JP7249149B2 - バイオフィルムの堆積および産生を阻害するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本明細書で使用される場合、抗微生物ペプチドは、あらゆる細菌活性を有する小さいペプチドである。「RC-101」は、インビトロでのHIV-1のT指向性株およびM指向性株による感染からヒトCD4+細胞を保護し得るおよびヒト頸腟部組織でのHIV-1感染を予防し得る、レトロサイクリンの類似体(環状オクタデカペプチド)である。RC-101の、腟液の存在下でHIV-1感染を予防し且つ完全な活性を保持する能力により、RC-101は(特に口腔バイオフィルム中での)他の局所的殺菌剤用途の良好な候補である。RC-101の配列はPlant Biotechnol J.2011 Jan;9(1):100-115(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
本研究では、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)UA159血清型c(ATCC 700610)、アクチノミセス・ネスルンディ(Actinomyces naeslundii)ATCC 12104、ストレプトコッカス・ゴルドニ(Streptococcus gordonii)DL-1およびカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)SC5314を使用した。これらの株を選択しており、なぜならば、S.ミュータンス(S.mutans)は十分に確立された病原性のう蝕原性細菌だからである[Ajdic D et al,2002]。S.ゴルドニ(S.gordonii)は歯のバイオフィルムの先駆的生着菌であり、歯のバイオフィルム形成の初期段階ではA.ネスルンディ(A.naeslundii)も検出され、A.ネスルンディ(A.naeslundii)は根のう蝕の発生と関連している可能性がある[Dige I et al,2009]。C.アルビカンス(C.albicans)は、ヒトの粘膜表面にコロニーを形成する真菌生物であり、幼児期のう蝕を有する幼児からの歯垢中でも検出される[Hajeshengallis E et al,2015]。全ての株を、20%グリセロールを含むトリプシンダイズブロス中で-80℃にて貯蔵した。S.ミュータンス(S.mutans)、S.ゴルドニ(S.gordonii)およびA.ネスルンディ(A.naeslundii)の培養に血液寒天プレートを使用した。C.アルビカンス(C.albicans)にはサブロー寒天プレートを使用した。これらの株全てを、使用前に、1%グルコースが入った、限外ろ過した(10kDa分子量カットオフ膜;Prep/Scale,Millipore,MA)緩衝トリプトン-酵母抽出物ブロス(UFTYE;2.5%トリプトンおよび1.5%酵母抽出物、pH7.0)中で中間指数期(mid-exponential phase)まで増殖させた(37℃、5%CO2)。
CTB、PTD、レトロサイクリンおよびプロテグリンと融合したGFPを発現するトランスプラストミック植物を、以前の研究[Limaye et al 2006;Kwon et al 2013;Xiao et al 2016;Lee et al 2011]で説明されているように作製した。既に説明されているようにサザンブロットアッセイを使用して、GFP融合タンパク質を発現するトランスプラストミック系統を確認した[Verma et al 2008]。同様に、UV照明下で各構築物の葉からの緑色蛍光を可視化することにより、GFPタグ付きタンパク質の発現を確認した。
これまで行われていた有機抽出およびその後の疎水性クロマトグラフィーにより、トランスプラストミックタバコ由来のGFP融合体プロテグリン-1(PG1)およびレトロサイクリン(RC101)の精製を達成した(Lee et al,2011)。凍結乾燥させた葉材料 約0.2~1gmを採取し、植物抽出緩衝液(2%フッ化フェニルメチルスルホニルおよび1プロテアーゼ阻害剤のカクテルが補充された0.2M TrisHCl pH8.0、0.1M NaCl、10mM EDTA、0.4Mスクロース、0.2% TritonX)10~20ml中で再構成した。この再懸濁液を、15分毎にボルテックスしてホモジナイズしつつ1時間にわたり氷中でインキュベートした。次いで、このホモジネートを1時間にわたり4℃で75000g(Beckman LE-80K最適超遠心分離機)にて沈降させて清澄な溶解物を得た。この溶解物を70%飽和硫酸アンモニウムおよび1/4体積の100%エタノールによる前処理にかけ、続いて2分にわたり激しく振盪した(Yakhnin et al,1998)。この処理済溶液を3分にわたり2100gで沈降させた。上方のエタノール相を集め、このプロセスを1/16体積の100%エタノールで繰り返した。プールしたエタノール相を、1/3体積の5M NaClおよび1/4体積の1-ブタノールでさらに処理し、2分にわたり激しくホモジナイズし、3分にわたり2100gで沈降させた。最下相を集め、7kDa MWCOゼバスピン脱塩カラム(Thermo scientific)上にロードし、製造業者の推奨に従って脱塩した。
ウエスタンブロットベースの方法および蛍光ベースの方法の両方により、GFP-RC101およびGFP-PG1の定量を実行した。凍結乾燥させた精製済タンパク質を滅菌1×PBSで再懸濁させ、Bradford法により総タンパク質を決定した。次いで、精製済タンパク質を、変性タンパク質試料を市販のGFP標準(Vector labs)と一緒に12%SDSゲル上ロードすることによりSDS-PAGE法によって定量し、次いで1:3000希釈のマウス抗GFP抗体(Millipore)を使用し、その後に1:4000希釈の二次HRP共役ヤギ抗マウス抗体(Southern biotech)で調べてウエスタンブロッティングを行った。
既に説明されているように(Xiao,et al 2016)、下記の4種のタグ:CTB、PTD、PG1およびRC101の取込みを測定するために、様々なヒト歯周細胞系統(例えばヒト歯根膜幹細胞(HPDLS)、上顎骨間葉幹細胞(MMS)、ヒト頭頸部扁平上皮細胞がん腫細胞(SCC-1)、歯肉由来間葉間質細胞(GMSC)、成人歯肉ケラチノサイト(AGK)および骨芽細胞(OBC))において、簡潔に言うと、各ヒト細胞系統細胞(2×104個)を一晩37℃にて8ウェルチャンバースライド(Nunc)中で培養し、続いて1時間にわたり37℃にて、1%FBSが補充されたPBS 100μl中で下記の精製済GFP融合タグ:CTB-GFP(8.8μg)、PTD-GFP(13μg)、GFP-PG1(1.2μg)およびGFP-RC101(17.3μg)と共にインキュベートした。10分にわたるRTでの2%パラホルムアルデヒドによる固定およびPBSによる3回の洗浄の後、全ての細胞を、DAPIを含むアンチフェードマウンティング培地(Vector laboratories,Inc)で染色した。陰性コントロールの場合、細胞を、1時間にわたり37℃にて、1%FBSを含むPBS中で市販のGFP(2μg)と共にインキュベートした。固定された細胞全てを、共焦点顕微鏡を使用して撮像した。3つの独立した分析において、画像を100倍対物レンズで観察し、各細胞系統に関して
少なくとも10~15個のGFP陽性細胞を記録した。
S.ミュータンス(S.mutans)に対するAMP(Gfp-PG1およびGfp-RC101)の死滅動態をタイムラプス死滅アッセイで分析した。S.ミュータンス(S.mutans)を対数期まで増殖させ、増殖培地で105CFU/mlまで希釈した。GFP-PG1およびGFP-RC101をそれぞれ0~10μg/mlおよび0~80μg/mlの濃度でS.ミュータンス(S.mutans)懸濁液に添加した。0時間、1時間、2時間、4時間、8時間および24時間で試料を採取し、0.89%NaClで連続的に希釈し、次いで寒天プレート上で広げ、48時間後にコロニーを計数した。各時点で600nmでの吸光度もチェックした。S.ゴルドニ(S.gordonii)懸濁液、A.ネスルンディ(A.naeslundii)懸濁液およびC.アルビカンス(C.albicans)懸濁液を10μg/mlの濃度でGfp-PG1と混合し、0時間、1時間および2時間で、CFUの計数のためにアリコートを取り出した。
十分に特徴付けられたEPS-マトリックス産生口腔病原体S.ミュータンス(S.mutans)UA159を使用して、唾液が塗布されたヒドロキシアパタイトディスク表面上でバイオフィルムを形成させた。簡潔に言うと、ヒドロキシアパタイトディスク(直径1.25cm、表面積2.7±0.2cm2、Clarkson,Chromatography Products,Inc.,South Williamsport,PA)に、フィルタ滅菌した清澄なヒト全唾液(sHA)を塗布した[Xiao J et alo,2012]。S.ミュータンス(S.mutans)を、1%(重量/体積)グルコースを含むUFTYE培地中で中間指数期まで増殖させた(37℃、5%CO2)。各sHAディスクに、1%(重量/体積)スクロースを含むUFTYE培地1ml当たり105CFUの活発に増殖するS.ミュータンス(S.mutans)細胞を播種し、19時間にわたり37℃および5%CO2で播種した。播種前に、このsHAディスクを30分にわたりGFP-PG1溶液(10ug)で局所的に処理した。共焦点撮像により、3Dバイオフィルム構造へのGFP-PG1処理の阻害効果を観測した。簡潔に言うと、2.5μM Alexa Fluor 647標識デキストランコンジュゲート(10kDa;647/668nm;Molecular Probes Inc.)を使用してEPSを標識し、細菌細胞を2.5μM SYTO9(485/498nm;Molecular Probes Inc.)で染色した。20×(開口数、1.00)水浸対物レンズを備えたLeica SP5顕微鏡を使用して撮像を実施した。励起波長は780nmであり、SYTO 9用の発光波長フィルタは495/540 OlyMPFEC1フィルタであり、Alexa Fluor 647用のフィルタはHQ655/40M-2Pフィルタであった。共焦点画像シリーズを各選択位置での光学切断により作成し、z-シリーズ走査のステップサイズは2μmであった。Amira 5.4.1ソフトウェア(Visage Imaging,San Diego,CA,USA)を使用して、バイオフィルム構造の3Dレンダリングを作成した[Xiao J et al.2012,Koo H et al.2010]。
選択した時点(19時間)でバイオフィルムを除去し、超音波処理によりホモジナイズし、既に説明されている微生物分析にかけ[Xiao J et al.2012,Koo H et al.2010]、本発明者らの超音波処理手順は細菌細胞を死滅させず、さらに最適な分散および最大の回復可能なカウントをもたらす。バイオフィルム懸濁液のアリコートを連続的に希釈し、自動Eddy Jet Spiral Plater(IUL,SA,Barcelona,Spain)を使用して血液寒天プレート上に蒔いた。一方、定量PCRと組み合わせたプロピジウムモノアジド(PAM)(PMA-qPCR)を使用して、Klein MI他[Klein MI et al.2012]が説明しているようにS.ミュータンス(S.mutans)細胞生存率を分析した。PMAおよびqCPRの組み合わせにより膜がインタクトな細胞(即ち生存細胞)のみが定量され、なぜならば、死滅細胞のDNAおよび細胞外DNAに架橋したPMAはこのDNAを改変し、この抽出されたDNAのPCR増幅を阻害するからである。簡潔に言うと、バイオフィルムペレットをTE(50mM Tris、10mM EDTA、pH8.0)500μlで再懸濁させた。ピペットを使用して、このバイオフィルム懸濁液を1.5ml微量遠心管に移し、次いでPMAと混合した。このバイオフィルム懸濁液にPMA(20%ジメチルスルホキシド中に20mM;Biotium,Hayward,CA)1.5μlを添加した。この管を、時折混合しつつ室温で5分にわたり暗所にてインキュベートした。次に、試料を3分にわたり光に当てた(600-Wハロゲン光源)。光誘起架橋の後、このバイオフィルム懸濁液を遠心分離し(13,000g/10分/4℃)、上清を廃棄した。ペレットをTE 100μlで再懸濁させ、続いてリゾチーム(100mg/mlストック)10.9μlおよびムタニライシン(mutanylysin)(5U/μlストック)5μlと共にインキュベートした(37℃/30分)。次いで、MasterPure DNA精製キット(Epicenter Technologies,Madison,WI)を使用してゲノムDNAを単離した。1つの試料当たりのゲノムDNA 10ピクトグラムおよび陰性コントロール(DNAなし)を、iQ SYBR Greenスーパーミックス(Bio-Rad Laboratories Inc.,CA)およびS.ミュータンス(S.mutans)特異的プライマー(16S rRNA)によるMyiQリアルタイムPCR検出システムにより増幅させた[Klein MI et al 2010]。
データを平均±標準偏差(SD)で表す。全てのアッセイを、少なくとも2つの別個の実験にて2回反復で実施した。Studentのt検定を使用して、試験とコントロールとの間でペアワイズ比較を行った。現在の研究での全ての統計的試験のために選択した有意水準はP<0.05であった。
トランスプラストミック系統の作製およびキャラクタリゼーション
