CN102575240B - 新的细胞内溶素OBPgpLYS - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有根据SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列的多肽和其片段或衍生物。本发明还涉及融合蛋白,其包含所述多肽和在N端或C端与所述多肽融合的额外肽段。此外,本发明还涉及编码所述多肽或融合蛋白的核酸,包含所述核酸分子的载体,以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外,本发明还涉及用作药物、尤其是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染、用作诊断手段、作为美容用物质或消毒剂的所述多肽或融合蛋白。本发明还涉及所述多肽或融合蛋白用于治疗或预防食品、食物加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗设备、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染。此外,本发明涉及包含所述多肽或融合蛋白的药物组合物。
Description
本发明涉及具有根据SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽和其片段或衍生物。本发明还涉及包含所述多肽以及与所述多肽在N端或C端融合的附加肽段的融合蛋白。此外,本发明涉及编码所述多肽或融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外,本发明涉及所述多肽或融合蛋白用作药物,特别是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染,用作诊断手段、作为美容物质或消毒剂。本发明还涉及所述多肽或融合蛋白用于治疗或预防食品、食品加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗设备、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染。此外,本发明涉及包含所述多肽或融合蛋白的药物组合物。
革兰氏阴性细菌具有外膜,其特点为特征性的不对称双分子层。外膜的双分子层由含有磷脂(主要为磷脂酰乙醇胺)的内侧单分子层和主要由单一糖脂——脂多糖(LPS)构成的外侧单分子层组成。在细菌界,LPS结构具有广阔的多样性,且LPS结构可响应主导的环境条件而受到修饰。LPS层的稳定性以及不同LPS分子之间的相互作用主要通过二价离子(Mg2+、Ca2+)与LPS分子的阴离子组分(脂质A中的磷酸基团和KDO的内核和羧基基团)的静电相互作用实现。此外,由于缺乏不饱和脂肪酸所致,脂质A疏水部分的密集而有序的包装形成具有高粘性的刚性结构。这使其较不易被亲脂性分子渗透,并赋予外膜(OM)额外的稳定性。
多种类型的具有杀菌或抑菌活性的试剂是已知的,例如抗生素、细胞内溶素、抗微生物肽和防卫素。然而,微生物对抗生素抗性的增加对治疗愈来愈多的细菌导致的感染造成了困难。特别的困难出现于由革兰氏阴性细菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和肠杆菌科细菌(Enterobacteriaceae)导致的感染。
细胞内溶素为噬菌体(或细菌的病毒)编码的肽聚糖水解酶。其在噬菌体复制(multiplication)的裂解周期中的晚期基因表达期间合成,并通过降解细菌肽聚糖来介导后代病毒体从受感染的细胞的释放。其为β(1,4)-糖基化酶(溶菌酶)、转糖基酶、酰胺酶或内肽酶。细胞内溶素的抗微生物应用已经在1991年由Gasson(GB2243611)提出。尽管细胞内溶素的杀灭能力久为人知,但由于抗生素的成功和主宰地位,忽略了这些酶作为抗细菌剂的用途。仅在多重抗生素抗性细菌出现后,用细胞内溶素对抗人类病原体这一简单理念方才受到注意。出现了令人瞩目的开发全新类型的抗细菌剂的需求,而用作酶抗生素(enzybiotics)(“酶”和“抗生素”的组合术语)的细胞内溶素完美地符合该需求。2001年,Fischetti及其同事首次证实了噬菌体C1细胞内溶素对A组链球菌的治疗潜力(Nelson等,2001)。此后,许多公开物确立了细胞内溶素作为控制细菌感染,特别是革兰氏阳性细菌的有吸引力和补充的替代手段。接着,证明了针对其他革兰氏阳性病原体如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)(Loeffler等,2001)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)(Schuch等,2002)、无乳链球菌(S.agalactiae)(Cheng等,2005)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(Rashel等,2007)的不同细胞内溶素作为酶抗生素的效力。现在,细胞内溶素疗法最重要的挑战在于革兰氏阴性细菌由于外膜屏蔽细胞内溶素接近肽聚糖而对细胞内溶素的外源作用不敏感。这一点现在阻止了细胞内溶素的有效范围扩张至重要的革兰氏阴性病原体。
抗微生物肽(AMP)代表了一大类短的、阳离子或两亲性、基因编码的肽抗生素,其可在几乎每一种生物中发现。不同的AMP展现出不同的特性,并且这一种类中的许多肽已被深入地研究,不仅作为抗生素,而且还作为细胞渗透肽的模板。尽管共有少量的共同特征(例如,阳离子性、两亲性和短尺寸),但AMP序列有极大的不同,并且已提出至少四种结构组(α螺旋、β螺旋、延伸和环)提供了观察到的AMP构象的多样性。并且,已提议了多种作为抗生素作用的模式,并且已显示,例如,许多这些肽的主要靶标是细胞膜,而其他肽的主要靶标是细胞质入侵以及核心代谢功能的破坏。尽管缺乏特定的靶结合,但AMP可变得足够集中从而显示出协作活性;例如,通过在膜中形成孔,如在多数AMP的情况下即如此。然而,这一现象仅在模式磷脂双层中观察到,并且在一些情况下,这些事件的发生需要膜中高达每六个磷脂分子一个肽分子的AMP浓度。这些浓度接近(如果没有达到的话)整个膜的饱和。由于AMP的最小抑制浓度(MIC)通常在低微摩尔范围之内,因此就这些阈值和它们在体内重要性的关联合理地产生了怀疑(Melo等,Naturereviews,Microbiology,2009,245)。
防卫素是一大家族的小的、阳离子的、富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽,其在脊椎动物和无脊椎动物中均有发现。根据半胱氨酸间隔样式,可将防卫素分为五组:植物、无脊椎、α-、β-和θ-防卫素。后三种大多数发现于哺乳动物中。α-防卫素是在嗜中性粒细胞和肠上皮中发现的蛋白质。β-防卫素是分布最广的,并由许多种类的白细胞和上皮细胞分泌。θ-防卫素目前很少发现,例如在恒河猴的白细胞中。防卫素具有抗细菌、真菌和许多有包膜和无包膜病毒的活性。然而,有效杀灭细菌所需的浓度大多数都很高,即,在微摩尔范围内。许多肽的活性可能限于存在生理盐条件、二价阳离子和血清时。取决于疏水氨基酸残基的含量,防卫素也可显示出溶血活性。
因此,有对针对革兰氏阴性细菌的新型抗微生物剂的需要。
该目标通过权利要求中限定的主题所解决。
下述附图用于阐释本发明。
图1显示了根据本发明的细胞内溶素OBPgpLYS。(A)描述了根据本发明的细胞内溶素OBPgpLYS的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。(B)给出了包含附加His6-标签的OBPgpLYS的一级结构,其显示了应用BLASTp和Pfam的功能性分析的结果。预测的N端肽聚糖结合结构域(PBD,氨基酸残基7-96)由下划线显示,并且溶菌酶样超家族的C端催化结构域(氨基酸残基126-292)由斜体书写。(B)中显示的在C端包含附加His6-标签的OBPgpLYS的完整氨基酸序列描述于SEQIDNO:47。
图2显示了噬菌体OBP的细胞内溶素的核苷酸序列(SEQIDNO:101)。
图3显示了根据本发明的细胞内溶素OBPgpLYS(SEQIDNO:1)的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。
图4显示经考马斯染色的SDS-PAGE的图片,显示未经修饰的细胞内溶素OBPgpLYS(SEQIDNO:47)及其修饰的细胞内溶素变体PKOBPgpLYS(SEQIDNO:49)的表达和纯化结果。LMW泳道为大小标记(LMW梯型分子量标记)。之后的三个泳道为Ni2+亲和层析之后纯化蛋白在洗脱缓冲液(20mMNaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5MNaCl;500mM咪唑)中的蛋白质级分。泳道FT为流过物,而泳道W为废级分。在纯化的蛋白质级分中仅可见很少的次级条带,表明重组蛋白的高纯度(>90%)。
图5中A至F显示未经修饰的OBPgpLYS(SEQIDNO:47)和经修饰的PKOBPgpLYS(SEQIDNO:49)的不同组合物在室温不振荡的条件下温育之后针对几种指数生长的革兰氏阴性细菌的抗菌活性的图示。每个菌种的革兰氏阴性细菌用包含0.5mMEDTA但不含细胞内溶素的组合物、包含1.315μM未经修饰的OBPgpLYS但不含EDTA的组合物、包含1.315μM修饰的PKOBPgpLYS但不含EDTA的组合物、包含1.315μM未经修饰的OBPgpLYS和0.5mMEDTA的组合物以及包含1.315μM修饰的PKOBPgpLYS和0.5mMEDTA的组合物温育30分钟。在图5A中,显示了针对大肠杆菌(Escherichiacoli)WK6细胞的抗细菌活性,在图5B中显示了针对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)LT2(SGSCN°2317)细胞的抗细菌活性,在图5C中显示了针对铜绿假单胞菌PAO1p细胞的抗细菌活性,在图5D中显示了针对铜绿假单胞菌Br667细胞的抗细菌活性,在图5E中显示了针对恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)G1细胞的抗细菌活性,而在图5F中显示了针对类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapseudomallei)细胞的活性。“Δ”给出了对应的OBPgpLYS和PKOBPgpLYS样品之间的抗细菌活性差异。误差棒表示平均值的标准偏差。
