BRPI1015203B1 - Proteína de fusão composta por uma endolisina e uma extensão de peptídeo anfifática, usos da mesma e composição farmacêutica que compreende a dita proteína - Google Patents

Abstract

agentes antlmicrobianos a presente invenção se refere aos agentes antimicrobianos contra bactérias gram-positivas, em particular às proteínas de fusão compostas de uma enzima tendo a atividade de degradação da parede celular de bactérias gram-positivas e uma extensão de peptídeo adicional fundida à enzima no terminal de n ou c. além disso, a presente invenção se refere às moléculas de ácido nucléico que codificam a referida proteína de fusão, vetores compreendendo as referidas moléculas de ácido nucléico e células hospedeiras compreendendo as referidas moléculas de ácido nucléico ou os referidos vetores. além disso, a presente invenção se refere à referida proteína de fusão para uso como um medicamento, em particular para o tratamento ou prevenção de infecções por bactérias gram-positivas, como meios de diagnóstico ou como substâncias cosméticas. a presente invenção também se refere ao tratamento ou prevenção de contaminação por bactérias gram-positivas de gêneros alimentícios, de equipamento de processamento de comida, de usinas de processamento de comida, de superfícies que entram em contato com os gêneros alimentícios, de dispositivos médicos, de superfícies em hospitais e cirurgias. além disso, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo a referida proteína de fusão.

Description

[001]A presente invenção se refere a agentes antimicrobianos contra bactérias Gram-positivas, em particular a proteínas de fusão compostas de uma enzima tendo a atividade de degradação da parede celular de bactérias Gram-positivas e uma extensão de peptídeo adicional fundido à enzima no N- ou C-terminal. Além disso, a presente invenção se refere às moléculas de ácido nucleico que codificam a referida proteína de fusão, vetores compreendendo as referidas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras compreendendo as referidas moléculas de ácido nucleico ou os referidos vetores. Além disso, a presente invenção se refere à referida proteína de fusão para uso como um medicamento, em particular para o tratamento ou prevenção de infecções por bactérias Gram-positivas, como meios de diagnóstico ou como substância cosmética. A presente invenção também se refere ao tratamento ou prevenção de contaminação por bactérias Gram-positivas de gêneros alimentícios, de equipamento de processamento de comida, de usinas de processamento de comida, de superfícies entrando em contato com os gêneros alimentícios, de dispositivos médicos, de superfícies em hospitais e cirurgias. Além disso, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo a referida proteína de fusão.

[002]Em contraste com bactérias Gram-negativas, as bactérias Gram-positi- vas não possuem uma membrana externa. A membrana citoplásmica é circundada por uma camada de até 25 nm de espessura de peptidoglicano (que é somente até 5 nm para bactérias Gram-negativas) que forma a parede celular. O propósito principal da parede celular de Gram-positivas é manter a forma bacteriana e contrapor-se a pressão de célula bacteriana interna. Peptidoglicano, ou mureína, é um polímero consistindo em açúcares e aminoácidos. O componente de açúcar consiste em alternar resíduos de N-acetilglicosamina β-(1,4) ligados e resíduos de ácido N-acetilmurâmico compõem os componentes de açúcar. Uma cadeia de peptídeo de três a cinco ami- noácidos está presa ao ácido N-acetilmurâmico. A cadeia de peptídeo pode se reticulada para a cadeia de peptídeo de outra cepa formando uma camada semelhante à malha 3D. A cadeia de peptídeo pode conter resíduos de aminoácido D e L e a composição pode variar para diferentes bactérias.

[003]Uma situação especial é encontrada em caso de Micobactérias que são geralmente consideradas Gram-positivas. As micobactérias foram recentemente mostradas possuir uma membrana celular externa. Todas as micobactérias compartilham uma parede celular espessa característica, que é hidrofóbica, cerosa, e rica em ácidos micólicos/micolatos. A parede celular consiste na camada de micolato hidrofóbico e uma camada de peptidoglicano mantida junto por arabinogalactan, um polissacarídeo. Para superar a parede celular espessa de micobactérias uma ação combinada dos novos agentes antimicrobianos com uma quitinase ou uma proteína similar para romper a camada de polissacarídeo, pode ser necessária.

[004]Vários tipos de agentes tendo atividade bacteriana ou bacteriostática são conhecidos, por exemplo, antibióticos, endolisinas, peptídeos antimicrobianos, e de- fensinas. O aumento da resistência microbiana aos antibióticos, entretanto, está criando dificuldades no tratamento cada vez mais de infecções causadas por bactérias. Dificuldades particulares surgem com infecções causadas por bactérias Gram-positi- vas como Staphylococcus aureus, Enterococci, Streptococci, Listeria monocytogenes e Clostridium difficile, especialmente com, por exemplo, Staphylococcus aureus resistente a meticilina e Enterococci resistente à vancomicina.

[005]Endolisinas são peptidoglicano hidrolases codificadas por bacteriófagos (ou vírus bacteriano). Elas são sintetizadas durante a expressão de gene tardia no ciclo lítico de multiplicação de fago e media a liberação de vírions progênies de células infectadas através de degradação do peptidoglicano bacteriano. Elas são ou β(1,4)- glicosilases (lisozimas), transglicosilases, amidases ou endopeptidases. A aplicação antimicrobiana de endolisinas já foi sugerida em 1991 por Gasson (GB2243611). Embora a capacidade de matar de endolisinas tenha sido conhecida durante um longo tempo, o uso dessas enzimas como antibacterianos foi ignorado devido ao sucesso e dominância de antibióticos. Somente após o aparecimento de múltiplas bactérias re-sistentes antibióticas este simples conceito de combater patógenos humanos com endolisinas recebeu interesse. Uma necessidade premente de desenvolver classes totalmente novas de agentes antibacterianos surgiu e endolisinas utilizadas como 'enzi- bióticos' - um termo híbrido de 'enzimas' e 'antibióticos' - perfeitamente atendeu a esta necessidade. Em 2001, Fischetti e colaboradores demonstraram pela primeira vez o potencial terapêutico de endolisina Cl de bacteriófago para estreptococo do grupo A (Nelson e outros, 2001). Portanto, muitas publicações estabeleceram endolisinas como uma alternativa complementar e atrativa para controlar infecções bacteri- anas, particularmente por Bactérias Gram-positivas. Subsequentemente, as endolisinas diferentes contra outros patógenos Gram-positivos tais como Streptococcus pneumoniae (Loeffler e outros, 2001), Bacillus anthracis (Schuch e outros, 2002), S. aga- lactiae (Cheng e outros, 2005) e Staphylococcus aureus (Rashel e outros, 2007) provaram suas eficácias como enzibióticos. Entretanto, sabe-se também que endolisinas podem, sob algumas condições (por exemplo, resistência iônica elevada), criar proto- plasto estável, onde a pressão de célula bacteriana interna não é suficiente para levar a uma explosão de célula. Sob essas condições a parede celular bacteriana pode se regenerar e as bactérias sobreviverão.

[006]Os peptídeos antimicrobianos (AMPs) representam uma ampla faixa de antibióticos de peptídeo codificado por gene curto, catiônico oi anfipático que podem ser encontrados em praticamente todos os organismos. Diferentes AMPs exibem diferentes propriedades, e muitos peptídeos nessa classe estão sendo intensivamente pesquisadas não somente como antibióticos, porém também como modelos para pep- tídeos de penetração de célula. Apesar do compartilhamento de algumas características comuns (por exemplo, catiônicoidade, anfipaticidade e tamanho curto), as sequências AMP variam grandemente, e pelo menos quatro grupos estruturais (α- hélices, β-folha, estendida e anelada) foram propostos acomodar a diversidade das conformações de AMP observadas. Do mesmo modo, vários modos de ação como antibióticos foram propostos, e foi mostrado, por exemplo, que o alvo primário de muitos desses peptídeos é a membrana celular ao passo que para outros peptídeos o alvo primário é invasão citoplásmica e rompimento das funções metabólicas do núcleo. AMPs podem se tornar concentrados o suficiente para exibir atividade cooperativa apesar da ausência de ligação alvo específica; por exemplo, formando-se um poro na membrana, como é o caso para a maioria dos AMPs. Entretanto, este fenômeno somente foi observado em modelos de bicamadas de fosfolipídios, e em alguns casos, as concentrações de AMP na membrana que foram tão elevadas quanto uma molécula de peptídeo por seis moléculas de fosfolipídio foram requeridas para que esses eventos ocorressem. Essas concentrações estão próximas de, se não em, saturação de membrana total. Como a concentração inibidora mínima (MIC) para AMPs é tipica-mente na faixa micromolar baixa, ceticismo tem, de modo compreensível, surgido quanto à relevância desses limiares e sua importância in vivo (Melo e outros, Nature reviews, Microbiology, 2009, 245).

[007]As defensinas são uma grande família de peptídeos antimicrobianos ricos em cisteína e arginina, catiônicos, pequenos, encontrados tanto em vertebrados quanto em invertebrados. As defensinas são divididas em cinco grupos de acordo com o padrão de espaçamento de cisteínas: planta, invertebrado, α-, β-, e θ-defensinas. As três últimas são mais geralmente encontradas nos mamíferos. As α-defensinas são proteínas encontradas em neutrófilos e epitélios intestinais. β-defensinas são as mais amplamente distribuídas e são secretadas por leucócitos e células epiteliais de muitos tipos. θ-Defensinas foram raramente encontradas até agora, por exemplo, em leucócitos de macacos rhesus. As defensinas são ativas contra bactérias, fungos e muitos vírus envolvidos e não envolvidos. Entretanto, as concentrações necessárias para morte eficiente de bactérias são mais geralmente elevadas, isto é, a faixa μ-molar. A atividade de muitos peptídeos pode ser limitada na presença de condições de sal fisiológicas, cátions divalentes e soro. Dependendo do teor de resíduos de aminoácido hidrofóbicos as Defensinas também mostram atividade hemolítica.