全ての融合タグ(CTB、PTD、プロテグリン、レトロサイクリン)をN末端で緑色蛍光タンパク質(smGFP)に融合させて、これらの融合タグの効率および特異性を評価した。参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第13/101,389号明細書で説明されているように、これらの融合タンパク質をコードする融合構築物を葉緑体形質転換ベクター中にクローニングし、次いで、このベクターを使用して目的の植物を形質転換させた。GFP融合タンパク質を発現する植物を作製するために、微粒子銃粒子送達系を使用してタバコ葉緑体を形質転換させた。図1Bで見られるように、各タグ融合GFPは同一の調節配列(光により調節されるpsbAプロモーターおよび5’UTR)により駆動され、転写されたmRNAは3’psbA UTRにより安定化される。psbA遺伝子は最も高度に発現される葉緑体遺伝子であり、従って、本発明者らの研究室ではpsbA調節配列を導入遺伝子発現に使用する[7、34]。発現カセットの葉緑体ゲノムへの組込みを容易にするために、この発現カセットには、天然の葉緑体ゲノム配列と同一である2つの隣接配列(イソロイシル-tRNAシンテターゼ(trnI)遺伝子およびアラニル-tRNAシンテターゼ(trnA)遺伝子)が隣接する。選択培地から現れた新芽を、trnIおよびtrnAスペーサー領域での導入遺伝子カセットの特異的組込みに関して調べ、次いでサザンブロット分析により各植物細胞(非形質転換の野生型葉緑体ゲノムの欠如)中の全ての葉緑体ゲノムの形質転換を確認した。そのため、融合タンパク質の抽出前に、全てのGFP発現カセットの安定した組込みおよび導入遺伝子による葉緑体ゲノムのホモプラスミーを確認した。加えて、UV光下で緑色蛍光を可視化することにより、GFP発現を表現型的に確認した。次いで、確認したホモプラスミー系統を自動型温室に移して栽培してバイオマスを増加させた。
GFP融合抗微生物ペプチドRC101およびPG1を発現するタバコ葉を温室から収穫し、その後にタンパク質の抽出および精製のために凍結乾燥させた。デンシトメトリに基づいて、GFP-RC101の平均発現レベルは粗抽出物中の総タンパク質の8.8%であることが分かり、GFP-PG1の発現は総タンパク質の3.8%であった。発現レベルの差違は以前に報告されたものと同様であった(Lee et al 2011,Gupta et al,2015)。
本発明者らは、図2(A~E)に示すように用量反応時間死滅研究を使用してGFP-PG1の抗微生物活性を最初に調べた。GFP-PG1は、バイオフィルムを形成することおよびう蝕を引き起こすことが立証されている病原体であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)に対する強力な抗菌活性を示し、低濃度にて1時間以内にこの細菌細胞を急速に死滅させる(図2A)。GFP-PG1はまた、初期口腔生着菌ストレプトコッカス・ゴルドニ(Streptococcus gordonii)およびアクチノミセス・ネスルンディ(Actinomyces naeslundii)も死滅させたが、試験した濃度ではカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)に対して示す抗真菌活性は限定されていた(図2E)。タイムラプス共焦点撮像は、S.ミュータンス(S.mutans)の生存率が非処理コントロール(図3B)と比較して図3Aで示すように10分という早さで影響を受けることを示す。SEM撮像から、細胞内成分の放出および不規則な細胞形態を引き起こすS.ミュータンス(S.mutans)膜表面の破壊が明らかになり、非処理の細菌は、いかなる目に見える細胞溶解または残骸もなくインタクトで滑らかな表面を示した(図3C)。S.ミュータンス(S.mutans)に対するGFP-PG1の抗微生物効力が示されたことから、本発明者らは、この抗微生物ペプチドのバイオフィルム形成を予防するまたは既に形成されたバイオフィルムを破壊する可能性を調べた。
病原性口腔バイオフィルムの形成の予防は困難であり、なぜならば薬物は局所適用の後で治療効果を発揮する必要があるからである。GFP-PG1がバイオフィルムの開始を妨害し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、唾液が塗布されたアパタイト(sHA)表面(歯代用物)を30分にわたるGFP-PG1の単回局所処理で処理し、次いでう蝕原性(スクロースリッチ)条件下にて、活発に増殖するS.ミュータンス(S.mutans)細胞と共にインキュベートした。本発明者らは、GFP-PG1処理sHA表面上でのEPS-マトリックスの最小限の蓄積を伴うS.ミュータンス(S.mutans)によるバイオフィルム形成の実質的な障害を観察した(図4Bおよび図4C)。ほとんどの接着細胞集団はコントロールと比較してほぼ生存不能であり(図4A)、このことから、局所的で短期間の暴露にもかかわらず、バイオフィルム開始へのGFP-PG1の強力な効果が実証された。
表面上で形成されたバイオフィルムの破壊は困難である。う蝕原性バイオフィルムの破壊は特に困難であり、なぜならば、病原性細菌(例えばS.ミュータンス(S.mutans))の集団に絡み付いて保護する周囲の菌体外多糖(EPS)リッチマトリックスに起因して薬物はこの集団に到達できないことが多いからである[Bowen and Koo,2011]。EPS分解酵素(例えばデキストラナーゼおよびムタナーゼ)は、う蝕原性バイオフィルムのマトリックスの消化を助ける可能性がある。本発明者らは、細胞生存率に影響を及ぼすことなくEPSマトリックス破壊に必要なデキストラナーゼおよび/またはムタナーゼを最初に最適化した(データは示さない)。図5に示すように、デキストラナーゼおよびムタナーゼの組み合わせは、EPS(赤色)と、細菌細胞集団(緑色)および「非被覆」細胞(矢印を参照されたい)の間の「オープンスペース」(矢印を参照されたい)とを消化し得る。そのため、GFP-PG1とEPS分解酵素との組み合わせは、全体的な抗バイオフィルム効果を相乗的に増強する。
精製済GFP融合タンパク質は、ヒト培養細胞(例えばHPDLS、MMS、SCC-1、GMSC、AGKおよび骨芽細胞(OBC))と共にインキュベートした場合に興味深い結果を示した。各細胞系統について1つの代表的な画像のみを提示するが、取込み研究を3回反復で実施し、共焦点顕微鏡下で少なくとも10~15個の画像を記録した。融合タグがないと、試験したいずれのヒト細胞系統にもGFPが侵入しなかった。CTB-GFPおよびPTD-GFPの両方は、これらの局在化パターンは異なっていたが、試験した細胞型全てに効率的に侵入した。CTB-GFPとのインキュベーションでは、GFPシグナルは、HPDLSCおよびMMSCの末梢、SSC-1中の、AGK中の、OBC中の一様に小さい細胞質点、およびGMSC中の大きな細胞質フォーカス(cytoplasmic focus)に主に局在化した。PTD-GFPを、MMSC中の小さい細胞質フォーカスとして、HPDLSC中の、GMSC中の、AGK中の、OBC中の様々なサイズの細胞質点として、ならびにSSC-1細胞の細胞質および末梢の両方で観測された。PG1-GFPは、試験したヒト細胞全てへの侵入において最も効率的なタグであり、なぜならば、GFPは、あらゆる他の融合タンパク質と比べて10倍低い濃度で局在化し得たからである。PG1-GFPは、もっぱらHPDLCS細胞、SCC-1細胞、GMSC細胞およびAGK細胞で細胞質局在化を示し、MMSCでは末梢およびサイトゾルの両方に局在化したが、OBCの末梢にのみ局在化した。RC101-GFPは、SSC-1、GMSC、AGKおよびOBCでは局在化したが、HPDLSCでの局在化はごくわずかであり、MMSC細胞では検出不能であった。
う蝕原性口腔バイオフィルムの構築は、細胞外EPSマトリックスが発達するにつれて、病原性細菌が表面(歯)上にどのように蓄積されるかの主な例である。う蝕原性バイオフィルム形成の予防は、局所処置による歯表面上での細菌蓄積の破壊を必要とする。クロルヘキシジン(CHX)は局所抗微生物療法の「ゴールドスタンダード」と見なされている(Flemmig and Beikler 2011;Marsh et al 2011;Caufield et al 2001)。CHXは唾液中のミュータンス連鎖球菌レベルを効率的に抑制するが、CHXは歯の汚れおよび歯石形成等の有害な副作用を有し、日々の予防または治療的使用には推奨されていない(Autio-Gold 2008)。代替として、いくつかの抗微生物ペプチド(AMP)が開発されて口腔細菌に対して試験されており、(浮遊細胞に対する効果は減少しているが)バイオフィルムに対して潜在的な効果を示している(Silva et al.,2012により概説されている)。残念ながら、これらの研究のほとんどは、臨床的に使用されているような局所処置レジメンではなくAMPへの連続的な長期バイオフィルム暴露(数時間)を使用して抗バイオフィルム効率を試験した。さらに、合成AMPは製造コストが高く、歯科用途には負担しきれないものになっている。ここで、本発明者らは植物により産生されるAMPが、歯代用物表面の単回で短期の局所処理により、バイオフィルム形成の制御において強力な効果を示すことを示した。
機械的粉砕により、植物細胞中で合成されたタンパク質薬物を放出することが実行可能であり、チューインガムに埋め込まれた凍結乾燥植物細胞に生体カプセル封入された(bioencapsulated)タンパク質薬物は、より長い持続期間のために、それらの緩慢な且つ徐放のための薬物送達を理想的な様式を提供する。これにより、現在の口腔リンス製剤の主要な制限(歯肉/歯の表面上での抗微生物剤の接触の短い持続期間)が克服される。
これらの課題は全て、口腔の健康を増進するためにこの新規の薬物送達概念を使用することで解消される可能性がある。タンパク質薬物の製造のための植物細胞の近年のFDA承認(Walsh 2014)は、この新規の概念の臨床上での進歩にとって良い兆候である。
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AMP、バイオフィルム分解酵素およびこれらの融合タンパク質を発現する葉緑体ベクターの作製
抗微生物剤が、微生物の集団に絡み付いて保護する周囲の細胞外マトリックス内に存在するこの集団に到達しないことが多いことから、バイオフィルム関連感染の効果的な処置は、問題がある。さらに、バイオフィルム関連の口腔疾患および口腔の健康の維持に対する新規の治療法の開発は、対費用効果が高く且つ容易に利用可能であることが必要である。
また、他の微生物種と比較した場合に、RM1ムタナーゼはバイオフィルム分解特性の増強を示す。特に、真菌性酵素はグリコシル化を必要とし、このグリコシル化は葉緑体中での真菌性酵素の発現を妨げる。
加えて、ヒト系での糖タンパク質の免疫原性は、さらなる規制上の懸念を生じさせる場合がある。従って、本発明は、葉緑体中での発現のための細菌性デキストラナーゼおよび細菌性ムタナーゼの使用を含む。
AMPの合成を最大化し且つ毒性を低減するために、図10に示すようにプロテアーゼ開裂部位により分離された、PG1またはRC101の10個のタンデムリピートを用いる。発現遺伝子の各コピーに関して、PG1またはRC101の10個の機能的コピーが作られる。この目的のために、本発明者らはタバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼを選択しており、このプロテアーゼは、高い特異性および7個のアミノ酸からなる短い開裂部位を有する。あるいは、フリン開裂部位も用い得る。このベクターを、バイオフィルム分解酵素をコードする核酸を含むようにも操作し得る。このコード領域を、AMPを発現するために利用されるプロモーター下で発現させ得る、または第2のプロモーター領域に作動可能に連結されたベクターに連結し得る。バイオフィルム分解酵素コード配列はまた、この酵素の放出を容易にするためにTEVプロテアーゼ開裂部位も含み得る。このアプローチにより、化学的開裂方法と比べて安全できれいな選択肢が提供される。最も重要なことに、融合タンパク質中の個々のPG1ペプチドは開裂前に二次構造体を形成せず、そのため宿主産生系にとって致命的であり得る機能的ペプチドの蓄積が回避される。実施例Iで開示された方法を使用して、開裂したPG1/RC101、バイオフィルム分解酵素またはこれらの融合タンパク質の抗微生物活性を使用してバイオフィルムを分解し得る。
疎水性相互作用カラム(HIC;TOSOH Butyl Toyopearl 650m)を使用して、緑色蛍光タンパク質(GFP)と融合したPG1を精製し得る。GFPはHICに選択的に結合し、Rc101/PG1を>90%の純度まで促進する。高価なHICクロマトグラフィー法の使用にもかかわらず、回収率は非常に悪い(<20%)。この問題に取り組んで収率を高めるために、エラスチン様バイオポリマーを有するPG1の10個のタンデムリピート(GVGVP(配列番号11);図10)をベクターに遺伝子操作する。このバイオポリマーは、このバイオポリマーの逆転移温度(Tt)を超えて温度が上昇すると溶液から沈殿するという独特な熱的性質を有する。GVGVPは、Tt未満では可溶性単量体状態に留まり、Ttを超えると不溶性凝集体を形成する。可溶性状態から不溶性状態へのこの相転移は溶液の温度を変更することにより可逆的であり、これによりタンパク質精製が容易になる。その後、融合タンパク質を、Tt未満に冷却することにより再び可溶化させて、図11に示すように共沈殿したあらゆる不溶性混入物を除去する。加熱(37℃)および冷却(4℃)のプロセスは逆転移サイクリング(ITC)として既知であり、3~5回のラウンドのITCを実施することにより高度に精製されたタンパク質が得られる(>98%純度、図11)。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB489092も参照されたい
Genbank AB489092
全長:1,146
質量(Da):119,007
参考文献:Otsuka R,et al.Microbiol Immunol.2015 Jan;59(1):28-36.