图6显示了未修饰的OBPgpLYS(SEQIDNO:47)和经修饰的PKOBPgpLYS(SEQIDNO:49)的宿主特异性的图示。每一种革兰氏阴性细菌与包含每一1.315μM未修饰的OBPgpLYS或经修饰的PKOBPgpLYS的组合物温育30分钟。该柱形图给出了未修饰的OBPgpLYS和经修饰的PKOBPgpLYS对铜绿假单胞菌PAO1p细胞(PAO1)、大肠杆菌WK6细胞(wk6)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌细胞(Burkpseudo)、铜绿假单胞菌Br667细胞(Br667)、鼠伤寒沙门氏菌LT2细胞(LT2)和恶臭假单胞菌G1细胞(PpuG1)的抗细菌活性。误差棒表示平均值的标准偏差。
如本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”与术语“多肽”所指相同。本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”指氨基酸残基通过肽键以特定顺序连接的直链聚合物。蛋白的氨基酸残基可通过例如共价附接多种基团如糖和磷酸而得以修饰。其他的物质如血红素或脂质可更松散的与多肽链相联系,得到缀合的蛋白,其也包含于本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”中。有多种方式阐明多肽链的折叠,特别是针对存在α螺旋和β折叠片层。如本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”指所有四种类型的蛋白,即全α、全β、α/β和α加β(αplusβ)。
如本文中使用的术语“融合蛋白”指由两个核酸序列融合所得的表达产物。此类蛋白可例如在重组DNA表达系统中产生。而且,如本文中使用的术语“融合蛋白”指第一氨基酸序列例如细胞内溶素与第二或更进一步的氨基酸序列的融合物。所述第二或更进一步的氨基酸序列优选为肽段,特别是阳离子肽、聚阳离子肽、两亲性肽、sushi肽、防卫素、疏水肽或抗微生物肽。优选地,所述第二和/或更进一步的氨基酸序列对于所述第一氨基酸序列为外源的,并且不与第一氨基酸序列的任何结构域实质上同源。
如本文中使用的术语“肽段”指任何类型的连接于蛋白如细胞内溶素的肽。具体而言如本文中使用的术语“肽段”指阳离子肽、聚阳离子肽、两亲性肽、sushi肽、防卫素、疏水肽和/或抗微生物肽。然而,在本发明的含义中,肽段并不指His6标签、Strep标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签或本领域已知的其他标签,硫氧还蛋白或者麦芽糖结合蛋白(MBP)。与如本文中使用的术语“肽段”相对,术语“标签”指可用于帮助多肽的表达和/或亲和纯化,将多肽固定于表面或者充当标志物或标记部分以供检测多肽(例如通过在不同的ELISA测定形式中的抗体结合)的肽,只要使该标签可用于上述所列举之一的功能并非由所述肽所荷的正电荷所致即可。然而,His6标签可能取决于相应的pH,亦可荷正电,但却是因为其结合于固定化的二价阳离子而用作亲合纯化工具而并非用作根据本发明的肽段。
如本文中使用的术语“肽”指由约2至约100个氨基酸残基,更优选约4至约50个氨基酸残基,更优选约5至30个氨基酸残基组成的短多肽,其中一个氨基酸残基的氨基基团通过肽键连接于另一个氨基酸残基的羧基基团。肽可具有特定功能。肽可为天然存在的肽或合成设计和产生的肽。所述肽可例如通过酶法或化学剪切来源于天然蛋白或从天然蛋白移出,或者可使用常规的肽合成技术(例如,固相合成)或分子生物学技术(参见Sambrook,J.等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))来制备。优选的天然存在的肽为例如抗微生物肽、防卫素和sushi肽。优选的合成产生的肽为例如聚阳离子肽、两亲性肽或疏水肽。在本发明意义内的肽不是指用于纯化或定位蛋白的His标签、Strep标签、硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白(MBP)等。
本文中使用的术语“细胞内溶素”指适于水解细菌细胞壁的酶。“细胞内溶素”包含至少一个具有至少下述活性之一的“酶活性域(EAD)”:内肽酶、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)、N-乙酰基胞壁酰胺酶(N-acetyl-muramidase)、N-乙酰基-氨基葡萄糖苷酶(溶菌酶)或转糖基酶。此外,所述细胞内溶素还可含有不具酶活性并结合于宿主细菌细胞壁的区,即所谓CBD(细胞壁结合结构域)。所述细胞内溶素可含有两个或更多个CBD。然而,如本文中使用的术语“细胞内溶素”还指具有至少一个EAD但没有CBD的酶。一般而言,细胞壁结合结构域能够结合细菌表面上不同的组分。优选地,所述细胞壁结合结构域为肽聚糖结合结构域并结合于细菌的肽聚糖结构。细胞内溶素的不同结构域可通过结构域接头连接。
如本发明所使用的术语“结构域接头”是指起着将单个蛋白结构域彼此相连的作用的氨基酸序列。作为规则,结构域接头不形成或仅形成很少的规则二级结构,如α螺旋或β-片层,并且能够占据就结构背景而言的不同构象。检测结构域接头的方法以及接头序列的特征是本领域公知的,例如描述于Bae等,2005,Bioinformatics,21,2264-2270或George&Heringa,2003,ProteinEngineering,15,871-879中。
如本文所使用的术语“野生型”或“wt”是指如SEQIDNO:86所示的细胞内溶素OBPgpLYS的氨基酸序列。编码该野生型细胞内溶素OBPgpLYS的核酸序列描述于SEQIDNO:101。
如本文中使用的术语“缺失”指从对应的起始序列去除1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
如本文中使用的术语“插入”或“添加”指向对应的起始序列插入或添加1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
如本文中使用的术语“取代”指用不同的氨基酸残基替换位于某个位置的氨基酸残基。
如本文中使用的术语“细胞壁”指所有构成革兰氏阴性细菌外细胞围绕物(enclosure)并由此确保其完整性的组分。具体而言,如本文中使用的术语“细胞壁”指肽聚糖、革兰氏阴性细菌具有脂多糖的外膜、细菌细胞膜,但也指沉积于肽聚糖上的其他层例如荚膜(capsule)、外蛋白层或粘液(slime)。
如本文中使用的术语“EAD”指细胞内溶素的酶活性结构域。EAD负责水解细菌肽聚糖。其呈现细胞内溶素的至少一种酶活性。EAD还可由超过一种酶活性模块构成。本文中使用的术语“EAD”与术语“催化结构域”同义。
如本文中使用的术语“阳离子肽”指具有荷正电的氨基酸残基的肽。优选地,阳离子肽具有9.0或更高的pKa值。通常,所述阳离子肽的至少四个氨基酸残基可荷正电,例如为赖氨酸或精氨酸。“荷正电”指所述氨基酸残基的侧链在接近生理条件下具有净正电荷。如本文中使用的术语“阳离子肽”还指聚阳离子肽。
如本文中使用的术语“聚阳离子肽”指主要由荷正电的氨基酸残基特别是赖氨酸和/或精氨酸残基构成的合成产生的肽。如果氨基酸残基的至少约20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95或约100%是荷正电的氨基酸残基,特别是赖氨酸和/或精氨酸残基,则肽主要由荷正电的氨基酸残基构成。作为不荷正电的氨基酸残基的氨基酸残基可为电中性的氨基酸残基和/或荷负电的氨基酸残基和/或疏水氨基酸残基。优选地,作为不荷正电的氨基酸残基的氨基酸残基为电中性的氨基酸残基,特别是丝氨酸和/或甘氨酸。
如本文所使用的术语“抗微生物肽”(AMP)是指任何具有抗微生物和/或抑微生物活性的肽。因此,如本文所使用的术语“抗微生物肽”特别是指任何具有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生物、抗原生动物、抗病毒、抗感染(anti-infectious)、抗传染(anti-infective)和/或杀菌、杀藻、杀变形虫、杀微生物、杀细菌、杀真菌、杀寄生物、杀原生动物、杀原虫(protozoicidal)特性的肽。
如本文所使用的术语“防卫素”是指存在于动物、优选哺乳动物、更优选人中的肽,其中防卫素在固有宿主防御系统中起着破坏外来物质诸如感染性细菌和/或感染性病毒和/或真菌的作用。防卫素是非抗体杀微生物和/或杀肿瘤蛋白、肽或多肽。“防卫素”的实例是“哺乳动物防卫素”、α防卫素、β防卫素、indolicidin和magainin。如本文所使用的术语“防卫素”是指自动物细胞分离的形式或合成产生的形式二者,还指基本上保留了它们母体蛋白的细胞毒活性、但其序列已通过插入或缺失一个或多个氨基酸残基而得以改变的变体。
如本文所使用的术语“sushi肽”是指具有短共有重复的补体调控蛋白(CCP)。sushi肽的sushi模块在许多不同的蛋白质中起着蛋白-蛋白相互作用结构域的功能。已显示含有sushi结构域的肽具有抗微生物活性。
如本文所使用的术语“两亲性肽”是指具有亲水和疏水两种官能团的肽。优选地,如本文所使用的术语“两亲性肽”是指具有确定的亲水和疏水基团排列的肽,例如,两亲性肽可以例如是α螺旋,其中沿着该螺旋一侧主要具有非极性侧链并且沿着其表面的剩余部分具有极性残基。
