАААСОТААОАААСОСААААААААТАОСОАОААОААТ 3' (8Е0 [□N0: 46)) и стандартным 3' праймером в соответствии с 8Е0 ГО N0: 45. Оригинальный немодифицированный 0ВР§рЬУ8 ПЦР фрагмент и удлиненный фрагмент лигандировали в рЕХР5СТ/Т0Р0® экспрессионном векторе (1иуйгодеи, СагЕЬай, СА, И8А), следуя протоколу ТА-клонирования компаниипроизводителя.
Рекомбинантную экспрессию 0ВР§рЬУ8 с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 47 и РК0ВР§рЬУ8 с аминокислотной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 49 осуществили в экспоненциально растущих клетках Е. сой ВЬ21 (λΌΕ3) рЬу88 (1иуйгодеи) после индукции с 1 мМ РРТО (изопропилтиогалактозидом) при 37°С в течение 4 ч. Оба белка подвергли очистке при помощи №2+ аффинной хроматографии (Ак!а РРЬС, ОЕ НеаНйсаге) с использованием С-концевого бхНЬтага, кодированного рЕХР5СТ/Т0Р0® экспрессионным вектором. №2+ аффинную хроматографию провели в 4 последующих этапа, все при комнатной температуре:
- 14 024253
1. Эквилибрация Н181гар НР 1 мл колонки (ОБ Неаййсаге) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (60 мМ имидазола, 0,5 мМ ЫаС1 и 20 мМ ΝαΗ2ΡΟ.1-ΝαϋΗ при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.
2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом эндолизина) в НМгар НР 1 мл колонки при скорости потока 0,5 мл/мин.
3. Отмывка колонки с 15 объемами колонки отмывочного буфера при скорости потока 1 мл/мин.
4. Элюирование связанного эндолизина из колонки с 10 объемами колонки элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 0,5 М №С1 и 20 мМ NаН2Р04-NаΟН при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.
Общий выход обоих очищенных рекомбинантных протеинов на литр экспрессионной культуры Е.сой приведен в табл. 1. Значения определили при помощи спектрофотометрического измерения протеиновой концентрации, а общий объем очищенного маточного раствора при длине волны 280 нм. Очищенные маточные растворы, состоящие из ОВРдрБУЗ и РКОВРдрБУЗ, сооответственно, в элюирующем буфере (20 мМ NаН2Р04NаОН рН7,4; 0,5 М №С1; 500 мМ имидазола) показали степень чистоты как минимум 90%, как определено визуально на δΌδ-РАОЕ (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) гелях.
Таблица 1. Выход очищенного рекомбинантного ОВРдрй-Υδ эндолизина и его РК-модифщированного варианта ΟΚΟΒΟ^ρΡΥδ на литр экспрессионной культуры Е. сой
Эндолизины Экспрессионный выход
ОВРёрЬУВ (5Е<3 ГО ΝΟ: 47) ΡΚΟΒΡ§ρΕΥ$ (5Ер ГО ΝΟ: 49) 3.3 мг 4.7 мг
Для определения антиграмотрицательного спектра эндолизинов ОВРдрй-Υδ в соответствии с δΕΟ ΙΌ NΟ: 47 и РΚΟΒР§ρ^Υδ в соответствии с δΕΟ ΙΌ NΟ: 49, испытали комбинацию 1,313 мкМ каждого эндолизина и 0,5 мМ ЭДТК на клинических мультирезистентных штаммах Р. аегцдшока Вг667, Ркеиботои8 рийба О1 (хозяин фага ОВР) и гамме прочих грамотрицательных патогенов (Р. аегцдшока РАО1р, Р. аегцдшока Вг667, Р. рцйба О1, ВигкйоМепа ркеиботайец ЕксйепсЫа сой \УК6 и δа1тоηе11а 1урЫтцгшт) (см. Табл. 3). Экспоненциально растущие бактериальные клетки (ОЭ600ш1| о! 0,6) разбавленные в 100 раз до конечной плотности примерно 106 клеток/мл каждого штамма инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания, с немодифицированным эндолизином ОВРдрй-Υδ (δΕΟ ΙΌ NΟ: 47) и модифицированным эндолизином РΚΟΒР§ρ^Υδ (δΕΟ ΙΌ NΟ: 49) каждый образец в комбинации без и вместе с 0,5 мМ ЭДТК. Для инкубации, оба эндолизина использовали в буфере (20 мМ NаН2РΟ4-NаΟН рН7,4; 0,5 М №С1; 0,5 М имидазола), причем инкубацию провели при конечной концентрации эндолизина 1,313 мкМ. В качестве контроля, каждый штамм также подвергли инкубации в течение 30 мин с 0,5 мМ ЭДТК (в таком же, как и вышеупомянутый буфер), но без эндолизина. После инкубации, клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно 105-104-103 клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани.
Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе подсчета количества клеток, рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах (=1θ§10Ν0/Ν;, где Ν0= число необработанных клеток, а Ν1 = число обработанных клеток, оба показателя рассчитаны после инкубации) (Табл. 2). Все образцы реплицировали в 3 раза. Представлены средние значения девиаций +/-. Максимальное фиксируемое снижение (редукцию) наблюдали на уровне 10 клеток/мл при первоначальной плотности клеток.
Таблица 2. Антибактериальная активность немодифицированного эндолизина (ΟΒР§ρ^Υδ,) и его модифицированного варианта (РКОВРдрЕ-Υδ) с и без ЭДТК-№ь в отношении различных экспоненциальнорастущих грамотрщательных видов бактерий, в логарифмических юнитах
0.5 мМ ΕϋΤΑ 1.313 мкМ ΟΒΡκρΙΛ 8 1.313 мкМ рковрвр ЬУ8 1.313 мкМ ОВРйрЬУ8 + 0.5 мМ ΕϋΤΑ 1.313 мкМ РКОВРарЬУ8 +0.5 мМ ЕОТА
Р, аепщтоза ΡΑΟΙρ 0.130 +/- 0.023 2.531 +/-0.173 3.079 +/-0.015 4.357 +/- 1.857 > 5.687
Р. αεηιβίηοΜ Вг667 0.031 +/- 0.023 1.082 +/- 0.083 1.163 +/- 0.063 3.144 +/- 0.223 5.272 +/- 0.573
Р. ри/Ма С1 0.412 +/- 0.055 0.141 +/- 0.027 0.904 +/- 0.079 4.891 +/- 0.000 > 4.891
Вигккоиепа р$еи<1ота11е1 0.220 +/- 0.081 0.997 +/-0.131 1.806 +/- 0.287 4.08 +/- 0.301 >4.861
ЕаскеНсЫа соИ \νκ6 0.592 +/-0.113 0.681 +/- 0.032 1.434 +/-0.018 1.179 +/- 0.200 1.695 +/-0.147
8а1топе11а (урЫтиНит 0.054 +/- 0.048 0.076 +/-0.011 0.127 +/-0.013 0.774 +/- 0.052 0.908 +/-0.037
- 15 024253
При общей эффективности ΟΒΡ§ρΕΥδ, результаты лечения с его применением варьируется у различных организмов, результаты, приведенные в Табл. 2, показывают добавочный эффект ΡΚΟΒΡ§ρΕΥδ по сравнению с немодифицированным ΟΒΡ§ρΕΥδ в отношении всех испытуемых бактериальных видов, как с, так и без 0,5 мМ ЭДТК. В отношении Ρ8еиάотоηа8 и Βи^к1ю1ύе^^а. наблюдается ярко выраженное синергическое действие с ЭДТК активности ΡΚΟΒΡ§ρΕΥδ.
Таблица 3. Перечень применяемых грамотрицательных штаммов
Г рамотрицательный штамм Источник Библн (^графическая ссылка
Рзешкжопаз аеги&поза ΡΑΟΙρ Вит νι'οιιηύ 1зо1а1с, Цисеп Аз1пс1 Нозрка!, Βηΐδδβίδ Рипау е1а1., 2003*
РзеиЛотопаз аеги^йкка Вг667 Вит туошк!1во1аРе, Циееп Аз1пс1 Но8р11а1, ВгиззеЕ Рнпау е( а1., 2003*
Рзеис1о топаз ρκΐϊάα С1 δοΐΐ 15о1аРе, Мозкоад РгоГ ν.ΚτγΙον**
ВигкЬоЫепа рзеиВотаИег СНшса! 1.зо1а1е, υΖ Оаз1ЬшзЪег§, Ееиуеп РгоП. Уег1тае§еп*
ЕзскеггсЫа соИ \νΚ6 8(ап0агб 1аЬога1огу ехргезыоп з(га)п 81га(а§епе***
8а1топе11а {урЫтипит ЬТ2 5О8С № 2317 РгоГ С. М1сЫек’**’*
Рй-пау ТР, Ос Уоз ϋ, СоеЬег С, ВПос1| р, РЪзоп 1, 81гие1епз М, Ошпз1ае£ег Е, СотеНз Р, Ζίζί М, Уап<1егке1еп А. (2003). Мо1еси1аг ер1Йетю1о£у ор Рзеийотопаз аеги^тоза οοΙοηΐζαίίοη ίη а Ъит ипК: регз1з1епсе ор а тиЕ00ги§-гез1з1ап1 с1опе апй а зПуег зиЕГаШагте-гезЕзСагк с1опе. СИп МгсгоЫЫ., 41(3):1192-1202.
8(а1е КеяеагсЬ 1пзй1и1е Рог Оепейсз апО 8е1есйоп οί 1пс1из[па1 Мкгоогдатзтз, Мозссто 113545,1з1 ΟοΓοζΗηϋ рго)егд, 1 ,Кизз1а
АГ<1. Ехрептепй ЬаЬогаЮгттвепеезк., υΖ Негезйаа! 49 - Ъиз 7003, 3000 Ьеиуеп, Ве|£шт ''8ΤΑΝ88ΕΝ8, Р., ОРЗОМЕК, С. , ΜΕΚΕΟΙΥΝΥ, Μ. , ККАМЕК, V/., ΖΑΒΕΑΕ1, М. ап<1 ΡΚΙΤΖ, Н.-Е (1989). ЕРйс1еп1 оНвопис1еой<1е-с11гес1ей сопзйисйоп ор тЫайопз ίη ехргеззюп сесЮгз Ъу Й1е §аррей йир1ех
О N А тейюй изт§ аКетайп® зе1ес(аЫе тагкегз. ΝιιοΙβίΟ Аийз КезеагсЬ 17, 4441-4454 .
.....СепГг, ЬеуепзтЮй.- & М1сгоЬ. ТесЪпоГ, Каз1ее1рагк АгепЬегр 23 - Ъиз 2457, 3001
ΗβνβτΕβ, Ве1ршт
Пример 2. Влияние различной концентрации ЭДТК на антибактериальную активность ΟΒΡ§ρΕΥδ и ΡΚΟΒΡ§ρΕΥδ.
Для определения влияния ЭДТК на антибактериальную активность немодифицированного и модифицированного эндолизинов, антибактериальную активность немодифицированного ΟΒΡ§ρΕΥδ эндолизина (8ЕЦ ГО ΝΟ: 47) и ΡΚΟΒΡ§ρΕΥδ эндолизина (8ЕЦ ГО ΝΟ: 49) испытали на клетках Ρ8еиάотоηа8 аегидшо8а ΡΑΟ1ρ (Ρίιη;ι\· 1Ρ е! а1. 1 СИп МюгоЬю1, 41(3):1192-1202 (2003)) с использованием различных концентраций ЭДТК и эндолизинов. Экспоненциально растущие бактериальные клетки (ΟΌ60οπιη из 0,6) разбавили в 100 раз до достижения показателя конечной плотности примерно 106/мл и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания вместе с немодифицированным эндолизином ΟΒΡ§ρΕΥδ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 47) и модифицированным эндолизином ΡΚΟΒΡ§ρΕΥδ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 49). Для инкубации, каждый тип эндолизина использовали в буфере (20 мМ NаН2ΡΟ4-NаΟН ]эН7.4: 0,5 М №С1; 0,5 М имидазола) при конечных концентрациях эндолизина 0,013 мкМ, 0,131 мкМ и 1,315 мкМ. При этом, использовали различные концентрации ЭДТК: 0 мМ, 0,05 мМ, 0,5 мМ и 10 мМ. В качестве контроля, инкубировали также один образец в течение 30 мин без эндолизина, вместо которого использовали добавочный буфер (20 мМ NаН2ΡΟ4-NаΟН ρН7.4; 0,5 М №С1; 0.5 М имидазола). После инкубации, клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно, 105-104-103 клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Пересчитали остаточные колонии после ночной инкубации при 37°С. На основе подсчета числа клеток, рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах (=1θ§10Ν0/Ν; где Ν0= число необработанных клеток, а Ν1= число обработанных клеток, расчеты проводились в обоих случаях после инкубации) (табл. 4). Все образцы реплицировали в три раза. Средние+/-стандартные девиации приведены. По результатам анализа, максимальное уменьшение (5.69 лог-юнитов) наблюдали при уровне детекции 10 клеток/мл и первоначальной клеточной плотности. А показывает разницу в показателях активности соответствующих образцов ΟΒΡ§ρΕΥδ и ΡΚΟΒΡ§ρΕΥδ.
- 16 024253
Таблица 4. Антибактериальный эффект немодифщированного эндолизина (0ВРдрЬУ8) и его модифицированного варианта (РК0ВРдрЬУ8) в комбинации с различными концентрациями ЭДТК-№ь в отношении экспоненциально растущих клеток Ркеиботопак аегидшока РА01р се11+ в логарифмических юнитах
Концентрация ЭДТК-№2 (в мМ)
0 0.05 0.5 10
Без эндолизина / 0.028 +/- 0.008 0.130+/-0.023 1.827 +/- 0.052
0,013 мкМ ОВРсрЬУЗ 0.956+/-0.110 / 4.626 +/- 0.287 /
0,013 мкМ РКОВРя»ЬУ8 0.992+/-0.181 / 5.204+/-0.000 /
Δ 0.036 0.578
0,131 мкМ ОВРврЬУЗ 2.158 +/- 0.027 / 4.599 +/- 0.275 /
0,131 мкМ РКОВРярЬУ8 2.529+/-0.184 / 5.671 +/- 0.000 /
Δ 0.371 1.072
1315 мкМ овРерЬУ» 2.531+/-0.173 2.762 +/- 0.091 4.357+/- 1.857 4.888+/-0.275
1315 мкМ РКОВРярЬУЗ 3.079+/-0.015 4.145+/-0.015 > 5.687 >5.687
Δ 0.548 1.383 > 1.330 > 0.799
Как следует из табл. 4, немодифицированный эндолизин 0ВРдрЬУ8 уменьшает значительно число клеток с более, чем 2,5 лог-юнитов для 1,315 мкМ и с +/- 1 лог-юнит для 0,013 мкМ, по сравнению с отрицательным контролем. Модифицированный эндолизин РК0ВРдрЬУ8 показывает уменьшение в дополнительные 0,5 лог-юнитов в отношении экспоненциально растущих РА01р клеток. Наблюдаемый антибактериальный эффект можно увеличить вплоть до редукции в 5,69 лог-юнитов (ниже уровня обнаружения) путем комбинирования РК0ВРдрЬУ8 с пермеабилизатором внешней мембраны ЭДТК-№ь при концентрации 0,5 и 10 мМ ЭДТК. Различие в активности между немодифицированным 0ВРдрЬУ8 и пируваткиназа(ПК)-модифицированным 0ВРдрЬУ8 повышается при увеличении количества добавляемого эндолизина (начиная с 0,013 - 1,315 мкМ эндолизина).
Пример 3. Клонирование, экспрессия и очистка производного 0ВРдрЬУ8, модифицированного с различными пептидными цепями на Ν-конце эндолизина.
Производное 0ВРдрЬУ8 в соответствии с 8Еф ГО N0:86 представляет собой модульный эндолизин, полученный из Ркеиботопак риййа фага ОВР с Ν-концевым пептидогликанным связыванием и Сконцевым каталитическим доменом. Производное 0ВРдрЬУ8 кодируют молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с 8Еф ГО N0: 101. Очищенную плазмидную ДНК (см. ПРИМЕР 1) использовали для получения молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с 8Еф ГО N0: 101 с сайтом рестрикции ВатН I (5'-ООА ТСС-3') на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты и Хйо I (5'-СТС ОАО-3') сайтом рестрикции на 3'- конце молекулы нуклеиновой кислоты.
Нижеупомянутые пептидные цепи (табл. 5) использовали для получения слитых белков с производным эндолизина 0ВРдрЬУ8. Полученные слитые белки также представлены в Табл. 5.
Таблица 5. Пептидные цепи и соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты для получения специфичных слитых белков
Пептидная цепь Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептидную цепь Аминокислотная последовательность полученного слитого белка
АзсарЫпе (8Е<3 ГО ΝΟ: 50) ЗЕф ГО ΝΟ: 90 ЗЕО ГО ΝΟ: 55
Ар1«1аес1пе (8ΕΟΠ5ΝΟ: 51) 8Ε()ΙϋΝΟ:91 ЗЕО ГО ΝΟ: 57
8агсо1охЙ1 ΙΑ (8Е<3 Π9ΝΟ:17) ЗЕО Ю N0:92 ЗЕО ГО ΝΟ: 63
8МАР-29 (ЗЕО ГО N0:12) ЗЕО ГО N0:93 ЗЕО ГО N0:65
Сесгорт А (А. аедурй) (8ΕΟΠ9ΝΟ:15) ЗЕО ГО N0:94 ЗЕО ГО N0:67
- 17 024253
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие соответствующие пептидные цепи, получили синтетическим путем с сайтом рестрикции № I (5'-САТ АТО-3') на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты и ВатН I (5-ООА ТСС-3') сайтом рестрикции на 3'- конце молекулы нуклеиновой кислоты.
Слитые белки получают путем соединения как минимум двух последовательностей нуклеиновых кислот с использованием стандартных методов клонирования, описанных, например, в публикации 8атЬгоок е1 а1. 2001, Мо1еси1аг С1оти§: А ЬаЬогаФгу Мапиа1. Таким образом, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептидные цепи, частично расщепили с соответствующими энзимами рестрикции № I и ВатН I. После этого, расщепленные нуклеиновые кислоты, кодирующие пептидные цепи, лигандировали в рЕТ21 Ь экспрессионном векторе (Nоνадеη, ОагтзЮШ, Оегтапу), который также до этого подвергли расщеплению с соответствующими энзимами рестрикции № I и ВатН I.
После этого, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую эндолизин ОВР§рЬУ§, частично расщепили с энзимом рестрикции ВатН I и Хйо I, таким образом, чтобы было возможно лигандировать эндолизин в рЕТ21Ь экспрессионном векторе (Nоνадеη, Оагтз1ай1, Оегтапу).
Таким образом, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептидную цепь, лигандировали в соответствующем векторе на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей производное эндолизина ОВР§рЬУ§. Помимо этого, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей эндолизин ОВР§рЬУ8, лигандировали в соответствующей плазмиде, таким образом, чтобы молекула, кодирующая Н1з6-таг, состоящий из шести гистидиновых остатков, ассоциировалась на 3'-конце молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей эндолизин.
Последовательность слияний эндолизин-пептид контролировали при помощи секвенирования ДНК, а корректные клоны трансформировали в Е.сой Т7 Ехргезз ΡέΥ/Ρι (ΌΕ3) (Νρ» Епд1апй Вю1аЬз, РгапкГиП, Оегтапу) для экспрессии белка.
Рекомбинантную экспрессию слитых белков в соответствии с 8ЕО ГО NО: 55, 57, 63, 65, 67осуществили в клетках Е. сой Т7 Ехргезз ΡέΥ/Ρι Еп§1апй Вю1аЬз, РгапкГий, Оегтапу). Клетки росли до достижения уровня значения оптической плотности ОЭ600 0,5-0,8 мкм. Затем индуцировали экспрессию слитого белка с 0,5 мМ ГРТО (изопропилтиогалактозидом) и осуществили экспрессию при 37°С в течение 4 ч.
Клетки собрали центрифугированием в течение 15 мин при 4000г и дезинтегрировали путем разрушения ультразвуком на льду. Суммарный экстракт растворимой и нерастворимой фракций клеток Е.сой сепарировали центрифугированием (8ота11, 8834, 30 мин, 15000 оборотов в минуту). Все белки очистили при помощи Νί2+ аффинной хроматографии (Ак1а РРЬС, ОЕ Неаййсате) с использованием Сконцевого 6хН18-тага, кодируемого вектором рЕТ21Ь.
Νί2+ аффинную хроматографию осуществили в 4 последовательных этапа, все при комнатной температуре:
1. Эквилибрация Шзйар РР 5 мл колонки (ОЕ Неаййсате) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (20 мМ имидазола, 1 М №С1 и 20 мМ Нерез (Н-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфоновой кислоты) при рН 7,4) при скорости потока 3-5 мл/мин.
2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом слитого белка) в Н1з1гар РР 5 т1 колонки при скорости потока 3-5 мл/мин
3. Отмывка колонки с 10 объемами колонки отмывочного буфера для удаления несвязанного образца, с последующей повторной отмывкой с 10% элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 0,5 М №С1 и 20 мМ Нерез при рН 7.4) при скорости потока 3-5 мл/мин/
4. Элюирование связанных слитых белков из колонки с линейным градиентом 4 объемов колонки элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 0,5 мМ №С1 и 20 мМ Нерез при рН 7,4) до 100% при скорости потока 3-5 мл/мин.
Очищенные стоковые растворы слитых белков в элюирующем буфере (20 мМ Нерез рН 7,4; 0,5 М №С1; 500 мМ имидазола) показали как минимум 60% степень чистоты, в соответствии с визуальным контролем на 8Э8-РАОЕ гелях (данные не приведены).
Пример 4. Антимикробная активность производного эндолизина ОВРдр^Υ8. модифицированного с использованием различных пептидных цепей на Ν-конце.