[008]Desse modo, há uma necessidade de novos agentes antimicrobianos contra bactérias Gram-positivas.

[009]Este objetivo é resolvido pelo material objeto definido nas reivindicações.

[0010]O termo “proteína" como utilizado aqui se refere sinonimamente ao termo “polipeptídeo". O termo “proteína” como utilizado aqui se refere a um polímero linear de resíduos de aminoácido ligados por ligações de peptídeo em uma sequência específica. Os resíduos de aminoácido de uma proteína podem ser modificados por, por exemplo, ligações covalentes de vários grupos tais como carboidratos e fosfato. Outras substâncias podem ser mais livremente associadas com as cadeias de poli- peptídeo, tal como heme ou lipídeo, dando origem às proteínas conjugadas que são também compreendidas pelo termo “proteína” como utilizado aqui. Os vários modos nos quais as cadeias de polipeptídeo dobram foram elucidados, em particular considerando a presença de alfa hélices e folhas pregueadas beta. O termo “proteína” como utilizado aqui se refere a todas as quatro classes de proteínas sendo todas-alfa, todas- beta, alfa/beta e alfa mais beta. Além disso, o termo “proteína” se refere a um com-plexo, sendo que o complexo se refere a um homômero.

[0011]O termo “proteína de fusão" como utilizado aqui se refere a um produto de expressão resultante da fusão de duas sequências de ácido nucleico. Tal proteína pode ser produzida, por exemplo, em sistemas de expressão de DNA recombinantes. Além disso, o termo “proteína de fusão” como utilizado aqui se refere a uma fusão de uma primeira sequência de aminoácido como, por exemplo, uma enzima, com uma segunda ou outra sequência de aminoácido. A segunda ou outra sequência de aminoácido pode definir um domínio ou qualquer tipo de extensão de peptídeo. Preferivelmente, a referida segunda e/ou outra sequência de aminoácido é estrangeira a e não substancialmente homóloga com qualquer domínio da primeira sequência de aminoácido.

[0012]O termo “extensão de peptídeo” como utilizado aqui se refere a qualquer tipo de peptídeo ligado a uma proteína tal como uma enzima.

[0013]O termo “peptídeo” como utilizado aqui se refere a polipeptídeos curtos consistindo em cerca de 2 a cerca de 100 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente de cerca de 4 a cerca de 50 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente a cerca de 5 a 30 resíduos de aminoácido, sendo que o grupo amino de um resíduo de aminoácido é ligado ao grupo carboxila de outro resíduo de aminoácido por uma ligação de peptídeo. Um peptídeo pode ter uma função específica. Um peptídeo pode ser um peptídeo de ocorrência natural ou um peptídeo produzido e sinteticamente designado. O peptídeo pode ser, por exemplo, derivado ou removido de uma proteína nativa por clivagem enzimática ou química, ou pode ser preparado utilizando técnicas de síntese de peptídeo convencionais (por exemplo, síntese de fase sólida) ou técnicas de biologia molecular (veja, Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Os exemplos de peptídeos de ocorrência natural são peptídeos antimicrobianos, defensinas, peptídeos de sushi. Os exemplos de peptídeos sinteticamente produzidos são peptídeos polica- tiônicos, anfifáticos ou hidrofóbico. Um peptídeo no significado da presente invenção não se refere as etiquetas His (His-tags), etiquetas Strep, tiorredoxina ou proteínas de ligação de maltose (MBP) ou similares, que são utilizadas para purificar ou localizar as proteínas.

[0014]O termo “endolisina” como utilizado aqui se refere a uma enzima que é adequada para hidrolisar as paredes celulares bacterianas. “Endolisinas” compreendem de pelo menos um “domínio enzimaticamente ativo” (EAD) tendo pelo menos uma das seguintes atividades: endopeptidase, quitinase, muraminidase tipo T4, mu- raminidase tipo lambda, N-acetil-muramoil-L-alanina-amidase (amidase), muramoil-L- alanina-amidase, muramidase lítica, transglicosilase (C), transglicosilase lítica (M), N- acetil-muramidase, N-acetil-glucosaminidase (lisozima) ou transglicosilases como, por exemplo, KZ144 e EL188. Além disso, as endolisinas podem conter também regiões que são enzimaticamente inativas, e se ligam à parede celular das bactérias hospedeiras, os então chamados CBDs (domínios de ligação de parede celular).

[0015]O termo “CBD” como utilizado aqui se refere ao domínio de ligação de parede celular de uma endolisina. Nas endolisinas que são específicas para bactérias Gram-positivas o CBD é geralmente encontrado no C-terminal, porém pode também ser encontrado no N-terminal ou em outro lugar dentro da proteína. Geralmente os domínios de CBD mediam a ligação da endolisina à parede celular bacteriana, porém, não têm nenhuma atividade enzimática em termos de hidrolisação da parede celular.

[0016]O termo “EAD” como utilizado aqui se refere ao domínio enzimatica- mente ativo de uma endolisina. O EAD é responsável pela hidrolisação de peptidogli- cano bacterianos. Ele exibe pelo menos uma atividade enzimática de uma endolisina. O EAD também pode ser composto de mais do que um módulo enzimaticamente ativo.

[0017]O termo “autolisinas” se refere a enzimas relacionadas com as endolisinas, porém codificadas por bactérias e envolvidas em, por exemplo, divisão celular. Uma visão geral de autolisinas é possível ser encontrada em “Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86”.

[0018]O termo “bacteriocina" como utilizado aqui se refere a substâncias semelhantes à proteína, semelhantes ao polipeptídeo ou semelhantes ao peptídeo que sejam capazes de inibir o crescimento de outras bactérias. Algumas bacteriocinas são capazes de degradar as paredes celulares bacterianas como Lisostafina (degradação de paredes celulares de Staphylococcus), Mutanolisina (degradação das paredes celulares de Streptococcus) e Enterolisina (degradação de paredes celulares de Enterococcus). Preferivelmente, a referida inibição é especificamente por meios de absorção das referidas outras bactérias para receptores específicos da bacteriocina. Em general, as bacteriocinas são produzidas por microrganismos. Entretanto, o termo “bacteriocina” como utilizado aqui se refere tanto a uma forma isolada produzida por um microrganismo ou a uma forma sinteticamente produzida, e se refere também às variantes que substancialmente retêm as atividades de suas bacteriocinas de origem, porém cujas sequências foram alteradas por inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácido.

[0019]O termo, “peptídeo antimicrobiano" (AMP) como utilizado aqui se refere a qualquer peptídeo que tenha atividade microbicida e/ou microbiestática. Desse modo, o termo “peptídeo antimicrobiano” como utilizado aqui se refere em particular a qualquer peptídeo tendo propriedades anti-bacterianas, anti-fúngicas, anti-micóticas, anti-parasíticas, anti-protozoários, anti-virais, anti-infecciosas, anti-infectivas e/ou ger- micidas, algicidas, amoebicidas, microbicidas, bactericidas, fungicidas, parasiticidas, protozoacidas, protozoicidal.

[0020]O termo “defensina" como utilizado aqui se refere a um peptídeo presente nos animais, preferivelmente mamíferos, mais preferivelmente humanos, sendo que a defensina desempenha um papel no sistema de defesa de hospedeiro inato como a destruição de substâncias estrangeiras tais como bactérias infecciosas e/ou vírus infeccioso e/ou fungos. Uma defensina é proteína, peptídeo ou polipeptídeo mi- crobicida e/ou tumoricida de não anticorpo. Os exemplos para "defensinas" são "de- fensinas de mamífero", alfa-defensinas, beta-defensinas, indolicidina e magaininas. O termo “defensinas" como utilizado aqui se refere tanto a uma forma isolada de células animais ou a uma forma sinteticamente produzida, e se refere também aos variantes que substancialmente retém as atividades citotóxicas de suas proteínas de origem, porém cujas sequências foram alteradas por inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácido.

[0021]O termo “peptídeo de sushi” como utilizado aqui se refere às proteínas de controle de complemento (CCP) tendo repetições de consenso curtas. O módulo de sushi de peptídeos de sushi funciona como um domínio de interação de proteína- proteína em muitas proteínas diferentes. Os peptídeos contendo um domínio de Sushi foram mostrados ter atividades antimicrobianas.

[0022]Como utilizado aqui, o termo “peptídeo catiônico" se refere a um peptí- deo tendo resíduos de aminoácido positivamente carregados. Preferivelmente um peptídeo catiônico tem um valor de pKa de 9,0 ou maior. Tipicamente, pelo menos, quatro dos resíduos de aminoácido do peptídeo catiônico podem ser positivamente carregados, por exemplo, lisina ou arginina. "Positivamente carregado" se refere às cadeias laterais dos resíduos de aminoácido que têm uma carga positiva líquida em cerca de condições fisiológicas. Os exemplos de peptídeos catiônicos de ocorrência natural que podem ser recombinantemente produzidos são defensinas, magaininas, melitina e cecropinas.

[0023]O termo “peptídeo policatiônico” como utilizado aqui se refere a um pep- tídeo sinteticamente produzido composto principalmente de resíduos de lisina e/ou arginina.

[0024]O termo “peptídeo anfipático" como utilizado aqui se refere a peptídeos tendo grupos funcionais tanto hidrofílicos quanto hidrofóbicos. Preferivelmente, o termo “peptídeo anfipático” como utilizado aqui se refere a um peptídeo tendo uma disposição definida de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, por exemplo, peptídeos an- fipáticos podem ser, por exemplo, alfa hélice, tendo predominantemente cadeias laterais não polares ao longo de um lado da hélice e resíduos polares ao longo do restante de sua superfície.

[0025]O termo “grupo hidrofóbico" como utilizado aqui se refere a grupos químicos tais como cadeias laterais de aminoácido que são substancialmente insolúveis em água, porém solúveis em uma fase de óleo, com a solubilidade na fase de óleo sendo mais elevada do que na água ou em uma fase aquosa. Na água, os aminoáci- dos tendo uma cadeia lateral hidrofóbica interagem com outro para gerar um ambiente não aquoso. Os exemplos de aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas são ala- nina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, histidina, triptofano e tirosina.