如本文所使用的术语“疏水基团”是指诸如氨基酸侧链的化学基团,其基本上不溶于水,但可溶于油相,其中在油相中的溶解度比在水中或水相中的溶解度更高。在水中,具有疏水侧链的氨基酸残基彼此相互作用从而产生非水性环境。具有疏水侧链的氨基酸残基的实例是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基。
本发明涉及新颖的抗革兰氏阴性细菌的抗细菌剂。具体地,本发明涉及包含根据SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽或其片段或衍生物。该包含根据SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽优选由根据SEQIDNO:3的核苷酸序列编码。
具有根据SEQIDNO:1的氨基酸序列的细胞内溶素OBPgpLYS具有328个氨基酸的长度。其包含N端细胞壁结合结构域(CBD)和C端酶活性结构域(EAD)。N端CBD是具有根据SEQIDNO:4的氨基酸序列的肽聚糖结合结构域(PGB,aa7-96)。C端EAD是符合溶菌酶样超家族催化结构域的催化结构域(aa126-292),并且具有根据SEQIDNO:5的氨基酸序列。细胞内溶素OBPgpLYS的PGB和催化结构域通过结构域接头连接。
因此,根据本发明优选的多肽片段是包含根据SEQIDNO:4和/或根据SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽。根据本发明的多肽的另一优选片段包含根据SEQIDNO:69的氨基酸序列。具有根据SEQIDNO:69的氨基酸序列的片段与具有根据SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽的不同在于缺失了起始甲硫氨酸残基。
根据本发明的衍生物是包含根据SEQIDNO:1、4、5和/或69的氨基酸序列但具有额外修饰和/或改变的多肽。所述修饰和/或改变可以是突变,特别是缺失、插入、添加、取代或其任意组合和/或氨基酸残基的化学变化,例如生物素化、乙酰化、PEG化、氨基、SH或羧基基团的化学变化。根据本发明的所述衍生物呈现OBPgpLYS(SEQIDNO:1)的溶解活性和/或根据本发明的所述片段活性。所述活性可为OBPgpLYS活性和/或根据本发明的片段活性的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或约200%。所述活性可由本领域技术人员通过本领域公知的测定法来测量,例如平板裂解(platelysis)测定法或液体裂解(liquidlysis)测定法,其例如描述于(Briers等,J.Biochem.BiophysMethods70:531-533,(2007))。
根据本发明优选的衍生物是包含根据SEQIDNO:86和87的氨基酸序列的多肽。所述衍生物与具有根据SEQIDNO:1和SEQIDNO:69的氨基酸序列的多肽的不同分别在于分别在325位和324位上的亮氨酸残基被组氨酸残基所取代。包含根据SEQIDNO:86的氨基酸序列的多肽优选由根据SEQIDNO:101的核苷酸序列编码。
在本发明优选的实施方案中,根据本发明的多肽、片段和/或衍生物还在N端或C端包含标签,诸如His6标签、Strep标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签,或其他本领域公知的标签。在本发明优选的实施方案中,所述标签与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物在C端连接。所述标签可通过额外的氨基酸残基与所述多肽、片段和/或衍生物连接。所述额外的氨基酸残基可由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外氨基酸残基组成。在本发明优选实施方案中,所述标签通过额外的氨基酸残基Leu-Glu或Lys-Gly连接于根据本发明的多肽、片段和/或衍生物。
在优选的实施方案中,本发明涉及包含根据SEQIDNO:47或SEQIDNO:88的氨基酸序列的多肽。分别与具有根据SEQIDNO:1和SEQIDNO:86的氨基酸序列的多肽相比,具有根据SEQIDNO:47和SEQIDNO:88的氨基酸序列的多肽分别包含与分别具有根据SEQIDNO:1和SEQIDNO:86的氨基酸序列的多肽的C端连接的额外的C端His6-标签,所述连接通过额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)。包含根据SEQIDNO:47的氨基酸残基的多肽优选由根据SEQIDNO:48的核苷酸序列编码。包含根据SEQIDNO:88的氨基酸残基的多肽优选由根据SEQIDNO:89的核苷酸序列编码。
本发明的其他方面是由根据本发明的多肽、片段和/或衍生物和肽段组成的融合蛋白,其中所述肽段在N端或C端与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物融合。
根据本发明的融合蛋白的肽段优选与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物共价连接。优选地,所述肽段由至少5个、更优选至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100个氨基酸残基组成。特别优选的肽段包含约5至约100个氨基酸残基、约5至约50个或约5至30个氨基酸残基。更优选的肽段包含约6至约42个氨基酸残基、约6至约39个氨基酸残基、约6至约38个氨基酸残基、约6至约31个氨基酸残基、约6至约25个氨基酸残基、约6至约24个氨基酸残基、约6至约22个氨基酸残基、约6至约21个氨基酸残基、约6至约20个氨基酸残基、约6至约19个氨基酸残基、约6至约16个氨基酸残基、约6至约14个氨基酸残基、约6至约12个氨基酸残基、约6至约10个氨基酸残基或约6至约9个氨基酸残基。优选地,所述肽段不是诸如His6标签、Strep标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签、或其他本领域公知标签的标签,也不是硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白(MBP)。然而,该肽段可额外的包含此类标签或多个标签等,其用于纯化或定位蛋白。
优选地,该肽段具有引导根据本发明的融合蛋白穿过革兰氏阴性细菌外膜的功能,但当不与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物融合而施与时没有活性或仅仅有很低的活性。引导融合蛋白穿过革兰氏阴性细菌外膜的功能是由所述肽段破坏膜或LPS的潜力造成的。为测定肽段是否具有破坏膜或LPS的活性,可将所述肽段与根据本发明的多肽融合,例如如本发明实施例所描述的那样。随后,可测试由根据本发明的多肽和所述肽段组成的融合蛋白的抗细菌活性,并与根据本发明的不具有该肽段的多肽相比较,也如在本发明实施例中所描述,并且例如在图5A至F和6所示。优选地,所述测试可在大肠杆菌WK6和/或铜绿假单胞菌PAO1p细胞上进行,如在本发明实施例中所使用的那样。如果对于至少一种测试革兰氏阴性细菌物种,所述融合蛋白与没有所述肽段的根据本发明的多肽相比较具有升高的抗细菌活性,则所述肽段具有破坏膜或LPS的活性。优选地,通过具有破坏膜或LPS的活性的肽段,根据本发明的多肽的抗细菌活性(以对数单位(=log10N0/Ni)计)升高至少约5%、更优选至少约10%。
在本发明的一个方面,融合的肽段是两亲性肽,其包含一个或多个荷正电的氨基酸残基赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸,其与一个或多个疏水氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸组合。氨基酸残基侧链优选适当定向,使得阳离子和疏水表面在肽的相反侧簇集(cluster)。优选地,所述肽中超过约30、40、50、60或70%的氨基酸是荷正电氨基酸。优选地,所述肽中超过约30、40、50、60或70%的氨基酸残基是疏水氨基酸残基。有利地,该两亲性肽融合在具有细胞壁降解活性的根据本发明的多肽、片段和/或衍生物的N端和/或C端末端,如此提高了后一蛋白的两亲性。
在优选的实施方案中,两亲性肽中至少约30、40、50、60或70%的所述氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基和/或该两亲性肽中至少约30、40、50、60或70%的所述氨基酸残基是疏水氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。
优选的两亲性肽是根据SEQIDNO:6的Pleurocidin、根据SEQIDNO:7的天蚕素P1、根据SEQIDNO:8的BuforinII、根据SEQIDNO:9的BuforinI和根据SEQIDNO:10的Magainin。其他优选的两亲性肽是Cathelidicine,例如根据SEQIDNO:11的LL-37。
在本发明其他方面,融合的肽段是抗微生物肽,其包含净正电荷,以及约50%的疏水氨基酸残基。该抗微生物肽是两亲性的,具有约12至约50个氨基酸残基的长度。
优选的抗微生物肽如下表所列。
在本发明的其他方面,融合的肽段是sushi肽,其描述于DingJL,LiP,HoBCellMolLifeSci.2008Apr;65(7-8):1202-19.TheSushipeptides:structuralcharacterizationandmodeofactionagainstGram-negativebacteria中。
优选的sushi肽是sushi肽S1和S3及其复合物(multiple);FASEBJ.2000Sep;14(12):1801-13。
在本发明其他方面,融合的肽段是防卫素,优选Cathelicidine、天蚕素P1、天蚕素A或MagaininII。
在本发明其他方面,融合的肽段是疏水肽,优选具有氨基酸序列Phe-Phe-Val-Ala-Pro(SEQIDNO:18)。