>gi|257153265|dbj|BAI23187.1|putative mutanase[Paenibacillus humicus]
MRIRTKYMNWMLVLVLIAAGFFQAAGPIAPATAAGGANLTLGKTVTASGQSQTYSPDNVKDSNQGTYWESTNNAFPQWIQVDLGASTSIDQIVLKLPSGWETRTQTLSIQGSANGSTFTNIVGSAGYTFNPSVAGNSVTINFSAASARYVRLNFTANTGWPAGQLSELEIYGATAPTPTPTPTPTPTPTPTPTPTPTVTPAPSATPTPTPPAGSNIAVGKSITASSSTQTYVAANANDNNTSTYWEGGSNPSTLTLDFGSNQSITSVVLKLNPASEWGTRTQTIQVLGADQNAGSFSNLVSAQSYTFNPATGNTVTIPVSATVKRLQLNITANSGAPAGQIAEFQVFGTPAPNPDLTITGMSWTPSSPVESGDITLNAVVKNIGTAAAGATTVNFYLNNELAGTAPVGALAAGASANVSINAGAKAAATYAVSAKVDESNAVIEQNEGNNSYSNPTNLVVAPVSSSDLVAVTSWSPGTPSQGAAVAFTVALKNQGTLASAGGAHPVTVVLKNAAGATLQTFTGTYTGSLAAGASANISVGSWTAASGTYTVSTTVAADGNEIPAKQSNNTSSASLTVYSARGASMPYSRYDTEDAVLGGGAVLRTAPTFDQSLIASEASGQKYAALPSNGSSLQWTVRQGQGGAGVTMRFTMPDTSDGMGQNGSLDVYVNGTKAKTVSLTSYYSWQYFSGDMPADAPGGGRPLFRFDEVHFKLDTALKPGDTIRVQKGGDSLEYGVDFIEIEPIPAAVARPANSVSVTEYGAVANDGKDDLAAFKAAVTAAVAAGKSLYIPEGTFHLSSMWEIGSATSMIDNFTVTGAGIWYTNIQFTNPNASGGGISLRIKGKLDFSNIYMNSNLRSRYGQNAVYKGFMDNFGTNSIIHDVWVEHFECGMWVGDYAHTPAIYASGLVVENSRIRNNLADGINFSQGTSNSTVRNSSIRNNGDDGLAVWTSNTNGAPAGVNNTFSYNTIENNWRAAAIAFFGGSGHKADHNYIIDCVGGSGIRMNTVFPGYHFQNNTGITFSDTTIINSGTSQDLYNGERGAIDLEASNDAIKNVTFTNIDIINAQRDGVQIGYGGGFENIVFNNITIDGTGRDGISTSRFSGPHLGAAIYTYTGNGSATFNNLVTRNIAYAGGNYIQSGFNLTIK(配列番号12)
>gi|257153264|dbj|AB489092.1|Paenibacillus humicus mut gene for putative mutanase,complete cds
1 aaaggaggat cgccaaccaa tcatcccagc aaagaaggtg atggcagccc aagaattgaa
61 agcgctttga atttggaata tacggatttg gccgacctgc tgattcagtc gtattcaagc
121 gattatgccg cgaaccaatc gaacccgagg aggactataa tgcgtatccg cactaaatat
181 atgaactgga tgttggtgct cgtcctgatc gccgccggct tcttccaggc tgccggcccc
241 atcgctcccg ccaccgctgc aggaggcgcg aatctgacgc tcggcaaaac cgtcaccgcc
301 agcggccagt cgcagacgta cagccccgac aatgtcaagg acagcaatca gggaacttac
361 tgggaaagca cgaacaacgc cttcccgcag tggatccaag tcgaccttgg cgccagcacg
421 agcatcgacc agatcgtgct caagcttccg tccggatggg agactcgtac gcaaacgctc
481 tcgatacagg gcagcgcgaa cggctcgacg ttcacgaaca tcgtcggatc ggccgggtat
541 acattcaatc catccgtcgc cggcaacagc gtcacgatca acttcagcgc tgccagcgcc
601 cgctacgtcc gcctgaattt cacggccaat acgggctggc cagcaggcca gctgtcggag
661 cttgagatct acggagcgac ggcgccaacg cctactccca cgcctactcc aacaccaacg
721 ccaacgccaa caccaacgcc aacccctaca gtaacccctg cgccttcggc cacgccgact
781 ccgactcctc cggcaggcag caacatcgcc gtagggaaat cgattacagc ctcttccagc
841 acgcagacct acgtagctgc aaatgcaaat gacaacaata catccaccta ttgggaggga
901 ggaagcaacc cgagcacgct gactctcgat ttcggttcca accagagcat cacttccgtc
961 gtcctcaagc tgaatccggc ttcggaatgg gggactcgca cgcaaacgat ccaagttctt
1021 ggagcggatc agaacgccgg ctccttcagc aatctcgtct ctgcccagtc ctatacgttc
1081 aatcccgcaa ccggcaatac ggtgacgatt ccggtctccg cgacggtcaa gcgcctccag
1141 ctgaacatta cggcgaactc cggcgcccct gccggccaga ttgccgagtt ccaagtgttc
1201 ggcacgccag cgcctaatcc ggacttgacc attaccggca tgtcctggac tccgtcttct
1261 ccggtcgaga gcggcgacat tacgctgaac gccgtcgtca agaacatcgg aactgcagct
1321 gcaggcgcca cgacggtcaa tttctacctg aacaacgaac tcgccggcac cgctccggta
1381 ggcgcgcttg cggcaggagc ttctgcaaat gtatcgatca atgcaggcgc caaagcagcc
1441 gcaacgtatg cggtaagcgc caaagtcgac gagagcaacg ccgtcatcga gcagaatgaa
1501 ggcaacaaca gctactcgaa cccgactaac ctcgtcgtag cgccggtgtc cagctccgac
1561 ctcgtcgccg tgacgtcatg gtcgccgggc acgccgtcgc agggagcggc ggtcgcattt
1621 accgtcgcgc ttaaaaatca gggtacgctg gcttccgccg gcggagccca tcccgtaacc
1681 gtcgttctga aaaacgctgc cggagcgacg ctgcaaacct tcacgggcac ctacacaggt
1741 tccctggcag caggcgcatc cgcgaatatc agcgtgggca gctggacggc agcgagcggc
1801 acctataccg tctcgacgac ggtagccgct gacggcaatg aaattccggc caagcaaagc
1861 aacaatacga gcagcgcgag cctcacggtc tactcggcgc gcggcgccag catgccgtac
1921 agccgttacg acacggagga tgcggtgctc ggcggcggag ctgtcctgag aacggcgccg
1981 acgttcgatc agtcgctcat cgcttccgaa gcatcgggac agaaatacgc cgcacttccg
2041 tccaacggct ccagcctgca gtggaccgtc cgtcaaggcc agggcggtgc aggcgtcacg
2101 atgcgcttca cgatgcccga cacgagcgac ggcatgggcc agaacggctc gctcgacgtc
2161 tatgtcaacg gaaccaaagc caaaacggtg tcgctgacct cttattacag ctggcagtat
2221 ttctccggcg acatgccggc tgacgctccg ggcggcggca ggccgctctt ccgcttcgac
2281 gaagtccact tcaagctgga tacggcgttg aagccgggag acacgatccg cgtccagaag
2341 ggcggtgaca gcctggagta cggcgtcgac ttcatcgaga tcgagccgat tccggcagcg
2401 gttgcccgtc cggccaactc ggtgtccgtc accgaatacg gcgctgtcgc caatgacggc
2461 aaggatgatc tcgccgcctt caaggctgcc gtgaccgcag cggtagcggc cggaaaatcc
2521 ctctacatcc cggaaggcac cttccacctg agcagcatgt gggagatcgg ctcggccacc
2581 agcatgatcg acaacttcac ggtcacgggt gccggcatct ggtatacgaa catccagttc
2641 acgaatccca atgcatcggg cggcggcatc tccctgagaa tcaaaggaaa gcttgatttc
2701 agcaacatct acatgaactc caacctgcgt tcccgttacg ggcagaacgc cgtctacaaa
2761 ggctttatgg acaatttcgg cactaattcg atcatccatg acgtctgggt cgagcatttc
2821 gaatgcggca tgtgggtcgg cgactacgcc catactcctg cgatctatgc gagcgggctc
2881 gtcgtggaaa acagccgcat ccgcaacaat cttgccgacg gcatcaactt ctcgcaggga
2941 acgagcaact cgaccgtccg caacagcagc atccgcaaca acggcgatga cggcctcgcc
3001 gtctggacga gcaacacgaa cggcgctccg gccggcgtga acaacacctt ctcctacaac
3061 acgatcgaga acaactggcg cgcggcggcc atcgccttct tcggcggcag cggccacaag
3121 gctgaccaca actacatcat cgactgtgtc ggcggctccg gcatccggat gaatacggtg
3181 ttcccaggct accacttcca gaacaacacc ggcatcacct tctcggatac gacgatcatc
3241 aacagcggca ccagccagga tctgtacaac ggcgagcgcg gagcgattga tctggaagct
3301 tccaacgacg cgatcaaaaa cgtcaccttc accaacatcg acatcatcaa tgcccagcgc
3361 gacggcgttc agatcggcta tggcggcggc ttcgagaaca tcgtgttcaa caacatcacg
3421 atcgacggca ccggccgcga cgggatatcg acatcccgct tctcgggacc tcatcttggc
3481 gcagccatct atacgtacac gggcaacggc tcggcgacgt tcaacaacct ggtgacccgg
3541 aacatcgcct atgcaggcgg caactacatc cagagcgggt tcaacctgac gatcaaatag
3601 gctgcaaaaa aaaggaagct cctcggagct tccttttttt(配列番号13)
1.パエニバチルス・カードラノリティカス(Paenibacillus curdlanolyticus)MP-1由来のムタナーゼの一般情報
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HQ640944
Genbank HQ640944;全長:1,261;質量(Da):131,631
参考文献:Pleszczynska M,et al.Protein Expr Purif.2012 Nov;86(1):68-74.