Клетки АОпеЮЬасЫ Ьаитаппй Ό8ΜΖ 30007 и Рзеийотопаз аегидшоза РАО1р (Вит теоипй 1зо1а1е, Оиееп Азйгй Нозрйа1, Вгиззе1з; Рнпау 1Р е1 а1. (2003), 1Шр://\у\у\УЛ1сЬгп1тлйЙ8о\'/риЬтей/ 12624051? огЛпа1роз=3&Ноо1=Еп1ге/8уз1ет2.РЕп1ге/.РиЬтеТРиЬтей_РезиЙзРапе1.РиЬтей_ОеГаииРерог1Рапе1. РиЬтей_ РУЭо с8ит 1 Сйп МкгоЬюД 41(3):1192-1202) использовали в качестве тест-штаммов. Инкубированные в течение ночного времени суток культуры разбавили в 10 раз в свежей среде Лурия-Бертани и вырастили до ОИ600=0,6. Культуру осадили центрифугированием и разбавили в 10 раз в буфере разбавления (10 мМ НЕРЕ8, 0,5 мМ ЭДТК; рН 7.4). Бактерии инкубировали при комнатной температуре с 10 мкг недиализированного слитого белка при конечной концентрации 100 мкг/мл в буфере (20 мМ NаΗ2Р04-NаОΗ рН 7,4; 0,5 М №С1; 0,5 М имидазола). По истечении 1 ч, в ФСБ построили серии разведения клеток и высеяли на среду Лурия-Бертани. Дополнительно, отрицательный контроль высеяли с использованием буфера (20 мМ NаΗ2Р04-NаОΗ рН 7.4; 0.5 М №С1; 0,5 М имидазола). Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе чисел клеток, рассчитали антибактериальную активность в логариф- 18 024253 мических юнитах (=1одю^/Ц ^ΐΐΗ N0 = число необработанных клеток и N = число обработанных клеток) (Табл. 5). Все образцы реплицировали как минимум в 4 раза.
Таблица 6. Антимикробная активность производного 0ВРдрЬУ8, модифицированного с использованием различных пептидных цепей, в отношении грамотрицателъных бактерий
Слитый белок Энзимная составляющая Пептидная цепь (Ν-концевая, если не указано иначе) Активность в отношении Ас1пе1оЪас1ег ЬаитаппИ ϋδΜΖ 30007 Активность в отношении Рзеиботопаз аеги&поза ΡΑΟΙρ
ЗЕО ГО N0:88 8Е0 ГО N0:87 - ++ +
5Е0 ΙΟΝΟ: 55 8Е<3 ГО N0:87 АзсарЬте (ЗЕОΙϋΝΟ: 50) +-Н- не опр.
8Εζ> ГО ΝΟ: 57 8Е0 ГО N0:87 АрИаесте (ЗЕО ГО N0:51) +++ не опр.
3Ε0 ГО ΝΟ: 63 8Е<2 ГО N0:87) ЗагсоЮхт ΙΑ (5Е0 ГО N0:17) +++ -н-
8Εζ>ΙΟΝΟ: 65 8Е0 ГО N0:87 ЗМАР-29 (8ΕΟΙϋΝΟ:12) +++ ++
8Е0ΙΟΝΟ: 67 8Е0 ГО N0:87 Сесгорт А (5Е0 ГО N0:15) +++ +++
Сокращения: +: 1 лог; ++: 2-3 лог; +++: 4 или более лог;
не опр. - данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
Слитые белки в табл. 6 без тагов и линкеров также испытали при помощи вышеописанных методов определения активности. Результаты подтвердили антибактериальную активность в отношении бактериальных штаммов, перечисленных в табл. 6.
Пример 5. Ν-концевое слияние антибактериального пептида с эндолизином Рзеиботопаз риИба фага ОВР.
Производное 0ВРдрЬуз, модульный эндолизин Р. рибба фага ОВР, подвергли Ν-концевому слиянию с тагами нативных антибактериальных пептидов (табл. 7) для изучения антибактериальной активности в отношении грамотрицательных бактерий.
Таблица 7. Перечень антибактериальных пептидных тагов, слитых с производным 0ВРдрЬУ8
Таг Описание + размеры Аминокислотная последовательность Последовательность нуклеиновой кислоты Публикация
а4-спиральный Т4лизосомы Амфипатичный спиральный (13 аа) ΡΝΚΑΚΚνίΤΤΡΚΤ (8Е<) ΙϋΝΟ: 68) ЗЕЦГОИО: 95 МапЬе\У5 е! а/., 1974*
Пентапептид (смоделированный) Гидрофобный (5 аа) РРУАР (8Е<3 ΙϋΝΟ: 18) ЗЕЦГОИО:96 Впегз Υ (Νοί риЬПзЬед)
Απίίγδΐηΐ (смоделированный) Гидрофобный (18 аа) 0РР1РАУ1ЬР31АРЫ νρ (8£<) ΙϋΝΟ: 70) 8Е<3 ΙΟΝΟ: 97 5Уа1та§Ь, М. (Νοί риЬПзЬед)
АгШузт 2 (смоделированный) Амфипатичный спиральный (25 аа) ΟΚΡΟΨΠΚΚΑΙΑΡ ККЫККРЬККЬА (8ΕΟΙΡΝΟ:71) 8Εζ> ГОЫО: 98 1^а1та§Ь, М (Νοί рйЫюЬеф
Рагазт 1 Альфа- спиральный пептид ΚΟΚΟΚ<2ΟΟΚνΚΑ ΚΑΚΤΚ88 (ЗЕ<3 ΙϋΝΟ: 72) 8Е<? ГО N0:99 Рагк, Ύείαΐ., 1998**
ЬусоЮхт 1 Амфипатичный спиральный (25 аа) ИУЬТАЬКРЬОКНА АККЕАКСЖЗКХ (8Е0 ГО N0: 73) 8Ε<3Π)ΝΟ: 100 Уап& Ас1атз, 1988***
*МаПкепз, Β.ίν. αηά Κβηιΐηξίοη, 8./. (1974). Тке 1кгее (Итепзюпа! з&и&иге о/ 1ке 1узогуте/гот Ьас1егюрка§е Т4. Ргос. ΝαίΙ. АсаА 8а. 1/8А. 71: 4178-4182 **1п ¥ир Рагк, Скап Вае Рагк, Μι 8ип Кт, 8ип Скап%Кйп (1998) . Рагазт I, ап апИпйсгоЫа! ρερϋάε άαϊ,νεά /гот МзЮпе Н2А ίη 1ке сеафзк, РагазИигиз азо1из. РЕВЗЬеиегз 437 258-262 ***Υαη, £ αηά Ас1атз, М.А. (1998). ЬусоЮхтз, АпНгтсгоЫа! РерМез /гот Уепот о/ 1ке УЫ/ЗрМег, Ьусоза сагоИпепзгз Т ΒΐοΙ. Скет,273:2059-2066.
- 19 024253
Методология модификации тагов производного ОВРцрйух
За исключением тага пентапептидов все антибактериальные пептидные таги слили с открытой рамкой считывания (ОРС, ОКР), которая кодирует производное ОВР§рЬУ8, с использованием адаптированной версии Ыдайои 1пйерепйеШ С1оти§ (Ь1С), как описано в Вегготе с1 а1. 2007. В данном случае уникальный Ес113611 рестрикционный сайт вставили впереди эндолизинового гена \УТ при помощи хвоста ПЦР со специфически смоделированным 5' праймером (5'-ССЛЛТССССЛССТССТССЛЛЛЛЛТЛСС СЛСЛЛС-3'; 8ЕС ГО N0:102) и стандартным производным ОВР§рЬу8 ревертивным праймером (5'ААСТАТТСССТСТССТТТСТТТСТ-3'; 8ЕЕ) ГО N0:103) на очищенной геномной ДНК фага ОВР. Данный удлиненный фрагмент затем лигировали в эксперссионном векторе рЕХР5СТ/ТОРО® ОпуЦгодеп. СагкЪай, СА, И8А), следуя протоколу ТА клонирования компании-производителя. Очищенную плазмиду разрезали один раз в Ес113611 рестрикционной кассете расщепления и гибридизированные пептиды (созданные гибридизацией праймерных пар, см. табл. 8) вставили в разрезанную плазмиду без необходимого этапа лигирования (Ь1С). Для Ν-концевого пентапептидного тагового слияния, хвост ПЦР с удлиненным 5' праймером, кодирующим данный пентапептид (5'-АТСССАТССТТСТТССТАССА ССССССТССТССАААААТАСССАСААС-3'; 8ЕО ГО N0:104) и ревертивный праймер (5'-ААСТА ТТСССТСТССТТТСТТТСТ-3'; 8ЕС ГО N0:103) стандартного производного ОВРдрЬук нанесли на фаг ОВР геномной ДНК. Корректность инсерции фрагментов в экспрессионном векторе контролировали секвенированием до момента введения в приемлемый экспрессионный штамм Е8сйепс1йа сой ВЕ21(ПЕ3)рЬу58.
Таблица 8. Применяемые праймерные пары для гибридизации антибактериальных пептидных тагов для
ОРС кодируемого производного ОВРдрЬуа
Таг Прямой праймер Реверсивный праймер
а4-спиральный Т4лизосомы 5 ’ТТОО ААТОООО АОСССО ААС сотое ААААСОТСТААТСА 3’; ЗЕО ГО N0:105 5’ТАТТТТТООАООАОССООТАС ООААООТООТСАТТАСАССТТ 3’;8ЕО ГО N0:106
АгШу$ш1 (смоделированный) 5 ’ТТАТОООСТТСТТС АТСССОО САОТААТССТОСССТССА 3’; ЗЕО ГО N0:107 5’ТАТТТТТООАТСТОССОСССОО ТАСОАТСАООААТОСОАТООАО ООСАООАТТ 3’; ЗЕО ГО N0:108
АгШу&т 2 (смоделированный) 5’ТТАТОООСАААССОООСТОО СТОАТСААААООСАСТООТАТ ТСААОА 3’ ; 8Е0 ГО N0:109 5’ТАГПТТООАТСТОССОССТОС САОТСТСТТСАОСООАСОАСОО АТСАОТТТСТТОААТАССАО 3’; 8ΕΟΙΟΝΟ:110
Рагазш 1 5’ТТООААТООООАОСАААОО ССОТООСААОСАОООАООСАА АОТАСОТО 3’; ЗЕО ГО N0:111 5’ТАТТТТТООАООАОССТОАОО ААСОООТСТТТОСТТТТОСАСОТ АСТТТОС 3’; 8Е0 ГО ΝΟ: 112
Ьусо1ох1п 1 5’ООААТООООАОСАТСТООСТ ОАССОСАСТОАААТТССТСОО 5’ТАТТТТТООАООАОСССАОТТ ТООАТААТТОСТОТТТТОССАОТ
САААСАСОССОСАА 3’; ЗЕО ГО ТТСТТТОСООСОТОТТ 3’; ЗЕО ГО N0:113 N0:114
САААСАСОССОСАА 3’; 8Е0 ГО N0:113 ТТСТТТОСООСОТОТТ 3’; ЗЕО ГО N0:114
Масштабная рекомбинантная экспрессия слитых вариантов производного модифицированного ОВР§рЬ¥8
Стандартную экспрессию осуществили в Ьу8одеиу ВгоЕй (ЬВ) в экспоненциально растущих клетках (ОЭ600 нм = 0,6), индуцированную с 1 мМ изопропил-бетаГО-тиогалактопиранозидом. Параметры экспрессии, как, например, температуру, время и экспрессионный штамм, варьировали на основе специфичности белков с целью оптимизации уровня растворимой экспрессии модифицированных эндолизинов (см. табл. 9).
Для очистки, клетки из экспрессионной культуры (500-600 мл) собрали центрифугированием (4500 оборотов в минуту, 30 мин, 4°С) и ресуспендировали в 1/25 объема лизирующего буфера (10 мМ имидазола, 20 мМ NаΗ2РО4, 0.5 М №С1, рН 7.4). данную суспензию заморозили/разморозили три раза до разрушения ультразвуком (8х 30 8, амплитуда 40% на У1Ъга Се11ТМ, 8отс8, Паийиггу, СТ, И8А) и профильтровали через мембранные фильтры Эигароге 0,45 и 0,22 мкм (Мййроге, ВШейса, МА, И8А). Очистку Н18-тагового слитого белка осуществили в один этап при помощи №2+ - аффинной хроматографии (Н18Тгар НР 1 мл колонки, СЕ Неаййсаге, Висктдйапъййе, ИК) согласно протоколу компаниипроизводителя. №2+ аффинную хроматографию провели в 4 последующих этапа, все при комнатной температуре:
1. Эквилибрация Н18Егар НР 1 мл колонки (СЕ Неаййсаге) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (60 мМ имидазола, 0,5 мМ №-1С1 и 20 мМ NаН2РО4-NаОН при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.
2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом эндолизина) в Н18Егар НР 1 мл колонки при скорости потока 0,5 мл/мин.
3. Отмывка колонки с 15 объемами колонки отмывочного буфера при скорости потока 1 мл/мин.
4. Элюирование связанного эндолизина из колонки с 10 объемами колонки элюирующего буфера
- 20 024253 (500 мМ имидазола, 0,5 М №-1С1 и 20 мМ NаН2Р04-Nа0Н при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.
Отмывочный буфер содержал низкую концентрацию имидазола, варьируемую на основе специфичности белков с целью достижения высокой степени очистки белка (см. табл. 9). Общий выход очищенных рекомбинантных белков на литр экспрессионной культуры Е.соП приведен в Табл. 3. Значения определили при помощи спектрофотометрического измерения белковой концентрации, а общий объем очищенного маточного раствора - при длине волны 280 нм. Очищенные маточные растворы показали степень чистоты как минимум 60% как определено визуально на 8Э8-РАОЕ (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) гелях.
Таблица 9. Параметры экспрессии и полученный общий выход на литр экспрессионной культуры N концевых модифицированных эндолизинов. РР = Е. соП ВЬ21(ПЕ3)рЬу58 Собой тш КР κίΓαίη, К1Ь = Е. сой ВЬ21(ПЕ3)рЬу58 Собоп Р1ик К1Ь κίπιίη
Модифицированный эндолизин Температура/врем я Выход белка (мг/л) [имидазол] (мМ)
а4-ОВР§рЬуз (8 Ер ГО ΝΟ: 75) 16/в течение ночного времени суток 1.28 60
Пентапептвд-ОВР^рЬуз (8Е<3 ГО ΝΟ: 77) 16/в течение ночного времени суток 1.10 65
АййузшЬОВрЁрЕуз (8Ε<3ΙϋΝΟ:79) 16/в течение ночного времени суток <0.1 50
АгШузтЗ-ОВРцрЬуз (5Εζ)ΙΟΝΟ:81) 16/в течение ночного времени суток 1.32 50
РагазЫ-ОВРерЬу» (8ЕГ> ГО ΝΟ: 83) 16/в течение ночного времени суток 0.38 50
Ьусо1охш1-ОВР£рЬу5 (ЗЕСНО ΝΟ: 85) 16/в течение ночного времени суток 1.71 50
Полученная ΐη νϊΐΐ'ο антибактериальная активность и круг хозяев вариантов производного модифицированного ОВРцрЬух
Экспоненциально растущие грамотрицательные бактериальные клетки (0Ό600ηιη = 0,6) разбавленные в 100 раз до конечной плотности примерно 106/мл, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания, с различными вариантами производного модифицированного 0ВР§рЬУ8. После инкубации, клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно 105-104-103 клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе подсчета количества клеток, рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах (= 1о§10ЭД)/ЭД где N0 = число необработанных клеток и N = число обработанных клеток, оба показателя рассчитаны после инкубации) (Табл. 10). Все образцы реплицировали в три раза. Средние +/- стандартные девиации приведены.
Таблица 10. Полученная ίη νίΙΐΌ антибактериальная активность различных вариантов производного модифицированного 0ВР§рЬУ8 в отношении круга экспоненциально растущих грамотрицательных бактериальных видов с 0.5 мМ ЭДТК. Первоначальная плотность составляет 106 клеток/мл и инкубация происходит в течение 30 мин без встряхивания при КТ. Концентрация белка составляет 1500 нМ (нмоль), за исключением АгШук1-0ВР§р1у5 (800 нМ).
- 21 024253
Р. ает£1поза ΡΑΟΙρ Р. ριύΐιία О1 £со#Х1-1 5а1топе11а {урктигтт ЬТ2
1500 нМ а4-ОВ1’£рЬуз (8Е<2 ГО ΝΟ: 75) ++ ++ ++ +
1500 нМ Реп1арер(МеОВРерЬуз (3Ε<3ΙΟΝΟ:77) ++ +++ -н- +
800 нМ ΑτύίγδίηΐОВР^рЬуз (8Ер Ю ΝΟ: 79) Не опр. ++ + +
1500 нМ АгШузт2ОВРдГОуя (8Ε<3Π3ΝΟ: 81) ++ -н- ++ +
1500 нМ Рагаят 1 -ОВР§рЬуя (ЗЕС> ГО ΝΟ: 83) +++ +++ +-н- ++
1500 нМ Ьусо1охт1ОВР§рЬуз (8Ε(2Π>ΝΟ:85) ++ Ή-+ ++ +
1500 нМ ΟΒΡ§ρΕΥ8 (8Εζ)ΙΓ}ΝΟ: 88) + + + +
Сокращения: +: примерно 0.5 лог; ++: 1-2 лог; +++:3-4 или более лог; не опр - штамм не был протестирован с соответствующим слитым белком.