[0026]O termo “deleção” como utilizado aqui se refere à remoção de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos de aminoácido da respectiva sequência inicial.

[0027]O termo “inserção” ou “adição” como utilizado aqui se refere à inserção ou adição de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos de aminoácido à respectiva sequência inicial.

[0028]O termo “substituição” como utilizado aqui se refere à permuta de um resíduo de aminoácido localizado em certa posição para outra diferente.

[0029]A presente invenção se refere a novos agentes antibacterianos contra bactérias Gram-positivas, em particular a proteínas de fusão compostas de uma enzima tendo a atividade de degradação da parede celular de bactérias Gram-positivas e uma extensão de peptídeo adicional fundida à enzima no N- ou C-terminal ou em ambos os terminais.

[0030]As proteínas de fusão de acordo com a presente invenção têm a vantagem que elas podem prevenir a regeneração de protoplastos estáveis e desse modo, prevenir a sobrevivência das bactérias que devem ser eliminadas. A regeneração do protoplasto pelas bactérias ocorre sob algumas condições (por exemplo, resistência iônica elevada), onde a pressão celular bacteriana interna não é suficiente para levar a uma explosão de célula e leva à sobrevivência das bactérias.

[0031]Em um aspecto da presente invenção a enzima tendo a atividade de degradação da parede celular de bactérias Gram-positivas é uma endolisina, autolisina e/ou bacteriocina.

[0032]Em outro aspecto da presente invenção a enzima pode conter também regiões que são enzimaticamente inativas, e se ligam à parede celular das bactérias hospedeiras, os então chamados CBDs (domínios de ligação de parede celular).

[0033]As proteínas de fusão preferidas de acordo com a presente invenção são descritas na SEQ ID NO:63 a 90. As proteínas de fusão de acordo com SEQ ID NO:63 a 90 podem compreender um ou mais resíduos de aminoácido adicionais no N-terminal. Preferivelmente o resíduo de aminoácido adicional é metionina.

[0034]Preferivelmente, a endolisina é codificada por bacteriófagos específicos para bactérias Gram-positivas tais como bactérias Gram-positivas de grupos bacteri- anos, famílias, gêneros ou espécies compreendendo cepas patogênicas para humanos ou animais como listado na seguinte tabela:Tabela 1:I. Phylum ActinobacteriaClasse: ActinobacteridaeOrdem: ActinomycetalesFamílias:Actinomycineae: Actinomycetaceae (Actinomyces, Mobiluncus) Corynebacterineae: Micobactériasceae (Mycobacterium), Nocardiaceae, CorynebacteriaceaeFrankineae: FrankiaceaeMicrococcineae: BrevibacteriaceaePropionibacteriaceae (Propionibacterium)Ordem: BifidobacterialesFamílias:Bifidobacteriaceae (Bifidobacterium, Falcivibrio, Gardnerella)Outras subclasses:Acidimicrobidae, Coriobacteridae, Rubrobacteridae, Sphaerobac- teridaeII. Phylum Firmicutes Classe: BacilliOrdem: Bacillales:Famílias:Bacillaceae (Bacillus), Listeriaceae (Listeria), Staphylococcaceae(Staphylococcus, Gemella, Jeotgalicoccus)Ordem: Lactobacillales:Famílias: Enterococcaceae (Enterococcus), Lactobacillaceae(Lactobacillus, Pediococcus), Leuconostocaceae (Leuconostoc), Streptococcaceae (Lactococcus, Streptococcus) Classe: ClostridiaOrdem: Clostridiales (Clostridium, Peptostreptococcus, Selenomonas)Ordem: HalanaerobialesOrdem: ThermoanaerobacteralesClasse: Tenericutes/MollicutesOrdem: Mycoplasmatales (Mycoplasma, Ureaplasma)Ordem: Entomoplasmatales (Spiroplasma)Ordem: Anaeroplasmatales (Erysipelothrix)Ordem: Acholeplasmatales (Acholeplasma)Ordem: Haloplasmatales (Haloplasma)

[0035]Preferivelmente, a autolisina é codificada por bactérias Gram-positivas tais como bactérias Gram-positivas de grupos, famílias, gêneros ou espécies bacteri- anas compreendendo cepas patogênicas para humanos ou animais com listado na tabela 1.

[0036]Preferivelmente, a bacteriocina é codificada por bactérias Gram-positi- vas tais como bactérias Gram-positivas de grupos, famílias, gêneros, ou espécies bac- terianas compreendendo cepas patogênicas para humanos ou animais como listado na tabela 1.

[0037]A enzima de acordo com a presente invenção tem atividade de degradação de parede celular contra bactérias Gram-positivas de grupos, famílias, gêneros ou espécies bacterianas compreendendo cepas patogênicas para humanos ou animais como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans, Streptococcus equi, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Propio- nibacterium acnes, Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacte- rium diphteriae, Mycoplasma pneumoniae, Actinomyces.

[0038]As endolisinas preferidas são endolisinas de fago de Listeria PlyA118, PlyA500, PlyPSA, PlyA511, PlyP35, PlyP40, fago Staph Phi 11, Phi MR11, LysK, Clostridium perfringens PlyS6, Ply3626, Clostridium difficile: endolisina CD27L, Estrepto- coco: endolisina B30, fago Dp-1 Pal amidase, endolisina C1, endolisina Cpl-1, PlyGBS, Enterococo: PlyV12, Bacillus anthracis: gama endolisina de fago PlyG.

[0039]As autolisinas preferidas são descritas em: Peptidoglicano bacteriano (mureína) hidrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86. Epub 2008 Feb 11. Review. Um exemplo de uma autolisina preferida é a autolisina AtlA.

[0040]As bacteriocinas preferidas são Lisostafina (degradação de paredes celulares de Staphylococcus), Mutanolisina (degradação de paredes celulares de Streptococcus) e Enterolisina (degradação de paredes celulares de Enterococcus).

[0041]Mais preferivelmente, a parte de endolisina é selecionada do grupo consistindo em Cpl-1 de acordo com SEQ ID NO:57, Ply511 de acordo com SEQ ID NO:58, LysK de acordo com SEQ ID NO:59, Lisostafina de acordo com SEQ ID NO:60 e PA6-gp20 de acordo com SEQ ID NO:61.

[0042]Em outra modalidade preferida da presente invenção as endolisinas, autolisinas e bacteriocinas da proteína de fusão de acordo com a presente invenção compreendem modificações e/ou alterações das sequências de aminoácido. Tais alterações e/ou modificações podem compreender mutações tais como deleções, inserções, e adições, substituições ou combinações dos mesmos e/ou alterações químicas dos resíduos de aminoácido, por exemplo, biotinilação, acetilação, pegilação, alterações químicas, dos grupos amino, SH ou carboxila. As referidas endolisinas, autolisinas e bacteriocinas da proteína de fusão de acordo com a presente invenção exibem a atividade lítica da respectiva endolisina tipo selvagem. Entretanto, a referida atividade pode ser igual, mais elevada ou menor como a atividade da respectiva endolisina tipo selvagem. A referida atividade pode ser cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou cerca de 200 % da atividade da respectiva endolisina tipo selvagem ou ainda mais. A atividade pode ser medida por ensaios bem conhecidos na técnica por uma pessoa versada na técnica como, por exemplo, o ensaio de lise de placa ou o ensaio de lise líquido que são, por exemplo, descritos em Briers e outros, J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007) ou Donovan DM, Lardeo M, Foster-Frey J. FEMS Microbiol Lett. 2006 Dec;265(1) ou publicações similares.

[0043]Preferivelmente, a extensão de peptídeo da proteína de fusão de acordo com a invenção é fundida ao N-terminal e/ou ao C-terminal da endolisina. Em uma modalidade preferida particular a referida extensão de peptídeo é somente fundida ao N-terminal da enzima. Em outra modalidade preferida a extensão de peptídeo é somente fundida ao C-terminal da enzima. Entretanto, também são preferidas proteínas de fusão modificadas tendo uma extensão de peptídeo ambas no N-terminal e no C-terminal. As referidas extensões de peptídeo no N-terminal e no C-terminal podem ser extensões de peptídeo iguais ou distintas. A extensão de peptídeo pode ser ligada à enzima por resíduos de aminoácido adicionais, por exemplo, devido às razões de clonagem. Preferivelmente, a referida extensão de peptídeo pode ser ligada à proteína de fusão por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácido adicionais. Em uma modalidade preferida a extensão de peptídeo é ligada à enzima pelos resíduos de aminoácido adicionais glicina e/ou serina (Gly-Ser). Além disso, a extensão de peptídeo da proteína de fusão de acordo com a invenção também compreende aminoácidos adicionais em seu N-terminal. Preferivelmente, a extensão de peptídeo compreende o aminoácido metionina (Met) ou alanina, metionina e glicina (Ala-Met-Gly).

[0044]A extensão de peptídeo da proteína de fusão de acordo com a presente invenção é preferivelmente covalentemente ligada à enzima. Preferivelmente, a referida extensão de peptídeo consiste em pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,97, 98, 99 ou pelo menos 100 resíduos de aminoácido. É especialmente preferida uma extensão de peptídeo compreendendo cerca de 5 a cerca de 100 resíduos de amino- ácido, cerca de 5 a cerca de 50 ou cerca de 5 a cerca de 30 resíduos de aminoácido. Mais preferida é uma extensão de peptídeo compreendendo cerca de 6 a cerca de 42 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 39 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 38 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 31 resíduos de ami- noácido, cerca de 6 a cerca de 25 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 24 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 22 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 21 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 20 resíduos de ami- noácido, cerca de 6 a cerca de 19 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 16 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 14 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 12 resíduos de aminoácido, cerca de 6 a cerca de 10 resíduos de ami- noácido ou cerca de 6 a cerca de 9 resíduos de aminoácido.