>gi|315201261|gb|ADT91063.1|alpha-1,3-glucanase[Paenibacillus curdlanolyticus]
MRNKYVTWTLALTMLFSSFFLAVGPNKVVHAAGGTNLALGKNVTASGQSQTYSPNNVKDSNQSTYWESTNNAFPQWIQVDLGATTSIDQIVLKLPAGWGTRTQTLAVQGSTDGSSFTNIVGSAGYVFNPAVANNAVTINFSAASTRYVRLNVTANTAWPAAQLSEFEIYGAGGTTTPPTTPAGTYEAESAALSGGAKVNTDHTGYTGTGFVDGYWTQGATTTFTANVSAAGNYDVTLKYANASGSAKTLSVYVNGTKIRQTTLASLANWDTWGTKVETLSLNAGNNTIAYKYEASDSGNVNIDSIAVAPSTSTPVDPEPPITPPTGSNIAIGKAISASSNTQAFVAANANDNDTNTYWEGGAASSTLTLDLGANQNVTSIVLKLNPSSAWSTRTQTIQVLGHNQSTTTFSNLVSSQSYTFNPATGNSVTIPVTATVKRLQLSITANSGSGAGQIAEFQVYGTPAPNPDLTITGMSWTPASPIETDAVTLNATVKNSGNADAPATTVNFYLNNELVGSSPVGALAAGASSTVSLNVGTKTAATYAVSAKVDESNSIIEQNDANNSYTNASSLVVAPVASSDLVGATTWTPSTPVAGNAIGFMVNLKNQGTIASASGAHGITVVVKNAAGAALQSFSGTYSGAIAAGASVNVTLPGTWTAVNGSYTVTTTVAVDANELTNKQGNNVSTSNLVVYAQRGASMPYSRYDTEDATRGGGATLQTAPTFNQAQIASEASGQSYIALPSNGSSAQWTVRQGQGGAGVTMRFTMPDSTDGMGLNGSLDVYVNGVKVKTVSLTSYYSWQYFSGDMPGDAPSAGRPLFRFDEVHWKLDTPLQPGDTIKIQKGNGDSLEYGIDFLEIEPVPTAIAKPANSLSVTEYGAVANDGQDDLAAFKATVTAAVAAGKSVYIPAGTFNLSSMWEIGSANNMINNITITGAGYWHTNIQFTNPNAAGGGISLRISGQLDFSNVYMNSNLRSRYGQNAIYKGFMDNFGTNSKIHDVWVEHFECGMWVGDYAHTPAIYATGLVVENSRIRNNLADGINYSQGTSNSIVRNSSIRNNGDDGLAVWTSNTNGAPAGVNNTFSYNTIENNWRAGGIAFFGGGGHKADHNLIVDTVGGSGIRMNTVFPGYHFQNNTGITFSDNTLINTGTSQDLYNGERGAIDLEASNDAIKNVTFTNIDIINTQRDAIQFGYGGGFENIVFNNININGTGLDGVTTSRFAGPHKGAAIYTYTGNGSATFNNLTTSNVAYPGLNFIQQGFNLVIQ(配列番号14)
1 atgcgcaaca agtatgtcac atggacgctc gccctgacga tgctattttc gagcttcttc
61 cttgcagtag gtcccaacaa ggtcgttcac gcagcaggcg gaacgaattt agcgctcggc
121 aaaaacgtta cggcaagcgg ccaatcgcaa acgtatagtc ccaacaatgt aaaagacagc
181 aatcaatcga cgtactggga aagcacgaac aatgcattcc cgcaatggat tcaagtagac
241 ttaggcgcaa cgacgagcat tgaccaaatc gtactgaagc tgcccgctgg atggggtacg
301 cgtacgcaaa cgttagctgt tcaaggaagc acggacggtt cctcgttcac gaatatcgtg
361 ggctccgcag gctatgtatt taatcctgct gttgccaata acgccgttac gattaacttc
421 tctgctgcaa gcacgcgtta tgttcgtctg aacgtaacag cgaacacggc ttggccagca
481 gcgcagctgt ccgaattcga gatttatggc gctggcggca cgacgacgcc tccaacaacg
541 ccagcaggca catatgaagc tgaatccgca gcattgtccg gcggtgcgaa agtgaacacg
601 gatcataccg gctacacggg tacgggcttt gttgacggct actggacaca aggcgcgaca
661 acgacgttca cggctaacgt gtccgcagct ggcaactatg acgttacatt gaaatatgcc
721 aacgcaagcg gcagtgccaa gacgctaagc gtttacgtca acggcacgaa gattcgccag
781 acgacgctgg caagcctggc aaactgggac acttggggca cgaaggttga gacgctgagc
841 ttgaatgccg gcaataatac gattgcatac aagtatgagg ctagcgactc gggcaacgtg
901 aatatcgact ccattgccgt ggcgccatcg acttcgacac cggtagatcc agaaccgccg
961 atcacgccgc caacgggcag caatatcgca atcggcaaag cgatcagcgc atcttcgaat
1021 acgcaagcat tcgtagctgc caacgcgaac gataacgata cgaacacgta ctgggaaggc
1081 ggagctgcat cgagcacgct gacgctggat cttggcgcga accaaaatgt aacctcgatc
1141 gtgctgaagc tgaatccttc ttcggcatgg agcacgcgta cgcaaacgat ccaagtgctt
1201 ggccacaacc aaagcacgac gacgttcagc aatctggtat cttcgcaatc gtatacgttc
1261 aatcctgcaa cgggcaactc cgtgacgatt ccggttacgg caacagttaa gcgcttgcag
1321 ctgagcatta cggcgaactc gggttccggc gctggtcaaa ttgcggaatt ccaagtgtat
1381 ggaacgccgg caccaaaccc agacctgacg atcacaggca tgtcctggac gcctgcttcg
1441 ccaattgaaa cggatgcagt tacgctgaat gcaacggtta aaaacagcgg aaatgcagac
1501 gctcctgcaa cgacggtaaa cttctacctg aacaatgagc tcgtaggctc ctcgccagtt
1561 ggcgcacttg ctgcaggcgc ttcctcgacg gtttcgctga atgttggtac gaaaacggct
1621 gcaacttatg cagttagcgc gaaagtcgat gagagcaatt cgattatcga gcaaaatgat
1681 gcgaacaaca gttatacgaa cgcatcctcg ctcgtcgtcg ctcctgtcgc aagctctgac
1741 ttggttggcg cgacgacgtg gacgcctagc acgccggttg ccggcaatgc aattggcttc
1801 atggtaaatc ttaaaaacca aggaacgatt gcatctgcaa gcggcgcgca tggcattaca
1861 gttgtcgtga aaaatgccgc aggcgctgcg ctccaatcgt tcagcggcac ctacagcgga
1921 gcaatcgcag ctggcgcatc cgttaacgta accctgccag gtacgtggac ggctgtgaat
1981 ggcagctaca cggtaacgac aacggttgct gtcgatgcta acgagctgac gaacaaacaa
2041 gggaacaacg taagcacttc gaacctcgtt gtttatgcac aacgtggcgc aagcatgcct
2101 tacagccgtt atgacacgga agacgctaca cgtggcggcg gtgcaacgct gcaaaccgca
2161 ccaaccttca accaagcgca aatcgcttcg gaagcatccg gacaaagcta tatcgcgctg
2221 ccttcgaacg gctcctccgc acaatggacg gtccgtcaag gacaaggcgg agctggcgtt
2281 acgatgcgct tcacgatgcc ggattcgact gacggtatgg gtttgaacgg ttcgctcgac
2341 gtttatgtca acggcgttaa agtaaaaacg gtatcgctca cgtcctacta cagctggcag
2401 tatttctcgg gcgatatgcc tggcgatgcg ccgtccgctg gccgtccgtt gttccgcttt
2461 gacgaagtac actggaagct tgacacgcct cttcaaccag gcgacacgat caaaatccaa
2521 aaaggcaacg gagatagcct ggaatacggc attgacttcc tcgaaatcga gccggttcca
2581 acagcaatcg ctaaacctgc caactcgctt tccgttacgg agtatggcgc tgtagcaaac
2641 gatggccaag acgaccttgc cgcattcaaa gcaacggtta cggctgcagt tgctgctggc
2701 aaatccgttt acattcctgc tggcacgttc aatctgagca gcatgtggga aatcggatcg
2761 gctaacaaca tgatcaacaa cattacgatt acaggcgcag gctactggca tacgaacatt
2821 caattcacga atccgaatgc agcaggcggc ggcatttcgc tccggatttc cggacagctt
2881 gatttcagca atgtttacat gaactccaac ctgcgttcgc gttatggtca aaatgcgatt
2941 tacaaaggct tcatggacaa cttcggcaca aactccaaaa tccatgacgt atgggttgag
3001 cacttcgagt gcggcatgtg ggtaggcgat tacgcgcata cgccagcgat ctatgcaacg
3061 ggtcttgtcg ttgaaaacag ccggattcgc aacaaccttg cagacggcat caactactcg
3121 caaggcacga gcaattcgat cgtacgcaac agcagtatcc gcaataacgg tgatgacggt
3181 ctggcggttt ggacgagtaa cacgaatggc gcgccagcag gcgtgaacaa cacgttctcg
3241 tacaacacga tcgaaaacaa ctggcgtgca ggcggtatcg cattcttcgg cggcggcggc
3301 cacaaggctg accacaacct gatcgttgat acggttggcg gctccggcat ccggatgaac
3361 acggtattcc caggctacca cttccaaaac aacacgggta ttacgttctc cgacaacacg
3421 ctgatcaaca caggcacaag ccaagatttg tacaacggcg agcgcggtgc gatcgatctc
3481 gaagcatcga acgatgcaat caagaacgtc acgttcacga acatcgacat catcaacacc
3541 cagcgcgatg cgatacaatt cggctacggc ggcggattcg agaacatcgt atttaacaac
3601 attaacatta acggtacggg gcttgacggc gttacaacct cacggtttgc tggaccgcat
3661 aaaggtgctg caatctacac gtacacgggc aatggctctg caacgttcaa taacctgacg
3721 acgagcaacg tggcatatcc aggcttgaat ttcattcagc aaggctttaa tctggtgatc
3781 cagtag(配列番号15)
1.ムタナーゼの一般情報
Genbank E16590;全長:1,291;質量(Da):135kD
参考文献:Shimotsuura I,et al.Appl Environ Microbiol.2008 May;74(9):2759-65.