- 22 024253
ЗЕОЧЕМСЕ ЫЗТ1ЫЗ
<110> КаРЬоПеке υηίνβκϊΐβίΐ Εβανεη, К.О. Ьеииеп Κ5ϋ
ЬУЗАИОО Но1д1пд ЕзРаЬНзЬтепР
<120> Нек еп0о1уз1п ОВРдрЬУЗ
<130> ЬУЗ-004 РСТ
<140> пор уеР кпомп
<141> 2010-08-24
<150> ЕР09168527.1
<151> 2009-08-24
<160> 119
<170> РаРепр1п νβτβίοη 3.3
<210> 1
<211> 328
<212> РКТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> ОВРдрЬУЗ
<400> 1
Мер Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а Зег 11е 11е Мер Зег 11е С1п Агд
ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг С1у С1у Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе 20 25 30
61у С1и Ьуз Суз Агд С1у А1а 11е 11е Ьеи Мер Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг 35 40 45
Рго Азп РЬе 5ег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а О1и 50 55 60
Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи 61п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг
70 75 80
ТЬг 11е ТЬг 11е Азр С1у Ьуз Тгр С1у О1у ТЬг Зег С1п 61у А1а Не 85 90 95
Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд С1п Не ТЬг С1и А1а О1и Агд А1а 100 105 110
61у 5ег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а ТЬг 7а1 Мер Зег Ьуз Н1з Мер 115 120 125
Зег 11е Е1и С1п Ьеи Агд А1а Мер Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг
- 23 024253
130 135 140
А1а С1и УаЬ Туг Не Азр Рхо Ьеи Азп С1и ТЬх Меб Аар Не РЬе С1и 145 150 155 160
Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а Н1з РЬе МеС А1а С1п 11е Ьеи Н1з 165 170 175
С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг С1и С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а 180 185 190
Туг С1и 01 у Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр С1у Рго 195 200 205
Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг 210 215 220
7а1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе 225 230 235 240
Азр Не ТЬг Зег Зех 7а1 ТЬг Суз А1а С1п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго 245 250 255
Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег О1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе 11е Ьуз Рго 260 265 270
Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр Уз1 Зег Уа1 275 280 285
Туг Уа1 Азп С1у Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Тух Рго Азп Агд 290 295 300
Азр Ьуз С1и Рго Азп НЬз МеЬ Ьуз 01и Агд 7а1 С1п МеЬ Ьеи А1а Уа1 305 310 315 320
ТЬг Ьуз Ьуз А1а Ьеи С1у 11е Уа1 325 <210> 2 <211> 987 <212> ОМА <213> ВасЬегхорЬаде ОВР <400> 2
аЬдаааааЬа дсдадаадаа ЬдсаЬсдаЬа аЬЬаЬдЬсда Ьасададаас дсЬсдсСЬса 60
сСсЬсасЬсЬ аЬддаддссд саЬсдасддс сЬсЬЬ'Ьддад адаадЬдЬсд СддддсЬаЬс 120
аЪсНдаСдс ЬдааЬааддЬ сЬаСссЬааЬ Нсадсасса асааасЬЬсс дадЬаасаса 180
- 24 024253
РаРдаадсдд ааРссдРдРР сасдРРРсРс садасРдсРР РддсРддРдР РддРсРРРаР 240
ассаРРасРа РРдаРддРаа аРддддРддР асРРсРсаад дРдсРаРРда сдсссРсдРс 300
аадРсРРасс дРсаааРРас сдаадсддад сдадсРдддР сдасдРРдсс аРРаддРсРР 360
дсРасРдРда РдРсРаадса РаРдРсРаРР даасадРРда дадсааРдсР сссРассдаР 420
адасааддаР аРдсРдаадР РРаРаРсдаР ссРРРаааРд адасдаРдда РаРаРРРдаа 430
аРаааРасРс саРРасдааР РдсРсаРРРс аРддсссааа РссРссасда аасддсдрдр 540
РРРаааРаРа ссдаадаасР ддсдадсддр ааддсРРаРд адддрсдрдс рдаРРРаддР 600
ааРасРсдас саддРдаРдд ассасРдРРР аааддРсдРд даРРаРРаса ааРРассддд 660
сдасРдааРР аРдРдаааРд ссаадрдрар РРдададада адРРааадда сссРасРРРс 720
дасаРРасдР сдРсРдРаас РРдРдсссаа садсРсРссд ааадРссасР РсРРдсРдса 780
РРддсаРсдд дсРасРРсРд дадаРРсаРс ааассРааас РсааРдааас ддсРдаРааа 840
дасдаРаРсР аРРдддРРРс РдРРРаРдРс ааРддРРасд сРааасаадс дааРссРРаР 900
РасссРаасс дддаРаадда асссаассаР аРдааадаас дРдРссаааР дсРРдсадРд 960
асааадааад сасРсддааР адРРРаа 987
<210> 3 <211> 984 <212> ϋΝΑ <213> ипкпомп <220>
<223> ОВРдрЬУЗ <400> 3
аРдаааааРа дсдадаадаа РдсаРсдаРа аРРаРдРсда Расададаас дсРсдсРРса 60
сРсРсасРсР аРддаддссд саРсдасддс сРсРРРддад адаадрдрсд РддддсРаРс 120
аРсРРдаРдс РдааРааддР сРаРссРааР РРсадсасса асааасРРсс дадРаасаса 180
РаРдаадсдд ааРссдРдРР сасдРРРсРс садасРдсРР РддсРддРдР РддРсРРРаР 240
ассаРРасРа РРдаРддРаа аРддддРддР асРРсРсаад дРдсРаРРда сдсссРсдРс 300
аадРсРРасс дРсаааРРас сдаадсддад сдадсРдддР сдасдРРдсс аРРаддРсРР 360
дсРасРдРда РдРсРаадса РаРдРсРаРР даасадРРда дадсааРдсР сссРассдаР 420
адасааддаР аРдсРдаадР РРаРаРсдаР ссРРРаааРд адасдаРдда РаРаРРРдаа 480
аРаааРасРс саРРасдааР РдсРсаРРРс аРддсссааа РссРссасда аасддсдрдр 540
РРРаааРаРа ссдаадаасР ддсдадсддр ааддсРРаРд адддрсдрдс РдаРРРаддР 600
ааРасРсдас саддРдаРдд ассасРдРРР аааддРсдРд даРРаРРаса ааРРассддд 660
сдасРдааРР аРдРдаааРд ссаадрдрар РРдададада адРРааадда сссРасРРРс 720
дасаРРасдР сдРсРдРаас РРдРдсссаа садсРсРссд ааадРссасР РсРРдсРдса 780
- 25 024253
ЕЕддсаЕсдд дсЕасЕЕсЕд дадаЕЕсаЕс ааассЕааас ЕсааЕдааас ддсЕдаЕааа 840
дасдаЕаЕсЕ аЕЕдддЕЕЕс ЕдЕЕЕаЕдЕс ааЕддЕЕасд сЕааасаадс дааЕссЕЕаЕ 900
ЕасссЕаасс дддаЕаадда асссаассаЕ аЕдааадаас дЕдЕссаааЕ дсЕЕдсадЕд 960
асааадааад сасЕсддааЕ адЕЕ 984
<2Х0> 4 <211> 90 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> РСВ о£ ОВРдрЬУЗ <400> 4
Азп А1а Зег 11е Не МеЕ Зег 11е С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег 15 10 15
Ьеи Туг С1у С1у Агд 11е Азр С1у Ьеи РЬе Е1у С1и Ьуз Суз Агд С1у 20 25 30
А1а 11е 11е Ьеи МеЕ Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп 35 40 45
Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а 51и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи 50 55 60
С1п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг 11е ТЬг 11е Азр С1у 65 70 75 80
Ьуз Тгр Е1у С1у ТЬг Зег 61п 51у А1а 11е 85 90
<210> 5
<211> 167
<212> РКТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> ЕАЬ о£ ОВРдрЬУЗ
<400> 5
Ьуз Нйз МеЕ Зег 11е 61и С1п Ьеи Агд А1а МеЕ Ьеи Рго ТЬг Азр Агд
10 15
С1п С1у Туг А1а С1и Уа1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп 61и ТЬг МеЕ Азр 20 25 30
11е РЬе 61и 11е Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 11е А1а Н1з РЬе МеЕ А1а С1п
- 26 024253
35 40 45
Не Теи Н1в СЬи ТЬг А1а Суз РЬе Ьув Туг ТЬг 61и С1и Ьеи А1а Зег
50 55 60
61у Ьув А1а Туг С1и С1у Агд А1а Авр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго О1у
65 70 75 80
Авр С1у Рго Ьеи РЬе Ьув С1у Агд С1у Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг 61у Агд
85 90 95
Ьеи Азп Туг Уа1 Ьув Сув С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьув Ьеи Ьув Авр
100 105 110
Рго ТЬг РЬе Авр Не ТЬг Зег Зег 7а1 ТЬг Сув А1а С1п С1п Ьеи Зег
115 120 125
<31и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе
130 135 140
Не Ьув Рго Ьув Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Авр Ьув Авр Авр Не Туг Тгр
145 150 155 160
Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп С1у
165
<210> 6
<211> 25
<212> РКТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> атрЫрЬаНс рерЫбе Р1еигос1бЬп
<400> 6
61у Тгр 31 у Зег РЬе РЬе Ьув Ьув А1а А1а Шв Уа1 С1у Ьув Н1з Уа1
1 5 10 15
С1у Ьуз А1а А1а Ьеи ТЬг ΗΪ5 Туг Ьеи 20 25 <210> 7 <211> 31 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> агпрЫрЬаЫс рерЫбе Сесгорап Р1 <400> 7
Зег Тгр Ьеи Зег Ьуз ТЬг А1а Ьуз Ьуз Ьеи С1и Азп Зег А1а Ьуз Ьуз 15 10 15
Агд Не Зег С1и С1у 11е А1а 11е А1а 11е С1п С1у 61у Рго Агд 20 25 30 <210> 8 <211> 21 <212> РЕТ <213> ипкпоип <220>
<223> атрЫрЬаНс рерЫде Ви£ог1п II <400> 8
ТЬг Агд Зег Зег Агд А1а С1у Ьеи С1п РЬе Рго Уа1 61у Агд Уа1 Шз 15 10 15
Агд Ьеи Ьеи Агд Ьуз 20 <210> 9 <211> 39 <212> РКТ <213> ипкпоип <220>
<223> атрЫрЬаЫс рерМЭе Ви£ог1п I <400> 9
А1а С1у Агд С1у Ьуз С1п С1у 61у Ьуз УаЬ Агд А1а Ьуз А1а Ьуз ТЬг 15 10 15
Агд Зег Зег Агд А1а 61у Ьеи 51п РЬе Рго Уа1 С1у Агд Уа1 Шз Агд 20 25 30
Ьеи Ьеи Агд Ьуз 61у Азп Туг 35 <210> 10 <211> 23 <212> РЕТ <213> ипкпоип <220>
<223> атрЫрЬаЫс рерЬЫе МадаЬпЬп <400> 10
С1у 11е С1у Ьуз РЬе Ьеи Нхз Зег А1а Ьуз Ьуз РЬе 61у Ьуз А1а РЬе
5 10 , 15
Уа1 61у С1и 11е Ме£ Азп Зег
- 28 024253 <210> 11 <2Π> 37 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> атрЫрЬаЫс рерМбе ЬЬ-37 <400> 11
Ьеи Ьеи 61 у Азр РЬе РЬе Агд Ьуз 5ег Ьуз С1и Ьуз Не 61у Ьуз 61и
1 5 10 15
РЬе Ьуз Агд Не νβΐ 61п Агд Не Ъуз Азр РЬе Ьеи Агд Азп Ьеи Уа1
25 30
Рго Агд ТЬг 61и 5ег 35 <210> 12 <211> 29 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> апЫт!сгоЫа1 рерЫбе ЗМАР-29 <400> 12
Агд 61у Ьеи Агд Агд Ьеи С1у Агд Ьуз Не А1а НЬз С1у Уа1 Ьуз Ьуз 15 10 15
Туг С1у Рго ТЬг Уа1 Ьеи Агд Не Не 25 Агд Не А1а 61у
20
<210> 13
<211> 13
<212> РЕТ
<213> ипкпомп
<22О>
<223> апЫшксгоЫа! рерЫбе Ιηάοΐίοϊόίη
<400> 13
Не Ьеи . Рго Тгр Ьуз Тгр Рго Тгр Тгр Рго Тгр Агд Агд
1 ,
<210> 14
<211> 18
<212> РЕТ
<213> ипкпомп
<220>
- 29 024253 <223> апЫп>1сгоЫа1 ρβρϋίάβ Ргокедгхп <400> 14
Агд С1у 61у Агд Ьеи Суз Туг Суз Агд Агд Агд РЬе Суз Уа1 Суз νβΐ 15 10 15
61у Агд
<210> 15
<211> 36
<212> РЕТ
<213> ипкпомп
<220> <223> апк1пи.сгоЪ1а1 реркх<3е Сесгорхп А (А.аедурк!)
<400> 15
61у 61у Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи 61у Ьуз Ьуз Ьеи С1и 61у А1а С1у Ьуз Агд
10 15 '/а1 РЬе Азп А1а А1а 61и Ьуз А1а Ьеи Рго Уа1 Уа1 А1а 61у А1а Ьуз 20 25 30
А1а Ьеи Агд Ьуз 35 <210> 16 <211> 40 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> апЫтхсгоЫаЬ рерЫде СесгорЬп А {ϋ. те1аподазкег) <400> 16
61 у 1 Тгр Ьеи Ьуз Ьуз 5 Не 61 у Ьуз Ьуз 11е С1и Агд Уа1 61у 61п ΗΪ5
10 15
ТЬг Агд Азр А1а ТЬг 11е 61п С1у Ьеи 61у 11е Рго 61 п 61п А1а А1а
20 25 30
Азп Уа1 А1а А1а ТЬг А1а Агд С1у
35 40
<210> 17 <211> 39 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> апР1ш1сгоЫа1 реркШе Загсокохап ΙΑ
- 30 024253
<210> 19 <2ΐι> 6 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупкЬектс рерМде «300> 19 ьуз Агд ьуз Ьуз Агд Ьуз 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупкЬек1с ρβρίίάβ <400> 20
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз 1 5
<210> 21
<211> 9
<212> РЕТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> зупкНес!с ρβρΡίάβ <400> 21
Агд Агд Агд Ахд Агд Агд Агд Агд Агд 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> РИТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупкЪеЫс рерЫде <400> 22
Ьуз Ьуз Ьуэ Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупРЬеРхс реркхбе <400> 23
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз 15 10 <210> 24 <211> 12 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупЬЬек1с ρβρΡίάθ <400> 24
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз 15 10 <210> 25 <211> 14 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупкЬеЫс рерЫде <400> 25
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд 15 10
- 32 024253 <210> 26 <211> 16 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупРНеРЬс ρβρίίάβ <400> 26
Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз 15 10 15 <210> 27 <211> 19 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупСПеНс рерЫде <400> 27
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз 15 10 15
Агд Ьуз Ьуз <210> 28 <211> 19 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупрЬекгс рерЫде <400> 28
Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд 15 10 15
Агд Агд Агд <210> 29 <211> 19 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупРЬеШс рерМде <400> 29
Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз
- 33 024253
10 15
Ъуз Ъуз Ъуз <210> 30 <211> 20 <212> РКТ <213> ипкпоип <220>
<223> зупЬЬеМс ρβρίΐόβ <400> 30
Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд Ъуз Агд Зег Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд 15 10 15
Ъуз Ъуз Агд Ъуз 20 <210> 31 <211> 21 <212> РКТ <213> ипкпоип <220>
<223> зупЕЬеЫс рерЫсЗе <400> 31
Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд Ъуз Агд Зег Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд 15 10 15
Ъуз Ъуз Агд Ъуз Ъуз 20 <210> 32 <211> 21 <212> РКТ <213> ипкпоип <220>
<223> зупЬЬеМс рерЫде <400> 32
Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд Ъуз Ъуз Агд Ъуз Ъуз 15 10 15
Агд Ъуз Ъуз Агд Ъуз 20 <210> 33 <211> 22
- 34 024253 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупСЬек1с ρβρίίάβ <400> 33
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Агд С1у Зег С1у Ьуз Агд Ьуз 15 10 15
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз 20 <210> 34 <211> 24 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупкЬеЫс ρβρίίάβ <400> 34
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Агд С1у 5ег С1у Зег С1у Ьуз 15 10 15
Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз 20 <210> 35 <211> 25 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> 5γηίΗβίίο ρβρίίάβ <400> 35
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз 15 10 15
Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз 20 25 <210> 36 <211> 31 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупкЬеМс ρβρίίάβ <400> 36
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Агд Зег Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд
- 35 024253
10 15
Ьуз Ьуз Агд Ьуз Агд Зег Ьуэ Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз
20 25 30
<210> 37
<211> 38
<212> РАТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> зупкЬеЫс рерЫЭе
<4 00> 37
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Агд С1у Зег С1у Зег С1у Ьуз
1 5 10 15
Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз С1у Зег С1у Зег С1у Ьуз Агд Ьуз
20 25 30
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз
35
<210> 38
<211> 39
<212> РАТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> зупЬЬеТхс рерс±0е
<400> 38
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз
1 5 10 15
Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд
20 25 30
Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз
35
<210> 39
<211> 42
<212> РКТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> зупкЬеЫс ρβρΐίάβ
<400> 39
Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Агд Зег Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд
1 5 10 15
Ьуз Ьуз Агд Ьуз Агд Зег Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Агд
20 25 30
Зег Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз
40 <210> 40 <211> 5 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> зупкЬекгс ρβρίίάβ <220>
<221> т1зс_£еакиге <222> (3)..(3) <223> мЬегеЬп Хаа 13 апу окЬег апйпо астс! гезабие кЬап ЬузЬпе, агд!п1пе апд ЫзкхсНпе <400> 40
Ьуз Агд Хаа Ьуз Агд
5 <210> 41 <211> 5 <212> РКТ <213> ипкпонп <220>
<223> зупкЬеЫс рерЫДе <400> 41
Ьуз Агд Зег Ьуз Агд 1 5 <210> .42 <211> 5 <212> РКТ <213> ипкпонп <220>
<223> зупкЬеЫс рерЫДе <400> 42
Ьуз Агд С1у Зег С1у
1
<210> 43
<211> 339
<212> РКТ
- 37 024253
<213> ι ипкпомп
<220>
<223> РКОВРдрЬУЗ
<4 00> 43
МеЕ 61у Зег Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Азп Зег 61и
1 5 10 15
Ьуз Азп А1а Зег Не Не МеЕ Зег Не С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи
20 25 30
Зег Ьеи Туг 61у С1у Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе 61у 61и Ьуз Суз Агд
35 40 45
С1у А1а Не Не Ьеи МеЕ Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг
50 55 60
Азп Ьуэ Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг 61и А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе
65 70 75 80
Ьеи 61п ТЬг А1а Ьеи А1а 61у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг Не Азр
85 90 95
С1у Ьуз Тгр 61 у 61у ТЬг Зег 61п С1у А1а Не Азр А1а Ьеи νβΐ Ьуз
100 105 110
Зег Туг Агд С1п Не ТЬг 61и А1а С1и Агд А1а 61у Зег ТЬг Ьеи Рго
115 120 125
Ьеи 61у Ьеи А1а ТЬг Уа1 МеЕ Зег Ьуз Н1з МеЕ Зег 11е С1и 61 п Ьеи
130 135 140
Агд А1а МеЕ Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п 61у Туг А1а С1и Уа1 Туг Не
145 150 155 160
Азр Рго Ьеи Азп 61и ТЬг МеЕ Азр Не РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи
165 170 175
Агд Не А1а ΗΪ3 РЬе МеЕ А1а С1п Не Ьеи Н1з 61и ТЬг А1а Суз РЬе
180 185 190
Ьуз Туг ТЬг 61и 61 и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а Туг 61 и 61у Агд А1а
195 200 205
Азр Ьеи С1у Азп ТЫ Агд Рго 61 у Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд
210 215 220
01у Ьеи Ьеи С1п 11е ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 225 230 235 240
Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр 11е ТЬг Зег Зег 245 250 255
Уа1 ТЬг Суз А1а С1п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи 260 265 270
А1а Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг 275 280 285
А1а Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг 7а 1 Азп С1у Туг 290 295 300
А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп
305 310 315 320
ΗΪ3 Мер Ьуз С1и Агд Уа1 С1п Мер Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а Ьеи 325 330 335
61у Не Уа1 <210> 44 <211> 21 <212> ОМА <213> АгР1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> ОВРдрЬУЗ £огмагс! рНгаег <400> 44 аРдаааааРа дсдадаадаа Р 21 <210> 45 <211> 24 <212> ОНА <213> АгРгПсгаЬ Зедиепсе <220>
<223> ОВРдрЬУЗ геуегзе рНтег <400> 45 аасРаРРссд адРдсРРРсР РРдР 24 <210> 46 <211> 54 <212> ОМА <213> АгР1£1с1а1 Зедиепсе <22й>
- 39 024253 <223> РКОВРдрЬУЗ 1огмагб ргйпег <400> 46 акдддаксса аасдсаадаа асдкаадааа сдсааааааа акадсдадаа даак 54 <210> 47 <211> 336 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> ОВРдрЬУЗ мгкЬ Н1з-кад <400> 47
Мек Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а Зег Не Не Мек Зег Не С1п Агд 15 10 15
ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг С1у С1у Агд 11е Азр С1у Ьеи РЬе 20 25 30
61у С1и Ьуз Суз Агд С1у А1а 11е Не Ьеи Мек Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг 35 40 45
Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и 50 55 60
Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг 65 70 75 80
ТЬг Не ТЬг Г1е Азр С1у Ьуз Тгр С1у С1у ТЬг Зег С1п 61у А1а Не 85 90 95
Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд б1п Не ТЬг С1и А1а 61и Агд А1а 100 105 110
С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 Мек Зег Ьуз Ηίε Мек 115 120 125
Зег Не С1и С1п Ьеи Агд А1а Мек Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг 130 135 140
А1а С1и Уа1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп С1и ТЬг Мек Азр Не РЬе С1и 145 150 155 160
Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 11е А1а Н1з РЬе Мек А1а С1п Не Ьеи Ηίε 165 170 175
С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг С1и 61и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а 180 185 190
Туг С1и С1у Агд А1а Азр 195 Ьеи С1у Азп ТЬг 200 Агд Рго С1у 205 Азр С1у Рго
Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи С1п 11е ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг
210 215 220
Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе
225 230 235 240
Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а С1п 61п Ьеи Зег 61и Зег Рго
245 250 255
Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а 5ег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе 11е Ьуз Рго
260 265 270
Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр 11е Туг Тгр Уа1 Зег Уа1
275 280 285
Туг '/а! Азп С1у Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд
290 295 300
Азр Ьуз С1и Рго Азп Щз МеС Ьуз С1и Агд Уа1 С1п МеС Ьеи А1а Уа1
305 310 315 320
ТЬг Ьуз Ьуз А1а Ьеи С1у 11е Уа1 Ьуз С1у Ηί3 Шз Шз Шз Шз Шз
325 330 335
<210> 48
<211> 1011
<212> 1 0ΝΑ
<213> 1 ипкпомп
<220>
<223> ОВРдрЬУЗ мз,сЬ аскИМопа! НЬз-Сад
<400> 48
асдаааааса дсдадаадаа сдеассдаса аССаСдСсда Сасададаас дсСсдсССса 60
сссСсасСсС аСддаддссд сассдасддс сСсСССддад адаадсдссд сддддссасс 120
аСсССдаСдс СдааСааддС сСаСсскааС ССсадсасса асааасССсс дадСаасаса 180
СаСдаадсдд ааСссдСдСС сасдСССсСс садасСдсСС СддсСддСдС СддСсСССаС 240
ассаССасСа ССдаСддСаа аСддддСддС асССсСсаад дСдсСаССда сдсссСсдСс 300
аадСсССасс дСсаааССас сдаадсддад сдадсСдддС сдасдССдсс аССаддСсСС 360
дсСасСдСда СдСсСаадса СаСдСсСаСС даасадССда дадсааСдсС сссСассдаС 420
адасааддаС аСдсСдаадС ССаСаСсдаС ссСССаааСд адасдаСдда СаСаСССдаа 480
- 41 024253
аСаааСасСс саССа с;да а С СдсСсаСССс аСддсссааа СссСссасда аасддсдСдС 540
СССаааСаСа ссдаадаасС ддсдадсддС ааддсССаСд адддСсдСдс СдаСССаддС 600
ааСасСсдас саддСдаСдд ассасСдССС аааддСсдСд даССаССаса ааССассддд 660
сдасСдааСС аСдСдаааСд ссаадСдСаС ССдададада адССааадда сссСасСССс 720
дасаССасдС сдСсСдСаас ССдСдсссаа садсСсСссд ааадСссасС СсССдсСдса 780
ССддсаСсдд дсСасССсСд дадаССсаСс ааассСааас СсааСдааас ддсСдаСааа 840
дасдаСаСсС аССдддСССс СдСССаСдСс ааСддССасд сСааасаадс дааСссССаС 900
СасссСаасс дддаСаадда асссаассаС аСдааадаас дСдСссаааС дсССдсадСд 960
асааадааад сасьсддааС адССаадддС саСсаСсасс <210> 49 <211> 347 <212> РКТ <213> ипкпомп <220> <223> РКОЗРдрЬУЗ м±СЬ аб(Ыс1опа1 Н1з-Сад <400> 49 аСсассаССд а 1011
МеС С1у Зег Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд 1 5 Ьуз Ьуз Агд 10 Ьуз Ьуз Азп Зег СЬи 15
Ьуз Азп АЬа Зег 11е Не МеС Зег 20 11е СЬп Агд 25 ТЬг Ьеи АЬа 30 Зег Ьеи
Зег Ьеи Туг С1у СЬу Агд Не Азр 35 40 С1у Ьеи РЬе С1у С1и Ьуз 45 Суз Агд
С1у АЬа 11е Не Ьеи МеС Ьеи Азп 50 55 Ьуз УаЬ Туг Рго Азп РЬе 60 Зег ТЬг
Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг 65 70 СЬи АЬа СЬи 75 Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе 80
Ьеи С1п ТЬг АЬа Ьеи АЬа СЬу Уа1 85 СЬу Ьеи Туг 90 ТЬг 11е ТЬг 11е Азр 95
С1у Ьуз Тгр С1у С1у ТЬг Зег СЬп 100 СЬу АЬа 11е 105 Азр АЬа Ьеи 110 Уа1 Ьу5
Зег Туг Агд С1п 11е ТЬг С1и А1а 115 120 С1и Агд АЬа С1у Зег ТЬг 125 Ьеи Рго
Ьеи С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 МеС Зег Ьуз Н1з МеС Зег Не СЬи СЬп Ьеи
- 42 024253
130 135 140
Агд А1а МеС Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а С1и Уа1 Туг Не 145 150 155 160
Азр Рго Ьеи Азп С1и ТЬг МеЬ Азр Не РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи 165 170 175
Агд Не А1а Нгз РЬе МеЬ А1а С1п Не Ьеи Н1з 61и ТЬг А1а Суз РЬе 180 185 190
Ьуз Туг ТЬг С1и С1и Ьеи А1а Зег 61у Ьуз А1а Туг 61и С1у Агд А1а 195 200 205
Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд 210 215 220
61у Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 225 230 235 240
Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег 245 250 255
Уа1 ТЬг Суз А1а С1п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи 260 265 270
А1а Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп 61и ТЬг 275 280 285
А1а Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег 7а1 Туг Уа1 Азп С1у Туг 290 295 300
А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп 305 310 315 320
ΗΪ3 Мер Ьуз С1и Агд Уа1 С1п Мес Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а Ьеи 325 330 335
С1у Не Уа1 Ьуз С1у Шз Нгз Нгз Нгз Нгз Нгз 340 345 <210> 50 <211> 24 <212> РКТ <213> ипкпоип <220>
<223> апСгшгсгоЫа! рерСгде азсарЫпе
- 43 024253 <400> 50
С1у Не 1 Ьуз Азр Тгр 5 Не Ьуз С1у А1а А1а 10 Ьуз Ьуз Ьеи Не Ьуз 15 ТЬг
Уа1 А1а Зег ΗΪ5 20 Не А1а Азп С1п
<210> <211> <212> <213> 51 17 РКТ ипкпоип
<220> <223> апЫтьсгоЫа! . рерЫде ар10аес1пе
<400> 51
А1а Азп 1 Агд Рго Уа1 5 Туг Не Рго Рго Рго 10 Агд Рго Рго Н13 Рго 15 Агд
Ьеи
<210> 52 <211> 22 <212> РКТ <213> ипкпоип <220>
<223> апЫт1сгоЫа1 рерЫде Щдгосьпе <400> 52
61у Ьеи Ьеи Зег Ьуз 7а1 Ьеи С1у Уа1 С1у Ьуз Ьуз 7а1 Ьеи Суз С1у 15 10 15
Уа1 Зег С1у Ьеи Уа1 Суз 20
<210> 53
<211> 24
<212> РКТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> апНт1сгоЫа1 рерЫде РзеисЛп
<4 00> 53
С1у Ьеи ί Азп ТЬг Ьеи Ьуз Ьуз Уа1 РЬе С1п С1у Ьеи Шз С1и А1а Не
10 15
Ьуз Ьеи Не Азп Азп Шз 7а1 С1п 20
- 44 024253 <210> 54 <211> 354 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> АзсарЫпе5-0ВРдрЬ¥8 <400> 54
Мег 61у Не 1 Ьуз Азр Тгр Не Ьуз С1у А1а А1а Ьуз Ьуз 10 Ьеи Зег 30 Зег Не 15 С1и Ьеи Ьуз Ьуз Зег
5 Зег Шз Не Мек
ТЬг Азл Уа1 А1а А1а Азп С1п С1у Зег Ьуз Азп
А1а Зег 35 20 Не Не Зег 25
Не 40 С1п Агд ТЬг Ьеи А1а 45
Ьеи Туг С1у С1у Агд Не Азр <31у Ьеи РЬе 61у С1и Ьуз Суз Агд С1у
50 55 60
А1а Не Не Ьеи Мек Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго АЗП РЬе Зег ТЬг Азп
65 70 75 80
Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи
35 90 95
С1п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЫ Не ТЬг Не Азр С1у
100 105 110
Ьуз Тгр С1у С1у ТЬг Зег С1п С1у А1а Не Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег
115 120 125
Туг Агд С1п Не ТЬг С1и А1а С1и Агд А1а С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи
130 135 140
С2у Ьеи А1а ТЬг Уа1 Мек Зег Ьуз Н1з Мек Зег Не С1и С1п Ьеи Агд
145 150 155 160
А1а Мек Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а С1и Уа1 Туг Не Азр
165 170 175
Рго Ьеи Азп С1и ТЬг Мек Азр 11е РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд
180 185 190
Не А1а Шз РЬе Мек А1а С1п Не Ьеи ΗΪ3 С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз
195 200 205
Туг ТЬг 01и 01 и Ьеи А1а Зег 215 С1у Ьуз А1а Туг С1и О1у Агд А1а Азр 220
210
Ьеи 01 у Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр 01у Рго Ьеи РЬе Ьуз О1у Агд С1у
225 230 235 240
Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг 61у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг
245 250 255
Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1
260 265 270
ТЬг Суз А1а 01 п С1п Ьеи Зег 61и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а
275 280 285
Зег 01у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а
290 295 300
Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп О1у Туг А1а
305 310 315 320
Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп НЬз
325 330 335
Мек Ьуз С1и Агд Уа1 С1п Мек Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а ΗΪ3 С1у
340 345 350
Не Уа1 <210> 55 <211> 362 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> АзсарЫпе5-ОВРдрЬУЗ мхкЬ аВсПкхопаЬ Шз-кад <400> 55
Мек С1у Не 1 Ьуз Азр Тгр 5 Не Ьуз 01у А1а А1а 10 Ьуз Ьуз Ьеи Не 15 Ьуз
ТЬг Уа1 А1а Зег Н±з Не А1а Азп 61п 01у Зег Ьуз Азп Зег С1и Ьуз
20 25 30
Азп А1а Зег 11е Не Мек Зег Не С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег
35 40 45
- 46 024253
Ьеи Туг С1у С1у Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе Е1у С1и Ьуз Суз Агд С1у 50 55 60
А1а Не 11е Ьеи МеС Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп 65 70 75 80
Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи 85 90 95
61п ТЬг А1а Ьеи А1а 61у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг Не Азр С1у 100 105 110
Ьуз Тгр С1у 61у ТЬг Зег С1п С1у А1а Не Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег 115 120 125
Туг Агд С1п Не ТЬс С1и А1а С1и Агд А1а С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи 130 135 140
С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 МеЬ Зег Ьуз Нхз МеЬ Зег Не С1и С1п Ьеи Агд 145 150 155 160
А1а МеЬ Ьеи Рго ТЬг Азр Агд 61п С1у Туг А1а С1и Уа1 Туг Не Азр 165 170 175
Рго Ьеи Азп С1и ТЬг МеЬ Азр Не РЬе С1и 11е Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 180 185 190
Не А1а Н1з РЬе МеЬ А1а С1п Не Ьеи ΗΪ5 С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз 195 200 205
Туг ТЬг С1и С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а Туг С1и 61у Агд А1а Азр 210 215 220
Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у 225 230 235 240
Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг 245 250 255
Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 260 265 270
ТЬг Суз А1а С1п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а 275 280 285
Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а 290 295 300
- 47 024253
Азр Ьуз 305 Азр Азр Не Туг 310 Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 315 Азп 61у Туг А1а 320
Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп ΗΪ3
325 330 335
Мек Ьуз 61и Агд Уа1 С1п Мек Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а ΗΪ5 61у
340 345 350
Не Уа1 Ьеи С1и Ηΐ3 ΗΪ3 НЬз НЬз Н1з ΗΪ3
355 360
<210> 56
<211> 347
<212> РКТ
<213> ипкпонп
<220>
<223> АртДаесипе-ОВРдрЪУЗ
<400> 56
Мек А1а Азп Агд Рго Уа1 Туг Не Рго Рго Рго Агд Рго Рго Н1з Рго
1 5 10 15
Агд Ьеи С1у Зег Ьуз Азп Зег 61и Ьуз Азп А1а Зег Не Не Мек Зег
20 25 30
Не С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг 61у 61у Агд Не Азр
35 40 45
С1у Ьеи РЬе С1у С1и Ьуз Суз Агд С1у А1а Не Не Ьеи Мек Ьеи Азп
50 55 60
Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг
¢5 70 75 80
61и А1а 61и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг А1а Ьеи А1а 61 у Уа1
85 90 95
61у Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг 11е Азр С1у Ьуз Тгр С1у С1у ТЬг Зег С1п
100 105 110
61у А1а 11е Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд С1п Не ТЬг С1и А1а
115 120 125
С1и Агд А1а С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 Мек Зег
130 135 140
- 48 024253
Ьуз 145 Ηί5 Мер Зег Не С1и С1п 150 Ьеи Агд А1а Мер 155 Ьеи Рго ТЬг Азр Агд 160
С1п С1у Туг А1а С1и Уа1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп С1и ТЬг Мер Азр
165 170 175
Не РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 11е А1а Н1з РЬе Мер А1а С1п
180 185 190
Не Ьеи ΗΪ5 С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг С1и С1и Ьеи А1а Зег
195 200 205
С1у Ьуз А1а Туг С1и С1у Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго 61у
210 215 220
Азр О1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд
225 230 235 240
Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр
245 250 255
Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а С1п С1п Ьеи Зег
260 265 270
С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе
275 280 285
Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр
290 295 300
7а1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп С1у Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг
305 310 315 320
Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп НЬз Мер Ьуз С1и Агд Уа1 С1п Мер
325 330 335
Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а НЬз С1у Не Уа1
340 345
<210> 57
<211> 355
<212> РКТ
<213> ; ипкпоип
<220>
<223> Ар1с1аес1пе-0ВРдрЬУЗ м!РЬ адсНР1опа1 Н1д-Рад <400> 57
- 49 024253
Мек А1а Азп Агд Рго Уа1 Туг 11е Рго Рго Рго Агд Рго Рго Ηίε Рго 15 10 15
Агд Ьеи С1у Зег Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а Зех Не Не Мек Зег 20 25 30
11е С1п Агд ТЬх Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг С1у С1у Агд Не Азр 35 40 45
С1у Ьеи РЬе 61у С1и Ьуз Суз Агд 61у А1а Не Не Ьеи Мек Ьеи Азп 50 55 60
Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг 65 70 75 80
С1и А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 85 90 95
С1у Ьеи Туг ТЬг 11е ТЬг 11е Азр С1у Ьуз Тгр С1у С1у ТЬг Зег С1п 100 105 110
С1у А1а 11е Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд 61п Не ТЬг С1и А1а 115 120 125
С1и Агд А1а 01у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи 61у Ьеи А1а ТЬг Уа1 Мек Зег 130 135 140
Ьуз ΗΪ5 Мек Зег Не С1и С1п Ьеи Агд А1а Мек Ьеи Рго ТЬг Азр Агд 145 150 155 160
С1п С1у Туг А1а 01и 7а1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп С1и ТЬг Мек Азр 165 170 175
11е РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а Шз РЬе Мек А1а С1п 180 185 190
Не Ьеи Шз С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг 61и С1и Ьеи А1а Зег 195 200 205
С1у Ьуз А1а Туг С1и С1у Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго С1у 210 215 220
Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд 61у Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд 225 230 235 240
Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр 245 250 255
Рго ТЬг РЬе Азр 260 Не ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а С1п 61п Ьеи Зег
265 270
С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег СЬу Туг РЬе Тгр Агд РЬе
275 280 285
Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр
2 90 295 300
Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп СЬу Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг
305 310 315 320
Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп НЬз МеС Ьуз С1и Агд νβΐ С1п МеС
325 330 335
Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а Шз 61у Не УаЬ Ьеи С1и Шз Шз Шз
34 0 34 5 350
Шз Шз НЬз
355
<210> 58
<211> 352
<212> РКТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> 1 ШдгосЬпе 2-ОВРдрЬУ5
<4 00> 58
МеС СЬу Ьеи Ьеи Зег Ьуз Уа1 Ьеи С1у Уа1 61у Ьуз Ьуз 7а1 Ьеи Суз
1 5 10 15
СЬу Уа1 Зег С1у Ьеи Уа1 Суз С1у Зег Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а
20 25 30
Зег Не Не Мес Зег Не С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг
35 40 45
СЬу СЬу Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе С1у С1и Ьуз Суз Агд СЬу А1а Не
50 55 60
11е Ьеи МеС Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи
65 70 75 80
Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг
85 90 95
<210> 59
<211> 360
<212> РКТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> Ы1дгос1пе 2-ОВРдрЬУ5 мгЕЬ аосЛ 11опа1 Нгз-Еад
<400> 59
МеЕ С1у Ьеи Ьеи Зег Ьуз Уа1 Ьеи С1у Ца1 Е1у Ьуз Ьуз Уа1 Ьеи Суз
С1у Уа1 Зег С1у Ьеи 17а1 Суз С1у Зег Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а 20 25 30
Зег 11е 11е МеЕ Зег 11е 61п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг 35 40 45
С1у С1у Агд 11е Азр С1у Ьеи РЬе С1у С1и Ьуз Суз Агд С1у А1а 11е 50 55 60
11е Ьеи МеЕ Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи 65 70 75 80
Рго Зег Азп ТЬг Туг 61и А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг 85 90 95
А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг 11е Азр С1у Ьуз Тгр 100 105 110
С1у С1у ТЬг Зег 61п С1у А1а Не Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд 115 120 125
61п Не ТЬг С1и А1а С1и Агд А1а С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи 61у Ьеи 130 135 140
А1а ТЬг Уа1 МеЕ Зег Ьуз Нгз МеЕ Зег Не 61и 61п Ьеи Агд А1а МеЕ 145 150 155 160
Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а С1и 7а1 Туг Не Азр Рго Ьеи 165 170 175
Азп 61и ТЬг МеЕ Азр 11е РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а 180 185 190
Нгз РЬе МеЕ А1а 61п Не Ьеи Нгз 61и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг 195 200 205
61и 61и 210 Ьеи А1а Зег 61у Ьуз 215 А1а Туг 61и С1у Агд 220 А1а Азр Ьеи 61 у
Азп 225 ТЬг Агд Рго С1у Азр 230 61 у Рго Ьеи РЬе Ьуз 235 61у Агд б1у Ьеи Ьеи 240
61п Пе ТЬг С1у Агд 245 Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз 250 Суз С1п Уа1 Туг Ьеи 255 Агд
С1и Ьуз Ьеи Ьуз 260 Азр Рго ТЬг РЬе Азр 265 Не ТЬг Зег Зег Уа1 270 ТЬг Суз
А1а 61п С1п Ьеи Зег 61и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег 61у 275 280 285
Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз 295 Рго Ьуз Ьеи Азп 61и ТЬг А1а Азр Ьуз 300
290
Азр Азр 11е Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп 61у Туг А1а Ьуз 61 п
305 310 315 320
А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз 61и Рго Азп Шз МеЬ Ьуз
325 330 335
61и Агд Уа1 61п МеГ Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а Шз 61у 11е Уа1 340 345 350
Ьеи С1и Шз Шз Шз Шз Шз Шз 355 360
<210> 60
<211> 354
<212> РКТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> РзеисНп 1-ОВРдрЬУ5
<400> 60
МеЬ 61у Ьеи Азп ТЬг Ьеи Ьуз Ьуз Уа1 РЬе 61п 61у Ьеи Шз 61и А1а
10 15
11е Ьуз Ьеи Не Азп Азп Шз Уа1 61п 61у Зег Ьуз Азп Зег 61и Ьуз 20 25 30
Азп А1а Зег Не 11е Мег Зег 11е С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег 35 40 45
Ьеи Туг 61у 61у Агд 11е Азр 61у Ьеи РЬе 61у 61и Ьуз Суз Агд 61у
- 54 024253
55 ео
А1а 11е 11е Ьеи МеС Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп 65 70 75 80
Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а 01и Зег 7а1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи 85 90 95
С1п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг 11е ТЬг 11е Азр <31у 100 105 110
Ьуз Тгр 61у С1у ТЬг Зег С1п С1у А1а 11е Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег 115 120 125
Туг Агд С1п Не ТЬг 61и А1а С1и Агд А1а С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи 130 135 140
С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 МеС Зег Ьуз Н1з МеС Зег Не С1и С1п Ьеи Агд 145 150 155 160
А1а МеС Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а С1и 7а1 Туг Не Азр 165 170 175
Рго Ьеи Азп С1и ТЬг МеС Азр 11е РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 180 185 190
Не А1а ΗΪ5 РЬе МеС А1а С1п Не Ьеи Шз С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз 195 200 205
Туг ТЬг С1и С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а Туг С1и С1у Агд А1а Азр 210 215 220
Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр 61у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у 225 230 235 240
Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг 245 250 255
Ьеи Ахд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 260 265 270
ТЬг Суз А1а С1п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а 275 280 385
Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а 290 295 300
Азр Ъуз Азр 305 Азр Не Туг 310 Тгр Уа1 Зег УаЪ Туг УаЪ Азп СЪу Туг АЪа
315 320
Ъуз СЪп А1а Азп Рго 325 Туг Туг Рго Азп Агд Азр 330 Ъуз СЪи Рго Азп НЪз 335
