JP5140426B2 - 齲蝕原因菌に選択的な殺菌剤、齲蝕原因菌を殺菌する方法 - Google Patents

Description

本発明は、齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素及び界面活性剤を有効成分として含む殺菌剤に関する。更に本発明は、齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素及び界面活性剤を有効成分として含む殺菌剤を用いて齲蝕原因菌を殺菌する方法に関する。

ヒトに虫歯や歯周病を引き起こす齲蝕の原因となる菌として、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）およびストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)（以下本明細書において齲蝕原因菌という）の２種が知られている（日本細菌学雑誌 51 (4): 931-951, 1996）。ところで、虫歯や歯周病の罹患率は非常に高いにも関わらず、根源的な治療法・予防法は未だに確立されていない。近年、虫歯予防に効果があるとしてキシリトールが注目されているが、これは虫歯菌に対しては静菌的効果しかなく、虫歯や歯周病の積極的な予防薬あるいは治療薬とはなりえない。

一方抗菌化学療法的なアプローチもなされており、抗菌活性が強く且つ抗菌スペクトルの広い抗菌剤がこれまでに数多く開発されてきた。しかしながら、このような化学療法的な抗菌剤は化学療法の対象とする細菌のみならず、口腔内常在細菌叢を形成している細菌群にも影響するために菌交代症を引き起こす。更には化学療法剤が効かない耐性菌が出現する事が大きな社会問題となっている。よってそのような問題を避けるために、特定の菌種のみに有効な、特異性の高い抗菌剤の利用が求められている。

上記において述べた問題を引き起こさない齲蝕原因菌の殺菌剤を得るために、本発明者らは鋭意検討を行なった結果、齲蝕原因菌に特異的な細菌壁溶解酵素であるオートミュタノリシン（automutanolysin:以下本明細書においてAmlという）を見出した（日本細菌学雑誌 60 (1): 115, 2005、特願2003-419123）。Amlは齲蝕原因菌に対する特異性が高いために、虫歯・歯周病の予防や治療に有効であると期待される。

しかし上記で述べたAmlに関しては、単独では齲蝕原因菌の溶菌に約1.5時間（半減期）を要するという問題があった。口腔内は唾液循環によって常に洗浄されているために、Amlを投与部位に長時間滞留させておくことは困難である。従って本発明の課題は、Amlの作用を高めて齲蝕原因菌を溶菌する時間を30分以内に短縮する手段を提供することにより、殺菌剤としてのAmlの実用性を高める手段を提供することである。

上記課題を解決するために本発明は、齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素のオートミュタノリシンおよび非イオン性界面活性剤のシュガーエステルを有効成分として含み、前記シュガーエステルが蔗糖ステアリン酸エステルまたは蔗糖パルミチン酸エステルから選ばれる殺菌剤を提供するものである。本発明の実施において、前記齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素はAmlである。また前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、また前記非イオン性界面活性剤はシュガーエステルであり、好ましくは、前記シュガーエステルがHLB値15または16の蔗糖ステアリン酸エステルまたはHLB値16の蔗糖パルミチン酸エステルである。また前記殺菌剤を含有する齲蝕予防剤、齲蝕治療剤、歯磨き剤またはうがい薬も、本発明の範囲内である。

更に本発明は、齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素のオートミュタノリシンおよび非イオン性界面活性剤のシュガーエステルを有効成分として含み、前記シュガーエステルが蔗糖ステアリン酸エステルまたは蔗糖パルミチン酸エステルから選ばれる殺菌剤を用いて齲蝕原因菌を殺菌する（人間を除く）方法を提供するものである。本発明の実施において、前記齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素はAmlである。また前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、また前記非イオン性界面活性剤はシュガーエステルであり、好ましくは、前記シュガーエステルがHLB値15または16の蔗糖ステアリン酸エステルまたはHLB値16の蔗糖パルミチン酸エステルである。

齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素であるオートミュタノリシンと特定の種類の非イオン性界面活性剤である蔗糖ステアリン酸エステルまたは蔗糖パルミチン酸エステルから選ばれるシュガーエステルを併用することにより、当該細菌壁溶解酵素であるオートミュタノリシンの齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素作用が増強することが明らかになった。かかる増強作用によって、齲蝕原因菌がオートミュタノリシンにより溶菌される時間が短縮されるために、オートミュタノリシンの齲蝕原因菌用殺菌剤としての実用性を高めることが可能となった。

図１は、Aml単独の系とP1670あるいはS1570をAmlに添加した系において、溶菌効果を比較したグラフである。 図２は、Amlに界面活性剤（P1670あるいはS1570）を併用した系において、溶菌効果に対する界面活性剤の濃度依存性を示したグラフである。 図３は、Amlに種々の界面活性剤を添加した系において溶菌効果を検討したグラフである。 図４は、種々の口腔細菌における溶菌効果を検討したグラフである。

上記において述べたように本発明は、Amlなどの齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素に特定の界面活性剤を添加することにより、当該酵素の作用を高める手段を提供するものである。ここでいうAmlとは特願2003-419123および日本細菌学雑誌 60 (1): 115, 2005において開示されている齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素、すなわち細菌壁溶解酵素である。Amlはストレプトコッカス・ミュータンスが持つ酵素であり、病原菌（ミュータンス菌）自身を溶菌・殺菌する。しかもAmlは種特異性が高くて他の菌叢に影響を与えないために、虫歯の治療・予防に利用するのに適している。

なお本明細書でいうAmlとは、下記の（１）〜（３）のいずれかの蛋白質からなるストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスに対する殺菌物質を意味するものである。なおAmlの配列は、NCBIデータベースAAN58422.1として登録されている。
（１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る蛋白質、又は該アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加され、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスに対して溶菌性を有する蛋白質
（２）ストレプトコッカス・ミュータンス死菌体を含むゲルを用いた酵素電気泳動（zymography）において100±10kDaに溶菌バンドを示す蛋白質
（３）配列表の配列番号２に示す塩基配列から成るDNA又は（１）の蛋白質をコードするDNAにより形質転換された細胞、バクテリア、昆虫、動物より得られる蛋白質

上記のAmlなどの齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素に添加するべき界面活性剤として、種々の界面活性剤を使用することができる。本発明において好ましい界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、特に好ましくはシュガーエステルである非イオン性界面活性剤であり、なお更に好ましくは、HLB値15または16の蔗糖ステアリン酸エステルまたはHLB値16の蔗糖パルミチン酸エステルである。

特に好ましいシュガーエステルの具体例としては、下記の実施例において使用され、リョートーシュガーエステルS-1570（三菱フーズ社製）、S-1670（三菱フーズ社製）およびP-1670（三菱フーズ社製）を挙げることができる。しかし本発明において使用できるシュガーエステルはそれらに限定されるものではない。

リョートーシュガーエステルS-1570は蔗糖ステアリン酸エステルであって、物性としてはHLB値が15であり、結合脂肪酸としてはステアリン酸を約70%含み、エステル組成としてはモノエステルを約70%とジ・トリ・ポリエステルを約30%含む。またリョートーシュガーエステルS-1670も蔗糖ステアリン酸エステルであって、物性としてはHLB値が16であり、結合脂肪酸としてはステアリン酸を約70%含み、エステル組成としてはモノエステルを約75%とジ・トリ・ポリエステルを約25%含む。

更にリョートーシュガーエステルP-1670は蔗糖パルミチン酸エステルであって、物性としてはHLB値が16であり、結合脂肪酸としてはパルミチン酸を約80%含み、エステル組成としてはモノエステルを約80%とジ・トリ・ポリエステルを約20%含む。

本発明においてリョートーシュガーエステルS-1570、S-1670およびP-1670を使用する濃度は、Amlの溶菌活性を増強する作用がある限り、特に限定されるものではない。しかしそれらの界面活性剤を0.001%以上の濃度で使用することは好ましく、0.025%以上の濃度で使用することは更に好ましく、0.05%以上の濃度で使用することはなお更に好ましい。しかし界面活性剤の使用濃度は、上記の範囲に限定されるものではない。

ところで特開平9-322763において、オーレオバシディウム プルランスの細胞壁の溶解活性を示す溶菌酵素と、アンフォレックスLB-2などの界面活性剤を併用することにより溶菌効果を高めることが記載されている。しかし特開平9-322763で使用されているオーレオバシディウム プルランスは齲蝕原因菌ではないので、特開平9-322763は歯科分野における用途を与えるものではない。また特開平9-322763で使用されている溶菌酵素とAmlは全く異なった酵素である。

本発明の抗菌剤は種々の用途に応用することができる。具体的な用途の例としては、齲蝕予防剤、齲蝕治療剤、歯磨き剤、うがい薬、齲蝕予防用ガムおよび食品などを挙げることができるが、本発明の抗菌剤の用途はそれらに限定されるものではない。なお当業者に良く知られている方法により、本発明の抗菌剤を含有する齲蝕予防剤、齲蝕治療剤、歯磨き剤、うがい薬、齲蝕予防用ガムおよび食品などを製造することができる。

以下において実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

本実施例において採用した溶菌効果の測定方法は以下のようである。
溶菌効果を測定するべき菌株を一晩培養し、生理食塩水で洗浄し、0.1M NaCl, 0.1mM CaCl₂を含有する 0.1Mリン酸緩衝液（pH6.8）中に懸濁した。菌体を分散させるために超音波破砕機で処理した。その後、30％エチレングリコール0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.3）に溶かした500μg/mlのAml溶液、および蒸留水に溶かした5mg/mlの界面活性剤（40μl）を、1mlの菌の懸濁液、0.1Mリン酸緩衝液、0.1M NaCl、0.1mMカルシウムからなる系に添加した。37℃でインキュベーションして経時的に濁度を測定し、濁度の減少率を指標として溶菌効果を評価した。

Streptococcus mutans 403R（齲蝕原因菌）を用いて、Aml単独の系、およびAmlにP1670あるいはS1570を0.05%の濃度で添加した系において、溶菌効果を経時的に測定した（表１、図１）。なお表１と図１において溶菌効果を、実験開始時点の菌液の濁度を100%とした際の、各時点における濁度を百分率により表した。図１から判るように、界面活性剤P1670を添加した群とS1570を添加した群においては、Aml単独の系と比較して明らかに強い溶菌効果が認められた。またAmlに0.05%のP1670あるいはS1570を添加した系で50%を溶菌するのに要した時間（ED50）は、約30分であった。なお、コントロールは齲蝕原因菌のみの培養である。

Streptococcus mutans 403Rを用いて、種々の最終濃度（0.05%, 0.025%, 0.001%）でP1670またはS1570をAmlに添加した系において、溶菌効果を経時的に測定した（表２、図２）。表２と図２において示されるように、P1670添加群とS1570添加群の両者において、濃度依存的な溶菌効果が認められた。すなわち、界面活性剤濃度0.001%においてはP1670でもS1570でも明らかな溶菌効果は認められなかった。一方、P1670については0.05%と0.025%、S1570については0.05%の界面活性剤の濃度で顕著な溶菌効果が認められた。

緩衝液に懸濁したS.mutans OMZ175（齲蝕原因菌）を用いて、Amlに種々の界面活性剤を添加した系における溶菌効果を検討した（表３、図３）。なお、本実験で検討した食品添加物は、グリチルリチン（0.5%）、キラジャのサポニン（0.5%）、S1670（0.1%）、S1570（0.05%）、P1670（0.05%）、タイズのサポニン（0.O5%）、ユッカのサポニン（0.05%）、トライトンX（0.05%）である。表３と図３で検討した種々の界面活性剤の中で、Amlと併用することによってトライトンXと同等あるいはそれ以上の溶菌効果が認められたのは、S1670、S1570、P1670のみであり、他の界面活性剤を添加した系では溶菌効果は認められなかった。

更に、種々の口腔細菌の菌株を用いて溶菌効果を検討することにより、溶菌効果が齲蝕原因菌に対して特異性を有しているか検討を行なった。本実験において使用した菌株は、齲蝕原因菌であるStreptococcus mutans C67-1、Streptococcus mutans LM7、Streptococcus sobrinus OMZ176a、及び齲蝕原因菌でないStreptococcus salivarius ATCC9222である。それらの菌株を用いて、Amlと0.05%のP1670またはS1570を併用した際の、各菌株における溶菌効果を検討した（表４、図４）。その結果、Streptococcus salivarius ATCC9222においては、AmlとP1670またはS1570を併用しても溶菌効果において相乗効果は認めらなかった。一方齲蝕原因菌においてはAmlとP1670またはS1570を併用することによって溶菌効果における相乗効果が認められた。よって溶菌効果は、齲蝕原因菌であるStreptococcus mutans（C67-1、LM7）とStreptococcus sobrinus（OMZ176a）に特異性を有することが認められた。

以上の結果から、Amlと界面活性剤（リョートーシュガーエステルS-1570、S-1670、P-1670）を併用することにより、界面活性剤の濃度に依存したAmlの溶菌効果が認められた。そして0.05%の界面活性剤を併用した際に50%の生菌が溶菌する時間（ED50）は約30分であり、Aml単独の際の1.5時間よりも大きく溶菌時間が短縮した。またAmlと界面活性剤を併用した際の溶菌効果は齲蝕原因菌に特異的であった。
産業上の利用可能性

本発明により、細菌壁溶解酵素に界面活性剤を添加することにより、当該酵素の抗菌効果を高めることが可能となった。その結果、細菌壁溶解酵素により齲蝕原因菌が溶菌される時間が短縮され、細菌壁溶解酵素を歯科分野で利用する実用性を高めることができた。細菌壁溶解酵素及び界面活性剤を有効成分として含有する本発明の抗菌剤は、齲蝕予防剤、齲蝕治療剤、歯磨き剤、うがい薬、又は齲蝕予防用ガムおよび食品など、種々の用途に応用することができる。

Claims (7)

1. 齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素のオートミュタノリシンおよび非イオン性界面活性剤のシュガーエステルを有効成分として含み、前記シュガーエステルが蔗糖ステアリン酸エステルまたは蔗糖パルミチン酸エステルから選ばれる殺菌剤。
2. 前記オートミュタノリシンは、
   （１）配列番号１で表され、
   （２）ストレプトコッカス・ミュータンス死菌体を含むゲルを用いた酵素電気泳動において１００±１０ｋＤａに溶菌バンドを示し、または
   （３）配列番号２によって表される塩基配列を含むＤＮＡもしくは配列番号１のタンパク質をコードするＤＮＡによって形質転換された細胞、細菌、昆虫、または動物から得られる
   請求項１に記載の殺菌剤。
3. 前記シュガーエステルが、ＨＬＢ値１５もしくは１６の蔗糖ステアリン酸エステルまたはＨＬＢ値１６の蔗糖パルミチン酸エステルである請求項１または２に記載の殺菌剤。
4. 請求項１から請求項３のいずれか一つの請求項に記載の殺菌剤を含有する齲蝕予防剤、齲蝕治療剤、歯磨き剤またはうがい薬。
5. 齲蝕原因菌に選択的な細胞壁溶解酵素のオートミュタノリシンおよび非イオン性界面活性剤のシュガーエステルを有効成分として含み、前記シュガーエステルが蔗糖ステアリン酸エステルまたは蔗糖パルミチン酸エステルから選ばれる殺菌剤を用いて齲蝕原因菌を殺菌する（人間を除く）方法。
6. 前記オートミュタノリシンは、
   （１）配列番号１で表され、
   （２）ストレプトコッカス・ミュータンス死菌体を含むゲルを用いた酵素電気泳動において１００±１０ｋＤａに溶菌バンドを示し、または
   （３）配列番号２によって表される塩基配列を含むＤＮＡもしくは配列番号１のタンパク質をコードするＤＮＡによって形質転換された細胞、細菌、昆虫、または動物から得られる
   請求項５に記載の方法。
7. 前記シュガーエステルがＨＬＢ値１５もしくは１６の蔗糖ステアリン酸エステルまたはＨＬＢ値１６の蔗糖パルミチン酸エステルである請求項５または６に記載の方法。

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