[0045]Preferivelmente, a extensão de peptídeo não tem nenhuma etiqueta tal como uma etiqueta His6, etiqueta Strep, etiqueta Avi, etiqueta Myc, etiqueta Gst, etiqueta JS, etiqueta de cisteína, etiqueta FLAG ou outras etiquetas conhecidas na técnica e nenhuma tiorredoxina ou proteínas de ligação de maltose (MBP). Entretanto, a extensão de peptídeo e/ou a endolisina, autolisina ou bacteriocina de acordo com a presente invenção pode compreender, além disso, tal etiqueta ou etiquetas.

[0046]Mais preferivelmente a extensão de peptídeo tem a função de facilitar a explosão da célula bacteriana através da interação da proteína de fusão com: primeiro a camada de peptidoglicano, degradação do peptidoglicano e segundo a membrana citoplásmica, desestabilizando a membrana citoplásmica.

[0047]Em um aspecto da presente invenção a extensão de peptídeo fundida é um peptídeo catiônico, mais preferivelmente um peptídeo policatiônico. Preferivelmente o peptídeo catiônico compreende um ou mais dos resíduos de aminoácido positivamente carregados de lisina, arginina e/ou histidina. Preferivelmente, mais do que cerca de 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou cerca de 100%, dos resíduos de aminoácido no referido peptídeo são resíduos de aminoácido positivamente carregados. Vantajosamente, o peptídeo catiônico é fundido na extremidade do N-Terminal e/ou no C- Terminal da enzima tendo atividade de degradação de parede celular, desse modo realçando a atividade catiônica das proteínas de fusão e/ou agentes antimicrobianos da presente invenção. Em outra modalidade da invenção, o peptídeo catiônico fundido à enzima consiste em pelo menos 5, mais preferivelmente de pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 resíduos de aminoácido. Preferivelmente pelo menos cerca de 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou cerca de 100%, dos resíduos de aminoácido do peptídeo catiônico são ou arginina ou lisina. Em outra modalidade da presente invenção o peptídeo catiônico compreende cerca de 3 a cerca de 50, mais preferivelmente cerca de 5 a cerca de 20, por exemplo cerca de 5 a cerca de 15 resíduos de aminoácido e os referidos resíduos de aminoácido são resíduos de arginina ou lisina. Os peptídeos catiônicos preferidos são descritos em SEQ ID NOs:13 e 14.

[0048]Especialmente preferidas são extensões de peptídeos catiônicos e/ou policatiônicos compreendendo pelo menos um motivo de acordo com SEQ ID NO: 62 (KRKKRK). Em particular, extensões de peptídeo catiônico compreendendo pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 motivos de acordo com SEQ ID NO: 62 (KRKKRK) são preferidos. Mais preferidos são extensões de peptídeo ca- tiônico compreendendo pelo menos um motivo KRK (lys-arg-lys), preferível pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 motivos KRK.

[0049]Em outra modalidade preferida da presente invenção a extensão de peptídeo catiônico compreende além dos resíduos de aminoácido positivamente carregados, em particular resíduos de lisina e/ou arginina, resíduos de aminoácido carregados de modo neutro, em particular resíduos de glicina e/ou serina. Preferidas são extensões de peptídeo catiônico consistindo em cerca de 70 % a cerca de 100 %, ou cerca de 80 % a cerca de 95 %, ou cerca de 85 % a cerca de 90 % de resíduos de aminoácido positivamente carregados, em particular resíduos de lisina, arginina, e/ou histidina, mais preferivelmente resíduos de lisina e/ou arginina e de cerca de 0 % a cerca de 30 %, ou cerca de 5 % a cerca de 20 %, ou cerca de 10 % a cerca de 20 % resíduos de aminoácido carregados de modo neutro, em particular resíduos de glicina e/ou serina. Preferidos são extensões de polipeptídeo consistindo em cerca de 4 % a cerca de 8 % de resíduos de serina, de cerca de 33 % a cerca de 36 % de resíduos de arginina e de cerca de 56 % a cerca de 63 % de resíduos de lisina. Especialmente preferidos são extensões de polipeptídeo compreendendo pelo menos um motivo de acordo com SEQ ID NO: 45 (KRXKR), sendo que X é qualquer outro aminoácido do que lisina, arginina e histidina. Especialmente preferidas são extensões de polipeptí- deo compreendendo pelo menos um motivo de acordo com SEQ ID NO: 46 (KRSKR). Mais preferidos são extensões catiônicas compreendendo pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou cerca de 20 motivos de acordo com SEQ ID NO: 45 (KRXKR) ou SEQ ID NO: 46 (KRSKR).

[0050] Também preferidas são extensões de polipeptídeo consistindo em cerca de 9 a cerca de 16 % de resíduos de glicina, de cerca de 4 a cerca de 11 % de resíduos de serina, de cerca de 26 a cerca de 32 % de resíduos de arginina e de cerca de 47 a cerca de 55 % de resíduos de lisina. Especialmente preferidas são extensões de polipeptídeo compreendendo pelo menos um motivo de acordo com SEQ ID NO: 47 (KRGSG). Mais preferidos são extensões catiônicas compreendendo pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou cerca de 20 motivos de acordo com SEQ ID NO: 47 (KRGSG).

[0051] Em outra modalidade preferida da presente invenção a extensão de peptídeo catiônico compreende além dos resíduos de aminoácido positivamente carregados, em particular resíduos de lisina e/ou arginina, resíduos de aminoácido hidro- fóbico, em particular resíduos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e glicina, mais preferivelmente resíduos de alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, e/ou trip- tofano. Preferidos são extensões de peptídeo catiônico consistindo em cerca de 70 % a cerca de 100 %, ou cerca de 80 % a cerca de 95 %, ou cerca de 85 % a cerca de 90 % resíduos de aminoácido positivamente carregados, em particular resíduos de lisina e/ou arginina e de cerca de 0 % a cerca de 30 %, ou cerca de 5 % a cerca de 20 %, ou cerca de 10 % a cerca de 20 % de resíduos de aminoácido hidrofóbico, resíduos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, ala- nina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e glicina, mais preferivelmente resinas de alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, e/ou triptofano.

[0052]Especialmente preferidas são extensões de peptídeo selecionadas do grupo consistindo nas seguintes sequências:

[0053]Em outro aspecto da presente invenção a extensão de peptídeo fundida é um peptídeo anfipático, que compreende um ou mais dos resíduos de aminoácido positivamente carregados de lisina, arginina e/ou histidina, combinados com um ou mais dos resíduos de aminoácido hidrofóbico de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e/ou glicina. As cadeias laterais dos resíduos de aminoácido são orientadas na ordem que as superfícies catiônicas e hidrofóbicas são agrupadas em lados opostos do pep- tídeo. Preferivelmente, mais do que cerca de 30, 40, 50, 60 ou 70% dos aminoácidos no referido peptídeo são aminoácidos positivamente carregados. Preferivelmente, mais do que cerca de 30, 40, 50, 60 ou 70%, dos resíduos de aminoácido no referido peptídeo são resíduos de aminoácido hidrofóbico. Vantajosamente, o peptídeo anfi- pático é fundido na extremidade do N-Terminal e/ou C-Terminal da enzima tendo atividade de degradação de parede celular, desse modo realçando a anfipaticidade das últimas proteínas.

[0054]Em outra modalidade da invenção, o peptídeo anfipático fundido à enzima consiste em pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos em 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 resíduos de amino- ácido. Em uma modalidade preferida pelo menos cerca de 30, 40, 50, 60 ou 70% dos referidos resíduos de aminoácido do peptídeo anfipático são resíduos de arginina ou lisina e/ou pelo menos cerca de 30, 40, 50, 60 ou 70% dos referidos resíduos de ami- noácido do peptídeo anfipático são dos aminoácidos hidrofóbicos valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treo- nina, serina, prolina e/ou glicina.

[0055]Os peptídeos anfipáticos preferidos são Pleurocidina de acordo com SEQ ID NO:1, Cecropina P1 de acordo com SEQ ID NO:2, Buforina II de acordo com SEQ ID NO:3, Buforina I de acordo com SEQ ID NO:23 e Magainina de acordo com SEQ ID NO:4. Os peptídeos anfipáticos também preferidos são Catelidicina, por exemplo, LL-37 de acordo com SEQ ID NO:5, Nigrocina 2 de acordo com SEQ ID NO: 48 e Ascafina 5 de acordo com SEQ ID NO:49.

[0056]Em um outro aspecto da presente invenção a extensão de peptídeo fundida é um peptídeo antimicrobiano, que compreende uma carga líquida positiva e cerca de 50% de aminoácidos hidrofóbicos. Os peptídeos antimicrobianos são anfipáticos, com um comprimento de cerca de 12 a cerca de 50 resíduos de aminoá- cido.

[0057]Os exemplos para peptídeos antimicrobianos são listados na seguinte tabela.

[0058]Em um outro aspecto da presente invenção a extensão de peptídeo fundido é um peptídeo sushi que é descrito por Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci. Abril de 2008; 65(7-8):1202-19. Os peptídeos sushi: caracterização estrutural e modo de ação contra bactérias Gram-negativas. Especialmente preferido é o peptídeo sushi 1 de acordo com SEQ ID NO:54.

[0059]Os peptídeos sushi preferidos são peptídeos sushi S1 e S3 e múltiplos dos mesmos; FASEB J. setembro de 2000;14(12):1801-13.

[0060]Em um outro aspecto da presente invenção a extensão de peptídeo é uma defensina, preferivelmente Catelicidina, Cecropina P1, Cecropina A ou Magainina II.

[0061]Em um outro aspecto da presente invenção a extensão de peptídeo fundido é um peptídeo hidrofóbico, por exemplo, Apidaecine tendo a sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 50, Variante WLBU2 tendo a sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 55 e Walmagh1 tendo a sequência de ami- noácido de acordo com SEQ ID NO: 56. O peptídeo hidrofóbico tendo a sequência de aminoácido Phe-Phe-Val-Ala-Pro (SEQ ID NO: 12) não é parte da presente invenção.