Мер Ъуз СЪи Агд 7а1 СЪп Мер Ъеи АЪа УаЪ ТЬг Ъуз Ъуз А1а ΗΪ3 СЪу 340 345 350 Не УаЪ <210> 61 <211> 362 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220> <223> РзеийЪп 1-0ВРдрЪУЗ иЪРЬ аскЪЪРЪопаЪ НЪз-Рад <400> 61
Мер СЪу Ъеи 1 Азп ТЬг 5 Ъеи Ъуз Ъуз УаЪ РЬе СЪп 10 СЪу Ъеи НЪз СЪи АЪа 15
Не Ъуз Ъеи Не Азп 20 Азп НЪз Уа1 СЪп 25 С1у Зег Ъуз Азп Зег СЪи Ъуз 30
Азп А1а Зег 35 Не Не Мер Зег Не 40 СЪп Агд ТЬг Ъеи АЪа Зег Ъеи Зег 45
Ъеи Туг СЪу 50 СЪу Агд Не Азр СЪу 55 Ъеи РЬе СЪу СЪи Ъуз Суз Агд СЪу 60
АЪа 11е 11е 65 Ъеи Мер Ъеи 70 АЗП Ъуз УаЪ Туг Рго 75 Азп РЬе Зег ТЬг Азп 80
Ъуз Ъеи Рго Зег Азп 85 ТЬг Туг СЪи АЪа СЪи Зег 90 УаЪ РЬе ТЬг РЬе Ъеи 95
СЪп ТЬг А1а Ъеи А1а 100 СЪу УаЪ СЪу Ъеи 105 Туг ТЬг Не ТЬг Ъ1е Азр СЪу 110
Ъуз Тгр СЪу 115 СЪу ТЬг 5ег СЪп СЪу 120 АЪа 11е Азр АЪа Ъеи УаЪ Ъуз Зег 125
Туг Агд СЪп 130 Не ТЬг СЪи АЪа СЪи 135 Агд АЪа СЪу Зег ТЬг Ъеи Рго Ъеи 140
СЪу Ъеи А1а ТЬг УаЪ Мер Зег Ъуз НЪз Мер Зег 11е СЪи СЪп Ъеи Агд
- 56 024253
145 150 155 160
А1а МеС Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг АЬа С1и Уа1 Туг 11е Азр
165 170 175
Рго Ьеи Азп С1и ТЬг МеС Азр Не РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд
180 185 190
Не АЬа ΗΪ8 РЬе МеС А1а 61п Пе Ьеи Н1з 61и ТЬг АЬа Суз РЬе Ьуз
195 200 205
Туг ТЬг С1и 61и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а Туг 61 и С1у Агд А1а Азр
210 215 220
Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго 61 у Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд 61у
225 230 235 240
Ьеи Ьеи СЬп Не ТЬг 61 у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз СЬп Уа1 Туг
245 250 255
Ьеи Агд 61и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1
260 265 270
ТЬг Суз А1а С1п СЬп Ьеи Зег 61и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а
275 280 285
Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе 11е Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп 61и ТЬг А1а
290 295 300
Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тхр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп 61у Туг А1а
305 310 315 320
Ьуз 61п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз 61и Рго Азп Шз
325 330 335
МеС Ьуз СЬи Агд Уа1 61п МеС Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а ΗΪ5 61у
340 345 350
Не Уа1 Ьеи С1и Ηί3 Й23 ΗΪ3 Й15 Шз Н1з
355 360 <210> 62 <211> 369 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> ЗагсоСохЬп ΙΑ-ОВРдрЬУЗ
- 57 024253
<400> ' 52
Мес С1у Тгр Ьеи Ьуз Ьуз 11е 61у Ьуз Ьуз 11е С1и Агд Уа1 Е1у С1п
1 5 10 15
ΗΪ3 ТЬг Агд Азр А1а ТЬг 11е Е1п Е1у Ьеи С1у 11е А1а С1п Е1п А1а
20 25 30
А1а Азп νβΐ А1а А1а ТЬг А1а Агд Е1у Зег Ьуз Азп Зех 61и Ьуз Азп
35 40 45
А1а Зег 11е 11е МеС Зег 11е Е1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи
50 55 60
Туг Е1у С1у Агд 11е Азр С1у Ьеи РЬе Е1у С1и Ьуз Суз Агд Е1у А1а
65 70 75 80
11е 11е Ьеи Мес Ьеи АЗП Ьуз Уа1 туг Рго Азп РЬе Зех ТЬх Азп Ьуз
85 90 95
Ьеи Рго Зег Азп ТЬг туг Е1и А1а Е1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи 61п
100 105 110
ТЬх А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг 11е ТЬг Не Азр Е1у Ьуз
115 120 125
Тгр С1у С1у ТЬг Зег С1п С1у А1а Не Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зех Туг
130 135 140
Агд Е1п 11е ТЬг С1и А1а С1и Агд А1а 61у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у
145 150 155 160
Ьеи А1а ТЬг Уа1 МеС Зег Ьуз Н1з МеС Зег 11е С1и Е1п Ьеи Агд А1а
165 170 175
Мес Ьеи Рго ТЬг Азр Агд Е1п Е1у Туг А1а С1и Уа1 Туг 11е Азр Рхо
180 185 190
Ьеи Азп С1и ТЬг МеС Азр Не РЬе Е1и 11е Азп ТЬх Рго Ьеи Ахд Не
195 200 205
А1а Нхз РЬе Мес А1а Е1п Пе Ьеи Нхз С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Тух
210 215 220
ТЬг Е1и С1и Ьеи А1а Зег Е1у Ьуз А1а Туг 61и 61у Ахд А1а Азр Ьеи
225 230 235 240
61у Азп ТЬг Агд Рго Е1у Азр 61 у Рго Ьеи РЬе Ьуз 61 у Ахд С1у Ьеи
245
250 255
Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп 260
Туг Уа1 Ьуз Суз С1п νβΐ Туг Ьеи 265 270
Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг 275 280
РЬе Азр 11е ТЬг Зег Зег \7а1 ТЬг 285
Суз А1а С1п <31п Ьеи Зег С1и Зег 290 295
Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег 300
С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз 305 310
Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр 315 320
Ьуз Азр Азр 11е Туг Тгр Уа1 Зег 325
Уа1 Туг УаЬ Азп С1у Туг А1а Ьуз 330 335
С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп 340
Агд Аэр Ьуз С1и Рго Азп Нгз Мек 345 350
Ьуз С1и Агд Уа1 О1п Мек Ьеи А1а 355 360
Х7а1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а НЬз С1у 11е 365
Уа1
<210> 63
<211> 377
<212> РЕТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> Загсокохкп ΙΑ-ОВРдрЬУЗ м1кЬ аекИкгопаЬ Нтз-кад
<400> 63
Мек С1у Тгр Ьеи Ьуз Ьуз Не С1у Ьуз Ьуз Не С1и Агд Уа1 С1у С1п
10 15
Н1з ТЬг Агд Азр А1а ТЬг 11е С1п 61у Ьеи С1у Не А1а С1п С1п А1а 20 25 30
А1а Азп УаЬ А1а А1а ТЬг А1а Агд 61у Зег Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп 35 40 45
АЬа Зег Не Не Мек Зег Не С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи 50 55 60
Туг С1у С1у Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе С1у С1и Ьуз Суз Агд С1у АЬа 65 70 75 80
- 60 024253
325 330 335
С1п А1а Азп Рго 340 Туг Туг Рго Азп Агд 345 Азр Ьуз С1и Рго Азп 350 НЬз Мек
Ьуз С1и Агд 355 Уа1 СХп Мек Ьеи А1а 360 УаХ ТЬг Ьуз Ьуз А1а 365 НЬз С1у 11е
Уа1 Ьеи С1и Низ Нйз Нхз НЬз НЬз НЬз
370 375 <210> 64 <211> 359 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> . ЗагсокохЬп ХА-ОВРдрЬУЗ
<400> 64
Мек Агд С1у Ьеи Агд Ахд Ьеи СХу Агд Ьуз Не А1а Низ С1у Уа1 Ьуз
1 5 10 15
Ьу5 Туг С1у Рго ТЬх УаХ Ьеи Агд Не Не Ахд 11е А1а С1у С1у Зег
20 25 30
Ьуз Азп Зех С1и Ьуз Азп А1а Зег Не Не Мек Зег 11е СХп Ахд ТЬх
35 40 45
Ьеи А1а Зех Ьеи Зег Ьеи Тух С1у С1у Ахд 11е Азр СХу Ьеи РЬе С1у
50 55 60
С1и Ьуз Суз Ахд С1у А1а Г1е Не Ьеи Мек Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго
65 70 75 80
Азп РЬе Зех ТЬх Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а СХи Зег
85 90 95
Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи СХп ТЬх А1а Ьеи А1а С1у УаХ С1у Ьеи Тух ТЬх
100 105 110
Не ТЬг Не Азр С1у Ьуз Тгр СХу СХу ТЬх Зег С1п С1у А1а Не Азр
115 120 125
А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд СХп Не ТЬг СХи А1а СХи Агд А1а С1у
130 135 140
Зег ТЬх Ьеи Рго Ьеи 61у Ьеи А1а ТЬг Уа1 Мек Зег Ьуз Н13 Мек Зег
145 150 155 160
- 61 024253
11е С1и С1п Ьеи Агд А1а Мек Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а 165 170 175
С1и Уа1 Туг 11е Азр Рго Ьеи Азп С1и ТЬг Мек Азр Не РЬе С1и Не 180 185 190
Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а НЬз РЬе Мек А1а С1п Не Ьеи Шз С1и 195 200 205
ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг С1и С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а Туг 210 215 220
61и 51у Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго 61у Азр С1у Рго Ьеи 225 230 235 240
РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 245 250 255
Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр 260 265 270
Не ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а С1п 61п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи 275 280 235
Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз 290 295 300
Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг 305 310 315 320
Уа1 Азп С1у Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр 325 330 335
Ьуз С1и Рго Азп НЬз Мек Ьуз С1и Агд Уа1 С1п Мек Ьеи А1а Уа1 ТЬг 340 345 350
Ьуз Ьуз А1а Н1з С1у Не 7а1 355 <210> 65 <211> 367 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> ЗагсокохЬп 1А-ОВРдрЬУ5 м1кЬ аддЬкЬопаЬ Нхз-кад <400> 65
- 62 024253
Мек Агд С1у Ьеи Агд Агд Ьеи С1у Агд Ьуз Не А1а Шз С1у Уа1 Ьуз 15 10 15
Ьуз Туг С1у Рго ТЬг Уа1 Ьеи Агд 11е 11е Агд 11е А1а С1у С1у Зег 20 25 30
Ьуз Азп Зег 61и Ьуз Азп А1а Зег Не Не Мек Зег Не С1п Агд ТЬг 35 40 45
Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг 61у С1у Агд Не Азр 61у Ьеи РЬе С1у 50 55 60
61и Ьуз Суз Агд С1у А1а Не Не Ьеи Мек Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго 65 70 75 80
Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и Зег 85 90 95
Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 61у Ьеи Туг ТЬг 100 105 110
Не ТЬг Не Азр С1у Ьуз Тгр С1у С1у ТЬг Зег С1п 61у А1а Не Азр 115 120 125
А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд С1п Не ТЬг С1и А1а 61и Агд А1а С1у 130 135 140
Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 Мек Зег Ьуз Наз Мек Зег 145 150 155 160
Не С1и С1п Ьеи Агд А1а Мек Ьеи Рго ТЬг Азр Агд 61п С1у Туг А1а 165 170 175
С1и 7а1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп С1и ТЬг Мек Азр Не РЬе С1и Не 180 185 190
Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а ΗΪ3 РЬе Мек А1а С1п Не Ьеи Н1з С1и 195 200 205
ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг 61и 61и Ьеи А1а Зег 61у Ьуз А1а Туг 210 215 220
С1и 61у Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр 61у Рго Ьеи 225 230 235 240
РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 245 250 255
- 63 024253
Ьуз Суз С1п Уа1 260 Туг Ьеи Агд СЬи Ьуз 265 Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг 270 РЬе Азр
Не ТЬг Зег 275 Зег УаЬ ТЬг Суз АЬа 280 СЬп СЬп Ьеи Зег 61и 285 Зег Рго Ьеи
Ьеи АЬа 290 А1а Ьеи АЬа Зег СЬу 295 Туг РЬе Тгр Агд РЬе 300 Не Ьуз Рго Ьуз
Ьеи Азп СЬи ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег УаЬ Туг
305 310 315 320
Уа1 Азп СЬу Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр 325 330 335
Ьуз СЬи Рго Азп 340 ΗΪ3 МеС Ьуз СЬи Агд 345 УаЬ О1п МеС Ьеи А1а 350 УаЬ ТЬг
Ьуз Ьуз АЬа ΗΪ3 СЬу Не УаЬ Ьеи СЬи Шз Шз Шз Нгз Шз Шз
355 360 365
<210> 66
<211> 366
<212> РЕТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> СесгорЬп А (А.аедурСЦ-ОВРдрЬУЗ
<400> 66
МеС С1у СЬу Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи С1у Ьуз Ьуз Ьеи СЬи СЬу А1а С1у Ьуз
10 15
Агд УаЬ РЬе Азп А1а А1а СЬи Ьуз А1а Ьеи Рго УаЬ УаЬ А1а СЬу А1а 20 25 30
Ьуз А1а Ьеи Агд Ьуз СЬу Зег Ьуз Азп Зег СЬи Ьуз Азп А1а Зег 11е 35 40 45
11е МеС Зег 11е С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг СЬу СЬу 50 55 60
Агд Не Азр СЬу Ьеи РЬе СЬу С1и Ьуз Суз Агд СЬу А1а Не Не Ьеи
65 70 75 80
МеС Ьеи Азп Ьуз УаЬ Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег
85 90 95
- 64 024253
Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и Зег \7а1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи Е1п ТЬг А1а Ьеи 100 105 110
А1а С1у νβΐ С1у Ьеи Туг ТЬг 11е ТЬг Не Азр С1у Ьуз Тгр С1у С1у 115 120 125
ТЬг Зег С1п С1у А1а Не Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд 51п Не 130 135 140
ТЬг С1и А1а С1и Агд А1а С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи 61у Ьеи А1а ТЬг 145 150 155 160
Уа1 МеЕ Зег Ьуз Ηίε МеЕ Зег Не С1и С1п Ьеи Агд А1а МеЕ Ьеи Рго 165 170 175
ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а С1и Уа1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп С1и 180 185 190
ТЬг МеЕ Азр Не РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а Нгз РЬе 195 200 205
МеЕ А1а 61 п 11е Ьеи ΗΪ3 С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг С1и С1и 210 215 220
Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а Туг С1и С1у Агд А1а Азр Ьеи 51у Азп ТЬг 225 230 235 240
Агд Рго С1у Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи С1п Не 245 250 255
ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз 260 265 270
Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр 11е ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а 61п 275 280 285
61п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег С1у Туг РЬе 290 295 300
Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр 305 310 315 320
Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп С1у Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп 325 330 335
Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз 61и Рго Азп Ыз МеЕ Ьуз С1и Агд
340
350
345 νβΐ С1п МеС Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а Шз С1у 11е Уа1 355 360 365
<210> 67
<211> 374
<212> РЕТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> СесгорЬп А (А. аедурН ) -ОВРдрЬУЗ м1сЬ айсПс1опа1 Шз-Сад
<400> 67
МеС С1у С1у Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи С1у Ьуз Ьуз Ьеи С1и С1у А1а 61у Ьуз
Агд Уа1 РЬе Азп А1а А1а б!и Ьуз А1а Ьеи Рго Уа1 Уа1 А1а С1у А1а 20 25 30
Ьуз А1а Ьеи Агд Ьуз С1у Зег Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а Зег 11е 35 40 45
11е МеС Зег 11е С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг С1у С1у 50 55 60
Агд 11е Азр С1у Ьеи РЬе С1у С1и Ьуз Суз Агд С1у А1а Не Не Ьеи 65 70 75 90
МеС Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег 85 90 95
Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи 61п ТЬг А1а Ьеи 100 105 110
А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг 11е Азр С1у Ьуз Тгр С1у С1у 115 120 125
ТЬг Зег С1п С1у А1а Не Азр А1а Ьеи \7а1 Ьуз Зег Туг Агд С1п Не 130 135 140
ТЬг С1и А1а С1и Агд А1а С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а ТЬг 145 150 155 160
Уа1 МеС Зег Ьуз Шз МеС Зег 11е С1и С1п Ьеи Агд А1а МеС Ьеи Рго 165 170 175
ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а С1и Уа1 Туг 11е Азр Рго Ьеи Азп С1и 180 185 190
- 66 024253
ТЬг МеЬ Азр 11е РЬе 195 С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 200 Не А1а Нхз 205 РЬе
Мек А1а С1п 11е Ьеи НХЗ С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг С1и С1и
210 215 220
Ьеи А1а Зег 61у Ьуз А1а Туг С1и С1у Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп ТЬг
225 230 235 240
Агд Рго С1у Азр 61у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи С1п Не
245 250 255
ТЬг 61у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз
260 265 270
Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а С1п
275 280 285
61п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег С1у Туг РЬе
290 295 300
Тгр Агд РЬе 11е Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр
305 310 315 320
11е Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп 61у Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп
325 330 335
Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп Н1з МеС Ьуз С1и Агд
340 345 350
Уа1 С1п МеЬ Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а Шз С1у 11е Уа1 Ьеи С1и
355 360 365
ΗΪ3 ΗΪ3 ΗΪ5 ΗΪ5 Шз Шз
370
<210> 68
<211> 13
<212> РКТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> апкхтхсгоЬха! рерЬхде А1рЬа 4
<400> 68
Рго Азп Агд А1а Ьуз Агд Уа1 11е ТЬг ТЬг РЬе Агд ТЬг
10
- 67 024253 <210> 69 <211> 327 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> ОВРдрЬУЗ ргадтпепР <400> 69
Ьуз 1 Азп Зег С1и Ьуз 5 Азп А1а Зег 11е Не 10 МеР Зег 11е С1п Агд 15 ТЬг
Ьеи А1а Зег Ьеи 20 Зег Ьеи Туг С1у С1у 25 Агд Не Азр С1у Ьеи 30 РЬе С1у
С1и Ьуз Суз 35 Агд С1у А1а 11е Не 40 Ьеи Мер Ьеи Азп Ьуз 45 Уа1 Туг Рго
Азп РЬе 50 Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи 55 Рго Зег Азп ТЬг Туг 60 С1и А1а С1и Зег
νβΐ 65 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п 70 ТЬг А1а Ьеи А1а С1у 75 Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг 80
Не ТЬг Не Азр С1у 85 Ьуз Тгр С1у 61у ТЬг 90 Зег С1п С1у А1а Не 95 Азр
А1а Ьеи Уа1 Ьуз 100 Зег Туг Агд С1п Не 105 ТЬг С1и А1а С1и Агд НО А1а 61у
8ег ТЬг Ьеи 115 Рго Ьеи С1у Ьеи А1а 120 ТЬг Уа1 МеР Зег Ьуз 125 ΗΪ5 Мер Зег
Не С1и 130 С1п Ьеи Агд А1а МеР 135 Ьеи Рго ТЬг Азр Агд 140 СЬп С1у Туг А1а
С1и 145 Уа1 Туг Не Азр Рго 150 Ьеи Азп С1и ТЬг МеР 155 Азр 11е РЬе 61и Не 160
Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 165 Не А1а ΗΪ3 РЬе Мер 170 А1а 61п Не Ьеи Н1з 175 С1и
ТЬг А1а Суз РЬе 180 Ьуз Туг ТЬг С1и 01и 185 Ьеи А1а Зег 61у Ьуз 190 А1а Туг
61и С1у Агд 195 А1а Азр Ьеи С1у Азп 200 ТЬг Агд Рго С1у Азр 205 С1у Рго Ьеи
РЬе Ъуз СЪу Агд СЪу Ъеи Ъеи СЪп 215 Не ТЬг СЪу Агд Ьеи Азп 220 Туг УаЪ
210
Ъуз Суз СЪп УаЪ Туг Ъеи Агд СЪи Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр
225 230 235 240
Не ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз АЪа СЪп СЪп Ьеи Зег СЪи Зег Рго Ьеи
245 250 255
Ъеи АЪа АЪа Ъеи АЪа Зег СЪу Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз
260 265 270
Ъеи Азп СЪи ТЬг АЪа Азр Ъуз Азр Азр Не Туг Тгр УаЪ Зег УаЪ Туг
275 280 285
УаЪ Азп СЪу Туг АЪа Ъуз СЪп АЪа Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр
290 295 300
Ъуз СЪи Рго Азп НЪз МеР Ъуз СЪи Агд УаЪ СЪп Мер Ъеи АЪа УаЪ ТЬг
305 310 315 320
Ъуз Ъуз АЪа Ъеи СЪу Не ν*ι
325
<210> 70
<2И> 13
<212> РКТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> апРЪтЪсхорЪаЪ рерРЪЬе АгРЪЪузЪпЪ <400> 70
СЪу РЬе РЬе Не Рго АЪа ¥а! Ъ1е Ьеи Рго Зег 1Ъе АЪа РЬе Ьеи 11е 15 10 15
УаЪ Рго <210> 71 <211> 25 <212> РРТ <213> ипкпоип <220>
<223> апРЪтЪсгоЬЪаЪ рерРЪйе АгРЪ1узЪп2 <400> 71
СЪу Ьуз Рго СЪу Тгр Ьеи 11е Ьуз Ьуз АЪа Ьеи УаЪ РЬе Ьуз Ъуз Ъеи 15 10 15
- 69 024253
11е Агд Агд Рго Ьеи Ьуз Агд Ьеи А1а 20 25 <210> 72 <211> 19 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> апкЬтЬсгоЬЬаЬ реркЬйе РагазЬп 1 <400> 72
Ьуз СЬу Агд СЬу Ьуз СЬп СЬу С1у Ьуз УаЬ Агд А1а Ьуз А1а Ьуз ТЬг 15 10 15
Агд Зег Зег <210> 73 <211> 25 <212> РЕТ <213> ипкпомп <220>
<223> апкЬтЬсгоЬЬаЬ реркЬде ЬусокохЬп <400> 73
11е Тгр Ьеи ТЬг АЬа Ьеи Ьуз РЬе Ьеи СЬу Ьуз НЬз АЬа АЬа Ьуз Ьуз
1 5 10 15
Ьеи АЬа Ьуз СЬп СЬп Ьеи Зег Ьуз Ьеи
20 25
<210> 74
<211> 346
<212> РЕТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> А1рЬа4-ОВРдрЬУЗ
<400> 74
Мек СЬу Зег Рго Азп Агд АЬа Ьуз Агд УаЬ 11е ТЬг ТЬг РЬе Агд ТЬг
1 5 10 15
61у Зег Зег Ьуз Азп Зег СЬи Ьуз Азп АЬа Зег 11е Не Мек Зег Ые
20 25 30
С1п Агд ТЬг Ьеи АЬа Зег Ьеи Зег Ьеи Туг СЬу СЬу Агд Не Азр СЬу
35 40 45
- 70 024253
Ъеи РЪе С1у С1и Ъуз Суз Агд С1у А1а Не 11е Ъеи Меи Ъеи Азп Ъуз 50 55 60
7а1 Туг Рго Азп РЪе Зег ТЪг Азп Ъуз Ъеи Рго 5ег Азп ТЪг Туг С1и 65 70 75 80
А1а С1и Зег Уа1 РЪе ТЪг РЪе Ъеи С1п ТЪг А1а Ъеи А1а С1у Уа1 С1у 85 90 95
Ъеи Туг ТЪг Г1е ТЪг 11е Азр С1у Ъуз Тгр С1у С1у ТЪг 5ег С1п С1у 100 105 110
А1а Не Азр А1а Ъеи 7а1 Ъуз Зег Туг Агд 01п Не ТЪг С1и А1а С1и 115 120 125
Агд А1а С1у Зег ТЪг Ъеи Рго Ъеи С1у Ъеи А1а ТЪг Уа1 Меи Зег Ъуз ' 130 135 140
Н1з МеЕ Зег Не С1и С1п Ъеи Агд А1а Меи Ъеи Рго ТЪг Азр Агд С1п 145 150 155 160
С1у Туг А1а С1и Уа1 Туг Не Азр Рго Ъеи Азп С1и ТЪг Меи Азр Не 165 170 175
РЪе С1и Не Азп ТЪг Рго Ъеи Агд Не А1а Н1з РЪе Меи А1а С1п Не 180 185 190
Ъеи Н1з С1и ТЪг А1а Суз РЪе Ъуз Туг ТЪг С1и С1и Ъеи А1а Зег 61у 195 200 205