其他优选的肽段如下表所列。
Alpha4 | PNRAKRVITTFRT | SEQ ID NO:68 |
Artilysin1 | GFFIPAVILPSIAFLIVP | SEQ ID NO:70 |
Artilysin2 | GKPGWLIKKALVFKKLIRRPLKRLA | SEQ ID NO:71 |
WLBU2变体 | KRWVKRVKRVKRWVKRVVRVVKRWVKR | SEQ ID NO:118 |
在本发明的一个方面,融合的肽段是阳离子肽和/或聚阳离子肽,其包含一个或多个荷正电的氨基酸残基赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸,特别是赖氨酸和/或精氨酸。优选地,所述肽段中超过约20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95或99%的氨基酸残基是荷正电的氨基酸残基,特别是赖氨酸和/或精氨酸残基。特别优选的是由约100%荷正电的氨基酸残基特别是精氨酸和/或赖氨酸残基组成的肽段,其中优选所述荷正电的氨基酸残基的约60%至约70%是赖氨酸残基,且所述荷正电的氨基酸残基的约30%至约40%是精氨酸残基。更优选的是由约100%荷正电的氨基酸残基特别是精氨酸和/或赖氨酸残基组成的肽段,其中优选约64%至约68%所述荷正电的氨基酸残基是赖氨酸,且约32%至约36%所述荷正电的残基是精氨酸。还优选仅由精氨酸或仅由赖氨酸组成的肽段。
特别优选的是包含至少一个根据SEQIDNO:19(KRKKRK)的基序的阳离子和/或聚阳离子肽段。具体而言,优选包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个根据SEQIDNO:19(KRKKRK)的基序的阳离子肽段。更优选的是包含至少一个KRK基序(lys-arg-lys),优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个KRK基序的阳离子肽段。
在本发明的另一个优选实施方案中,所述阳离子肽段除了所述荷正电的氨基酸残基特别是赖氨酸和/或精氨酸残基之外还包含电中性氨基酸残基,特别是甘氨酸和/或丝氨酸残基。优选的阳离子肽段的组成为约70%至约100%,或约80%至约95%,或约85%至约90%荷正电的氨基酸残基,特别是赖氨酸和/或精氨酸残基;以及约0%至约30%,或约5%至约20%,或约10%至约20%电中性氨基酸残基,特别是甘氨酸和/或丝氨酸残基。优选的是由约4%至约8%丝氨酸残基,约33%至约36%精氨酸残基和约56%至约63%赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至少一个根据SEQIDNO:40(KRXKR)的基序的多肽段,其中X为任何除了赖氨酸、精氨酸和组氨酸之外的氨基酸。特别优选的是包含至少一个根据SEQIDNO:41(KRSKR)的基序的多肽段。更优选的是包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个根据SEQIDNO:40(KRXKR)或SEQIDNO:41(KRSKR)的基序的阳离子段。
还优选由约9至约16%甘氨酸残基,约4至约11%丝氨酸残基,约26至约32%精氨酸残基和约47至约55%赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至少一个根据SEQIDNO:42(KRGSG)的基序的多肽段。更优选的是包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个根据SEQIDNO:42(KRGSG)的基序的阳离子段。
在本发明的另一个优选实施方案中,所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基特别是赖氨酸和/或精氨酸之外,还包含疏水氨基酸残基特别是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸残基。优选的是由约70%至约100%,或约80%至约95%,或约85%至约90%荷正电的氨基酸残基特别是赖氨酸和/或精氨酸残基以及约0%至约30%,或约5%至约20%,或约10%至约20%疏水氨基酸残基特别是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸残基组成的阳离子肽段。
特别优选的是选自下组序列的肽段:
肽段 | 长度 | SEQ ID NO: |
KRKKRK | 6 | SEQ ID NO:19 |
KRKKRKKRK | 9 | SEQ ID NO:20 |
RRRRRRRRR | 9 | SEQ ID NO:21 |
KKKKKKKK | 8 | SEQ ID NO:22 |
KRKKRKKRKK | 10 | SEQ ID NO:23 |
KRKKRKKRKKRK | 12 | SEQ ID NO:24 |
KRKKRKKRKKRKKR | 14 | SEQ ID NO:25 |
KKKKKKKKKKKKKKKK | 16 | SEQ ID NO:26 |
KRKKRKKRKKRKKRKKRKK | 19 | SEQ ID NO:27 |
RRRRRRRRRRRRRRRRRRR | 19 | SEQ ID NO:28 |
KKKKKKKKKKKKKKKKKKK | 19 | SEQ ID NO:29 |
KRKKRKKRKRSKRKKRKKRK | 20 | SEQ ID NO:30 |
KRKKRKKRKRSKRKKRKKRKK | 21 | SEQ ID NO:31 |
KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK | 21 | SEQ ID NO:32 |
KRKKRKKRKRGSGKRKKRKKRK | 22 | SEQ ID NO:33 |
KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRK | 24 | SEQ ID NO:34 |
KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKK | 25 | SEQ ID NO:35 |
KRKKRKKRKRSKRKKRKKRKRSKRKKRKKRK | 31 | SEQ ID NO:36 |
KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRKGSGSGKRKKRKKRK | 38 | SEQ ID NO:37 |
KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK | 39 | SEQ ID NO:38 |
KRKKRKKRKRSKRKKRKKRKRSKRKKRKKRKRSKRKKRKKRK | 42 | SEQ ID NO:39 |
特别优选的是包含根据本发明的多肽、片段和/或衍生物以及具有根据SEQIDNO:20的氨基酸序列的肽段的融合蛋白。更优选的是具有根据SEQIDNO:43和SEQIDNO:115的氨基酸序列的融合蛋白。还优选的是具有根据SEQIDNO:49和SEQIDNO:116的氨基酸序列的融合蛋白。与分别具有根据SEQIDNO:43和SEQIDNO:115的氨基酸序列的融合蛋白相比,分别具有根据SEQIDNO:49和SEQIDNO:116的氨基酸序列的融合蛋白分别包含与分别具有根据SEQIDNO:43和SEQIDNO:115的氨基酸序列的融合蛋白C端连接的额外C端His6标签,所述连接通过额外的氨基酸残基赖氨酸和精氨酸(Lys-Gly)。分别具有根据SEQIDNO:43和SEQIDNO:115及SEQIDNO:49和SEQIDNO:116的氨基酸序列的融合蛋白的不同在于,具有根据SEQIDNO:115和SEQIDNO:116的氨基酸序列的融合蛋白各自在位置336上具有亮氨酸残基至组氨酸残基的取代。
在本发明的另一个优选实施方案中,根据本发明的融合蛋白的肽段包含氨基酸序列的修饰和/或改变。此类改变和/或修饰可包含突变如缺失、插入和添加、取代或其组合,和/或氨基酸残基的化学变化,例如生物素化,乙酰化,PEG化,氨基、SH或羧基基团的化学变化。
上文已概述的根据本发明的融合蛋白由以下组成:
(a)根据本发明的多肽、片段和/或衍生物;以及
(b)与所述多肽、片段和/或衍生物在N端或C端融合的肽段;以及任选地
(c)在N端或C端的标签,诸如His6标签、Strep标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签或本领域公知的其他标签。
在肽段与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物在C端融合的情况下,该融合蛋白优选在N端包含额外的标签。在本发明特别优选的实施方案中,所述肽段与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物在N端融合。在所述融合蛋白包含额外标签时,所述标签优选在C端。
如上所述的融合蛋白的两个或三个组分分别可通过额外的氨基酸残基彼此相连,例如这是由于克隆的原因。此外,肽段可通过额外的氨基酸残基连接至融合蛋白的起始甲硫氨酸残基。所述额外的氨基酸残基可由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外氨基酸残基组成。在本发明优选的实施方案中,所述肽段通过额外的氨基酸残基Gly-Ser或Gly-Gly-Ser与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物相连。连接起始甲硫氨酸残基和肽段的额外氨基酸残基优选为Gly-Ser。在所述融合蛋白还包含标签的情况下,根据本发明的多肽、片段和/或衍生物优选通过额外的氨基酸残基Leu-Glu或Lys-Gly与所述标签连接。
以下表格例示了根据本发明特别优选的融合蛋白的上述组装,在第一列中列出,其在N端以第二列中的甲硫氨酸残基开始,并且在C端以最后一列中的任选的标签结束。
本发明还涉及编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的分离的核酸分子。根据本发明的特别优选的核酸分子包含根据SEQIDNO:2、3、48、89或101的核酸序列。本发明还涉及包含根据本发明的核酸分子的载体。所述载体可提供根据本发明的所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的组成型或诱导型表达。
本发明还涉及用于从微生物获得所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的方法,如经遗传修饰的合适的宿主细胞,其表达所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白。所述宿主细胞可为微生物如细菌或酵母,或者动物细胞例如哺乳动物细胞特别是人细胞。在本发明的一个实施方案中,所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。宿主可仅由于生物技术上的原因选取,例如产量、溶解度、成本等,但也可从医药的观点来选取,例如,非病理性细菌或酵母或人细胞。本发明的另一个方面涉及用于遗传转化合适的宿主细胞以获得本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的表达的方法,其中所述宿主细胞是通过将编码所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的遗传物质引入所述宿主细胞,并通过本领域技术人员众所公知的遗传工程方法获得其翻译和表达来遗传修饰的。
在另一个方面本发明涉及组合物,优选药物组合物,其包含根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或经下述核酸分子或载体转化的宿主,所述核酸分子或载体包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。
在本发明优选实施方案中,所述组合物包含其他的试剂,其渗透革兰氏阴性细菌的外膜,如金属螯合剂例如EDTA、TRIS、乳酸、乳铁蛋白、多粘菌素、柠檬酸和/或其他如Vaara(Agentsthatincreasethepermeabilityoftheoutermembrane.VaaraM.MicrobiolRev.1992Sep;56(3):395-441)所述的物质。还优选的是包含上述提及的渗透剂的组合的组合物。特别优选的是包含约10μM至约100mMEDTA、更优选约50μM至约10mMEDTA、更优选约0.5mM至约10mMEDTA、更优选约0.5mM至约2mMEDTA、更优选约0.5mM至约1mMEDTA的组合物。还优选包含约0.5mM至约2mMEDTA,更优选约1mMEDTA以及另外约10至约100mMTRIS的组合物。
本发明还涉及用作药物的根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或经包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主。在其他方面,本发明涉及根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或经包含下述核酸分子的载体转化的宿主在制备用于治疗和/或预防与病原性革兰氏阴性细菌相关的病症、疾病或病状中的用途,所述核酸分子包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。具体而言,待治疗和/或预防的病症、疾病或病状可以由下述包含人或动物的病原性菌株的细菌组、科、属或种的革兰氏阴性细菌引起,如肠杆菌科(埃希氏菌属(Escherichia)特别是大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属特别是铜绿假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘胺醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibiro)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spriochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌科(Bacteroidaceae)(类杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、卟啉单胞菌(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)、特别是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)。特别的,待治疗和/或预防的病症、疾病或病状可由铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、大肠杆菌和/或鼠伤寒沙门氏菌造成。
本发明还涉及包含根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或经下述核酸转化的宿主的药物,所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。
在其他方面,本发明涉及在需要治疗和/或预防的受试者中治疗病症、疾病或病状的方法,所述方法包括施与所述受试者有效量的根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或有效量的经下述核酸转化的宿主或根据本发明的组合物,所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。所述受试者可为人或动物。
具体而言,所述治疗方法可用于治疗和/或预防由革兰氏阴性细菌特别是上述列举的革兰氏阴性细菌造成的皮肤,软组织,呼吸系统,肺,消化道,眼,耳,牙齿,鼻咽,口,骨,阴道,菌血症(bacteraemia)伤口和/或心内膜炎的感染。
用于本发明的治疗(或预防)方法中的施用剂量和途径取决于待治疗的具体疾病/感染位置。施用途径可例如为经口、局部、鼻咽、肠胃外、静脉内、直肠或任何其他的施用途径。
对于将根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或有效量的经核酸(所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列)转化的宿主或根据本发明的组合物施用于感染位置(或有受感染危险的位置),可使用下述制剂,所述制剂保护活性化合物免受环境影响如蛋白酶、氧化、免疫应答等,直至其抵达感染位置。因此,所述制剂可为胶囊、锭剂、丸剂、栓剂、可注射溶液或任何其他医药上合理的盖仑(galenic)制剂。优选地,所述盖仑制剂可包含合适的载体、稳定剂、调味剂、缓冲剂或其他合适的试剂。例如,对于局部施用,所述制剂可为洗液或硬膏(plaster),对于鼻咽施用所述试剂可为通过喷雾施与鼻部的盐水溶液。
优选地,如果待治疗(或预防)的感染是由多重抗性的细菌菌株,特别是针对一种或多种下述抗生素具有抗性的菌株造成时,将根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白用于医疗,所述抗生素为:链霉素、四环素、头孢噻吩、庆大霉素、头孢噻肟、头孢菌素、头孢他啶或亚胺培南。此外,根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可通过将其与常规的抗细菌剂如抗生素、硫醚抗生素、细菌素或细胞内溶素等组合给药而用于治疗方法。
本发明还涉及包含一个或多个隔室的药物包(pharmaceuticalpack),其中至少一个隔室包含一种或多种根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或一种或多种经下述核酸转化的宿主或根据本发明的组合物,所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面本发明涉及制备药物组合物的方法,所述方法包括将可药用的稀释剂、赋形剂或载体与一种或多种根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或一种或多种经下述核酸转化的宿主混合,所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。
在甚至其他方面,本发明的组合物是美容组合物。几种细菌菌种可导致患者的身体暴露于环境的表面如皮肤的刺激。为了预防此类刺激或者为了消除所述细菌病原体的次要病候(minormanifestation),可使用特定的美容制备物,其包含足够量的根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白以降解已经存在或新沉降的病原性革兰氏阴性细菌。
在其他方面,本发明涉及根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白作为诊断手段用于医药、食品或饲料或环境诊断,特别是作为诊断手段用于诊断细菌感染,特别是由革兰氏阴性细菌造成的细菌感染。在此方面,根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可用作工具以特异性降解病原性细菌,特别是革兰氏阴性病原性细菌。通过根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白使得细菌细胞降解可通过添加去污剂如TritonX-100或其他减弱细菌细胞包膜(envelope)的添加剂如多粘菌素B来支持。需要特定细胞降解作为后续对细菌进行特异性检测的起始步骤,所述检测使用基于核酸的方法如PCR、核酸杂交或NASBA(基于核酸序列的扩增),免疫方法如IMS、免疫荧光或ELISA技术,或其他依赖于细菌细胞的细胞成分的方法如使用对独特细菌组或种具有特异性的酶测定法(例如,β-半乳糖苷酶之于肠细菌,凝固酶之于凝固酶阳性菌株)。