[0062]Em outra modalidade preferida da presente invenção as extensões de peptídeo da proteína de fusão de acordo com a presente invenção compreendem modificações e/ou alterações das sequências de aminoácido. Tais alterações e/ou modificações podem compreender mutações tais como deleções, inserções, e adições, substituições ou combinações dos mesmos e/ou mudanças químicas dos resíduos de aminoácido, por exemplo, biotinilação, acetilação, pegilação, mudanças químicas dos grupos amino, SH ou carboxila.

[0063]Especialmente preferidas são proteínas de fusão de acordo com as SEQ ID NOs: 63 a 90 e as proteínas de fusão selecionadas do grupo consistindo nas seguintes proteínas de fusão:

[0064]A proteína de fusão de acordo com a presente invenção, e desse modo, em particular as proteínas de fusão especialmente preferidas de acordo com SEQ ID NO:63 a 90, pode adicionalmente compreender uma metionina no N-Terminal .

[0065]A proteína de fusão de acordo com a presente invenção, e desse modo, em particular as proteínas de fusão especialmente preferidas de acordo com SEQ ID NO:63 a 90, podem adicionalmente compreender uma etiqueta, por exemplo, para purificação. Preferido é uma etiqueta His6, preferivelmente no C-Terminal da proteína de fusão. A referida etiqueta pode estar ligada à proteína de fusão por resíduos de aminoácido adicionais, por exemplo, devido às razões de clonagem. Preferivelmente a referida etiqueta pode estar ligada à proteína de fusão por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácido adicionais. Em uma modalidade preferida a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 em seu C-Terminal ligado à proteína de fusão pelos resíduos de aminoácido adicionais lisina e glicina (Lys-Gly) ou leucina e ácido glutâmico (Leu-Glu). Em outra modalidade preferida a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 em seu N-Terminal ligada à proteína de fusão pelos resíduos de aminoácido adicionais lisina e glicina (Lys-Gly) ou leucina e ácido glutâmico (Leu-Glu). Em uma modalidade mais preferida a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 em seu N-Terminal ligada à proteína de fusão pelos resíduos de amino- ácido adicionais leucina e ácido glutâmico (Leu-Glu). Em outra modalidade preferida a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 em seu C-Terminal ligada à proteína de fusão pelos resíduos de aminoácido adicionais leucina e ácido glutâmico (Leu-Glu).

[0066]Em uma modalidade mais preferida, a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 no seu C-Terminal ligada à proteína de fusão pelos resíduos adicionais de aminoácido leucina e ácido glutâmico (Leu-Glu) e a extensão de peptídeo de proteína fusão de acordo com a invenção e ligado ao N-Terminal da enzima pelos resíduos adicionais de aminoácido glicina e serina (Gly-Ser). Em outra modalidade preferida a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 no seu C-Terminal ligada à proteína fusão dos resíduos adicionais aminoácido leucina e ácido glutâmico (Leu- Glu) e a extensão de peptídeo da proteína de fusão de acordo com a invenção é ligada ao N-Terminal da enzima pelos resíduos adicionais de aminoácido glicina e serina (Gly- Ser) e a proteína de fusão compreende no N-Terminal os resíduos adicionais do aminoácido metionina (Met) ou metionina e glicina (Met-Gly) ou alanina, metionina e glicina (Ala- Met-Gly). Preferivelmente as proteínas de fusão estão de acordo com a SEQ ID NO: 108-123.

[0067]Em outra modalidade preferida, a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 em seu N-Terminal ligado a proteína de fusão pelos resíduos adicionais, sendo que a Etiqueta His6 também compreende seu N-Terminal da serina aminoáci- dos adicionais e serina (Ser-Ser) ou metionina e glicina (Met-Gly) ou metionina, glicina serina, e serina (Met-Gly-Ser-Ser).

[0068]Em outra modalidade preferida a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 em seu N-Terminal ligada à proteína de fusão pelos resíduos adicionais de aminoácido serina, serina, glicina, leucina, valina, prolina, arginina, glicina, serina e histidina (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His). Em outra modalidade preferida a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 em seu N-Terminal ligada à proteína de fusão pelos resíduos adicionais de aminoácido serina, serina, glicina, leucina, valina, prolina, arginina, glicina, serina, histidina e metionina (Ser-Ser-Gly-Leu-Val- Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met). Em outra modalidade preferida a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 em seu N-Terminal ligada à proteína de fusão pelos resíduos adicionais de aminoácido serina, serina, glicina, leucina, valina, prolina, arginina, glicina, serina e histidina (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) ou serina, serina, glicina, leucina, valina, prolina, arginina, glicina, serina, histidina e metionina (Ser-Ser- Gly-Leu -Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) e a extensão de peptídeo da proteína de fusão de acordo com a invenção está ligado ao C-Terminal da enzima pelo resíduo adicional de aminoácido serina. Em outra modalidade preferida a proteína de fusão compreende uma etiqueta His6 em seu N-terminal ligada à proteína de fusão pelos resíduos adici-onais aminoácido serina, serina, glicina, leucina, valina, prolina, arginina, glicina, serina e histidina (Ser-Ser-Gly -Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) ou serina, serina, glicina, leucina, valina, prolina, arginina, glicina, histidina, serina e metionina (Ser-Ser-Gly- Leu-Val-Pro- Arg-Gly-Ser-His-Met) e a extensão de peptídeo da proteína de fusão de acordo com a invenção está ligado ao C-terminal da enzima pelo resíduo adicional de aminoácido serina e a etiqueta His6 compreende no N-terminal os resíduos adicional de aminoácido serina e serina (Ser-Ser) ou metionina, glicina, serina e serina (Met- Gly-Ser-Ser) ou metionina e serina (Met-Ser). Preferivelmente as proteínas de fusão estão de acordo com a SEQ ID NO: 122 e 123.

[0069]Proteínas de Fusão são construídas ligando-se pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos usando técnicas de clonagem padrão descrita por exemplo, Sambrook e outros 2001, Clonagem Molecular: Um Manual de Laboratório. Tal proteína pode ser produzida, por exemplo, em sistemas de expressão de DNA recom- binante. Tais proteínas de fusão como de acordo com a presente invenção pode ser obtido por fusão para os ácidos nucleicos para endolisina e a extensão de peptídeo respectivo.

[0070]As proteínas de fusão de acordo com a presente invenção podem ser fundidas ou ligadas a outras proteínas adicionais. Exemplo para esta outra proteína adicional é tiorredoxina.

[0071]A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica a proteína de fusão de acordo com a presente invenção. A presente invenção ainda refere-se a um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O referido vetor pode fornecer para a expressão constitutiva ou induzida de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção.

[0072]A invenção também se refere a um método para a obtenção de uma referida proteína de fusão de um microrganismo, tal como uma célula hospedeira adequada geneticamente modificada que expressa uma referida proteína de fusão. A referida célula hospedeira pode ser um microrganismo tal como bactérias ou leveduras ou uma célula animal como, por exemplo, uma célula de mamíferos, em particular uma célula humana. Em uma modalidade da presente invenção da célula hospedeira é uma célula hospedeira é uma célula Pichiapastoris. O hospedeiro pode ser selecio-nado devido a meras razões biotecnológicas, por exemplo, rendimento, solubilidade, custos, etc, porém também podem ser selecionados de um ponto de vista médico, por exemplo, uma bactéria não-patológica ou leveduras, células humanas. Outro aspecto da presente invenção está relacionado a um método para transformar geneticamente uma célula hospedeira adequada, para obter a expressão das proteínas de fusão de acordo com a invenção sendo que a célula hospedeira é geneticamente modificada pela introdução de um material genético que codifica uma referida proteína de fusão na célula hospedeira e obter a sua translação e expressão por métodos de engenharia genética conhecida pelo homem versado na técnica.

[0073]Em um outro aspecto a presente invenção refere-se a uma composição, preferivelmente uma composição farmacêutica, compreendendo uma proteína de fusão de acordo com o presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com uma molécula de ácido nucleico ou um vetor compreendendo uma sequência de nucleotí- deos que codificam uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção.

[0074]A presente invenção também se refere a uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com um ácido nu- cleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento. Em um outro aspecto a presente invenção refere-se ao uso de uma proteína de fusão de acordo com o presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína modificada de fusão de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de prevenção e/ou de um distúrbio, doença ou condição associada com bactérias Gram-positivas. Em particular, o tratamento e/ou prevenção do distúrbio, doença ou condição pode ser causada por bactérias Gram-positivas de grupos de bactérias, famílias, gêneros ou espécies compreendendo as cepas patogénicas para os seres humanos ou animais, como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans, Streptococcus equi, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Propionibacterium acnes, Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacteriumdiphte- riae, Mycoplasma pneumoniae, Actinomyces.

[0075]A presente invenção ainda refere-se a um medicamento compreendendo uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção.

[0076]Em um outro aspecto a presente invenção refere a um método de tratar uma doença, distúrbio, ou condição em um indivíduo em necessidade de tratamento e/ou prevenção, que método compreende administração ao referido individuo uma quantidade efetiva de uma proteína de fusão de acordo com o presente invenção e/ou uma quantidade efetiva de um hospedeiro transformado com um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção ou uma composição de acordo com a presente invenção. O indivíduo pode ser um humano ou um animal.

[0077]Em particular, o referido método de tratamento pode ser para o tratamento e/ou prevenção e/ou de infecção da pele, dos tecidos moles, do sistema respiratório, do pulmão, do trato digestivo, do olho, do ouvido, dos dentes, da nasofaringe, da boca, dos ossos, da vagina, de feridas de bacteriemia e endocardite causadas por bactérias Gram-positivas, em particular pelas bactérias Gram-positivas como listado acima.

[0078]A dosagem e rotina de administração usada em um método de tratamento (ou profilaxia) de acordo com a presente invenção dependem do sítio/doença específica da infecção a ser tratada. A rotina de administração pode ser, por exemplo, oral, tópica, nasofaringe, parenteral, intravenosa, retal ou qualquer outra rotina de ad-ministração.

[0079]Para aplicação de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou uma quantidade efetiva de um hospedeiro transformado com um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção ou uma composição de acordo com a presente invenção a um sítio da infecção (ou sítio em perigo a ser infectado) a formulação pode ser usado que protege os compostos ativos de influências ambientais, tais como proteases, oxidação, resposta imune etc., até obter o sítio da infecção. Portanto, a formulação pode ser cápsula, drágea, pílula, pó, supositório, emulsão, suspensão, loção, gel, creme, pomada, solução injetável, xarope, spray, inalantes ou qualquer outra formulação razoável de medicina galênica. Preferivelmente, a formulação galê- nica pode compreender veículos adequados, estabilizantes, aromatizantes, tampões ou outros reagentes adequados. Por exemplo, para aplicação tópica a formulação pode ser uma loção, creme, gel, pomada ou emplastro, para aplicação da nasofaringe a formulação pode ser solução salina a ser aplicado através de um spray para o nariz. Para administração oral no caso do tratamento e/ou prevenção de um sítio de infecção específica, por exemplo, no intestino, pode ser necessário para proteger uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção do aspecto do ambiente digestivo do trato gastrointestinal até o sítio da infecção é alcançado. Assim, as bactérias como veículo, que sobrevivem as etapas iniciais da digestão no estômago e que secreta mais tarde em uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção no ambiente intestinal pode ser usado.

[0080]Em uma modalidade específica da presente invenção o uso de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou hospedeiro transformado com um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio, doença ou condição causada por Listeria monocytogenes, em particular Granulomatosisinfantiseptica (listeriose do recém-nascido), mononucleose, con- juntivite, meningite, granulomatosisseptica e a listeriose das mulheres grávidas.

[0081]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Staphylococcus aureus, em infecções específicas da pele como piodermite, particularmente foliculite, furúnculo, carbúnculo, abcessos das glândulas sudoríparas e pênfigo, e, como síndrome da pele em escala. A sín- drome da pele em escalada pode aparecer em três quadros clínicos: dermatite exfoliativa, impetigo bolhosa e escarlatinaformeritroderma. Além disso, o distúrbio, doença, condição causada por Staphylococcus aureus é Staphylococcus pneumonia, hospitalização, em particular infecções da ferida cirúrgica, mastite puerperalis e enterocolite, e intoxicações alimentares.

[0082]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Streptococcus pyogenes, em particular tonsilite, faringite, escarlate, erisipela, febre reumática e glomerulonefrite aguda.

[0083]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Streptococcus pneumoniae, em particular pneumonia, ulcusserpenscorneae, otite média, meningite, mastoidite, peritonite e osteomi- elite.

[0084]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Clostridium perfringens, em particular, gangrena gasosa, necroticansulcerosa enterite e intoxicações alimentares.

[0085]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Clostridium botulinum, em particular o botulismo.

[0086]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Clostridium difficile, em particular pseudomembra- noesenterocolite.

[0087]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Bacillus anthracis, em particular antraz cutâneo, inalação de antraz e carbúnculo gastrointestinal.

[0088]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Enterococcus faecalis ou E. faecium, como infecções nosocomial e endocardite.

[0089]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Bacillus cereus, em particular intoxicações alimentares, bronquicopneumonia, septicemia e meningite.

[0090]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Mycobacterium avium, Mycobacterium paratuber- culosisand Mycobacterium tuberculosis, em particular a tuberculose.

[0091]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Mycoplasma pneumoniae, em particular a pneumonia, doenças do trato respiratório superior e inflamações do tímpano.

[0092]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Actinomyces, em particular na actinomicose em humana, gado, gato e cão.

[0093]Em uma outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, doença ou condição é causada por Corynebacteriumdiphteriae, em particular de difteria localizadas as amígdalas, o nariz, a nasofaringe ou na orelha média, difteria progressiva da laringe, da traqueia e os brônquios, tóxicos ou difteria maligna, pele e difteria ferida.

[0094]Preferivelmente, uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção é usado para tratamento médico, se a infecção a ser tratada (ou prevenido) é causada por cepas multirresistentes de bactérias, em particular por cepas resistentes contra um ou mais dos seguintes antibióticos: estreptomicina, tetraciclina, cefalotina, penicilina, gentamicina, cefotaxima, cefalosporina, ceftazidima ou imipenem. Além disso, uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode ser usada em métodos de tratamento através da administração em combinação com agentes anti- bacterianos convencionais, tais como antibióticos, lantibióticos, bacteriocinsorendoli- sinas, etc.

[0095]A presente invenção também se refere a um produto farmacêutico compreendendo um ou mais compartimentos, sendo que pelo menos um compartimento compreende uma ou mais proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um ou mais hospedeiro transformado com um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção ou uma composição de acordo com a presente invenção.

[0096]Em um outro aspecto a presente invenção refere-se a um processo de preparação de um composição farmacêutica, o referido processo compreendendo uma ou mais mistura da proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um ou mais hospedeiro transformado com um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção com um diluente excipiente farmaceuticamente aceitável, ou veículo.

[0097]Em um aspecto ainda mais a composição de acordo com a presente invenção é uma composição de cosméticos. Várias espécies de bactérias podem causar irritações nas superfícies do ambiente exposto do corpo do paciente, tais como a pele. Para evitar prevenir tais irritações ou para eliminar manifestações menores do referido patógenos bacterianos, preparações cosméticas especiais podem ser empregadas, que compreendem uma quantidade suficiente da proteína de fusão de acordo com a presente invenção, para bactérias Gram-positivas patogênicas degradar sedimenta-ção recentemente ou existentes.

[0098]Em um outro aspecto a presente invenção refere-se à proteína de fusão de acordo com a presente invenção para o uso como meio de diagnóstico em medicinal, comida ou alimentos ou diagnósticos ambientais, em particular como meio de diagnóstico para o diagnóstico da infecção bacteriana causada em particular por bactérias Gram-positivas. Neste contexto, a proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode ser usada como uma ferramenta especificamente para degradar bac-térias patogênicas, em particular as bactérias patogênicas Gram-positivas. A degradação das células bacterianas pela proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode ser suportada pela adição de detergentes como Triton X-100 ou outros aditivos que enfraquecem o envelope celular das bactérias, como polimixina B. Degradação celular específica é necessária como uma etapa inicial para detecção específica subsequente de bactérias usando métodos baseados em ácidos nucleicos, como PCR, hibridização de ácidos nucleicos ou NASBA (Amplificação com base em Sequência de Ácido nucleico), métodos imunológicos, como IMS, imunofluorescência ou técnicas ELISA, ou outros métodos contar no teor celular das células bacterianas como ensaios enzimáticos usando proteínas específicas para diferentes grupos de bactérias ou espécies (por exemplo, β-galactosidase para enterobactérias, coagulase para cepas positiva de coagulase).

[0099]Em um outro aspecto da presente invenção relacionado ao uso da proteína de fusão de acordo com a presente invenção para o tratamento ou prevenção de contaminação por bactérias Gram-positivas de ingredientes alimentares, de equipamentos de processamento de alimentos, de plantas de processamento de alimentos, de superfícies entrando em contato com ingredientes alimentares tais como prateleiras e áreas de depósito de alimentos e em todas as outras situações, onde patogênicos, patogênicos facultativos ou outras bactérias indesejáveis pode potencialmente infestar material alimentar, de dispositivos médicos e de todos os tipos de superfícies em hospitais e cirurgias.

[00100]Em particular, uma proteína de fusão da presente invenção pode ser usada profilaticamente como agente de desinfecção. O referido agente de desinfecção pode ser usado antes ou após a cirurgia, ou, por exemplo, durante a hemodiálise. Além disso, bebês prematuros e pessoas imunocomprometidos, ou aqueles indivíduos com necessidade de protéticos dispositivos pode ser tratada com uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção. O referido tratamento pode ser profilatica- mente ou durante a infecção aguda. No mesmo contexto, as infecções hospitalares, especialmente por cepas resistentes a antibióticos como Staphylococcus aureus resistente a Methicillin, Enterococcus faecalis resistente à vancomicin, Enterococcus fa- ecium resistente à vancomicin, Streptococcus pneumoniae, Propionibacterium acnes, Mycobacterium tuberculosis resistente multi-droga, podem ser profilaticamente trata-dos ou durante fase aguda com uma proteína de fusão da presente invenção. Portanto, uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode ser usada como um desinfetante também em combinação com outros ingredientes úteis em uma solução desinfetante, como detergentes, tensídeos, solventes, antibióticos, lantibióticos ou bacteriocinas.

[00101]Para o uso da proteína de fusão de acordo com a presente invenção como um desinfetante, por exemplo, no hospital, cirurgia dentária, veterinários, cozinha ou banheiro, a proteína de fusão pode ser preparada em uma composição em forma de, por exemplo, um fluido, um pó, um gel ou um ingrediente de uma limpeza úmida ou um produto de folha de desinfecção. A referida composição pode adicionalmente compreender veículo adequado, aditivos, agentes de diluição e/ou excipientes para o uso respectivo e forma, respectivamente, - porém também os agentes que suportam a atividade antimicrobiana, como EDTA ou agentes melhorar a atividade anti- microbiana das proteínas de fusão. A proteína de fusão também pode ser usada com agentes desinfetantes comuns, como, Álcoois, Aldeídos, Agentes oxidantes, Fenóli- cos, Compostos de amônio quaternário ou luz UV. Para desinfecção, por exemplo, superfícies, objetos e/ou dispositivos a proteína de fusão pode ser aplicado nas referidas superfícies, objetos e/ou dispositivos. A aplicação pode ocorrer, por exemplo, molhando-se a composição de desinfecção com quaisquer meios, tais como um pano ou um trapo, por pulverização, vazamento. As proteínas de fusão podem ser usadas em diferentes concentrações, dependendo da aplicação respectiva e o “tempo de reação" pretendia para obter atividade antimicrobiana total.

[00102]O escopo adicional de aplicabilidade da presente invenção se tornará aparente da descrição detalhada dada a seguir, no entanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e exemplos específicos, quando indicarem modalidades preferidas da invenção, são dadas a título de ilustração apenas, uma vez que vários alterações e modificações dentro do âmbito e escopo da invenção se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica desta descrição detalhada. É preciso entender que tanto a descrição geral precedente e seguinte descrição detalhada são exemplares e explicativas e não são restritivas da invenção, como reivindicada.

[00103]Os exemplos a seguir explicam a presente invenção, porém não são considerados limitantes. A menos que indicado diferentemente, métodos padrão biologia molecular foram utilizados, como por exemplo, descrito por Sambrock e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Nova York.Exemplo 1: Clonagem, expressão e purificação da CPL-1, Ply511, LysK, Li- sostafina (LSS) e PA6-gp20 enzimas modificadas com vários extensões de peptídeo sobre o N-terminal ou C-terminal.Enzimas

[00104]Cpl-1 de acordo com a SEQ ID NO: 57 é uma endolisina originando- se de Streptococcus pneumoniaephage Cpl-1. A CPL-1 endolisina é codificada pela molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 91. A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 91 foi sinteticamente produzida com um BamH I (5'-GGA TCC-3 ') sítio de restrição na extremidade 5'- da molécula de ácido nucleico e uma Xho I (5'-CTC GAG-3 ') sítio de restrição na extremidade 3'- da molécula de ácido nucleico.

[00105]A Ply511 de acordo com a SEQ ID NO: 58 é uma endolisina originando-se de Listeria monocytogenesphage A511. A Ply511 endolisina é codificada pela molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 92. A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 92 foi sinteticamente produzida com um BamH I (5'-GGA TCC-3 ') sítio de restrição na extremidade 5'- da molécula de ácido nucleico e uma Xho I (5'-CTC GAG-3 ') sítio de restrição na extremidade 3'- da molécula de ácido nucleico.

[00106]A LysK de acordo com a SEQ ID NO: 59 é uma endolisina originando- se de Staphylococcus aureusphage K. O endolisinaLysK é codificado pela molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 93. A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 93 foi sinteticamente produzida com um BamH I (5'-GGA TCC-3 ') sítio de restrição na extremidade 5'- da molécula de ácido nucleico e uma Xho I (5'-CTC GAG-3 ') sítio de restrição na extremidade 3'- da molécula de ácido nucleico.

[00107]A Lisostafina (Lss) de acordo com a SEQ ID NO: 60 é uma bacteriocina originando-se de Staphylococcus simulans. A bacteriocina Lss é codificada pela molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 94. A molécula de ácido nu- cleico de acordo com a SEQ ID NO: 94 foi sinteticamente produzida com um BamH I (5'-GGA TCC-3 ') sítio de restrição na extremidade 5'- da molécula de ácido nucleico e uma Xho I (5'-CTC GAG-3 ') sítio de restrição na extremidade 3'- da molécula de ácido nucleico.

[00108]A PA6-gp20 de acordo com a SEQ ID NO: 61 é uma endolisina originando-se de Propionibacterium acnes fago. O endolisina PA6-gp20 é codificada pela molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 123. A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 123 foi sinteticamente produzida com um BamH I (5'-GGA TCC-3 ') sítio de restrição na extremidade 5'- da molécula de ácido nucleico e uma Xho I (5'-CTC GAG-3 ') sítio de restrição na extremidade 3'- da molécula de ácido nucleico.

[00109]As extensões de peptídeo seguintes na tabela 5 foram usadas para a produção de proteínas de fusão com as enzimas Cpl-1, Ply511, LysK, Lisostafina (Lss) e PA6-gp20:

[00110]As moléculas de ácido nucleico que codificam as extensões de peptí- deo respectivos foram sinteticamente produzidas com um Nde I (5'-ATG CAT-3 ') sítio de restrição na extremidade 5'- da molécula de ácido nucleico e uma BamH I (5'-GGA TCC- 3 ') sítio de restrição na extremidade 3'- da molécula de ácido nucleico, exceto a molécula de ácido nucleico que codifica o PK e PK2 para ligação com o bacterioci- nLss, que foi produzido com um sítio de restrição Nco I e dois nucleotídeos adicionais (5'- CCA TGG GC-3 ') na extremidade 5'- da molécula de ácido nucleico.

[00111]As proteínas de fusão são construídas ligando-se pelo menos duas sequências de ácido nucleico usando técnicas de clonagem padrão descrita, por exemplo, por Sambrook e outros. 2001, Molecular Cloning: Um Manual de Laboratório. Portanto, as moléculas de ácido nucleico que codificam as extensões de peptídeo foram clivadas em uma digestão com as enzimas de restrição respectivas Nde I e BamH I e no caso da molécula de ácido nucleico que codifica a extensão de peptídeo PK e PK2 para ligação com o Lss a digestão foi realizada com as enzimas de restrição Nco I e BamH I. Subsequentemente, os ácidos nucleicos clivados que codificam as extensões de peptídeo foram ligados no vetor de expressão pET21 b (Novagen, Darmstadt, Alemanha), que também foi clivado em uma digestão com as enzimas de restrição Nde I respectivas e BAMH I antes. A molécula de ácido nucleico clivada que codifica a extensões PK e PK2 para ligação com o Lss, foi ligada em um vetor de expressão modificada pET32 b (vetor modificado para obtenção de Novagen, Darmstadt, Alemanha), que também foi clivado em uma digestão com as enzimas de restrição Nco I respectivos e BamH I antes. A modificação do vetor de expressão pET32b refere-se à deleção da sequência que codifica uma etiqueta S e uma etiqueta His6 central.

[00112]Posteriormente, as moléculas de ácido nucleico que codificam as enzimas Cpl-1, Ply511, PA6-gp20, LysK e Lss foram clivadas em uma digestão com a enzima de restrição BamH I e Xho I, de modo que a endolisina poderia ser ligada no vetor de expressão pET21b ( Novagen, Darmstadt, Alemanha) e o vetor de expressão pET32 b modificado, respectivamente, que também foram clivados em uma digestão com as respectivas enzimas de restrição BamH I e Xho I antes.

[00113]No caso da extensão de peptídeo PK, que foi ligado ao C-terminal da Lisostafina e da LysK, a proteína de fusão resultante tem uma etiqueta His6 no N- terminal, onde a etiqueta His6 é ligada ao N-terminal por um ligante. Para a clonagem das respectivas moléculas de ácido nucleico do vetor de expressão pET32 b (Novagen, Darmstadt, Alemanha) foi usado.

[00114]Assim, a molécula de ácido nucleico que codifica a extensão de pep- tídeo é ligada no vetor respectivo na extremidade 5' da molécula de ácido nucleico que codifica a enzima respectiva. Além disso, a molécula de ácido nucleico que codifica a enzima é ligada respectiva é ligada nas respectivas plasmídeo, de modo que uma molécula de ácido nucleico que codifica uma etiqueta His6 consistindo de seis resíduos de histidina está associada na extremidade 3'- da molécula de ácido nucleico que codifica a endolisina.

[00115]Como algumas proteínas de fusão podem ser tóxicas na expressão em bactérias, ou não homogênea devido à degradação de proteínas, a estratégia poderia ser a de expressar essas proteínas de fusão fundidas ou ligadas a outras proteínas adicionais. Um exemplo para essas outras proteínas adicionais é tiorredoxina, que foi mostrada para mediar expressão de peptídeos antimicrobianos tóxicos em E.coli (TrxA expressão de mediação de fusão de peptídeos antimicrobianos CM4 de vários genes unidos em Escherichia coli. Zhou L, Z Zhao, Li B, Cai . Y, Zhang S. Protein ExprPurif 2009 Abr; 64 (2) :225-230). No caso da proteína de fusão consistindo na PK N-terminal ou peptídeo PK2 e o bacteriocina Lss, o peptídeo foi ligado no vetor de expressão no pET32 b modificado, de modo que um tiorredoxina adicional está associado na extremidade 5 '- do peptídeo. O tiorredoxina pode ser removido da pro-teína de fusão expressas pelo uso de enterocinase, portanto, entre a molécula de ácido nucleico que codifica o peptídeo e a uma codificação a tiorredoxina é um sítio de restrição enterocinase introduzido.

[00116]A sequência das fusões de peptídeo endolisina foi controlada através de sequenciamento de DNA e clones corretas foram transformados em E.coli BL21 (DE3) e em E. coli BL21 (DE3) pLysScells (Novagen, Darmstadt, Alemanha) para a expressão da proteína.

[00117]A expressão recombinante de proteínas de fusão de acordo com a SEQ ID NO: 107 a 122 e 124 é realizada em células E. coli BL21 (DE3) e. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen, Darmstadt, Alemanha). As células foram crescendo até uma densidade óptica de OD600nm de 0,5-0,8 foi alcançado. Então a expressão da proteína de fusão foi induzida com IPTG a 1 mM (isopropiltiogalactosídeo) e a expressão foi realizada a 37°C durante um período de 4 horas.

[00118]Células E.coli BL21 foram colhidas por centrifugação durante 20 min a 6000g e interrompido através de sonicação no gelo. Fração solúvel e insolúvel do extrato bruto E.coli foram separados por centrifugação (Sorvall, SS34, 30 min, 15 000 rpm). Todas as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade Ni2+ (FPLC Akta, a GE Healthcare) usando a etiqueta His6 em seu C-terminal de , codificados pelos vetores pET21b ou pET32b.