Ъуз А1а Туг С1и С1у Агд А1а Азр Ъеи С1у Азп ТЪг Агд Рго С1у Азр 210 215 220
С1у Рго Ъеи РЪе Ъуз С1у Агд С1у Ъеи Ъеи С1п Не ТЪг С1у Агд Ъеи 225 230 235 240
Азп Туг νβΐ Ъуз Суз С1п Уа1 Туг Ъеи Агд С1и Ъуз Ъеи Ъуз Азр Рго 245 250 255
ТЪг РЪе Азр 11е ТЪг Зег Зег Ца1 ТЪг Суз А1а С1п С1п Ъеи Зег С1и 260 265 270
Зег Рго Ъеи Ъеи А1а А1а Ъеи А1а Зег С1у Туг РЪе Тгр Агд РЪе Не 275 280 285
Ъуз Рго Ъуз Ъеи Азп С1и ТЪг А1а Азр Ъуз Азр Азр 11е Туг Тгр Уа1 290 295 300
Зег Уа1 Туг УаЪ Азп СЪу Туг А1а Ъуз 51п А1а Азп Рго Туг Туг Рго 305 310 315 320
Азп Агд Азр Ъуз С1и Рго Азп Нйз МеЬ Ъуэ С1и Агд Уа1 С1п НеЬ Ъеи 325 330 335
А1а Уа1 ТЬг Ъуз Ъуз А1а Н1з С1у Не Уа1 340 345
<210> 75
<211> 354
<212> РЕТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> А1рЬа4-ОВРдрЪУЗ нПЬ а0сПС1опа1 НЪз-кад
<4 00> 75
МеО С1у Зег Рго Азп Агд А1а Ъуз Агд Уа1 Не ТЬг ТЬг РЬе Агд ТЬг
С1у Зег Зег Ъуз Азп Зег 01ц Ъуз Азп А1а Зег Не 11е МеЬ Зег Не 20 25 30
С1п Агд ТЬг Ъеи А1а Зег Ъеи Зег Ъеи Туг С1у С1у Агд Не Азр С1у 35 40 45
Ъеи РЬе С1у 61и Ъуз Суз Агд С1у А1а 11е Не Ъеи Ме£ Ъеи Азп Ъуз 50 55 60
Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ъуз Ъеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и 65 70 75 80
А1а С1и Зег УаЪ РЬе ТЬг РЬе Ъеи С1п ТЬг А1а Ъеи А1а 61у 7а1 С1у 85 90 95
Ъеи Туг ТЬг Не ТЬг Ъ1е Азр 01у Ъуз Тгр С1у С1у ТЬг Зег С1п С1у 100 105 110
А1а Не Азр А1а Ъеи Уа1 Ъуз Зег Туг Агд С1п Не ТЬг С1и А1а О1и 115 120 125
Агд А1а С1у Зег ТЬг Ъеи Рго Ъеи С1у Ъеи А1а ТЬг Уа1 Ме1 Зег Ъуз 130 135 140
Шз МеС Зег Не С1и С1п Ъеи Агд А1а МеЬ Ъеи Рго ТЬг Азр Агд С1п 145 150 155 160
- 72 024253
С1у Туг А1а С1ч Уа1 Туг 11е Азр Рго Ьеи Азп С1и ТЬг Мек Азр Не
165 170 175
РЬе С1и 11е Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а НЬз РЬе Мек А1а С1п Не
180 185 190
Ьеи НЬз С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг С1и СЬи Ьеи А1а Зег 61у
195 200 205
Ьуз А1а Туг С1и 51у Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр
210 215 220
С1У Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи 61п 11е ТЬг С1у Агд Ьеи
225 230 235 240
Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п 7а1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго
245 250 255
ТЬг РЬе Азр 11е ТЬг Зег Зес Уа1 ТЬг Суз А1а С1п С1п Ьеи Зег С1и
260 265 270
Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не
275 280 285
Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп 51и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр Уа1
290 295 300
Зег Уа1 туг Уа1 Азп С1у туг А1а Ьуз 61п А1а Азп Рго туг Туг Рго
305 310 315 320
Азп Агд Азр Ьуз СЬи Рго Азп НЬз Мек Ьуз С1и Агд Уа1 С1п Мек Ьеи
325 330 335
А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а НЬз С1у Не Уа1 Ьуз С1у НЬз НЬз НЬз НЬз
340 345 350
НЬз НЬз
<210> 76
<211> 338
<212> РКТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> РепкареркЬде-ОВРдрЬуз
<400> 76
- 73 024253
Мек С1у Зег РЬе РЬе Уа1 А1а Рго С1у Зег Зег Ьуз Азп Зег С1и Ьуз 15 10 15
Азп А1а Зег 11е 11е Мек Зег Не С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег 20 25 30
Ьеи Туг С1у С1у Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе С1у С1и Ьуз Суз Агд С1у 35 40 45
А1а Не Не Ьеи Мек Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп 50 55 60
Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи 65 70 75 80
С1п ТЬг А1а Ьеи А1а 01у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг Не Азр С1у 85 90 95
Ьуз Тгр С1у 61у ТЬг Зег С1п 61у А1а Не Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег 100 105 110
Туг Агд С1п Не ТЬг 61и А1а С1и Агд А1а б1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи 115 120 125
С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 Мек Зег Ьуз ΗΪ5 Мек Зег Не С1и С1п Ьеи Агд 130 135 140
А1а Мек Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а С1и Уа1 Туг Не Азр 145 150 155 160
Рго Ьеи Азп С1и ТЬг Мек Азр Не РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 165 170 175
Не А1а Н1з РЬе Мек А1а С1п Не Ьеи Н1з 61и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз 180 185 190
Туг ТЬг С1и С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а Туг С1и С1у Агд А1а Азр 195 200 205
Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд 61у 210 215 220
Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг 225 230 235 240
Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 245 250 255
- 74 024253
ТЬг Суз АЬа СЬп 260 СЬп Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а АЬа Ьеи АЬа
265 270
Зег СЬу Туг РЬе Тгр Ахд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг АЬа
275 280 285
Азр Ьуз Азр Азр 11е Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг УаЬ Азп СЬу Туг АЬа
290 295 300
Ьуз СЬп АЬа Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз СЬи Рго Азп НЬз
305 310 315 320
МеС Ьуз СЬи Агд УаЬ СЬп МеС Ьеи А1а УаЬ ТЬг Ьуз Ьуз А1а НЬз СЬу
325 330 335
Не УаЬ
<210> 77
<211> 346
<212> РКТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> РепСарерСЬбе-ОВРдрЬуз иЬсЬ аскЬЬСЬопаЬ НЬз-Сад
<400> 77
МеС СЬу Зег РЬе РЬе Уа1 АЬа Рго СЬу Зег Зег Ьуз Азп Зег СЬи Ьуз
1 5 10 15
Азп АЬа Зег Не Не МеС Зег Не СЬп Агд ТЬг Ьеи АЬа Зег Ьеи Зег
20 25 30
Ьеи туг СЬу СЬу Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе СЬу СЬи Ьуз Суз Агд СЬу
35 40 45
АЬа Не Не Ьеи МеС Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп
50 55 60
Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и АЬа С1и Зег УаЬ РЬе ТЬг РЬе Ьеи
65 70 75 80
СЬп ТЬг АЬа Ьеи АЬа СЬу Уа1 СЬу Ьеи Туг ТЬг Не ТЫ Не Азр СЬу
85 90 95
Ьуз Тгр СЬу СЬу ТЬг Бег СЬп С1у А1а Не Азр АЬа Ьеи УаЬ Ьуз Зег
100 105 110
- 75 024253
Туг Агд С1п 11е ТЬг С1и АЬа СЬи Агд АЬа СЬу Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи 115 120 125
61у Ьеи А1а ТЬг 7а1 МеС Зег Ьуз НЬз МеС Зег 11е СЬи С1п Ьеи Агд 130 135 140
А1а МеС Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п СЬу Туг А1а СЬи Уа1 Туг 11е Азр 145 150 155 160
Рго Ьеи Азп С1и ТЬг МеС Азр 11е РЬе СЬи 11е Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 165 ПО 175
11е А1а НЬз РЬе МеС АЬа 61п 11е Ьеи НЬз С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз 180 185 190
Туг ТЬг С1и С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а Туг С1и С1у Агд А1а Азр 195 200 205
Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго СЬу Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у 210 215 220
Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг СЬу Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз СЬп Уа1 Туг 225 230 235 240
Ьеи Агд СЬи Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 245 250 255
ТЬг Суз А1а 61п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а 260 265 270
Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Пе Ьуз Рго Ьуз Ьеи Аэп С1и ТЬг АЬа 275 280 285
Азр Ьуз Азр Азр 11е Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп СЬу Туг А1а 290 295 300
Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп НЬз 305 310 315 320
МеС Ьуз С1и Агд Уа1 СЬп МеС Ьеи А1а ’/а! ТЬг Ьуз Ьуз А1а НЬз 61у 325 330 335
Пе Уа1 Ьуз СЬу НЬз НЬз НЬз НЬз НЬз НЬз 340 345 <210> 78
- 76 024253 <211> 351 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> АгкХ1уз1-0ВРдрЬуз <400> 78
Мек 1 С1у Зег СХу РЬе 5 РЬе Не Рго А1а УаХ 10 Не Ьеи Рго Зег Не 15 АХа
РЬе Ьеи Не Уа1 Рго С1у Зег Зег Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп АХа Зег
20 25 30
Не Не Мек Зег Не СХп Агд ТЬг Ьеи АХа Зег Ьеи Зег Ьеи Туг СХу
35 40 45
С1у Агд Не Азр СХу Ьеи РЬе СХу С1и Ьуз Суз Агд СХу А1а Не Не
50 55 60
Ьеи Мек Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго
65 70 75 80
Зег Азп ТЬг Туг СХи АХа СХи Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг АХа
85 90 95
Ьеи АХа СХу Уа1 СХу Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг Не Азр СХу Ьуз Тгр СХу
100 105 110
51 у ТЬг Зег С1п СХу А1а Не Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд СХп
115 120 125
Не ТЬг СХи АХа СХи Агд А1а СХу Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи АХа
130 135 140
ТЬг Уа1 Мек Зег Ьуз Шз Мек Зег Не 51 и СХп Ьеи Агд АХа Мек Ьеи
145 150 155 160
Рго ТЬг Азр Агд СХп СХу Туг А1а СХи Уа1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп
165 170 175
СХи ТЬг Мек Азр Не РЬе СХи Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а Шз
180 185 190
РЬе Мек А1а 51 п 11е Ьеи Н1з СХи ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг СХи
195 200 205
СХи Ьеи А1а Зег СХу Ьуз А1а Туг С1и 51 у Агд А1а Азр Ьеи СХу Азп
210 215 220
- 77 024253
ТЬг Агд Рго 61у Азр 61у Рго Ьеи РЬе Ьуз 61у Агд 61у Ьеи Ьеи 61п
225 230 235 240
Не ТЬг 61у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и
245 250 255
Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр 11е ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а
260 265 270
С1п 61 п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег 61 у Туг
275 280 285
РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп 61 и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр
290 295 300
Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп С1у Туг А1а Ьуз 61п А1а
305 310 315 320
Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп Нгз МеЕ Ьуз 61и
325 330 335
Агд Уа1 61п МеЕ Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а НгЗ 61у Не Уа1
340 345 350 <210> 79 <211> 359 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> АгЕг1уз1-0ВРдрЬуз м!ЕЬ асЬЛЕгопа! Нгз-Еад
<400> 79
МеЕ 1 С1у Зег 61у РЬе 5 РЬе Не Рго А1а Уа1 10 Не Ьеи Рго Зег Не 15 А1а
РЬе Ьеи Не Уа1 20 Рго С1у Зег Зег Ьуз 25 Азп Зег 61и Ьуз Азп 30 А1а Зег
Не Не МеЕ 35 Зег 11е 61п Агд ТЬг 40 Ьеи А1а Зег Ьеи Зег 45 Ьеи Туг 61у
С1у Агд 50 Не Азр С1у Ьеи РЬе 55 61 у С1и Ьуз Суз Агд 60 С1у А1а Не Не
Ьеи 65 МеЕ Ьеи Азп Ьуз Уа1 70 Туг Рго Азп РЬе Зег 75 ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго 80
Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг А1а 35 90 95
Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг Не Азр С1у Ьуз Тгр б1у 100 105 110
С1у ТЬг Зег С1п С1у А1а 11е Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд С1п 115 120 125
11е ТЬг С1и А1а 61и Агд А1а О1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а 130 135 140
ТЬг Уа1 МеЬ Зег Ьуз НЬз МеГ Зег 11е С1и С1п Ьеи Агд А1а МеЬ Ьеи 145 150 155 160
Рго ТЬг Азр Агд С1п 61у Туг А1а С1и 7а1 Туг 11е Азр Рго Ьеи Азп 165 170 175
61и ТЬг МеЬ Азр Не РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 11е А1а Н1з 180 185 190
РЬе МеЬ А1а О1п 11е Ьеи ЯЬз С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг С1и 195 200 205
С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а Туг С1и СЬу Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп 210 215 220
ТЬг Агд Рго СЬу Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд 61у Ьеи Ьеи С1п 225 230 235 240
11е ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и 245 250 255
Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а 260 265 270
С1п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Зег С1у Туг 275 280 285
РЬе Тгр Агд РЬе 11е Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр 290 295 300
Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп С1у Туг А1а Ьуз С1п А1а 305 310 315 320
Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз 61и Рго Азп ΗΪ3 МеЬ Ьуз С1и
- 79 024253
325 330 335
Агд Уа1 С1п МеС Ьеи А1а \7а1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а Н1з О1у Не Уа1 Ьуз 340 345 350
С1у Шз Н1з Шз ΗΪ5 Н1з Шз 355 <210> 80 <211> 358 <212> РЕТ <213> ипкпоип <220>
<223> АгС11уз2-ОВРдрЬУЗ <400> 80
МеС С1у Зег С1у Ьуз Рго С1у Тгр Ьеи 11е Ьуз Ьуз А1а Ьеи Уа1 РЬе
1 5 10 15
Ьуз Ьуз Ьеи Не Агд Агд Рго Ьеи Ьуз Агд Ьеи А1а С1у Зег Зег Ьуз
20 25 30
Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а Зег Не Не МеС Зег Не С1п Агд ТЬг Ьеи
35 40 45
А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг С1у С1у Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе С1у 61и
50 55 60
Ьуз Суз Агд 61у А1а Не Не Ьеи МеС Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп
65 70 75 80
РЬе Зег ТЬг АЗП Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а 61и Зег Уа1
85 90 95
РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг 11е
100 105 но
ТЬг Не Азр С1у Ьуз Тгр С1у С1у ТЬг Зег 61п СП у А1а Не Азр А1а
115 120 125
Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд С1п Не ТЬг С1и А1а С1и Агд А1а С1у Зег
130 135 140
ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 МеС Зег Ьуз Шз МеС Зег Не
145 150 155 160
61и С1п Ьеи Агд А1а МеС Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а С1и
165 170 175
Уа1 Туг 11е Азр Рго Ьеи 180 Азп С1и ТЬг МеС Азр 11е РЬе С1и 185 190 Не Азп
ТЬг Рго Ьеи Агд 11е А1а 195 Шз РЬе МеС А1а С1п 11е Ьеи Н1з 200 205 61и ТЬг
А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг 210 С1и С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а 215 220 Туг С1и
С1у Агд А1а Азр Ьеи С1у 225 230 Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр С1у Рго 235 Ьеи РЬе 240
Ьуз С1у Агд О1у Ьеи Ьеи 245 С1п 11е ТЬг 61у Агд Ьеи Азп Туг 250 Уа1 Ьуз 255
Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд 260 С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе 265 270 Азр 11е
ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз 275 А1а С1п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго 280 285 Ьеи Ьеи
А1а А1а Ьеи А1а Зег С1у 290 Туг РЬе Тгр Агд РЬе 11е Ьуз Рго 295 300 Ьуз Ьеи
Азп 305 С1и ТЬг А1а Азр Ьуз 310 Азр Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 315 Туг \7а1 320
Азп С1у Туг А1а Ьуз С1п 325 А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд 330 Азр Ьуз 335
О1и Рго Азп ΗΪ3 МеС Ьуз С1и Агд Уа1 С1п МеС Ьеи А1а \7а1 340 345 350 Ьуз А1а Н1з С1у Не Уа1 355 <210> 81 <211> 366 <212> РКТ <213> ипкпомп <220> <223> АгСПуз2-ОВРдрЬУЗ мЬСЬ βάάΐϋίοηαΐ НЬз-Сад <400> 81 ТЬг Ьуз
МеС 1 С1у Зег С1у Ьуз Рго 5 61у Тгр Ьеи Не Ьуз Ьуз А1а Ьеи 10 Уа1 РЬе 15
- 81 024253
Ьуз Ьуз Ьеи 11е Агд Агд Рго Ьеи 20
Ьуз Агд Ьеи АЬа СЬу Зег Зег Ьуз 25 30
Азп Зег СЬи Ьуз Азп АЬа Зег 11е 35 40
Ые Мек Зег 11е СЬп Агд ТЬг Ьеи 45
АЬа Зег Ьеи Зег Ьеи Туг СЬу СЬу 50 55
Агд 11е Азр СЬу Ьеи РЬе СЬу СЬи 60
Ьуз Суз Агд СЬу АЬа 11е Ые Ьеи 65 70
Мек Ьеи Азп Ьуз УаЬ Туг Рго Азп 75 80
РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег 35
Азп ТЬг Туг СЬи АЬа СЬи Зег УаЬ 90 95
РЬе ТЬг РЬе Ьеи СЬп ТЬг АЬа Ьеи 100
АЬа СЬу УаЬ СЬу Ьеи Туг ТЬг Ые 105 110
ТЬг Ые Азр СЬу Ьуз Тгр СЬу СЬу 115 120
ТЬг Зег СЬп СЬу АЬа Ые Азр АЬа 125
Ьеи УаЬ Ьуз Зег Туг Агд СЬп Ые 130 135
ТЬг С1и А1а СЬи Агд АЬа СЬу Зег 140
ТЬг Ьеи Рго Ьеи СЬу Ьеи АЬа ТЬг 145 150
УаЬ Мек Зег Ьуз НЬз Мек Зег Ые 155 160
СЬи С1п Ьеи Агд АЬа Мек Ьеи Рго 165
ТЬг Азр Агд СЬп С1у Туг А1а С1и 170 175
УаЬ Туг Ые Азр Рго Ьеи Азп 61и 130
ТЬг Мек Азр 11е РЬе С1и Ые Азп 185 190
ТЬг Рго Ьеи Агд 11е АЬа НЬз РЬе 195 200
Мек А1а С1п 11е Ьеи НЬз СЬи ТЬг 205
АЬа Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг СЬи 61и 2X0 215
Ьеи А1а Зег СЬу Ьуз АЬа Туг СЬи 220
СЬу Агд АЬа Азр Ьеи СЬу Азп ТЬг 225 230
Агд Рго СЬу Азр СЬу Рго Ьеи РЬе 235 240
Ьуз СЬу Агд 61у Ьеи Ьеи СЬп Ые 245
ТЬг СЬу Агд Ьеи Азп Туг УаЬ Ьуз 250 255
Суз СЬп УаЬ Туг Ьеи Агд СЬи Ьуз
Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Ые
- 82 024253
260 265 270
ТЬг Зег Зег УаЪ ТЬг Суз АЪа СЪп СЪп Ьеи Зег СЪи Зег Рго Ьеи Ьеи
275 280 285
АЪа А1а Ьеи АЪа Зег СЪу Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи
290 295 300
Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр 11е Туг Тгр УаЪ Зег УаЪ Туг УаЪ
305 310 315 320
Азп СЪу Туг АЪа Ьуз СЪп АЪа Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз
325 330 335
СЪи Рго Азп НЪз Мер ьуз СЪи Агд УаЪ СЪп Мер Ьеи АЪа УаЪ ТЬг Ьуз
340 345 350
Ьуз А1а НЪз СЪу Не УаЪ Ьуз СЪу НЪз НЪз НЪз НЪз НЪз НЪз
355 360 365
<210> 82
<211> 352
<212> РЕТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> РагазЪп!- -ОВРдрЬуз
<400> 82
Мер СЪу Зег Ьуз СЪу Агд СЪу Ьуз СЪп СЪу СЪу Ьуз УаЪ Агд АЪа Ьуз
1 5 10 15
А1а Ьуз ТЬг Агд Зег Зег СЪу Зег Зег Ьуз Азп Зег СЪи Ьуз Азп АЪа
20 25 30
Зег Не Не Мер Зег Не СЪп Агд ТЬг Ьеи АЪа Зег Ьеи Зег Ьеи Туг
35 40 45
СЪу СЪу Агд Не Азр СЪу Ьеи РЬе СЪу СЪи ЬуЗ Суз Агд СЪу АЪа Не
50 55 60
11е Ьеи Мер Ьеи Азп Ьуз УаЪ Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи
65 70 75 80
Рго Зег Азп ТЬг Туг СЪи АЪа СЪи Зег УаЪ РЬе ТЬг РЬе Ьеи СЪп ТЬг
85 90 95
А1а Ьеи А1а СЪу УаЪ СЪу Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг Не Азр СЪу Ьуз Тгр
100 105 НО
СЬу СЬу ТЬг Зег СЬп СЬу АЬа Не Азр АЬа Ьеи УаЬ Ьуз Зег Туг Агд 115 120 125
СЬп Не ТЬг СЬи АЬа СЬи Агд АЬа СЬу Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи СЬу Ьеи 130 135 140
АЬа ТЬг УаЬ МеС Зег Ьуз НЬз МеС Зег Не СЬи СЬп Ьеи Агд АЬа МеС 145 150 155 160
Ьеи Рго ТЬг Азр Агд СЬп 61у Туг АЬа СЬи УаЬ Туг Не Азр Рго Ьеи 165 170 175
Азп СЬи ТЬг МеС Азр Не РЬе СЬи Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не АЬа 180 185 190
НЬз РЬе МеС АЬа СЬп Не Ьеи НЬз СЬи ТЬг АЬа Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг Ь95 200 205
СЬи СЬи Ьеи АЬа Зег СЬу Ьуз АЬа Туг СЬи СЬу Агд АЬа Азр Ьеи СЬу 210 215 220
Азп ТЬг Агд Рго СЬу Азр СЬу Рго Ьеи РЬе Ьуз СЬу Агд СЬу Ьеи Ьеи 225 230 235 240
СЬп ЬЬе ТЬг СЬу Агд Ьеи Азп Туг УаЬ Ьуз Суз СЬп УаЬ Туг Ьеи Агд 245 250 255
СЬи Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр ЬЬе ТЬг Зег Зег УаЬ ТЬг Суз 260 265 270
АЬа СЬп СЬп Ьеи Зег СЬи Зег Рго Ьеи Ьеи АЬа АЬа Ьеи АЬа Зег СЬу 275 280 285
Туг РЬе Тгр Агд РЬе ЬЬе Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп СЬи ТЬг АЬа Азр Ьуз 290 295 300
Азр Азр ЬЬе Туг Тгр УаЬ Зег УаЬ Туг УаЬ Азп СЬу Туг АЬа Ьуз СЬп 305 ЗЬО ЗЬ5 320
АЬа Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз СЬи Рго Азп НЬз МеС Ьуз 325 330 335
СЬи Агд УаЬ СЬп МеС Ьеи АЬа УаЬ ТЬг Ьуз Ьуз АЬа НЬз СЬу ЬЬе УаЬ 340 345 350
- 84 024253 <210> 83 <211> 360 <212> РКТ <213> ипкпомп <220>
<223> Рагаз1п1-0ВРдрЬуз м!сЬ аббЬСЬопаЬ НЬз-Сад <400> 83
МеС СЬу Зег Ьуз СЬу Агд СЬу Ьуз СЬп СЬу СЬу Ьуз УаЬ Агд АЬа Ьуз 15 10 15
А1а Ьуз ТЬг Агд Зег Зег С1у Зег Зег Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а 20 25 30
Зег Не Не МеС Зег Не С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг 35 40 45
61у С1у Агд Не Азр 61у Ьеи РЬе С1у С1и Ьуз Суз Агд С1у А1а Не 50 55 60
Не Ьеи МеС Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи 65 70 75 80
Рго Зег Азп ТЬг Туг СЬи А1а С1и Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг 85 90 95