在其他方面,本发明涉及根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白用于处理或防止革兰氏阴性细菌污染食品、食品加工装置、食品加工厂、与食品接触的表面如架子和食品储藏区域以及在所有其他病原性、偶发病原性(facultativepathogenic)或其他不受欢迎的细菌可潜在地感染食品材料情况下,医疗设备和医院和手术中所有类型的表面时。
具体而言,本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可预防性地用作消毒剂。所述消毒剂可在手术之前或之后使用,或者例如在血液透析过程中使用。而且,早产婴儿和免疫妥协的个体,或有假体装置需要的那些受试者,可用根据本发明的融合蛋白治疗。所述治疗可为预防性的,或在急性感染过程中进行。在相同背景下,医院内感染,特别是由抗生素抗性菌株如铜绿假单胞菌(FQRP),不动杆菌属菌种和肠杆菌科如大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属、摩根氏菌属、变形杆菌属、普罗维登斯菌属、沙雷氏菌属和耶尔森氏菌属菌种造成的感染可预防性地或在急性期中用根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白来治疗。因此,根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白还可用作与其他可用于消毒溶液的成分如去污剂、tensid、溶剂、抗生素、硫醚抗生素或细菌素组合使用的消毒剂。
下述实施例解释本发明,但并不视为限定性的。除非另行指出,使用如Sambrock等,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork所述的分子生物学标准方法。
实施例1:恶臭假单胞菌噬菌体OBP的修饰的细胞内溶素变体
具有根据SEQIDNO:1的氨基酸序列OBPgpLYS为332个氨基酸残基的、来源于恶臭假单胞菌噬菌体OBP的模块性细胞内溶素,其具有推定的N端肽聚糖结合结构域和C端催化壳多糖酶结构域。与具有根据SEQIDNO:1的氨基酸序列的OBPgpLYS相比,具有根据SEQIDNO:47的氨基酸序列的OBPgpLYS包含通过额外氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)与C端相连的额外的C端His6标签。
将纯化的噬菌体OBP基因组DNA用作模板用于在用Pfu聚合酶(Fermentas,Ontario,Canada)的标准PCR反应中使用下述PCR参数扩增OBPgpLYS的开放阅读框(ORF):
因此,使用标准5′引物(5’ATGAAAAATAGCGAGAAGAAT3’(SEQIDNO:44))和标准的3′引物(5’AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT3’(SEQIDNO:45))。为了用编码聚阳离子9聚物肽Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-(SEQIDNO:20)的基因片段延伸编码OBPgpLYS的ORF的5’端,应用了用延伸的5’引物(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAAATAGCGAGAAGAAT3’(SEQIDNO:46))和根据SEQIDNO:45的标准的3’引物进行的补尾PCR(tailPCR)(用与上述标准PCR相同的参数)。通过遵循生产商的TA克隆实验方案将原始的未经修饰的OBPgpLYSPCR片段和经延伸的片段均连接于pEXP5CT/TOPO表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。
具有SEQIDNO:47的氨基酸序列的OBPgpLYS和具有SEQIDNO:49的氨基酸序列的PKOBPgpLYS的重组表达是在指数生长的大肠杆菌BL21(λDE3)pLysS细胞(Invitrogen)中在用1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)在37℃诱导4小时之后进行的。两个蛋白均通过Ni2+亲和层析(AktaFPLC,GEHealthcare)使用C端6xHis标签纯化,其由pEXP5CT/TOPO表达载体编码。
Ni2+亲和层析以后述四个步骤进行,均为室温:
1.用10个柱体积的洗涤缓冲液(60mM咪唑,0.5mMNaCl和20mMNaH2PO4-NaOH,pH7.4)以0.5ml/分钟的流速平衡HistrapHP1ml柱(GEHealthcare)。
2.将总裂解液(包含所需的细胞内溶素)以0.5ml/分钟的流速上样于HistrapHP1ml柱。
3.用15个柱体积的洗涤缓冲液以1ml/分钟的流速洗涤柱。
4.用10个柱体积的洗脱缓冲液(500mM咪唑,5mMNaCl和20mMNaH2PO4-NaOH,pH7.4)以0.5ml/分钟的流速从柱洗脱结合的细胞内溶素。
每升大肠杆菌表达培养物的两种纯化重组蛋白的总产量示于表1。值是通过在280nm波长的分光光度法测量蛋白质浓度和纯化的储液的总体积来确定的。在洗脱缓冲液(20mMNaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5MNaCl;500mM咪唑)中,分别由OBPgpLYS和PKOBPgpLYS组成的纯化的储液如在SDS-PAGE凝胶上显影确定为至少为90%纯的。
表1-每升大肠杆菌表达培养物中纯化的重组OBPgpLYS细胞内溶素及其PK-修饰的PKOBPgpLYS的产量
为了确定根据SEQIDNO:47的细胞内溶素OBPgpLYS和根据SEQIDNO:49的PKOBPgpLYS的抗革兰氏阴性的谱,用1.315μM每一种细胞内溶素与0.5mMEDTA的组合对临床多重抗性铜绿假单胞菌菌株Br667、恶臭假单胞菌G1(噬菌体OBP的宿主)以及多种其他革兰氏阴性病原体(铜绿假单胞菌PAO1p、铜绿假单胞菌Br667、恶臭假单胞菌G1、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、大肠杆菌WK6和鼠伤寒沙门氏菌)进行测试(参见表3)。将指数生长的细菌细胞(OD600nm为0.6)稀释100倍至每种菌株约106个细胞/ml的最终密度,并用未修饰的细胞内溶素OBPgpLYS(SEQIDNO:47)和修饰的细胞内溶素PKOBPgpLYS(SEQIDNO:49)各与或不与0.5mMEDTA的组合在室温不振荡条件下温育30分钟。对于温育,将细胞内溶素分别用于缓冲液(20mMNaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5MNaCl;0.5M咪唑)中,并在1.313μM的细胞内溶素终浓度下进行温育。作为对照,还将每种菌株用0.5mMEDTA(与上述相同的缓冲液中)但无细胞内溶素条件下温育30分钟。在温育之后,将细胞悬液稀释三次(分别为105-104-103个细胞/ml),并将100μl的每一稀释物铺板于LB培养基。在37℃的过夜温育之后对残余的菌落进行计数。基于计数的细胞数,抗细菌活性计算为以对数单位表示的相对失活(=log10N0/Ni,其中N0=未处理的细胞数而Ni=经处理的细胞数,均在温育后计数)(表2)。所有的样品进行三次重复实验。表示为平均值+/-标准偏差。观察到的最大减少取决于10个细胞/ml的检测水平和起始的细胞密度。
表2-在有或没有EDTA-Na2的条件下未经修饰的细胞内溶素(OBPgpLYS)及其经修饰的细胞内溶素变体(PKOBPgpLYS)对不同的指数生长的革兰氏阴性菌种的抗细菌活性,用对数单位表示。
尽管OBPgpLYS处理的全局效力具有菌种依存性,表2的结果显示PKOBPgpLYS与未经修饰的OBPgpLYS相比对所有测试的细菌菌种具有额外的效果,无论0.5mMEDTA是否存在。对于假单胞菌属和伯克霍尔德氏菌属菌种,观察到PKOBPgpLYS活性与EDTA具有明显的协同作用。
表3-使用的革兰氏阴性菌株列表
*PirnayJP,DeVosD,CochezC,BilocqF,PirsonJ,StruelensM,DuinslaegerL,CornelisP,ZiziM,VanderkelenA.(2003).MolecularepidemiologyofPseudomonasaeruginosacolonizationinaburnunit:persistenceofamultidrug-resistantcloneandasilversulfadiazine-resistantclone.JClinMicrobiol.,41(3):1192-1202.
**StateResearchInstituteforGeneticsandSelectionofIndustrialMicroorganisms,Moscow113545,1stDorozhniiprojezd,1,Russia
***Afd.Experiment.Laboratoriumgeneesk.,UZHerestraat49-bus7003,3000Leuven,Belgium
****STANSSENS,P.,OPSOMER,C.,MCKEOWNY,M.,KRAMER,W.,ZABEAU,M.andFRITZ,H.-J.(1989).Efficientoligonucleotide-directedconstructionofmutationsinexpressionvectorsbythegappedduplexDNAmethodusingalternatingselectablemarkers.NucleiCAcidsResearch17,4441-4454.