[00119]Algumas proteínas foram expressas usando uma versão pET32b modificada vetor (etiqueta S e central etiqueta His6 deletada) como descrito acima, que se funde tiorredoxina no N-terminal das proteínas de interesse. O vetor também contém um sítio de clivagem enterocinase logo antes da proteína de interesse. Este site permite a clivagem proteolítica entre tiorredoxina e a proteína de interesse, que pode purificar através da etiqueta His6 em seu C-terminal restante. Para a função antimicro- biana da proteína de fusão, pode ser necessário para remover o tiorredoxina por clivagem proteolítica. Portanto, a proteína de fusão foi clivada com 2-4 unidades/mg en- terocinase recombinante (Novagen, Darmstadt, Alemanha) para remover o tiorredo- xina seguinte o protocolo fornecido pelo fabricante. Após clivagem enterocinase a pro-teína de fusão foi purificada através da purificação Etiqueta His6 como descrita abaixo.

[00120] A cromatografia de afinidade Ni2+ é realizada em 4 etapas subsequentes, todos à temperatura ambiente:1. Equilíbrio da coluna Histrap FF 5 ml (GE Healthcare) com até 10 volumes de coluna do tampão de lavagem (imidazol a 20 mM, NaCl a 1 M e Hepes a 20 mM em pH 7,4) em uma taxa de fluxo de 3-5 ml/min.2. Carregamento do lisado total (com proteína de fusão desejável) na coluna Histrap FF 5 ml, em uma taxa de fluxo de 3-5 ml/min.3. Lavagem da coluna com até 10 volumes de coluna de Tampão de Lavagem para remover não ligado amostra seguido por uma segunda etapa de lavagem com tampão de eluição de 10% (imidazol a 500 mM, NaCl a 0,5 M e Hepes a 20 mM em pH 7,4) em uma taxa de fluxo de 3-5 ml/min.4. Eluição de proteínas de fusão ligada delimitada da coluna com um gradiente linear de 4 volumes coluna de Tampão de Eluição (500 mM imidazol, 0,5 M NaCl e 20 mMHepes em pH 7,4) a 100% em uma taxa de fluxo de 3-5 ml/min.

[00121]Soluções de matéria-prima purificada de proteínas de fusão em Tampão de Eluição (Hepes a 20 mM pH7,4, MNaCl a 0,5; imidazol a 500mM) foram pelo menos 90% de pureza, como determinado visualmente em gel SDS-PAGE (dados não mostrados).Exemplo 2: Atividade antimicrobiana de enzimas Cpl-1 modificadas com várias extensão de peptídeo sobre o N-terminal.

[00122]As proteínas de fusão Cpl1 com as extensões de peptídeo do N-termi- nal Pseudina 1, WLBU2 Variante, LL-37, Indolicidina, Magainina, Pleurocidina, Cecro- pina A (A. aegypti), Buforina II, SarcotoxinIA e PK foram produzidos como descrito no exemplo 1. A atividade antimicrobiana da referida proteína de fusão contra Streptococcus pneumoniae DSMZ 11967 e Streptococcus pneumoniae DSMZ 14378 foram testadas usando o teste de semeadura descrito abaixo. A atividade medida da proteína de fusão é mostrada na Tabela 6.

[00123]Os resultados apresentados na Tabela 6 mostram uma alta atividade antimicrobiana de todas as proteínas de fusão contra Streptococcus pneumoniae DSMZ 11967 e Streptococcus pneumoniae DSMZ 14378.Ensaio de Semeadura:

[00124]Células em crescimento exponencial, por exemplo, Streptococci, Listeria, Propionibacteria ou Staphylococci foram tomadas (1 ml) resfriado em gelo e lavada com água destilada. As bactérias foram resuspensos em 20mM Tris pH 7,0, 1 mM MgCl2, 0,5 M sacarose. Proteínas de fusão foram diluídas em tampão re-sus- penso, adição de sacarose a uma concentração final de 0,5 M e incubadas (concentração final da proteína de fusão sobre 10μg/ml) com a bactéria respectiva durante 60 minutos em temperatura ambiente. Após as bactérias foram colocadas em placas de ágar apropriado (por exemplo, Streptococci: Columbia ágar sangue) contendo sacarose 0,5 M e as colônias resultantes foram contadas após incubação. As colônias residuais foram contadas após uma incubação durante a noite a 37°C. Com base no número de células contadas a atividade antibacteriana de unidades logarítmicas (=log10N0/Ni com N0 = número de células não tratadas e Ni = número de células tratadas) foi calculada. Todas as amostras foram replicadas em pelo menos quatro vezes.

EXEMPLO 3: Atividade antimicrobiana de enzima Ply511 modificada com o pentapeptídeo no N-terminal.

[00125]A proteína de fusão Ply511 com o pentapeptídeo de extensão de pep- tídeos do N-terminal de acordo com SEQ ID NO: 12 foi produzida como descrito no exemplo 1. A atividade antimicrobiana da referida proteína de fusão contra a Listeria monocytogenes DSMZ 15675 e Listeria monocytogenes DSMZ 20600 foi testada usando o teste de semeadura descrito no exemplo 2. A atividade medida da proteína de fusão é mostrada na Tabela 7.

[00126]Os resultados apresentados na Tabela 7 mostram uma alta atividade antimicrobiana do pentapeptídeo proteína de fusão: Ply511 contra Listeria monocytogenes DSMZ 15675 e Listeria monocytogenes DSMZ 20600.

EXEMPLO 4: Atividade antimicrobiana de Lss e da enzima LysK modificadas com peptídeos policatiônico no N-terminal ou C-terminal.

[00127]A fusão proteínas Lss e LysK, respectivamente, com a extensão de peptídeos do N-terminal PK de acordo com a SEQ ID NO: 13, a proteína de fusão Lss com a extensão de peptídeo do N-terminal PK2 de acordo com a SEQ ID NO: 31, bem como a fusão proteínas Lss e LysK, respectivamente, com a extensão de peptídeos do termina de C PK foram produzidos como descrito no exemplo 1. A atividade anti- microbiana da referida proteínas de fusão contra Staphylococcus aureusDSMZ 346 e Staphylococcus epidermidisDSMZ 20041 foi testada usando o teste de semeadura descrito no exemplo 2, bem como usando o teste de lise, como descrito a seguir.

Teste de Lise

[00128]O teste de Lise foi usando para a LysK e Lisostafinas modificadas para examinar o efeito antimicrobiano dessas proteínas de fusão.

[00129]Células estafilocócicas foram cultivadas em BHI médio até a densidade óptica a 600nm de 0,7-1 ser alcançada, indicando um crescimento exponencial. As células foram colhidas por centrifugação e resuspensos em tampão de lise (20 mMTris-HCl (pH 7,4), 60 mMNaCl, 2mM CaCl2. Células foram resuspensas em uma densidade óptica a 600nm de 1,0 e incubadas com proteínas de fusão. Atividade foi medida espectrofotometricamente em 600nm.

[00130]A atividade medida da proteína de fusão é mostrada na Tabela 8.

[00131]Os resultados apresentados na Tabela 8 mostram uma alta atividade antimicrobiana das proteínas de fusão Lss com o peptídeo do N-terminal PK ou PK2 contra Staphylococcus aureus DSMZ 346 e Staphylococcus epidermidis DSMZ 20041. Mas também a outras proteínas de fusão mostram atividade antimicrobiana contra as duas cepas bacterianas testadas.

Abreviações: +: 1 log; ++: 2-3 log; +++: 4 ou mais logs.EXEMPLO 5: Atividade antimicrobiana de enzima PA6-gp20 modificada com a extensão de peptídeo hidrofóbico Walmagh 1

[00132]A proteína de fusão PA6-gp20 com a extensão de peptídeo do N-ter-minal Walmagh 1 de acordo com a SEQ ID NO: 56 foi produzida como descrito no exemplo 1. A atividade antimicrobiana da referida proteína de fusão contra Propionibacterium acnes DSMZ 1897 e Propionibacterium acnes DSMZ 16379 foi testada usando o teste de semeadura descrito no exemplo 2. A atividade medida da proteína de fusão é mostrada na Tabela 9.

[00133]Os resultados apresentados na Tabela 9 mostram a atividade antimicro- biana da proteína de fusão contra ambas cepas bacterianas de Propionibacterium acnes.

Abreviações: ++: 2-3log;

[00134]As proteínas de fusão na Tabela 6 a 9, sem qualquer etiqueta e ligante também foram testadas com os ensaios de atividade descritos acima. Todos eles mostraram atividade antimicrobiana contra as cepas de bactérias usadas na Tabela 6 a 9.

Claims (9)

1. Proteína de fusão CARACTERIZADA pelo fato de que é composta por uma endolisina e uma extensão de peptídeo anfifática fundida à endolisina no N- ou C- terminal ou em ambos os terminais,em que a proteína de fusão possui as sequências de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOs: 63 a 65, 67, 70 e 72 a 81,em que a endolisina é uma endolisina tendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 57, eem que a extensão de peptídeo anfifática é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 4, 6 a 11, 48 a 50, 52 e 53.

2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de fusão compreende um resíduo de aminoácido adicional no N-terminal e/ou em que a extensão de peptídeo está ligada à proteína de fusão por um ou mais resíduos de aminoácido adicionais.

3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de fusão compreende uma etiqueta ou uma proteína adicional no C- e/ou N-terminal, em particular, em que a dita etiqueta ou proteína adicional está ligada à proteína de fusão por um ou mais resíduos de aminoácido adicionais.

4. Uso da proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é como um meio de diagnóstico ou uma substância cosmética.

5. Uso da proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecções por bactérias Gram-positivas.

6. Uso da proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é como um desinfetante.

7. Uso da proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é para o tratamento ou prevenção de contaminação por bactérias Gram-positivas de gêneros alimentícios, de equipamento de processamento de alimento, de usinas de processamento de alimento, de superfícies que entram em contato com os gêneros alimentícios, de dispositivos médicos, de superfícies em hospitais e superfícies entorno de procedimentos cirúrgicos.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é como um meio diagnóstico em diagnósticos medicinais, alimentícios ou de alimentação ou ambientais.

9. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.