А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг Не Азр С1у Ьуз Тгр 100 105 110
С1у С1у ТЬг Зег С1п С1у А1а Не Азр А1а Ьеи 7а1 Ьуз Зег Туг Агд 115 120 125
61п Не ТЬг С1и А1а СЬи Агд А1а С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи 130 135 140
А1а ТЬг Уа1 МеС Зег Ьуз НЬз МеС Зег Не С1и С1п Ьеи Агд АЬа МеС 145 150 155 160
Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а 61и Уа1 Туг Не Азр Рго Ьеи 165 170 175
Азп С1и ТЬг МеС Азр Не РЬе С1и Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а 180 185 190
НЬз РЬе МеС АЬа С1п Не Ьеи НЬз СЬи ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг 195 200 205
С1и С1и Ьеи АЬа Зег СЬу Ьуз А1а Туг С1и С1у Агд А1а Азр Ьеи С1у
- 85 024253
210 215 220
Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи 235 Ьеи 240
225 230
С1п 11е ТЬг Б1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз Е1п Уа1 Туг Ьеи Агд
245 250 255
С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр 11е ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз
260 265 270
А1а С1п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а АЬа Ьеи А1а Зег С1у
275 280 285
Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз
290 295 300
Азр Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп С1у Туг А1а Ьуз С1п
305 310 315 320
А1а АЗП РГО Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и Рго Азп Н1з Мек Ьуз
325 330 335
С1и Агд Уа1 С1п Мек Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а ΗΪ3 С1у Не Уа1
340 345 350
Ьуз С1у Н1з Ηί3 Ηίί Н1з ΗΪ5 Н1з
355 360 <210> 84 <211> 358 <212> РКТ <213> ипкпонп
<220>
<223> ЬусокохЬп-ОВРдЬуз
<400> 84
Мек 61у Зег Не Тгр Ьеи ТЬг А1а Ьеи Ьуз РЬе Ьеи С1у Ьуз Шз А1а
1 5 10 15
А1а Ьуз Ьуз Ьеи А1а Ьуз С1п С1п Ьеи Зег Ьуз Ьеи С1у Зег Зег Ьуз
20 25 30
Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а Зег Не Не Мек Зег Не С1п Агд ТЬг Ьеи
35 40 45
А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг С1у С1у Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе С1у С1и
- 86 024253
55 60
Ьуз Суз Агд 61у А1а 11е 11е Ьеи МеЬ Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп 65 70 75 80
РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и Зег Уа1 85 90 95
РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг ТЬг Не 100 105 110
ТЬг 11е Азр 61у Ьуз Тгр С1у С1у ТЬг Зег 61п 61у А1а 11е Азр А1а 115 120 125
Ьеи 7а1 Ьуз Зег Туг Агд С1п 11е ТЬг <31и А1а С1и Агд А1а С1у Зег 130 135 140
ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 МеЬ Зег Ьуз Н1з МеЬ Зег Не 145 150 155 160
С1и С1п Ьеи Агд А1а МеЬ Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг А1а С1и 165 170 175
Уа1 Туг 11е Азр Рго Ьеи Азп С1и ТЬг МеЬ Азр 11е РЬе 61и Не Азп 180 185 190
ТЬг Рго Ьеи Агд 11е А1а Нгз РЬе МеЬ А1а 61п 11е Ьеи Шз С1и ТЬг 195 200 205
А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг С1и С1и Ьеи А1а Зег 61у Ьуз А1а Туг 61и 210 215 220
61у Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго 61у Азр С1у Рго Ьеи РЬе 225 230 235 240
Ьуз 01у Агд 61у Ьеи Ьеи С1п 11е ТЬг <31у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз 245 250 255
Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр 11е 260 265 270
ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а 61п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи 275 230 285
А1а А1а Ьеи А1а Зег 61у Туг РЬе Тгр Агд РЬе 11е Ьуз Рго Ьуз Ьеи 290 295 300
- 87 024253
Азп 305 61 и ТЪг А1а Азр Ьуз Азр 310 Аэр Не Туг Тгр Уа1 315 Зег Уа1 Туг Уа1 320
Азп С1у Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз
325 330 335
С1и Рго Азп ΗΪ3 Меи Ьуз С1и Агд Уа1 С1п Меи Ьеи А1а Уа1 ТЪг Ьуз
340 345 350
ъуз А1а Н1з 61у Не Уа1
355
<210> 85
<211> 366
<212> РЗТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> Ьусоиохйп-ОВРдЬуз нгиъ айсНиЬопа! Шз-иад
<400> 85
Меи 61 у Зег Не Тгр Ьеи ТЪг А1а Ьеи Ьуз РЪе Ьеи 61у Ьуз Н1з А1а
1 5 10 15
А1а Ьуз Ьуз Ьеи А1а Ьуз 61п С1п Ьеи Зег Ьуз Ьеи 61у Зег Зег Ьуз
20 25 30
Азп Зег 61и Ьуз Азп А1а Зег Не Не Меи Зег Не С1п Агд ТЪг Ьеи
35 40 45
А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг 61у 61у Агд Не Азр С1у Ьеи РЪе С1у С1и
50 55 60
Ьуз Суз Агд 61у А1а Не 11е Ьеи Меи Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп
65 70 75 80
РЪе Зег ТЪг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЪг Туг С1и А1а С1и Зег Уа1
85 90 95
РЪе ТЪг РЪе Ьеи 61п ТЪг А1а Ьеи А1а 61 у 7а1 61у Ьеи Туг ТЪг Не
100 105 110
ТЪг Не Азр 61у Ьуз Тгр 61у 61у ТЪг Зег 61п 61у А1а Не Азр А1а
115 120 125
Ьеи Уа1 Ьуз Зег туг Агд 61п Не ТЪг 61 и А1а 61и Агд А1а С1у Зег
130 135 140
ТЪг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а ТЪг Уа1 Меи Зег Ьуз Ηί3 Меи Зег Не
- 88 024253
145 150 155 160
С1и С1п Ьеи Агд А1а 165 Мер Ьеи Рго ТЬг Азр Агд 01п С1у Туг А1а С1и
170 175
Уа1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп О1и ТЬг меи Азр Не РЬе 01и Не Азп
180 185 190
ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а Н1з РЬе Меи А1а С1п Не Ьеи Шз С1и ТЬг
195 200 205
А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг 61и 01и Ьеи А1а Зег 01 у Ьуз А1а Туг 61и
210 215 220
С1у Агд А1а Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго О1у Азр С1у Рго Ьеи РЬе
225 230 235 240
Ьуз С1у Агд 61у Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз
245 250 255
Суз О1п Уа1 туг Ьеи Ахд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр Не
260 265 270
ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а С1п С1п Ьеи Зег С1 и Зег Рго Ьеи Ьеи
275 280 285
А1а А1а Ьеи А1а Зег С1 у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз Ьеи
290 295 300
Азп О1и ТЬг А1а АЗр Ьуз АЗр Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1
305 310 315 320
АЗП С1у Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд Азр Ьуз
325 330 335
С1и Рго АЗП Нхз Меи Ьуз С1и Агд νβΐ С1п Меи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз
340 345 350
Ьуз А1а ΗΪ3 С1у 11е Уа1 Ьуз С1у ΗΪ5 Нхз Нхз Нхз Нхз Шз
355 360 365
<210> 86
<211> 328
<212> РКТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> ' ОВРдрЬУЗ
- 89 024253 <400> 86
Мер Ьуз Азп Зег О1и Ьуз Азп А1а Зег 11е 11е Мер Зег Не С1п Агд 15 10 15
ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг С1у С1у Агд 11е Азр 61у Ьеи РЬе 20 25 30
С1у С1и Ьуз Суз Агд С1у А1а 11е Не Ьеи МеР Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг 35 40 45
Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг С1и А1а С1и 50 55 60
Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг А1а Ьеи А1а С1у Уа1 С1у Ьеи Туг 65 70 75 80
ТЬг 11е ТЬг 11е Азр С1у Ьуз Тгр С1у 61у ТЬг Зег С1п С1у А1а 11е 85 90 95
Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд С1п 11е ТЬг 61и А1а С1и Агд А1а 100 105 110
С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи С1у Ьеи А1а ТЬг Уа1 МеР Зег Ьуз Ыз Мер 115 120 125
Зег Не С1и С1п Ьеи Агд А1а Мер Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг 130 135 140
А1а С1и Уа1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп 51и ТЬг Мер Азр 11е РЬе С1и 145 150 155 160
Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд 11е А1а Н1з РЬе МеР А1а 01п Не Ьеи Нйз 165 170 175
С1и ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг СЬи С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз А1а 180 185 190
Туг С1и С1у Агд А1а Азр Ьеи 61у Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр С1у Рго 195 200 205
Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг С1у Агд Ьеи Азп Туг 210 215 220
Уа1 Ьуз Суз С1п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе 225 230 235 240
Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз А1а С1п С1п Ьеи Зег С1и Зег Рго
245 250 255
Ьеи Ьеи АЬа АЬа Ьеи АЬа Зег СЬу Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго
260 265 270
Ьуз Ьеи Азп СЬи ТЬг АЬа Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр УаЬ Зег УаЬ
275 280 285
Туг УаЬ Азп СЬу Туг АЬа Ьуз СЬп АЬа Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд
290 295 300
Азр Ьуз СЬи Рго Азп НЬз МеС Ьуз СЬи Агд УаЬ СЬп МеС Ьеи АЬа УаЬ
305 310 315 320
ТЬг Ьуз Ьуз АЬа НЬз СЬу Не УаЬ
325
<210> 87
<211> 327
<212> РКТ
<213> ипкпоип
<220>
<223> ОВРдрЬУЗ
<400> 87
Ьуз Азп Зег СЬи Ьуз Азп АЬа Зег Не Не МеС Зег Не СЬп Агд ТЬг
1 5 10 15
Ьеи АЬа Зег Ьеи Зег Ьеи Туг СЬу СЬу Агд Не Азр СЬу Ьеи РЬе СЬу
20 25 30
СЬи Ьуз Суз Агд СЬу АЬа Не Не Ьеи МеС Ьеи Азп Ьуз УаЬ Туг Рго
35 40 45
Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг СЬи АЬа СЬи Зег
50 55 60
УаЬ РЬе ТЬг РЬе Ьеи СЬп ТЬг АЬа Ьеи АЬа СЬу УаЬ СЬу Ьеи Туг ТЬг
65 70 75 80
ЬЬе ТЬг ЬЬе Азр СЬу Ьуз тгр СЬу СЬу ТЬг Зег СЬп СЬу АЬа Не АЗр
85 90 95
АЬа Ьеи УаЬ Ьуз Зег Туг Агд СЬп Не ТЬг СЬи АЬа СЬи Агд АЬа СЬу
100 105 110
Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи СЬу Ьеи АЬа ТЫ УаЬ МеС Зег Ьуз НЬз МеС Зег
115 120 125
- 91 024253
Не С1и С1п Ьеи Агд 130 А1а Мес 135 Ьеи Рго ТЬг Азр Агд 140 СЬп СЬу Туг АЬа
С1и Уа1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп СЬи ТЬг Мек Азр Не РЬе С1и Не
145 150 155 160
Азп ТНг Рго Ьеи Агд Не А1а НЬз РЬе Мек АЬа СЬп Не Ьеи НЬз СЬи
165 170 175
ТЬг А1а Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг СЬи СЬи Ьеи АЬа Зег СЬу Ьуз А1а Туг
180 185 190
С1и С1у Агд А1а Азр Ьеи СЬу Азп ТЬг Агд Рго С1у Азр С1у Рго Ьеи
195 200 205
РЬе Ьуз С1у Агд С1у Ьеи Ьеи СЬп Не ТЬг СЬу Агд Ьеи Азп Туг Уа1
210 215 220
Ьуз Суз СЬп Уа1 Туг Ьеи Агд СЬи Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе Азр
225 230 235 240
11е ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз АЬа СЬп СЬп Ьеи Зег СЬи Зег Рго Ьеи
245 250 255
Ьеи АЬа АЬа Ьеи А1а Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе Не Ьуз Рго Ьуз
260 265 270
Ъеи Азп СЬи ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр Не Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг
275 280 285
Уа1 Азп 61у Туг А1а ьуз СЬп АЬа Азп Рго Туг Туг РГО АЗП Агд Азр
290 295 300
Ьуз СЬи Рго Азп НЬз Мек Ьуз СЬи Агд Уа1 СЬп Мек Ьеи А1а Уа1 ТЬг
305 310 315 320
Ьуз Ьуз А1а Ыз СЬу Не УаЬ
325
<210> 88
<211> 336
<212> РЕТ
<213> ипкпомп
<220>
<223> ОВРдрЬУЗ άβΓίν36ίνβ мЬкЬ НЬз- -кад
<400> 88
- 92 024253
Мек Ьуз Азп Зег С1и Ьуз Азп А1а Зег Не Не Мек Зег 11е С1п Агд 15 10 15
ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Ьеи Туг С1у С1у Агд 11е Азр СЬу Ьеи РЬе 20 25 30
СЬу 61и Ьуз Суз Агд С1у А1а Не Не Ьеи Мек Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг 35 40 45
Рго Азп РЬе Зег ТЬг Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг СЬи А1а СЬи 50 55 60
Зег Уа1 РЬе ТЬг РЬе Ьеи С1п ТЬг А1а Ьеи АЬа СЬу Уа1 С1у Ьеи Туг 65 70 75 80
ТЬг Не ТЬг Не Азр С1у Ьуз Тгр 61у СЬу ТЬг Зег 61п С1у АЬа Не 85 90 95
Азр А1а Ьеи Уа1 Ьуз Зег Туг Агд С1п Не ТЬг С1и А1а С1и Ага АЬа 100 105 110
С1у Зег ТЬг Ьеи Рго Ьеи 61у Ьеи А1а ТЬг Уа1 Мек Зег Ьуз НЬз Мек 115 120 125
Зег Не С1и С1п Ьеи Агд А1а Мек Ьеи Рго ТЬг Азр Агд С1п С1у Туг 130 135 140
АЬа 61и 7'а1 Туг Не Азр Рго Ьеи Азп С1и ТЬг Мек Азр 11е РЬе СЬи 145 150 155 160
Не Азп ТЬг Рго Ьеи Агд Не А1а Шз РЬе Мек А1а С1п Не Ьеи НЬз 165 170 175
С1и ТЬг АЬа Суз РЬе Ьуз Туг ТЬг СЬи С1и Ьеи А1а Зег С1у Ьуз АЬа 180 135 190
Туг С1и 61у Агд АЬа Азр Ьеи СЬу Азп ТЬг Агд Рго СЬу Азр 61у Рго 195 200 205
Ьеи РЬе Ьуз С1у Агд СЬу Ьеи Ьеи С1п Не ТЬг СЬу Агд Ьеи Азп Туг 210 215 220
Уа1 Ьуз Суз 61п Уа1 Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе 225 230 235 240
Азр Не ТЬг Зег Зег Уа1 ТЬг Суз АЬа С1п С1п Ьеи Зег СЬи Зег Рго 245 250 255
- 93 024253
Ьеи Ьеи А1а А1а 260 Ьеи А1а Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе 265 11е 270 Ьуз Рго
Ьуз Ьеи Азп С1и ТЬг А1а Азр Ьуз Азр Азр 11е Туг Тгр Уа1 Зег Уа1
275 280 285
Туг 7а1 Азп СЬу Туг А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг Туг Рго Азп Агд
290 295 300
Азр Ьуз С1и Рго Азп Н1з Меь Ьуз С1и Агд Уа1 С1п Мег Ьеи А1а Уа1
305 310 315 320
ТЬг Ьуз Ьуз А1а Н1з С1у 11е νβΐ Ьуз СЬу 01з НЬз Нхз Н1з ΗΪ3 ΗΪ3
325 330 335
<210> 89
<211> 1011
<212> ΟΝΑ
<213> ипкпонп
<220>
<223> ОВРдрЬУЗ άβΓίνδϊίνβ мЬЬЬ асЮПаюпа! НЬз-Ьад
<400> 89
асдааааага дсдадаадаа бдеаседаЬа аЫааЬдСсда Ьасададаас дсксдсЬЬса 60
сЬсксасЬск акддаддссд саьсдасддс сГсЬЬГддад адаадЬдЕсд ЬддддсЬабс 120
аЬсЬЬдаЬдс ЕдааЬааддЬ сЬаЬссЬааб ЬЬсадсасса асааасЬЕсс дадСаасаса 180
ЬаЬдаадсдд ааЬссдЬдЫ сасдЬЫсбс садасЬдсЬЬ ЬддсГддЬдЬ ЬддЬсЬЬЬаГ 240
ассаЫаска ЬкдаЬддЬаа аЬддддсддЬ асСЬсСсаад д£дс£аЫда сдсссксдИс 300
аадбсЬЬасс дбсаааЬСас сдаадсддад сдадсСдддС сдасдСЬдсс акбаддСсГЬ 360
дссасбдкда сдссьаадса -ЬасдссСаЫ: даасадсьда дадсааЬдсб сссбассдаЬ 420
адасааддак акдскдаадЬ ЬЬаСаЬсдаЬ ссЫсЬаааЪд адасдаЬдда ЬаЬаЬЫдаа 480
аЬаааСасЬс саЬ'ЬасдааЬ £дсЬсаЫСс аЬддсссааа ЬссЬссасда аасддсдЬдЬ 540
ЬЕЕаааЬака ссдаадаас! ддсдадсддЬ ааддсЫаСд адддГсдьдс гдаЬЬСаддЬ 600
ааЬасЬсдас саддЬдаЬдд ассасЬдЬЫ: аааддЬсдЬд даИаИаса ааЫассддд 660
сдасЬдааЫ аЬдЬдаааЬд ссаадЬдЬаЬ ЕЬдададада адЫааадда сссЬасЬЬЬс 720
дасаЫасдб сдЬсгдсаас Мадгдсссаа садсСсСссд ааадЬссаск ЬсЫдсЬдса 780
ЫддсаЬсдд дсЬасЫасЬд дадаЫасаЬс ааассЬааас ЬсааЬдааас ддсЬдаЬааа 840
дасдакаЬсЬ аЫдддЬЫс ЬдСЫаЬдЬс ааЬддЪЬасд сЬааасаадс дааЬссЬЬа!; 900
кассскаасс ддда^аадда асссаассаЬ аЬдааадаас дЬдЬссааак дсЬЬдсадкд 960
- 94 024253 асааадааад сасасддааС адССаадддС сабсаСсасс аксассаССд а 1011 <210> 90 <211> 72 <212> ОНА <213> ипкпомп <220>
<223> апсхтхсгоЫа! рерСЮе азсарЫпе <400> 90 ддСаСсааад аССддаксаа аддсдсадсд ааааааскда СсаааассдС СдссСсСсас 60 аССдсСаасс ад 72 <210> 91 <211> 51 <212> ОНА <213> ипкпомп <220>
<223> апс1т1сгоЬ1а1 рерЫс1е ар!с!аес1пе <400> 91 дсдаассдСс сддСсбасаС сссассдсса сдСссассдс асссасдСск д 51 <210> 92 <211> 117 <212> ОНА <213> ипкпомп <220>
<223> апЫт1СГоЫа1 рерЫОе ЗагсоСоххп ΙΑ <400> 92 ддакддсСса аааадаССдд саадаааабс дадсдадСсд дСсадсабас дсдбдаСдса 60 асСакссадд дСССаддСаС сдсасадсаа дсадсСааСд СадсадсСас СдсСсдд 117 <210> 93 <211> 87 <212> ОНА <213> ипкпомп <220>
<223> апСхтхсгоЫа! рерЫЬе 5МАР-29 <400> 93 сдСддСскдс дксдссСддд СсдсааааСС дсдсасддсд СсааааааСа сддсссдасс 60 дбдсСдсдса ССаСссдсаС сдсСддС <210> 94 <211> 120 <212> ОНА <213> ипкпомп
- 95 024253 <220>
<223> апЫпбсгоЫа! реркйбе СесгорЬп А (А.аедурСй) <400> 94 ддсСддсСда ааааааЫдд саааааааСс даасдсдкдд дссадсасас дсдСдаСдса 60 ассаСссадд дкскдддкак сссасадсад дсадсСаасд кадссдсдас Сдсксдкддк 120 <210> 95 <211> 39 <212> ОНА <213> ипкпонп <220>
<223> апНга1сгоЫа1 рерЫбе А1рЬа 4 <400> 95 ссдаассдкд саааасдкдС ааксассасс ЫссдСасс 39 <210> 96 <211> 15 <212> ОМА <213> ипкпомп <220>
<223> зупСЬеЫс рерЫбе <400> 96
ЫсИсдСад сассд 15 <210> 97 <211> 54 <212> ОМА <213> ипкпомп <220>
<223> апЫт1сгор1а1 рерЫбе АгЫ1уЫп1 <400> 97 ддсысЫса Ссссддсадс ааСсссдссс сссаСсдсак СссСдаРсдЪ ассд 54 <210> 98 <211> 75 <212> СЫА <213> ипкпомп <220>
<223> апЫггисгорЬа! рерЫбе АгЫ1уЫп2 <400> 93 ддсааассдд дсСддскдаС саааааддса сСддкаНса адаааскдаС ссдксдкссд 60 сСдаададас Сддса 75 <210> 99 <211> 57 <212> ОНА <213> ипкпонп
- 96 024253 <220>
<223> апк1т1сгоЫа1 реркибе Рагазйп 1 <400> 99 аааддссдкд дсаадсаддд аддсааадка сдкдсаааад сааадасссд кксскса 57 <210> 100 <211> 75 <212> ΟΝΑ <213> ипкпомп <220>
<223> апк1т1сгоЫа1 реркйбе Ьусокохип <400> 100 акскддскда ссдсаскдаа аккссксддс ааасасдссд сааадаааск ддсаааасад 60 сааккаксса ааскд 75 <210> 101 <211> 934 <212> ϋΝΑ <213> ипкпомп <220>
<223> ОВРдрЬУЗ <400> 101
акдааааака дсдадаадаа кдсаксдака аккакдксда касададаас дсксдсккса 60
сксксаскск акддаддссд саксдасддс скскккддад адаадкдксд кддддскакс 120
аксккдакдс кдаакааддк скаксскаак кксадсасса асаааскксс дадкаасаса 130
какдаадсдд аакссдкдкк сасдкккскс садаскдскк кддскддкдк кддкскккак 240
ассаккаска ккдакддкаа акддддкддк аскксксаад дкдскаккда сдсссксдкс 300
аадксккасс дксаааккас сдаадсддад сдадскдддк сдасдккдсс аккаддкскк 360
дскаскдкда кдкскаадса какдкскакк даасадккда дадсаакдск ссскассдак 420
адасааддак акдскдаадк ккакаксдак сскккааакд адасдакдда какакккдаа 430
акааакаскс саккасдаак кдсксакккс акддсссааа ксскссасда аасддсдкдк 540
кккааакака ссдаадааск ддсдадсддк ааддсккакд адддксдкдс кдакккаддк 600
аакасксдас саддкдакдд ассаскдккк аааддксдкд даккаккаса ааккассддд 660
сдаскдаакк акдкдааакд ссаадкдкак ккдададада адккааадда ссскаскккс 720
дасаккасдк сдкскдкаас ккдкдсссаа садскскссд ааадкссаск ксккдскдса 780
ккддсаксдд дскасккскд дадакксакс ааасскааас ксаакдааас ддскдакааа 840
дасдакакск аккдддкккс кдкккакдкс аакддккасд скааасаадс даакссккак 900
кассскаасс дддакаадда асссаассак акдааадаас дкдкссааак дсккдсадкд 960
- 97 024253 асааадааад сасасддааб ад£С 984 <210> 102 <211> 33 <212> ΟΝΑ <213> АгН£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> £огиаг<3 ргЪтег <400> 102 ддааРдддда дсбссЬссаа аааРадсдад аад 33 <210> 103 <211> 24 <212> ОКА <213> АгР1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> геуегзе ргхтег <400> 103 аасРаСРссд £д£дс££Рс£ РРдР 24 <210> 104 <211> 48 <212> ΟΝΑ <213> АгРШсЪаЪ Зедиепсе <220>
<223> ех£епйесЗ £огиаг<3 ргхтег <400> 104 ардддаРссР £с££сд£адс ассдддсРсс РссаааааРа дсдадаад 48 <210> 105 <211> 39 <212> ОМА <213> ΑΓΐίίίσίβΙ зедиепсе <220>
<223> £огмагй ргхтег а1рЬа4 <400> 105
РРддааРддд дадсссдаас сдрдсаааас дрдРааСса 39 <210> 106 <211> 42 <212> ОМА <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> хеиегзе ргЪтег а1рЬа4 <400> 106 баРРРРРдда ддадссддРа сддааддрдд РдаРРасасд £6 42
- 98 024253 <210> 107 <211> 39 <212> ϋΝΑ <213> АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> £огмагс1 рггшег агЕг1уз1 <400> 107
ЕЕаЕдддсЕЕ сЕЕсаЕсссд дсадЕааЕсс ЕдсссЕсса 39 <210> 108 <211> 53 <212> ϋΝΑ <213> АгЕт£тсга1 Зедиепсе <220>
<223> χβνβΓβε рггшег аггг1уз1 <400> 108
ЕаСЕЕЕЕдда ЕсЕдссдссс ддЕасдаЕса ддааЕдсдаЕ ддадддсадд аЕЕ 53 <210> 109 <211> 47 <212> ϋΝΑ <213> АгЕ1£1с1а1 Зециепсе <220>
<223> £огмагс! рггшег агЕг1уз2 <400> 109
ЕЕаЕдддсаа ассдддсЕдд сЕдаЕсаааа ддсасЕддЕа ЕЕсаада 47 <210> 110 <211> 64 <212> ϋΝΑ <213> АгЕг£1сга1 Зедиепсе <220>
<223> геуегз рггшег агЕг1уз2 <400> 110
ЕаЕЕЕЕЕдда ЕсЕдссдссЕ дссадЕсЕсЕ Есадсддасд асддаЕсадЕ ЕЕсЕЕдааЕа 60 ссад 64 <210> 111 <211> 48 <212> ϋΝΑ <213> АгЕг£1сга1 Зедиепсе <220>
<223> £огмаг0 рггшег Рагазгп1 <400 111
ЕЕддааЕддд дадсаааддс сдЕддсаадс адддаддсаа адЕасдбд 48
- 99 024253 <210> 112 <211> 51 <212> СНА <213> Аг£х£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> геуегзе ргхшег Рагаз1п1 <400> 112 £а£££££дда ддадсскдад даасдддбсб ££дс££££дс асд£ас£££д с 51 <210> 113 <2Н> 55 <212> ΏΝΑ .