*****Centr.Levensmidd.-&Microb.Technol.,KasteelparkArenberg23-bus2457,3001Heverlee,Belgium
实施例2:不同EDTA浓度对OBPgpLYS和PKOBPgpLYS抗细菌活性
的作用
为了确定EDTA对未经修饰的和经修饰的细胞内溶素的抗细菌活性的影响,使用不同浓度的EDTA和细胞内溶素测试了未经修饰的OBPgpLYS细胞内溶素(SEQIDNO:47)和PKOBPgpLYS细胞内溶素(SEQIDNO:49)对铜绿假单胞菌PAO1p细胞(PirnayJP等,JClinMicrobiol.,41(3):1192-1202(2003))的抗细菌活性。将指数生长的细菌细胞(OD600nm为0.6)稀释100倍至约106/ml的最终密度,并用未经修饰的细胞内溶素OBPgpLYS(SEQIDNO:47)和经修饰的细胞内溶素PKOBPgpLYS(SEQIDNO:49)在室温不振荡条件下温育30分钟。对于温育,将细胞内溶素分别以最终细胞内溶素浓度0.013μM、0.131μM和1.315μM用于缓冲液(20mMNaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5MNaCl;0.5M咪唑)中。从而,使用下述不同的EDTA浓度:0mM、0.05mM、0.5mM和10mM。作为对照,将一个样品不用细胞内溶素,代之以添加缓冲液(20mMNaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5MNaCl;0.5M咪唑)也温育30分钟。在温育之后,将细胞悬液稀释三次(分别为105-104-103个细胞/ml),并将100μl的每个稀释物铺板于LB培养基。在37℃的过夜温育之后对残余的菌落进行计数。基于计数的细胞数,抗细菌活性计算为以对数单位表示的相对失活(=log10N0/Ni,其中N0=未处理的细胞数而Ni=经处理的细胞数,均在温育后计数)(表4)。所有的样品进行三次重复实验。表示为平均值+/-标准偏差。观察到的最大减少(5.69对数单位)取决于10个细胞/ml的检测水平和起始的细胞密度。“Δ”给出了相应的OBPgpLYS和PKOBPgpLYS样品之间活性的差异。
表4-未经修饰的细胞内溶素(OBPgpLYS)及其修饰的细胞内溶素变体(PKOBPgpLYS)与不同EDTA-Na2浓度的组合对指数生长的铜绿假单胞菌PAO1p细胞的抗微生物活性,以对数单位表示
如表4所示,未经修饰的细胞内溶素OBPgpLYS与阴性对照相比显著减少了细胞数,其中对于1.315μM减少了超过2.5对数单位,而对于0.013μM,为+/-1对数单位。修饰的细胞内溶素PKOBPgpLYS导致指数生长的PAO1p细胞额外的0.5个对数单位的减少。观察到的抗细菌作用可通过将PKOBPgpLYS与外膜渗透剂EDTA-Na2以0.5和10mMEDTA的浓度组合来增加至多达5.69对数单位的减少(低于检测水平)。未修饰的OBPgpLYS和PK修饰的OBPgpLYS之间活性的差异随着添加的细胞内溶素的量的升高(从0.013至1.315μM细胞内溶素)而增加。
实施例3:用各种肽段在细胞内溶素N端修饰的OBPgpLYS衍生物的克
隆、表达和纯化
根据SEQIDNO:86的OBPgpLYS衍生物是来源于恶臭假单胞菌噬菌体OBP的模块性细胞内溶素,其具有N端肽聚糖结合结构域和C端催化结构域。该OBPgpLYS衍生物由根据SEQIDNO:101的核酸分子编码。将纯化的质粒DNA(参见实施例1)用于产生根据SEQIDNO:101的核酸分子,所述核酸分子在其5’端具有BamHI(5′-GGATCC-3′)限制性位点,且在该核酸分子的3’端具有XhoI(5′-CTCGAG-3′)限制性位点。
以下表5中的肽段用于与细胞内溶素OBPgpLYS衍生物产生融合蛋白。得到的融合蛋白也在表5中列出。
表5:用于产生特定融合蛋白的肽段和它们各自的核酸序列
合成地产生编码各肽段的核酸分子,使该核酸分子的5’端具有NdeI(5′-CATATG-3′)限制性位点,并使该核酸分子的3’端具有BamHI(5′-GGATCC-3′)限制性位点。
通过应用标准克隆技术连接至少两个核酸分子从而构建融合蛋白,所述标准克隆技术例如描述于Sambrook等.2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual。因此,在应用相应限制性酶NdeI和BamHI的消化中切割编码肽段的核酸分子。随后,将经切割的编码肽段的核酸连接至pET21b表达载体(Novagen,Darmstadt,Germany)中,其中所述载体在之前也已用相应的限制性酶NdeI和BamH切割过。
此后,在应用限制性酶BamHI和XhoI的消化中切割编码细胞内溶素OBPgpLYS衍生物的核酸分子,从而使得内溶素可连接至pET21b表达载体(Novagen,Darmstadt,Germany)中。
因此,编码肽段的核酸分子连接至相应的载体中,其位于编码细胞内溶素OBPgpLYS衍生物的核酸分子的5’端。而且,编码细胞内溶素OBPgpLYS衍生物的核酸分子也连接至相应质粒中,从而使得编码由6个组氨酸残基组成的His6标签的核酸分子连接在编码内溶素的核酸分子的3’端。
通过DNA测序控制内溶素-肽-融合物的序列,并将正确的克隆转化至大肠杆菌T7ExpresslysY/Iq(NewEnglandBiolabs,Frankfurt,Germany)中用于蛋白表达。
在大肠杆菌T7ExpresslysY/Iq(NewEnglandBiolabs,Frankfurt,Germany)中完成根据SEQIDNO:55、57、63、65、67的融合蛋白的重组表达。使细胞生长直到OD600nm的光密度达到0.5-0.8。然后用0.5mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导融合蛋白表达,且表达在37℃进行了4小时。
通过在4000g离心15分钟来收获细胞,并通过在冰上声裂破坏。通过离心(Sorvall,SS34,30min,15000rpm)分离大肠杆菌粗提取物的可溶性和不溶性级分。所有蛋白均通过Ni2+亲和层析(FPLC,GEHealthcare)使用C端6xHis标签纯化,其由pET21b载体编码。
Ni2+亲和层析以后述四个步骤进行,均为室温:
1.用多至10个柱体积的洗涤缓冲液(20mM咪唑,1MNaCl和20mMHepes,pH7.4)以3-5ml/分钟的流速平衡HistrapHF5ml柱(GEHealthcare)。
2.将总裂解液(包含所需的融合蛋白)以3-5ml/分钟的流速上样于HistrapFF5ml柱。
3.用多达10个柱体积的洗涤缓冲液洗涤柱以移除未结合的样本,随后为用10%洗脱缓冲液(500mM咪唑,0.5MNaCl和20mMHepes,pH7.4)以3-5ml/分钟的第二洗涤步骤。
4.用4个柱体积的洗脱缓冲液(500mM咪唑,0.5MNaCl和20mMHepes,pH7.4)的至100%的线性梯度以3-5ml/分钟的流速从柱中洗脱结合的融合蛋白。
在洗脱缓冲液(pH7.4的20mMHepes;0.5MNaCl;500mM咪唑)中的纯化的融合蛋白储液至少为60%纯的,如SDS-PAGE凝胶上显影确定的那样(数据未显示)。
实施例4:用各种肽段在N端修饰的细胞内溶素OBPgpLYS衍生物的抗
微生物活性
将鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)DSMZ30007和铜绿假单胞菌PAO1p细胞(烧伤分离物,QueenAstridHospital,Brussels;PirnayJP等(2003),http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12624051?ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSumJClinMicrobiol.,41(3):1192-1202)用作测试菌株。将过夜培养物在新鲜LB培养基中稀释10倍,并使其生长至OD600=0.6。将培养物离心下来,并在稀释缓冲液(10mMHEPES,0.5mMEDTA;pH7.4)中稀释10倍。用每一种10μg未透析的融合蛋白在室温下温育细菌,所述融合蛋白的终浓度是在缓冲液(20mMNaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5MNaCl;0.5M咪唑)中100μg/ml。1小时后,在PBS中制得细胞系列稀释,并铺板在LB上。此外,还应用缓冲液(20mMNaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5MNaCl;0.5M咪唑)铺板阴性对照。在37℃的过夜温育之后对残余的菌落进行计数。基于计数的细胞数,作为对数单位(=log10N0/Ni,其中N0=未处理的细胞数而Ni=经处理的细胞数)计算抗细菌活性(表5)。所有的样品均重复至少4次。
表6:用各种肽段修饰的OBPgpLYS衍生物针对革兰氏阴性菌的抗微生物活性
缩写:+:1个对数单位;++:2-3个对数单位;+++:4或更多个对数单位;未测定的意思是这一菌株未用相应的融合蛋白测试。
表6中没有任何标签和接头的融合蛋白也用上述的活性测试法进行了测试。它们均显示出针对表6中所用细菌菌株的抗微生物活性。
实施例5:与恶臭假单胞菌噬菌体OBP的细胞内溶素融合的N-端抗细
菌肽
使恶臭假单胞菌噬菌体OBP的模块性细胞内溶素OBPgpLys衍生物N端融合于一系列天然抗细菌肽标签(表7),以便于研究其抗革兰氏阴性菌活性。
表7:与OBPgpLYS衍生物融合的抗菌肽标签列表
*Matthews,B.W.andRemington,S.J.(1974).ThethreedimensionalstructureofthelyozymefrombacteriophageT4.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,71:4178-4182
**InYupPark,ChanBaePark,MiSunKim,SunChangKim(1998).ParasinI,anantimicrobialpeptidederivedfromhistoneH2Ainthecatcsh,Parasilurusasotus.FEBSLetters437258-262
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OBPgpLys衍生物的标签修饰方法
除了五肽标签外,所有其他的抗细菌肽标签均应用例如Berrow等2007年描述的连接不依赖性克隆(LigationIndependentCloning,LIC)的修改版融合至编码OBPgpLYS衍生物的ORF中。此前,通过应用特异设计的5’引物(5’-GGAATGGGGAGCTCCTCCAAAAATAGCGAGAAG-3’;SEQIDNO:102)和标准OBPgpLys衍生物反向引物(5’-AACTATTCCGTGTGCTTTCTTTGT-3’;SEQIDNO:103)对纯的噬菌体OBP基因组DNA进行加尾PCR,从而将独特的Ecl136II限制性位点插入到WT细胞内溶素基因之前。然后按照生产商的TA克隆方案,将这一延伸的片段连接至pEXP5CT/TOPO表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。在Ecl136II限制性消化当中切割纯的质粒一次,并将杂交的肽表达盒(通过引物对杂交而产生,参见表8)插入到经切割的质粒当中,无需连接步骤(LIC)。对于N端五肽标签融合,应用编码这一五肽的延伸的5’引物(5’-ATGGGATCCTTCTTCGTAGCACCGGGCTCCTCCAAAAATAGCGAGAAG-3’;SEQIDNO:104)和标准的OBPgpLys衍生物反向引物(5’-AACTATTCCGTGTGCTTTCTTTGT-3’;SEQIDNO:103)对噬菌体OBP基因组DNA进行加尾PCR。在将构建物引入合适的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株之前,通过测序分析证实了表达载体中片段的正确插入。
表8:用于将抗细菌肽标签与OBPgpLys衍生物的编码ORF杂交所使用的引物对
经修饰的OBPgpLYS衍生物融合变体的大规模重组表达
在溶原性肉汤(LysogenyBroth;LB)中,在应用1mM异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷诱导的、指数生长中的细胞(OD600nm=0.6)中进行表达。例如温度、时间和表达菌株的表达参数根据蛋白特异性基础而不同,以便于优化经修饰的细胞内溶素的可溶解表达水平(参见表9)。
为了进行纯化,从表达培养物(500-600ml)中收获细胞(4500rpm,30min,4℃),并将其重悬于1/25体积的裂解缓冲液(10mM咪唑,20mMNaH2PO4,0.5MNaCl,pH7.4)中。将这一悬浮液冷冻/解冻3次,然后进行声处理(8x30s,变幅(amplitude)40%,在VibraCellTM,Sonics,Dandurry,CT,USA上进行),并过滤通过0.45和0.22μmDurapore膜滤器(Millipore,Billerica,MA,USA)。根据生产商的说明,应用Ni2+亲和层析(HisTrapHP1ml柱,GEHealthcare,Buckinghamshire,UK),通过一步法完成带His-标签的融合蛋白的纯化。Ni2+亲和层析以后述四个步骤进行,均为室温:
1.用10个柱体积的洗涤缓冲液(60mM咪唑,0.5mMNaCl和20mMNaH2PO4-NaOH,pH7.4)以0.5ml/分钟的流速平衡HistrapHP1ml柱(GEHealthcare)。
2.将总裂解液(包含所需的细胞内溶素)以0.5ml/分钟的流速上样于HistrapHP1ml柱。
3.用15个柱体积的洗涤缓冲液以1ml/分钟的流速洗涤柱。
4.用10个柱体积的洗脱缓冲液(500mM咪唑,5mMNaCl和20mMNaH2PO4-NaOH,pH7.4)以0.5ml/分钟的流速从柱洗脱结合的细胞内溶素。
洗涤缓冲液包含低的咪唑浓度,其根据蛋白质特定基础而不同,以确保更高的蛋白质纯度(参见表9)。每升大肠杆菌表达培养物的重组蛋白质总产量也显示于表3当中。值是通过在280nm波长分光光度法测量的蛋白质浓度和纯化的储液的总体积来确定的。如SDS-PAGE凝胶上显影确定的那样,纯化的储液至少为60%纯的。
表9:N端修饰的细胞内溶素的表达参数和每升表达培养物获得的蛋白质产量。RP=大肠杆菌BL21(DE3)pLysSCodonminRP菌株,RIL=大肠杆菌BL21(DE3)pLysSCodonPlusRIL菌株
经修饰的OBPgpLys衍生物变体的体外抗细菌活性和宿主范围
将指数生长的革兰氏阴性细菌细胞(OD600nm=0.6)稀释100倍至约106个细胞/ml的最终密度,并用不同的经修饰的OBPgpLYS衍生物变体在室温不振荡条件下温育30分钟。在温育之后,将细胞悬液稀释三次(分别为105-104-103个细胞/ml),并将100μl的每一稀释物铺板于LB培养基。在37℃的过夜温育之后对残余的菌落进行计数。基于计数的细胞数,抗细菌活性计算为以对数单位表示的相对失活(=log10N0/Ni,其中N0=未处理的细胞数而Ni=经处理的细胞数,均在温育后计数)(表10)。所有的样品进行三次重复实验。表示为平均值+/-标准偏差。
表10:不同的经修饰的OBPgpLYS衍生物变体与0.5mMEDTA对一系列指数生长的革兰氏阴性种的体外抗细菌活性。初始密度为106细胞/ml,并且在RT下无振动温育30分钟。除Artiys1-OBPgplys(800nM)之外,蛋白质浓度为1500nM。
缩写:+:约0.5log;++:1-2log;+++:3-4或更多个log;未测定的意思是未用相应的融合蛋白测试这一菌株。
Claims (21)
1.多肽,其选自根据SEQIDNO:1、47、86、87、88的氨基酸序列。
2.融合蛋白,其由根据权利要求1的多肽和在N端或C端与所述多肽融合的肽段,以及任选的标签组成,其中所述肽段选自根据SEQIDNO:12、15、17或20的氨基酸序列,并且直接连接于或者通过1、2、或3个额外氨基酸残基连接于所述多肽。
3.根据权利要求2的融合蛋白,其中将所述肽段与所述多肽连接的额外氨基酸残基为Gly-Ser或Gly-Gly-Ser。
4.根据权利要求2或3的融合蛋白,其中所述多肽通过额外的氨基酸残基Leu-Glu或Lys-Gly与所述标签连接。
5.根据权利要求2的融合蛋白,其中所述融合蛋白选自根据SEQIDNO:43、49、62-67或115-116的氨基酸序列。
6.分离的核酸分子,其编码权利要求1的多肽。
7.根据权利要求6的分离的核酸分子,其中所述被编码的多肽还包含标签。
8.根据权利要求6的分离的核酸分子,其中所述被编码的多肽包含His6-标签。
9.根据权利要求6的分离的核酸分子,其中所述被编码的多肽选自根据SEQIDNO:47或88的氨基酸序列。
10.一种分离的核酸分子,其编码权利要求2的融合蛋白。
11.根据权利要求10的分离的核酸分子,其中所述被编码的多肽选自根据SEQIDNO:47或88的氨基酸序列。
12.根据权利要求10的分离的核酸分子,其中所述被编码的融合蛋白选自根据SEQIDNO:43、49、62-67或115-116的氨基酸序列。
13.载体,其包含根据权利要求6-12中任一项的核酸分子。
14.宿主细胞,其包含根据权利要求6-12中任一项的核酸分子。
15.宿主细胞,其包含根据权利要求13的载体。
16.根据权利要求1的多肽或根据权利要求2-5中任一项的融合蛋白在制备用于人或动物的药物中的用途,其中所述药物用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染。
17.根据权利要求1的多肽或根据权利要求2-5中任一项的融合蛋白用于处理或预防食品、食品加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗设备、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染的非治疗目的的用途。
18.药物组合物,其包含根据权利要求1的多肽或根据权利要求2-5中任一项的融合蛋白。
19.根据权利要求1的多肽或根据权利要求2-5中任一项的融合蛋白用作食品或化妆品的抗微生物剂、用作消毒剂或用于环境领域中的非治疗目的的用途。
20.根据权利要求1的多肽或根据权利要求2-5中任一项的融合蛋白在制备医疗诊断中的诊断物质中的用途。
21.根据权利要求1的多肽或根据权利要求2-5中任一项的融合蛋白在食品或饲料或环境诊断中作为诊断手段的用途。
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