1 cccgggtacc agacctatcg ggaaaaacgc gagcggccct tcgcgcctta tgcgctacgg
61 acggtgctgg cgggcggttt gtttttcatc atcattcccc tgatgatcta cacggcatcg
121 tatatcccgt ttttgctcgt gccgggtccc ggacacgggt tgaaagacgt cgtctccgcc
181 cagaagttca tgttcaatta tcatagccgg cttaacgcca cccacccatt ctcgtcgctg
241 tggtgggagt ggcctctcat ccgcaagccg atctggtatt acggagccgc ggaattggcg
301 ccgggaaaaa tggcgagcat cgtgggcatg ggcaatccgg cggtgtggtg gacgggaacg
361 attgcggtaa tcgcggccct tcgctcggcc tggaagaagc gggaccggag catgaccgtc
421 gtcttcgttg gaatcgcctc gtcttatctt ccgtgggttt tcgtatccag actcaccttt
481 atttatcact ttttcgcttg cgttccgttt ctcgttcttt gcatcgttta ttggattcga
541 aaaatggaat agcgtaagcc gggatatcgg attgcgacgc tcctttacgc aggcgcggtt
601 ctggtgctgt tcattttgtt ttacccgatt ttgtcgggga ccgaaataga cgtttcttac
661 gcggaccgcg ttctgaagtg gttcggcggg tggatttttc acgggtaagc gagcgttgga
721 agcaaggaag ggaaggaaga cgagcgtctc cttcccgaaa tccatccaat atcttgaaat
781 tgcatacatt tttcgtaaga ttgcttctta tctgtctccc tcccctgttc ttataatggg
841 ggtatcccaa cgaaaggagg gtttgtaagc gctgtcagcs tgtttgccga aagttctcgc
901 atttgctgac ctacactttg aggaggagga atttaatgcg ctgcaaattt gtcgcatggt
961 cgcttgttac agccatgctg atggccagtt tgctgacggc tgtaggaccg ttcggccccg
1021 cttccgccgc gggaggaccg aatctgacgc cgggcaaacc cattacggcg agcggccaat
1081 cccaaaccta cagccctcag aacgtaaaag acggcaatca aaatacgtat tgggaaagca
1141 cgaacaacgc gttcccgcaa tggattcaag tggatttggg cgcaagcacg ggcatcgacc
1201 aaattgtgct gaagctgccc gcaagctggg aagcgcgcac gcaaacgctg gccgttcaag
1261 gcagcttgaa cggttcgacg ttcacggaca ttgtcggctc cgccaattat gtattcagtc
1321 cgtctgtcgg gaacaacacg gttacgatca actttaccgc gaccagcacg cgctacgtgc
1381 gcttgtatgt aacggccaac acgggctggc cggcggcgca gctgtccgaa ttcgaaattt
1441 acggctccgg cgaccagacg ccggcgcctg atacgtatca agccgaatcc gcggctctgt
1501 ccggcggcgc gaaagtcaac acggaccatg ccggatatat cggcacgggc tttgttgacg
1561 gttactggac gcaaggcgcg acgacgacct tttcggtcaa cgcgccgacg gcgggcaact
1621 acgatgtaac gctgaggtac ggcaacgcaa ccggcagcaa caaaacggta agcctctacg
1681 tcaatggagc gaagattcgc cagaccacgc tgcccagcct gcctaactgg gattcatgga
1741 gcagcaagac ggagacgctt aacctgaatg caggcagcaa caccattgcg tacaaatacg
1801 acccgggcga ttccggcaac gtcaatcttg accaaatcac ggtcgaagcg tcgacttcaa
1861 cgcctactcc tactccatcc cctactccta cacctacgcc aacgccgacg cctacgccta
1921 cgcctacacc cacacctact ccgaccccga cgcctacgcc tacacctaca cctacaccta
1981 cgccgacgcc tcctccgggc ggcaacatcg ccatcggcaa atcgatttcc gcatcctccc
2041 acacgcagac gtacgttgcg gagaacgcga acgataacga tgtcaacacg tactgggaag
2101 gcggcggcaa tccgagcacg ctgacgctcg atctcggagc gaactacaat attacgtcca
2161 tcgtgctgaa gctgaacccg tcctcgatat gggctgcgcg tacgcaaacg attcaagtgc
2221 tcggacacga tcagaacacg acgaccttca gcaatctggt ctcggcgaaa tcgtactcgt
2281 tcgatccggc ctccggcaat actgtgacca ttccggttac ggcgacggtg aaacgtttgc
2341 agttgaacat tacgtcgaac tccggcgccc cggccggaca agtcgccgag ttccaggtgt
2401 tcggcacgcc tgcgccgaat ccggacctga cgattaccgg catgtcctgg tcgccttctt
2461 ctccggttga gaccgacgcc attacgctaa acgcaacggt gaagaacaac gggaatgcca
2521 gcgccgcggc gaccaccgtc aatttctacc tgaacaacga gctggcgggt tccgcgccgg
2581 tagccgcgct ggcggcaggc gcttcggcaa cggtgccgct gaatgtcggc gcgaaaaccg
2641 ccgcgacata cgcggtcggc gccaaagtag acgagagcaa cgcggtcatc gagctgaacg
2701 agtcgaacaa cagctacacg aatccggctt cactcgttgt ggcccccgtt tccagctcgg
2761 atctggtggg cacggtttcg tggacgccga gcactccgat tgccaacaat gccgtttctt
2821 ttaacgtaaa tcttaaaaat caaggaacga ttgcttccgc cggcgggtct cacggcgtga
2881 cggtcgtgct taaaaatgct tccggttcga ccgttcaaac gttcagcggt tcctataccg
2941 gcagcctggc tccgggagcg tccgtcaaca tcacccttcc ggggacctgg acggcggcag
3001 ccggcagcta cacggtaacg gccaccgttg cggcagacgc caacgaactt ccgatcaagc
3061 aagccaacaa cgcgaacacc gcaagcctga ccgtatattc cgcccgcggc gcgagcatgc
3121 cgtacagccg gtatgacacc gaggacgcca ccctcggcgg cggcgccacg ctgaagtccg
3181 cgccgacatt cgatcaggcg cttacggcat cggaagccac cggccaactc tatgcggcgc
3241 tgccctcgaa cggctcctat cttcaatgga ccgtcagaca gggtcagggc ggcgcaggcg
3301 tgacgatgag atttacgatg cccgactcgg cggacggcat gggattaaac ggttcgctag
3361 acgtttacgt caacggcacc aaagtcaaaa ccgtatcgct gacctcctac tacagctggc
3421 agtatttctc gggcgatatg cccggagacg ctcccagcgc gggccgtccg ctcttccgct
3481 ttgacgaagt gcactggaag ctggatactc cgctcaaacc cggagacacg attcgcatcc
3541 agaagaacaa cggcgacagc ctggaatacg gtgtcgactt tattgaaatc gaaccggttc
3601 cggctgcgat ctcccgtccg gccaactcgg tttccgtaac ggattacggc gctgtgccga
3661 acgacggaca ggacgatctc accgccttta aagccgccgt aaacgcggcg gtcgcatccg
3721 acaagatctt gtacattccg gaaggaacgt tccacctcgg caacatgtgg gagatcggtt
3781 ccgtcagcaa catgatcgat cacattacga ttacgggagc cggtatctgg tatacgaaca
3841 tccagtttac caacgccaat ccggcgtccg gcggcatctc gctccggatt acgggcaagc
3901 ttgatttcag caacgtgtac ctcaactcca atttgcggtc gcggtatggt caaaatgcgg
3961 tttacaaagg ctttatggac aacttcggga ccaattccgt catccgcgac gtctgggtcg
4021 agcacttcga atgcggcttc tgggtcgggg actacgggca tacgccggcg atccgcgcga
4081 gcgggctgct gattgaaaac agccgaatcc gcaacaacct ggccgatggc gtcaacttcg
4141 cccaagggac cagcaattcg accgtacgca acagcagcct gcgcaacaac ggcgacgacg
4201 cccttgccgt atggacgagt aatacgaacg gcgcgcccga aggcgtaaac aataccttct
4261 cgtacaacac catcgaaaac aactggcgcg cgggaggcat cgccttcttc ggaggaagcg
4321 gacacaaggc cgaccacaac tacatcgtcg actgcgtcgg cggttccggc atccggatga
4381 acaccgtgtt ccccggatac cacttccaga acaataccgg cattgtgttc tcggacacga
4441 ccatcgtcaa ctgcggcacg agcaaagacc tatacaacgg cgaacgcggc gccatcgatc
4501 tggaagcttc gaacgacgcc atccggaacg tgacgtttac caacatcgat attatcaact
4561 ctcagcgcga tgcgatccag ttcggttacg gcggcggctt caccaacatc gtgttcaaca
4621 acatcaacat taacggaacc ggtcttgacg gcgtaaccac ctcgcggttc tcgggaccgc
4681 atctgggcgc ggcgatcttc acctataccg gcaacggctc cgccacgttc aacaatctga
4741 ggaccagcaa tatcgcttac cccaatctgt attacatcca gagcgggttc aatctgatca
4801 tcaataatta gatatctggg cccgtctgcg ggggaggaac tcttcggagc tcgaattcgt
4861 aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca
4921 tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat
4981 taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa ctgtcgtgcc agctgcatta
5041 atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcsg tttkcgtatt gggcgccctt(配列番号17)
1.トリコデルマ・ハルチアナム(Trichoderma harzianum)由来のムタナーゼの一般情報
http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WZM7も参照されたい 全長:635
質量(Da):67,726
最終変更:2002年3月1日-v1
Checksum:iBB0D864E2F432C58
http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WZM7.fasta)
>tr|Q8WZM7|Q8WZM7_TRIHA Alpha-1,3-glucanase OS=Trichoderma harzianum GN=p3 PE=2 SV=1
MLGVFRRLRLGALAAAALSSLGSAAPANVAIRSLEERASSADRLVFCHFMIGIVGDRGSS
ADYDDDMQRAKAAGIDAFALNIGVDGYTDQQLGYAYDSADRNGMKVFISFDFNWWSPGNA
VGVGQKIAQYANRPAQLYVDNRPFASSFAGDGLDVNALRSAAGSNVYFVPNFHPGQSSPS
NIDGALNWMAWDNDGNNKAPKPGQTVTVADGDNAYKNWLGGKPYLAPVSTWVFNHFGPEV
SYSKNWVFPSGPLIYNRWQQVLQQGFPRVEIVTWNDYGESHYVGPLKSKQFHDGNSKWVN
DMPHDGFLDLSKPFIAAYKNRDTDISKYVQNEQLVYWYRRNLKALDCDATDTTSNRPANN
GSGNYFEGRPDGWQTMDDTVYVAALLKTAGSVTVTSGGTTQTFQANAGANLFQIPASIGQ
QKFALTRNGQTVFSGTSLMDITNVCSCGIYNFNPYVGTIPAGFDDPLQADGLFSLTIGLH
VTTCQAKPSLGTNPPVTSGPVSSLPASSTTRASSPPPVSSTRVSSPPVSSPPVSRTSSAP
PPPGNSTPPSGQVCVAGTVADGESGNYIGLCQFSCNYGYCPPGPCKCTAFGAPISPPASN
GRNGCPLPGEGDGYLGLCSFSCNHNYCPPTACQYC(配列番号18)
>ENA|AJ243799|AJ243799.1 Trichoderma harzianum mRNA for alpha-1,3-glucanase(p3 gene)
ATGTTGGGCGTTTTCCGCCGCCTCAGGCTCGGCGCCCTTGCCGCCGCAGCTCTGTCTTCT
CTCGGCAGTGCCGCTCCCGCCAATGTTGCTATTCGGTCTCTCGAGGAACGTGCTTCTTCT
GCTGACCGTCTCGTATTCTGTCATTTCATGATTGGGATCGTGGGTGACCGTGGCAGCTCG
GCAGATTATGATGACGATATGCAACGTGCCAAAGCCGCTGGCATTGACGCCTTCGCCCTG
AACATCGGCGTTGACGGCTATACCGACCAGCAGCTCGGCTATGCCTATGACTCTGCCGAT
CGTAATGGCATGAAAGTCTTCATTTCATTTGATTTCAACTGGTGGAGCCCCGGCAATGCA
GTTGGTGTTGGCCAGAAGATTGCGCAGTATGCCAACCGCCCTGCCCAGCTGTATGTCGAC
AACCGGCCATTCGCCTCTTCCTTCGCCGGTGACGGTCTGGATGTAAATGCGTTGCGCTCT
GCTGCAGGCTCCAACGTTTACTTTGTGCCCAACTTCCACCCTGGTCAATCTTCCCCCTCC
AACATTGATGGCGCCCTTAACTGGATGGCCTGGGATAATGATGGAAACAACAAGGCACCC
AAGCCGGGCCAGACTGTCACAGTGGCAGACGGTGACAACGCTTATAAGAATTGGTTGGGT
GGCAAGCCTTACCTGGCGCCTGTCTCAACTTGGGTTTTCAACCATTTCGGGCCCGAAGTT
TCATATTCCAAGAACTGGGTTTTCCCAAGTGGGCCTCTGATCTATAACCGGTGGCAACAA
GTCTTGCAGCAAGGGTTCCCAAGGGTTGAGATCGTTACCTGGAATGACTACGGGGAATCT
CACTACGTCGGTCCCCTGAAGTCTAAGCAATTTCATGATGGGAACTCCAAATGGGTCAAT
GATATGCCCCACGATGGATTCCTGGATCTTTCGAAGCCGTTCATAGCCGCATATAAAAAC
AGGGATACCGACATCTCCAAGTATGTTCAAAATGAGCAGCTTGTTTACTGGTACCGCCGC
AACTTAAAGGCACTGGACTGTGACGCCACCGACACAACCTCTAACCGCCCGGCTAACAAT
GGAAGCGGCAATTACTTTGAGGGACGCCCCGATGGTTGGCAAACTATGGATGATACGGTT
TACGTGGCGGCACTTCTCAAGACTGCCGGTAGCGTCACGGTCACGTCTGGTGGCACCACT
CAAACGTTCCAGGCCAACGCCGGAGCCAATCTCTTCCAAATCCCGGCCAGCATCGGCCAG
CAAAAGTTTGCTCTGACTCGTAACGGTCAGACCGTCTTTAGCGGAACCTCATTGATGGAT
ATCACCAACGTTTGCTCTTGCGGTATCTACAACTTCAACCCATATGTTGGCACCATTCCT
GCCGGCTTTGACGACCCTCTTCAGGCTGACGGTCTTTTCTCTTTGACCATCGGATTGCAC
GTCACAACTTGTCAGGCCAAGCCATCTCTTGGAACTAACCCTCCTGTCACTTCCGGCCCT
GTGTCCTCGCTTCCAGCTTCCTCCACCACCCGCGCATCCTCGCCGCCTCCTGTTTCTTCA
ACTCGTGTCTCTTCTCCCCCTGTCTCTTCCCCTCCAGTTTCTCGCACCTCTTCTGCCCCT
CCCCCTCCGGGCAACAGCACGCCGCCATCGGGTCAGGTTTGCGTTGCCGGCACCGTTGCC
GACGGCGAGTCTGGCAACTACATCGGCCTGTGCCAATTCAGCTGCAACTACGGTTACTGC
CCACCAGGACCGTGTAAGTGCACCGCCTTTGGTGCTCCCATCTCGCCACCGGCATCCAAC
GGCCGCAACGGCTGCCCTCTGCCGGGAGAAGGCGATGGTTATCTGGGCCTGTGCAGTTTC
AGTTGTAACCATAATTACTGCCCGCCAACGGCATGTCAATACTGCTAGGAGGGATCAATC
TCAGTATGAGTATATGGAGGCTGCTGAAGGACCAATTAGCTGTTCTTATCGGCAGACGAA
ACCCATAGAGTAAGAAGTTAAATAAAATGCAATTAATGTGTTTTCAAAAAAAAAAAAAAA
A(配列番号19)
(トリコデルマ・ハルチアナム(Trichoderma harzianum)は真菌であることからポリAテールが存在する)
1.トリコデルマ・ハルチアナム(Trichoderma harzianum)由来のムタナーゼの一般情報
http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WZM7も参照されたい;
http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WZM7.fastaを参照されたい)
>tr|Q8WZM7|Q8WZM7_TRIHA Alpha-1,3-glucanase OS=Trichoderma harzianum GN=p3 PE=2 SV=1
MLGVFRRLRLGALAAAALSSLGSAAPANVAIRSLEERASSADRLVFCHFMIGIVGDRGSS
ADYDDDMQRAKAAGIDAFALNIGVDGYTDQQLGYAYDSADRNGMKVFISFDFNWWSPGNA
VGVGQKIAQYANRPAQLYVDNRPFASSFAGDGLDVNALRSAAGSNVYFVPNFHPGQSSPS
NIDGALNWMAWDNDGNNKAPKPGQTVTVADGDNAYKNWLGGKPYLAPVSTWVFNHFGPEV
SYSKNWVFPSGPLIYNRWQQVLQQGFPRVEIVTWNDYGESHYVGPLKSKQFHDGNSKWVN
DMPHDGFLDLSKPFIAAYKNRDTDISKYVQNEQLVYWYRRNLKALDCDATDTTSNRPANN
GSGNYFEGRPDGWQTMDDTVYVAALLKTAGSVTVTSGGTTQTFQANAGANLFQIPASIGQ
QKFALTRNGQTVFSGTSLMDITNVCSCGIYNFNPYVGTIPAGFDDPLQADGLFSLTIGLH
VTTCQAKPSLGTNPPVTSGPVSSLPASSTTRASSPPPVSSTRVSSPPVSSPPVSRTSSAP
PPPGNSTPPSGQVCVAGTVADGESGNYIGLCQFSCNYGYCPPGPCKCTAFGAPISPPASN
GRNGCPLPGEGDGYLGLCSFSCNHNYCPPTACQYC(配列番号20)
>ENA|AJ243799|AJ243799.1 Trichoderma harzianum mRNA for alpha-1,3-glucanase(p3 gene)
ATGTTGGGCGTTTTCCGCCGCCTCAGGCTCGGCGCCCTTGCCGCCGCAGCTCTGTCTTCT
CTCGGCAGTGCCGCTCCCGCCAATGTTGCTATTCGGTCTCTCGAGGAACGTGCTTCTTCT
GCTGACCGTCTCGTATTCTGTCATTTCATGATTGGGATCGTGGGTGACCGTGGCAGCTCG
GCAGATTATGATGACGATATGCAACGTGCCAAAGCCGCTGGCATTGACGCCTTCGCCCTG
AACATCGGCGTTGACGGCTATACCGACCAGCAGCTCGGCTATGCCTATGACTCTGCCGAT
CGTAATGGCATGAAAGTCTTCATTTCATTTGATTTCAACTGGTGGAGCCCCGGCAATGCA
GTTGGTGTTGGCCAGAAGATTGCGCAGTATGCCAACCGCCCTGCCCAGCTGTATGTCGAC
AACCGGCCATTCGCCTCTTCCTTCGCCGGTGACGGTCTGGATGTAAATGCGTTGCGCTCT
GCTGCAGGCTCCAACGTTTACTTTGTGCCCAACTTCCACCCTGGTCAATCTTCCCCCTCC
AACATTGATGGCGCCCTTAACTGGATGGCCTGGGATAATGATGGAAACAACAAGGCACCC
AAGCCGGGCCAGACTGTCACAGTGGCAGACGGTGACAACGCTTATAAGAATTGGTTGGGT
GGCAAGCCTTACCTGGCGCCTGTCTCAACTTGGGTTTTCAACCATTTCGGGCCCGAAGTT
TCATATTCCAAGAACTGGGTTTTCCCAAGTGGGCCTCTGATCTATAACCGGTGGCAACAA
GTCTTGCAGCAAGGGTTCCCAAGGGTTGAGATCGTTACCTGGAATGACTACGGGGAATCT
CACTACGTCGGTCCCCTGAAGTCTAAGCAATTTCATGATGGGAACTCCAAATGGGTCAAT
GATATGCCCCACGATGGATTCCTGGATCTTTCGAAGCCGTTCATAGCCGCATATAAAAAC
AGGGATACCGACATCTCCAAGTATGTTCAAAATGAGCAGCTTGTTTACTGGTACCGCCGC
AACTTAAAGGCACTGGACTGTGACGCCACCGACACAACCTCTAACCGCCCGGCTAACAAT
GGAAGCGGCAATTACTTTGAGGGACGCCCCGATGGTTGGCAAACTATGGATGATACGGTT
TACGTGGCGGCACTTCTCAAGACTGCCGGTAGCGTCACGGTCACGTCTGGTGGCACCACT
CAAACGTTCCAGGCCAACGCCGGAGCCAATCTCTTCCAAATCCCGGCCAGCATCGGCCAG
CAAAAGTTTGCTCTGACTCGTAACGGTCAGACCGTCTTTAGCGGAACCTCATTGATGGAT
ATCACCAACGTTTGCTCTTGCGGTATCTACAACTTCAACCCATATGTTGGCACCATTCCT
GCCGGCTTTGACGACCCTCTTCAGGCTGACGGTCTTTTCTCTTTGACCATCGGATTGCAC
GTCACAACTTGTCAGGCCAAGCCATCTCTTGGAACTAACCCTCCTGTCACTTCCGGCCCT
GTGTCCTCGCTTCCAGCTTCCTCCACCACCCGCGCATCCTCGCCGCCTCCTGTTTCTTCA
ACTCGTGTCTCTTCTCCCCCTGTCTCTTCCCCTCCAGTTTCTCGCACCTCTTCTGCCCCT
CCCCCTCCGGGCAACAGCACGCCGCCATCGGGTCAGGTTTGCGTTGCCGGCACCGTTGCC
GACGGCGAGTCTGGCAACTACATCGGCCTGTGCCAATTCAGCTGCAACTACGGTTACTGC
CCACCAGGACCGTGTAAGTGCACCGCCTTTGGTGCTCCCATCTCGCCACCGGCATCCAAC
GGCCGCAACGGCTGCCCTCTGCCGGGAGAAGGCGATGGTTATCTGGGCCTGTGCAGTTTC
AGTTGTAACCATAATTACTGCCCGCCAACGGCATGTCAATACTGCTAGGAGGGATCAATC
TCAGTATGAGTATATGGAGGCTGCTGAAGGACCAATTAGCTGTTCTTATCGGCAGACGAA
ACCCATAGAGTAAGAAGTTAAATAAAATGCAATTAATGTGTTTTCAAAAAAAAAAAAAAA
A(配列番号21)
(トリコデルマ・ハルチアナム(Trichoderma harzianum)は真菌であることからポリAテールが存在する)
GenBank:L41562.1
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L41562.1)
成熟タンパク質は、67KDのMWを有する574個のアミノ酸を有する。最適な反応条件はpH5.5および40℃である。pH範囲は3~6である。
MATMLKLLALTLAISESAIGAVMHPPGNSHPGTHMGTTNNTHCG
ADFCTWWHDSGEINTQTPVQPGNVRQSHKYSVQVSLAGTNNFHDSFVYESIPRNGNGR IYAPTDPPNSNTLDSSVDDGISIEPSIGLNMAWSQFEYSHDVDVKILATDGSSLGSPS
DVVIRPVSISYAISQSDDGGIVIRVPADANGRKFSVEFKTDLYTFLSDGNEYVTSGGS
VVGVEPTNALVIFASPFLPSGMIPHMTPDNTQTMTPGPINNGDWGAKSILYFPPGVYW MNQDQSGNSGKLGSNHIRLNSNTYWVYLAPGAYVKGAIEYFTKQNFYATGHGILSGEN
YVYQANAGDNYIAVKSDSTSLRMWWHNNLGGGQTWYCVGPTINAPPFNTMDFNGNSGI
SSQISDYKQVGAFFFQTDGPEIYPNSVVHDVFWHVNDDAIKIYYSGASVSRATIWKCH
NDPIIQMGWTSRDISGVTIDTLNVIHTRYIKSETVVPSAIIGASPFYASGMSPDSRKS
ISMTVSNVVCEGLCPSLFRITPLQNYKNFVVKNVAFPDGLQTNSIGTGESIIPAASGL
TMGLNISNWTVGGQKVTMENFQANSLGQFNIDGSYWGEWQIS(配列番号22)
1 ggcatagtaa tcccgacagc cgagtatgat ggagcttctt cggataatga tagcgccacc
61 agaccttgct tgagctggag agctaaaaca ttaaacgcca cacgaccaac actctcatta
121 gttgcgatag atgatgctcg gagctgttga aactcagaaa ttccttctat gcggggtctc
181 caagatcgat cctgggggat gtgaatacta cggtggacct aattgacgcc ttgacaggtg
241 atgttaagcg aaccaaggaa gaataatctg gggctagatg aagatgttga gctgtaaggt
301 acggtacgtt cctattggct ttatcggagc ttctccgggt tactcagtct ttccgggagc
361 atgatcattt ttgtattgtc caatagtaag cagaaactga gagccaccac aaactcaaaa
421 cctcggtagc gaagtttccc ggaaccagtc aggattctca gaaactgtgc tcgtgttgcg
481 gggaatccgc attctacgtc gtctggagca aggaaatgtt cgtgctggat tgaggaggat
541 aggtaggttg gagaatctct tcagctaacc aatctataag catgctccgg taacctttag
601 agtttcacat tcaacgtaat ttccaagata gccagagcgt ccttgaatta ctatgtagaa
661 atcctaaaat ttcccctgta aaatgcaagt caacgagatg cgtgccctca atgtctctcg
721 gcgctacccc ggaaatgatg cataaggcca agaatgtcac ccggtaactt tttcttcaga
781 atatcctaag atttccatca aacacagtcg aataggtcaa tgctcgcgag agactttctg
841 ccttcactct acgtcctact catagaagtt caacggctca attccggggt aatctagagt
901 ttggacctca agggagatgt tgcaacaaat tgtactagaa cgatgcgctt gctttccaat
961 acagtagttg acttcatata gcttccaaca aaagggatgg ggatgaaggc tctatagcga
1021 gaagtctata agaaagtgtc ctcatacctg tatctctcag tcgttcgaga acaatcccgg
1081 aaactatctt atcttgcgag aaagaagaca atatctcaaa cttatggcca caatgctaaa
1141 gctacttgcg ttgacccttg caattagcga gtccgccatt ggagcagtca tgcacccacc
1201 tggcaattct catcccggta cccatatggg cactacgaat aatacccatt gcggcgccga
1261 tttctgtacc tggtggcatg attcagggga gatcaatacg cagacacctg tccaaccagg
1321 gaacgtgcgc caatctcaca agtattccgt gcaagtgagc ctagctggta caaacaattt
1381 tcatgactcc tttgtatatg aatcgatccc ccggaacgga aatggtcgca tctatgctcc
1441 caccgatcca cccaacagca acacactaga ttcaagtgtg gatgatggaa tctcgattga
1501 gcctagtatc ggccttaata tggcatggtc ccaattcgag tacagccacg atgtagatgt
1561 aaagatcctg gccactgatg gctcatcgtt gggctcgcca agtgatgttg ttattcgccc
1621 cgtctcaatc tcctatgcga tttctcagtc tgacgatggt gggattgtca tccgggtccc
1681 agccgatgcg aacggccgca aattttcagt tgagttcaaa actgacctgt acacattcct
1741 ctctgatggc aacgagtacg tcacatcggg aggcagcgtc gtcggcgttg agcctaccaa
1801 cgcacttgtg atcttcgcaa gtccgtttct tccttctggc atgattcctc atatgacacc
1861 cgacaacacg cagaccatga cgccaggtcc tatcaataac ggcgactggg gcgccaagtc
1921 aattctttac ttcccaccag gtgtatactg gatgaaccaa gatcaatcgg gcaactcggg
1981 gaagttagga tctaatcata tacgtctaaa ctcgaacact tactgggtct accttgcccc
2041 cggtgcgtac gtgaagggtg ctatagagta ttttaccaag cagaacttct atgcaactgg
2101 tcatggtatc ctatcgggtg aaaactatgt ttaccaagcc aatgccggcg acaactacat
2161 tgcagtcaag agcgattcaa ccagcctccg gatgtggtgg cacaataacc ttgggggtgg
2221 tcaaacatgg tactgcgttg gcccgacgat caatgcgcca ccattcaata ctatggattt
2281 caatggaaat tctggcatct caagtcaaat tagcgactat aagcaggtgg gagccttctt
2341 cttccagacg gatggaccag aaatatatcc caatagtgtc gtgcacgacg tcttctggca
2401 cgtcaatgat gatgcaatca aaatctacta ttcgggagca tctgtatcgc gggcaacgat
2461 ctggaaatgt cacaatgacc caatcatcca gatgggatgg acgtctcggg atatcagtgg
2521 agtgacaatc gacacattaa atgttattca cacccgctac atcaaatcgg agacggtggt
2581 gccttcggct atcattgggg cctctccatt ctatgcaagt gggatgagtc ctgattcaag
2641 aaagtccata tccatgacgg tttcaaacgt tgtttgcgag ggtctttgcc cgtccctatt
2701 ccgcatcaca ccccttcaga actacaaaaa ttttgttgtc aaaaatgtgg ctttcccaga
2761 cgggctacag acgaatagta ttggcacagg agaaagcatt attccagccg catctggtct
2821 aacgatggga ctgaatatct ccaactggac tgttggtgga caaaaagtga ctatggagaa
2881 ctttcaagcc aatagcctgg ggcagttcaa tattgacggc agctattggg gggagtggca
2941 gattagctga attccagctc tcggagcgcg tgagtgcttc tacccgctcc tttacccttg
3001 tcgagagata aaggcataag ttagctcatg tgaaggcgat ttcagttcat tctctctttt
3061 tggagcttat ttcctgttcg accaattgtg acaccaactt gcctttcaaa agacgtggac
3121 gatatgtgta cggtaatcag tcaaatgaac gtcaacattc atttaataag gacatttcca
3181 ggtttcctta ctctgtcgat tatgcctaac tcgggttgat gtcttgtcag gatggaaaat
3241 ctcgttgtgt acttccagtg aaatgggcag ggctaagccc taaaccctaa cgcatacaat
3301 ttgtaggcac ctacccatgt aagttcacac ccagtcgact tataagtcta gatatttatg
3361 ctatgcaggc tctggaatga tttacattcc atgctataca tagttatttg caagaatttg
3421 cagacgagat aaaaatcaat ggacgaataa tcacgcatta ctccacaggc tcatgccacg
3481 gagcaagggt tcccccgaat ctaggccaga ccgggatgat attcaaccga ttctttttgc
3541 agtaactatc tccgtacgag ctgcacgagc taaacggatt atataaaggt gctaactgag
3601 cattggatcc gtcagttata tgaaatgca(配列番号23)
GenBank:KF999646.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF999646.1)
最適pHは約5である。pH範囲は3~6である。
MATMLKLLTLALAISESAIGAVLHPPGSSHPSTRTDTTNNTHCG
ADFCTWWHDSGEINTQTPVQPGNVRQSHKYSVQVSLAGANNFQDSFVYESIPRNGNGR
IYAPTDPPNSNTLDSSVDDGISIEHSIGLNMAWSQFEYSQDVDIKILAADGSSLGSPS
DVVIRPVSISYAISQSDDGGIVIRVPADANGRKFSVEFKNDPYTFLSDGNEYVTSGGS
VVGVEPTNALVIFASPFLPSGMIPHMTPDNTQTMTPGPINNGDWGSKSILYFPPGVYW
MNQDQSGNSGKLGSNHIRLNSNTYWVYFAPGAYVKGAIEYFTKQNFYATGHGVLSGEN
YVYQANAGENYVAVKSDSTSLRMWWHNNLGGGQTWYCVGPTINAPPFNTMDFNGNSGI
SSQISDYKQVGAFFFQTDGPEIYPNSVVHDVFWHVNDDAIKIYYSGASVSRATIWKCH
NDPIIQMGWTSRDISGVTIDTLNVIHTRYIKSETVVPSAIIGASPFYASGMSPDSSKS
ISMTVSNVVCEGLCPSLFRITPLQNYKNFVVKNVAFPDGLQTNSIGTGESIIPAASGL
TMGLDISNWSVGGQKVTMQNFQANSLGQFDIDGSYWGEWQIN(配列番号24)
1 atggccacaa tgctaaagct acttacgttg gcccttgcaa ttagcgagtc tgccattgga
61 gcagtcctgc acccacctgg cagttctcat cccagtaccc gtacggacac tacgaataat
121 acccattgcg gtgccgactt ctgtacctgg tggcatgatt caggcgagat caacacacag
181 acacctgtcc aaccggggaa cgtgcgccaa tctcacaagt attccgtaca agtgagccta
241 gctggtgcga acaactttca ggactccttt gtatatgaat cgatccctcg gaacggaaat
301 ggtcgcatct atgctcccac cgatccaccc aacagcaaca cactagattc aagtgttgat
361 gatggaatct cgattgaaca tagtattggc ctcaatatgg catggtccca attcgagtac
421 agccaggatg tcgatataaa gatcctggcc gctgatggct catcgttggg ctcaccaagt
481 gatgttgtta ttcgccccgt ctcaatctcc tatgcaattt ctcaatccga cgatggcgga
541 attgtcattc gggtcccagc cgatgcgaac ggccgcaaat tttcagtcga gttcaaaaat
601 gacccgtaca cgttcctctc tgacggcaac gagtacgtca catcgggagg cagcgttgtc
661 ggcgttgagc ctaccaacgc acttgtgatc ttcgcaagcc cgtttcttcc gtcaggcatg
721 attcctcata tgacacccga caacacgcag accatgacac caggacctat caataacggc
781 gactggggct ccaagtcaat tctttatttc ccaccgggcg tatactggat gaaccaagat
841 caatcaggca actcggggaa attaggatct aatcatatac gcctgaactc gaacacctac
901 tgggtctact ttgccccagg tgcgtacgtg aagggtgcta tagagtattt caccaagcag
961 aacttctatg caactggtca tggtgtccta tcgggtgaaa actatgttta ccaagccaat
1021 gctggcgaaa actacgttgc ggtcaagagc gattcgacta gcctccggat gtggtggcac
1081 aataacctgg gaggtggaca aacatggtac tgcgttgggc ctacgatcaa tgcgccgcca
1141 tttaacacaa tggatttcaa tggaaattcc ggtatctcaa gtcaaattag cgactataag
1201 caggtgggag ctttcttctt tcagacggat ggaccagaaa tttatcccaa tagtgtcgtg
1261 cacgacgtct tctggcatgt caatgatgat gcaatcaaaa tctactattc cggagcatct
1321 gtctcgcggg caacgatctg gaaatgtcac aacgatccaa tcatccagat gggatggacg
1381 tctcgggata tcagtggagt gacaatcgac acattgaatg tcatccacac ccgctacatc
1441 aagtcggaga cggtggtgcc ttcggctatc attggggctt ctccattcta tgcaagtggg
1501 atgagtcctg attcaagcaa gtctatatcc atgacggttt caaacgttgt ctgcgaggga
1561 ctttgcccgt ctctgttccg aatcacacct ttacagaact acaagaattt tgttgtcaaa
1621 aatgtggctt tcccagatgg gctacagacg aatagtattg gcacgggaga aagcattatt
1681 ccagccgcat ctggtctaac gatgggactg gatatctcca actggtctgt tggtggtcag
1741 aaggtgacta tgcagaactt tcaagccaat agtctggggc aattcgacat tgacggcagc
1801 tattgggggg agtggcagat taactagctg aataatattg cagctttcag ggcgcatgag
1861 tgcttgtacc cgctccttta cccttgtc(配列番号25)
GenBank:AJ272066.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/7801166)
最適pHは約5.5である。最適温度は60℃である。pH範囲は5~7.5である(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032959298001277)
MATMLKLLALTLAISESAIGAVMHPPGVSHPGTHTGTTNNTHCG
ADFCTWWHDSGEINTQTPVQPGNVRQSHKYSVQVSLAGTNNFHDSFVYESIPRNGNGR
IYAPTDPSNSNTLDSSVDDGISIEPSIGLNMAWSQFEYSQDVDIKILATDGSSLGSPS
DVVIRPVSISYAISQSNDGGIVIRVPADANGRKFSVEFKNDLYTFLSDGNEYVTSGGS
VVGVEPTNALVIFASPFLPSGMIPHMKPHNTQTMTPGPINNGDWGAKSILYFPPGVYW
MNQDQSGNSGKLGSNHIRLNSNTYWVYLAPGAYVKGAIEYFTKQNFYATGHGVLSGEN
YVYQANAGDNYVAVKSDSTSLRMWWHNNLGGGQTWYCVGPTINAPPFNTMDFNGNSGI
SQISDYKQVGAFFFQTDGPEIYPNSVVHDVFWHVNDDAIKIYYSGASVSRATIWKCH
NDPIIQMGWTSRDISGVTIDTLNVIHTRYIKSETVVPSAIIGASPFYASGMSPDSSKS
ISMTVSNVVCEGLCPSLFRITPLQNYKNFVVKNVAFPDGLQTNSIGTGESIIPAASGL
TMGLNISSWTVGGQKVTMENFQANSLGQFNIDGSYWGEWQISRISSSQSA
(配列番号26)
1 atggccacaa tgctaaagct acttgcgttg acccttgcaa ttagcgagtc cgccattgga
61 gcagtcatgc acccacctgg cgtttctcat cccggtaccc atacgggcac tacgaataat
121 acccattgcg gcgccgactt ctgtacctgg tggcatgatt caggggagat caacacgcag
181 acacctgtcc aaccagggaa cgtgcgccaa tctcacaagt attccgtgca agtgagtcta
241 gctggtacaa acaactttca tgactccttt gtatatgaat cgatcccccg gaacggaaat
301 ggtcgcatct atgctcccac cgatccatcc aacagcaaca cattagattc aagcgtggat
361 gatggaatct cgattgagcc tagtatcggc ctcaatatgg catggtccca attcgagtac
421 agccaggatg tcgatataaa gatcctggca actgatggct catcgttggg ctcaccaagt
481 gatgttgtta ttcgccccgt ctcaatctcc tatgcgattt ctcagtccaa cgatggcggg
541 attgtcatcc gggtcccagc cgatgcgaac ggccgcaaat tttcagtcga attcaaaaat
601 gacctgtaca ctttcctctc tgatggcaac gagtacgtca catcgggagg tagcgtcgtc
661 ggcgttgagc ctaccaacgc acttgtgatc ttcgcaagtc cgtttcttcc ttctggcatg
721 attcctcata tgaaacccca caacacgcag accatgacgc caggtcctat caataacggc
781 gactggggcg ccaagtcaat tctttacttc ccaccaggtg tatactggat gaaccaagat
841 caatcgggca actcgggtaa attaggatct aatcatatac gtctaaactc gaacacttac
901 tgggtctacc ttgcccccgg tgcgtacgtg aagggtgcta tagagtattt caccaagcaa
961 aacttctatg caactggtca tggtgtccta tcaggtgaaa actatgttta ccaagccaat
1021 gctggcgaca actatgttgc agtcaagagc gattcgacca gcctccggat gtggtggcac
1081 aataaccttg ggggtggtca aacatggtac tgcgttggcc cgacgatcaa tgcgccacca
1141 ttcaacacta tggatttcaa tggaaattct ggcatctcaa gtcaaattag cgactataag
1201 caggtgggag ccttcttctt ccagacggat ggaccagaaa tctatcccaa tagtgtcgtg
1261 cacgacgtct tctggcacgt caatgatgat gcaatcaaaa tctactattc gggagcatct
1321 gtatcgcggg caacgatctg gaaatgtcac aatgacccaa tcatccagat gggatggaca
1381 tctcgggata tcagtggagt gacaatcgac acattaaatg ttattcacac ccgctacatc
1441 aaatcggaga cggtggtgcc ttcggctatc attggggcct ctccattcta tgcaagtggg
1501 atgagtcccg attcaagcaa gtccatatcc atgacggttt caaacgttgt ttgcgagggt
1561 ctttgcccgt ccctgttccg catcacaccc ctacagaact acaaaaattt tgttgtcaaa
1621 aatgtggctt tcccagatgg gctacagaca aatagtattg gcacaggaga aagcattatt
1681 ccagccgcat ctggtctaac gatgggacta aatatctcca gctggactgt tggtggacaa
1741 aaagtgacaa tggagaactt tcaagccaat agcctggggc agttcaatat tgacggcagc
1801 tattgggggg agtggcagat tagtcgaatt tccagctctc agagcgcgtg agtgcttcta
1861 cccgctcctt tacccttgtc gaaggatcaa ggcataagtt agctcatgtg aaggcgattt
1921 cagttcattc tctctttttt ggagctcatt tccttttcga ccaattgtga caccaaattg
1981 ccatgtgtac tgtaattggt caaatgaacg ttaaccttcg atttaatatg gacatttcca
2041 ggtttcctta ctctgtcgat tatgcctaac tcgggttgat gtcttgtcag gatgaaaatc
2101 tcgttgtcat gtacttcgag tgaaatgggc agggctaacc cctaagccct aacgcccaat
2161 cgacttataa gtctagatgt ttatgctatg caggctctgg aatgatttac attccatgct
2221 ataca(配列番号27)
Claims (14)
- 配列番号:1のムタナーゼ酵素をコードする核酸に作動可能に連結された少なくとも1種の抗微生物ペプチド(AMP)をコードする核酸を保有する凍結乾燥植物葉を含む、前記連結された核酸はAMP-ムタナーゼ融合タンパクを発現し、前記AMPおよび前記ムタナーゼ酵素が相乗的に作用してバイオフィルム構造を分解し、且つ、バイオフィルムの堆積を阻害する、多成分組成物であって、前記AMPをコードする核酸が、プロテグリン1、RC-101 CSP、CSPC16、G2、C16G2、CSPM8、M8G2、S6L3-33、C16-33およびM8-33から選択されるAMPをコードし、前記組成物を送達するための生物学的に許容される担体内に含まれる組成物。
- さらに、バイオフィルム分解酵素を含む請求項1に記載の組成物であって、当該バイオフィルム分解酵素が、ムタナーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼI、DNAアーゼ、ディスペルジンB、グリコシドヒドロラーゼ、および配列番号:12、14、16、18、20、24、および26によってコードされる酵素から選択される、組成物。
- 前記AMPおよび前記ムタナーゼ酵素は、組換えにより産生される、請求項1に記載の組成物。
- 前記AMPがPG1であり、前記凍結乾燥植物葉が、配列番号:2のデキストラナーゼ酵素をコードする核酸に作動可能に連結されたPG1をコードする核酸をさらに保有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物中での前記デキストラナーゼ対ムタナーゼの比は5:1であり、前記組成物は、グルコアミラーゼをさらに含む、請求項4に記載の組成物。
- 抗微生物剤/抗生物質をさらに含む、あるいは、フッ化物および、またはCHXをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記担体はチューインガム、口腔リンスまたは生物学的に適合する緩衝液である、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1、4または5に記載の組成物を含むチューインガム。
- 請求項1、4または5に記載の組成物を含み、さらに、0.064%のチモール、0.06%のサリチル酸メチル、0.042%のメントール、0.092%のユーカリプトール、20-30%のエタノール、水、安息香酸、ポロキサマー407、安息香酸ナトリウムおよびカラメルを含む口腔リンス。
- バイオフィルムを分解するおよび/または除去する方法において使用される、請求項1、4または5に記載の多成分組成物であって、
前記方法は、前記バイオフィルムを保有する(harbouring)表面と、多成分組成物とを接触させることを含み、
前記組成物は殺菌効果を有し、1種または複数種の望ましくない微生物を含む前記バイオフィルムを相乗的に低減する、または除去する、
前記バイオフィルムが、前記低減または除去を必要とする動物対象中にまたは前記動物対象上に存在する場合の、組成物。 - 前記バイオフィルムが、口腔中に存在する、または、前記バイオフィルムは医療機器上に存在する、請求項10に記載の使用のための多成分組成物。
- 請求項10に記載の使用のための多成分組成物であって、前記バイオフィルムが、尿路中の表面、中耳、前立腺、血管内膜、心臓弁、皮膚、頭皮、爪、歯および創傷内部からなる群から選択される身体の内表面または外表面に存在する、組成物。
- 前記AMPおよび前記酵素は植物色素体中で産生されており、前記組成物は植物残余物(plant remnant)をさらに含む、所望により、前記植物はタバコまたはレタス植物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記少なくとも1種のAMPおよび前記少なくとも1種の酵素が、融合タンパク質としてレタス植物中で発現されている、請求項13に記載の組成物。
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