<213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> £огмагс1 рггтег ЬусоЬоххп <400> 113 ддаакдддда дса£с£ддс£ дассдсаскд ааа££сс£сд дсааасасдс сдсаа 55 <210> 114 <211> 60 <212> ОМА <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> геуегзе ргйпег Ьусокоххп <400> 114 £а£££££дда ддадсссадк ££дда£аа££ дскдкЬккдс сад£С£с£££ дсддсдСдкь 60 <210> 115 <211> 339 <212> РКТ <213> ипкпоип <220>
<223> РКОВРдрЬУЗ 1етаШе <400> 115
Ме£ 31у Зег Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Азп Зег С1и 15 10 15
Ьуз Азп А1а Зег 11е Не Ме£ Зег 11е С1п Агд ТЬг Ьеи А1а Зег Ьеи 20 25 30
Зег Ьеи Туг С1у С1у Агд Не Азр С1у Ьеи РЬе С1у С1и Ьуз Суз Агд 35 40 45
61у А1а 11е 11е Ьеи Ме£ Ьеи Азп Ьуз Уа1 Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг 50 55 60
- 100 024253
- 101
Нгз МеС Ьуз СЬи Агд УаЬ СЬп МеС Ьеи АЬа УаЬ ТЬг Ьуз Ьуз АЬа Ηΐ5 325 330 335
СЬу Не УаЬ <210> 116 <2Ы> 347 <212> РКТ <213> ипкпоип <220>
<223> РКОВРдрЬУЗ (ЗегЬуаСЬуе нЬСЬ аскИСЬопа! НЬз-Сад <400> 116
МеС СЬу Зег Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд 1 5
Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Азп Зег СЬи 10 15
Ьуз Азп АЬа Зег 11е Х1е МеС Зех 20
Не СЬп Агд ТЬг Ьеи АЬа Зег Ьеи 25 30
Зег Ьеи Туг СЬу СЬу Агд 11е Азр 35 40
СЬу Ьеи РЬе СЬу СЬи Ьуз Суз Агд 45
СЬу АЬа Не Не Ьеи МеС Ьеи Азп 50 55
Ьуз УаЬ Туг Рго Азп РЬе Зег ТЬг 60
Азп Ьуз Ьеи Рго Зег Азп ТЬг Туг 65 70
СЬи АЬа СЬи Зег УаЬ РЬе ТЬг РЬе 75 80
Ьеи СЬп ТЬг АЬа Ьеи АЬа СЬу УаЬ 85
СЬу Ьеи Туг ТЬг Не ТЬг 11е Азр 90 95
СЬу Ьуз Тгр СЬу СЬу ТЬг Зег СЬп 100
СЬу АЬа Не Азр АЬа Ьеи УаЬ Ьуз 105 110
Зег Туг Агд СЬп Не ТЬг СЬи АЬа 115 120
СЬи Агд АЬа 61у Зег ТЬг Ьеи Рго 125
Ьеи СЬу Ьеи АЬа ТЬг УаЬ МеС Зег 130 135
Ьуз НЬз МеС Зег Не СЬи СЬп Ьеи 140
Агд АЬа МеС Ьеи Рго ТЬг Азр Агд 145 150
СЬп СЬу Туг АЬа СЬи Уа1 Туг Не 155 160
Азр Рго Ьеи Азп СЬи ТЬг МеС Азр 165
Не РЬе СЬи Не Азп ТЬг Рго Ьеи 170 175
- 102 024253
Агд Не А1а Н1з 180 РЬе МеС А1а С1п 11е Ьеи Н1з С1и ТЬг А1а Суз РЬе
185 190
Ьуз Туг ТЬг 61и 61и Ьеи А1а Зег 61у Ьуз А1а Туг 61и С1у Агд А1а
195 200 205
Азр Ьеи С1у Азп ТЬг Агд Рго 61 у Азр С1у Рго Ьеи РЬе Ьуз 61 у Агд
210 215 220
С1у Ьеи Ьеи 61п 11е ТЬг 61у Агд Ьеи Азп Туг Уа1 Ьуз Суз 61 п Уа1
225 230 235 240
Туг Ьеи Агд С1и Ьуз Ьеи Ьуз Азр Рго ТЬг РЬе АЗр Не ТЬг Зег Зег
245 250 255
Уа1 ТЬг Суз А1а С1п 61 п Ьеи Зег С1и Зег Рго Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи
260 265 270
А1а Зег С1у Туг РЬе Тгр Агд РЬе 11е Ьуз Рго Ьуз Ьеи Азп 61и ТЬг
275 280 285
А1а Азр Ьуз Агр Азр 11е Туг Тгр Уа1 Зег Уа1 Туг Уа1 Азп 61 у Туг
290 295 300
А1а Ьуз С1п А1а Азп Рго Туг туг Рго Азп Агд Азр Ьуз С1и РГО Азп
305 310 315 320
Шз МеС Ьуз С1и Агд Уа1 С1п МеС Ьеи А1а Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а Шз
325 330 335
О1у 11е Уа1 Ьуз С1у Шз ΗΪ3 Н1з НЁЗ ΗΪ3 Нхз
340 345
<210> 117
<211> 18
<212> РКТ
<213> 1 ипкпоип
<220>
<223> апС1ш1сгоЫа1 рерСЁбе Еапа1ехЁп <400> 117
РЬе Ьеи С1у С1у Ьеи 11е Уа1 Рго А1а МеС 11е Суз А1а Уа1 ТЬг Ьуз 15 10 15
Ьуз Суз
- 103 024253 <210> 113 <211> 27 <212> РКТ <213> ипкпоып <220>
<223> рерЫйе зкгеЬсЬ НЬВЫ2 9аг1апС <400> 113
Ьуз Агд Тгр Уа1 Ьуз Агд Уа1 Ьуз Агд 0а1 Ьуз Агд Тгр Уа1 Ьуз Агд 15 10 15
Уа1 Уа1 Агд Уа1 Уа1 Ьуз Агд Тгр Уа1 Ьуз Агд 20 25 <210> 119 <211> 26 <212> РКТ <213> ипкпоип <220>
<223> апСхтхсгоЫа! рерЫйе Μβΐίΐίϊη <400> 119
Е1у 11е Е1у А1а Уа1 Ьеи Ьуз Уа1 Ьеи ТЬг ТЬг С1у Ьеи Рго А1а Ьеи 15 10 15
11е Зег Тгр 11е Ьуз Агд Ьуз Агд С1п С1п 20 25

Claims (31)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Литический полипептид с пептидогликангидролазной активностью, содержащий аминокислотную последовательность 5>ЕО ГО N0: 1.
  2. 2. Полипептид по п.1, содержащий делецию, присоединение, инсерцию и/или замещение в аминокислотной последовательности 5>ЕО ГО N0: 1 и сохраняющий литическую активность полипептида.
  3. 3. Полипептид по п.1 или 2, содержащий дополнительно таг (метку), предпочтительно Н1к6-таг.
  4. 4. Полипептид по п.3, содержащий аминокислотную последовательность 5>Е0 ГО N0: 47.
  5. 5. Фрагмент полипептида по п.1, содержащий его каталитический домен и домен связывания с клеточной стенкой и сохраняющий литическую активность полипептида.
  6. 6. Фрагмент по п.5, содержащий аминокислотные последовательности 5>Е0 ГО N0: 4 и 5.
  7. 7. Фрагмент по п.6, содержащий делецию, присоединение, инсерцию и/или замещение в аминокислотной последовательности 5>Е0 ГО N0: 4 или 5 и сохраняющий литическую активность полипептида.
  8. 8. Фрагмент по любому из пп.5-7, содержащий дополнительно таг (метку), предпочтительно Н156-таг.
  9. 9. Слитый белок, содержащий полипептид по любому из пп.1-4 или фрагмент по любому из пп.5-8 и слитую с указанным полипептидом или фрагментом на N или С-конце пептидную цепь, представляющую собой катионный пептид, поликатионный пептид, амфипатичный пептид, кикЫ пептид, дефензин, гидрофобный пептид и/или антимикробный пептид.
  10. 10. Слитый белок по п.9, в котором пептидная цепь содержит от 5 до примерно 100 аминокислотных остатков, в частности от 5 до 50 аминокислотных остатков, в частности от 5 до 30 аминокислотных остатков.
  11. 11. Слитый белок по п.9 или 10, в котором катионная и/или поликатионная пептидная цепь содержит как минимум один аминокислотный остаток, принадлежащий группе, включающей остатки аргинина, гистидина и лизина, в частности, в котором пептидная цепь содержит как минимум 70% аминокислотных остатков, представляющих собой остатки аргинина, гистидина и/или лизина, в частности остатки аргинина и/или лизина.
  12. 12. Слитый белок по п.9, в котором амфипатичный пептид содержит как минимум один положительно заряженный аминокислотный остаток, принадлежащий группе, включающей остатки лизина, аргинина и гистидина, соединенный как минимум с одним гидрофобным аминокислотным остатком, принадлежащим группе, включающей остатки валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и глицина, в частности, в котором амфипатичный пептид содержит примерно 70% аминокислотных остатков, представляющих
    - 104 024253 собой остатки аргинина или лизина, и примерно 30% аминокислотных остатков, представляющих собой остатки валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина или глицина.
  13. 13. Слитый белок по п.9, в котором пептидная цепь содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО 6-39.
  14. 14. Слитый белок по п.9, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО: 43 или 49.
  15. 15. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по любому из пп.1-4.
  16. 16. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая фрагмент по любому из пп.5-8.
  17. 17. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.9-14.
  18. 18. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.15-17.
  19. 19. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.15-17 либо вектор по п.18.
  20. 20. Применение полипептида по любому из пп.1-4 в качестве лекарственного препарата для человека или ветеринарного лекарственного препарата для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, либо в качестве ветеринарного диагностического средства для выявления инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, либо в качестве антимикробного агента в пищевой или косметической промышленности, либо в качестве дезинфектанта в мероприятиях по очистке окружающей среды.
  21. 21. Применение фрагмента по любому из пп.5-8 в качестве лекарственного препарата для человека или ветеринарного препарата для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, либо в качестве ветеринарного диагностического средства для выявления инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, либо в качестве антимикробного агента в пищевой или косметической промышленности, либо в качестве дезинфектанта в мероприятиях по очистке окружающей среды.
  22. 22. Применение слитого белка по любому из пп.9-14 в качестве лекарственного препарата для человека или ветеринарного препарата для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, либо в качестве ветеринарного диагностического средства для выявления инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, либо в качестве антимикробного агента в пищевой или косметической промышленности, либо в качестве дезинфектанта в мероприятиях по очистке окружающей среды.
  23. 23. Применение полипептида по любому из пп.1-4 в качестве лекарственного препарата для лечения или профилактики инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями.
  24. 24. Применение фрагмента по любому из пп.5-8 в качестве лекарственного препарата для лечения или профилактики инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями.
  25. 25. Применение слитого белка по любому из пп.9-14 в качестве лекарственного препарата для лечения или профилактики инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями.
  26. 26. Применение полипептида по любому из пп.1-4 для устранения, уменьшения или предотвращения заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, загрязнения оборудования на предприятиях пищевой отрасли, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, изделий медицинского назначения, поверхностей в больницах и хирургических блоках.
  27. 27. Применение фрагмента по любому из пп.5-8 для устранения, уменьшения или предотвращения заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, загрязнения оборудования на предприятиях пищевой отрасли, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, изделий медицинского назначения, поверхностей в больницах и хирургических блоках.
  28. 28. Применение слитого белка по любому из пп.9-14 для устранения, уменьшения или предотвращения заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, загрязнения оборудования на предприятиях пищевой отрасли, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, изделий медицинского назначения, поверхностей в больницах и хирургических блоках.
  29. 29. Фармацевтическая композиция для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, содержащая полипептид по любому из пп.1-4.
  30. 30. Фармацевтическая композиция для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, содержащая фрагмент по любому из пп.5-8.
  31. 31. Фармацевтическая композиция для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, содержащая слитый белок по любому из пп.9-14.
EA201270322A 2009-08-24 2010-08-24 Литический полипептид с пептидогликангидролазной активностью и его применение против инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями EA024253B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09168527 2009-08-24
PCT/EP2010/062351 WO2011023702A1 (en) 2009-08-24 2010-08-24 New endolysin obpgplys

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270322A1 EA201270322A1 (ru) 2012-08-30
EA024253B1 true EA024253B1 (ru) 2016-08-31

Family

ID=42988347

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270322A EA024253B1 (ru) 2009-08-24 2010-08-24 Литический полипептид с пептидогликангидролазной активностью и его применение против инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями

Country Status (12)

Country Link
US (3) US8846865B2 (ru)
EP (1) EP2470648B1 (ru)
JP (1) JP5847081B2 (ru)
KR (1) KR20120059576A (ru)
CN (1) CN102575240B (ru)
AU (1) AU2010288559B8 (ru)
CA (1) CA2772001A1 (ru)
EA (1) EA024253B1 (ru)
IL (1) IL218296A0 (ru)
MX (1) MX2012002216A (ru)
SG (1) SG178440A1 (ru)
WO (1) WO2011023702A1 (ru)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0815484D0 (en) 2008-08-26 2008-10-01 Univ Leuven Kath Antibacterial agents
EP3363896A1 (en) 2009-06-26 2018-08-22 Lysando AG Antimicrobial agents
CN102458452B (zh) 2009-06-26 2015-12-02 勒芬天主教大学，K.U.勒芬R&D 抗微生物剂
WO2012065034A1 (en) * 2010-11-12 2012-05-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Enolase peptide conjugate vaccines against staphylococcus aureus
EP2468856A1 (en) * 2010-12-23 2012-06-27 Lysando Aktiengesellschaft Antimicrobial Agents
EP2702070B1 (en) * 2011-04-27 2015-09-30 Lysando AG New antimicrobial agents
WO2015070911A1 (en) * 2013-11-14 2015-05-21 Lysando Ag Modified kz144 endolysin sequence
WO2015121443A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Lysando Ag Antimicrobial agents
US20170106058A1 (en) * 2014-04-08 2017-04-20 Lysando Ag Pharmaceutical composition against chronic bacterial infections
EP3164146B1 (en) 2014-06-26 2019-12-25 The Rockefeller University Acinetobacter lysins
SG11201707345VA (en) 2015-03-12 2017-10-30 Micreos Human Health Bv Combination of bactericidal agent with a lysosomotropic alkalinising agent for the treatment of a bacterial infection
CN105062992B (zh) * 2015-07-20 2018-05-11 昆明理工大学 一种细胞内溶素和编码此细胞内溶素的多核苷酸
EP3144387B1 (en) * 2015-09-15 2018-03-14 Micreos Human Health B.V. A novel endolysin polypeptide
CN116077630A (zh) 2015-09-17 2023-05-09 抗非特公司 具有对抗革兰氏阴性菌的活性的溶素多肽
WO2017127567A1 (en) * 2016-01-19 2017-07-27 Genebiologics, Llc Production of arginine-rich proteins and use as a fertilizer and germination enhancer
WO2018100408A1 (en) * 2016-11-30 2018-06-07 Sasinapas Co.,Ltd. Modified peptides
CN110300760B (zh) * 2016-12-16 2023-10-20 米尼奥大学 新的内溶素
CN107828769B (zh) * 2017-09-28 2021-03-02 昆明理工大学 一种耐热裂解酶MMPpgh和编码此酶的多核苷酸
JP2021519083A (ja) 2018-03-29 2021-08-10 コントラフェクト コーポレイション 溶解素−抗微生物ペプチド（ａｍｐ）ポリペプチドコンストラクト、溶解素、それをコードする単離ポリヌクレオチド及びその使用
US10988520B2 (en) 2018-03-29 2021-04-27 Contrafect Corporation Lysin-antimicrobial peptide (AMP) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof
WO2019222502A1 (en) * 2018-05-17 2019-11-21 University Of Maryland, College Park Endolysins active against bacellus bacteria, pharmaceutical, and methods relating thereto
EP3813796A4 (en) * 2018-05-23 2022-06-22 The Rockefeller University RECOMBINANT LYSINE
JP2021525092A (ja) * 2018-05-30 2021-09-24 ライサンド アーゲー 新規抗微生物融合タンパク質
JP2021525072A (ja) 2018-05-30 2021-09-24 ライサンド アーゲー 新規抗微生物タンパク質
CN111378638B (zh) * 2018-12-29 2023-05-05 江苏万邦医药科技有限公司 幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法
RU2730613C1 (ru) * 2019-05-08 2020-08-24 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты)
RU2730614C1 (ru) * 2019-05-08 2020-08-24 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты)
RU2730615C1 (ru) * 2019-05-08 2020-08-24 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против грамотрицательных бактерий: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae и Salmonella typhi (варианты)
CN113795577A (zh) * 2019-05-08 2021-12-14 法戈梅德生物制药有限公司 新的加德纳菌内溶素及其用途
RU2730616C1 (ru) * 2019-05-08 2020-08-24 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Acinetobacter baumannii, (варианты)
US11667895B2 (en) 2019-05-10 2023-06-06 The Board Of Trustees Of The University Of Alabama Methods and devices related to controlled delivery of phages as a theranostic tool
US20230138922A1 (en) 2020-03-11 2023-05-04 Telum Therapeutics S.L. New recombinant lysin and its use in the treatment of gram-negative bacterial infections
CN115942932A (zh) 2020-03-19 2023-04-07 迈克瑞欧斯人体健康有限公司 感兴趣的稳定蛋白
CN117534733B (zh) * 2024-01-10 2024-03-29 黑龙江八一农垦大学 抗菌肽cm24、重组基因、乳酸工程菌及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0510907A2 (en) * 1991-04-20 1992-10-28 Agricultural And Food Research Council Bacteriophage lysins and their applications in destroying and testing for bacteria
WO2010023207A2 (en) * 2008-08-26 2010-03-04 Katholieke Universiteit Leuven K.U. Leuven R&D Antimicrobial agents

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8816693D0 (en) 1988-07-13 1988-08-17 Agricultural & Food Res Viral enzyme & gene
US7572602B1 (en) * 2004-12-03 2009-08-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Nucleic acid encoding endolysin fusion protein
US8383102B2 (en) * 2009-05-21 2013-02-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Fusion of peptidoglycan hydrolase enzymes to a protein transduction domain allows eradication of both extracellular and intracellular gram positive pathogens
EP3363896A1 (en) 2009-06-26 2018-08-22 Lysando AG Antimicrobial agents
CN102458452B (zh) 2009-06-26 2015-12-02 勒芬天主教大学，K.U.勒芬R&D 抗微生物剂
US9534223B2 (en) * 2010-04-27 2017-01-03 Lysando Ag Method of reducing biofilms

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0510907A2 (en) * 1991-04-20 1992-10-28 Agricultural And Food Research Council Bacteriophage lysins and their applications in destroying and testing for bacteria
WO2010023207A2 (en) * 2008-08-26 2010-03-04 Katholieke Universiteit Leuven K.U. Leuven R&D Antimicrobial agents

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARIMA H. ET AL.: "Bactericidal action of lysozymes attached with various sizes of hydrophobic peptides to the C-terminal using genetic modification" FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL LNKD- DOI:10.1016/S0014-5793(97)01071-5, vol. 415, no. 1, 22 September 1997 (1997-09-22), pages 114-118, XP004261147 ISSN: 0014-5793 the whole document *
LOESSNER M. J.: "Bacteriophage endolysins - current state of research and applications" CURRENT OPINION IN MICROBIOLOGY, CURRENT BIOLOGY LTD, GB LNKD- DOI:10.1016/0.MIB.2005.06.002, vol. 8, no. 4, 1 August 2005 (2005-08-01), pages 480-487, XP004989436 ISSN: 1369-5274 the whole document *
ORITO Y. ET AL.: "Bacillus amyloliquefaciens phage endolysin can enhance permeability of Pseudomonas aeruginosa outer membrane and induce cell lysis" APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER VERLAG, BERLIN, DE LNKD- DOI:10.1007/S00253-003-1522-1, vol. 65, no. 1, 1 July 2004 (2004-07-01), pages 105-109, XP002579253 ISSN: 0175-7598 [retrieved on 2004-01-09] the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
US20120189608A1 (en) 2012-07-26
AU2010288559B2 (en) 2015-08-06
AU2010288559A8 (en) 2015-08-13
KR20120059576A (ko) 2012-06-08
CN102575240A (zh) 2012-07-11
US9169472B2 (en) 2015-10-27
JP5847081B2 (ja) 2016-01-20
AU2010288559B8 (en) 2015-08-13
US20160010071A1 (en) 2016-01-14
MX2012002216A (es) 2012-04-10
IL218296A0 (en) 2012-04-30
WO2011023702A1 (en) 2011-03-03
CA2772001A1 (en) 2011-03-03
AU2010288559A1 (en) 2012-02-16
EP2470648A1 (en) 2012-07-04
EP2470648B1 (en) 2019-04-10
US20150024469A1 (en) 2015-01-22
SG178440A1 (en) 2012-04-27
JP2013502231A (ja) 2013-01-24
US8846865B2 (en) 2014-09-30
EA201270322A1 (ru) 2012-08-30
CN102575240B (zh) 2016-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA024253B1 (ru) Литический полипептид с пептидогликангидролазной активностью и его применение против инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями
AU2016202296B2 (en) Antimicrobial Agents
EA024794B1 (ru) Вариант эндолизина со встроенным катионным пептидом с активностью, разрушающей липополисахарид
EP2635676B1 (en) Novel endolysin
JP6034188B2 (ja) 抗微生物剤
EP2702070B1 (en) New antimicrobial agents
TW201204262A (en) Method of reducing biofilms
Arasu et al. Bactericidal activity of fish galectin 4 derived membrane-binding peptide tagged with oligotryptophan
EP2321409A1 (en) New endolysin plyp40
CN112368010A (zh) 抗微生物的、细菌噬菌体来源的多肽及其针对革兰氏阴性细菌的用途
Peng et al. Tissue distribution, expression, and antimicrobial activity of Anas platyrhynchos avian β-defensin 6
Varma et al. A Brief Review on Lysozyme’s Pharmacology and Drug-Carrying Capacity
WO2021157732A1 (ja) バクテリオファージ併用剤

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU