KR101443920B1 - 시스토비루스 ｐｈｉ6의 외피막 단백질 Ｐ9을 융합파트너로포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질의생산방법 - Google Patents

시스토비루스 ｐｈｉ6의 외피막 단백질 Ｐ9을 융합파트너로포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질의생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시스토비루스 phi6의 외피막 단백질 (major envelope protein) P9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용하여 막 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 발현벡터를 이용하면 목적 막 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있다.

Description

시스토비루스 ｐｈｉ6의 외피막 단백질 Ｐ9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질의 생산방법{MEMBRANE PROTEIN EXPRESSION VECTOR COMPRISING MAJOR ENVELOPE PROTEIN P9 OF CYSTOVIRUS phi6 AS A FUSION PARTNER AND METHOD FOR PRODUCING THE MEMBRANE PROTEIN USING SAME}
본 발명은 시스토비루스 phi6의 외피막 단백질 P9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용하여 막 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
막 단백질은 생물체 프로테옴의 약 25-30% 정도를 차지하는데, 호흡이나 광합성 같은 기초적인 에너지 대사부터, 세포와 세포간 또는 세포와 외부간 커뮤니케이션, 물질 수송, 지질 대사 등에 관여하는 다양한 단백질 군이다. 또한, 막 단백질은 약제 개발의 중요한 대상으로서, 시중에서 판매되는 약제의 약 50% 정도가 막 단백질의 일종인 G-단백질과 연결된 수용체 (G-protein coupled receptor, GPCR)를 작용점으로 한다고 보고된 바 있으며 (Lundstrom, K., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15:3654, 2005), 가장 많이 팔리는 약 100개 중의 1/4은 GPCR이 작용점이라는 보고도 있다 (Klabunde, T. 및 Hessler, G., ChemBioChem. 3:928-944, 2002).
그러나, 막 단백질은 경제적으로 중요한 단백질군임에도 불구하고 현재 기능 또는 구조 연구가 수용성 단백질 (soluble protein)과는 비교할 수 없을 정도로 뒤처져 있다. 막 단백질 연구가 상대적으로 뒤떨어진 가장 큰 이유는 수용성 단백질과 달리 막 단백질, 특히 여러 번 막을 가로지르는 다층막 단백질 (multipass transmembrane)은 재조합 DNA 기술을 이용한 생산이 거의 불가능했기 때문이다 (Mancia F. 및 Hendrickson W. A, Mol. BioSyst. 3:723-734, 2007).
따라서, 수용성 단백질과 달리 미생물을 이용한 막 단백질의 발현 사례는 매우 드물며, 그 발현량도 매우 적다 (Marullo, S. et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA., 85:7551, 1988; 및 Grisshammer et al. Biochem J., 295:571, 1993). 특별히 성공적인 경우라 할 수 있는 뉴로텐신 수용체 (neurotensin receptor)과의 경우를 보면, 맥아당 결합 단백질 (maltose binding protein)과의 융합 형태로 발현시켜 대장균 세포 100 g 당 약 3 ㎎의 단백질을 얻을 수 있다고 보고된 바 있다 (White, J. F., et al. FEBS Lett. 564:289, 2004).
그러나, 대장균을 이용하여 외래 막 단백질의 발현을 유도 (induction)할 경우, 보통 목적 단백질의 발현이 관찰되기 이전에 숙주가 사멸해 버린다. 이 문제를 해결하기 위하여 막 단백질 발현벡터를 도입한 후 막 단백질의 발현을 유도해도 죽지 않는 돌연변이체 대장균 C41과 C43이 개발된 바 있으며 (Miroux, B. and Walker, J. E. J. Mol . Biol. 260:289-298, 1996), 막 단백질의 발현에 대장균 C41(DE3)과 C43(DE3)을 사용할 경우 효과를 보는 결과도 보고된 바 있다 (Korepanova, A., et. al Protein Science 14:148-158, 2005).
한편, 미스틱 (Mistic)이라 이름 붙인 고초균 (Bacillus subtilus) 단백질을 융합파트너로 사용하면 진핵세포 다중막 단백질을 발현시킬 수 있다는 논문이 발표되어 과학자들의 큰 관심을 끈 바 있으나 (Roosild T. P. et al., Science 307:1317 -1321 2005), 이 시스템을 이용한 막 단백질의 발현 성능에 대한 평가는 대체로 회의적이다 (Wagner et al., Trends in Biotech. 24:364-371, 2006). 최근에는 대장균 GlpF (glycerol-conducting channel protein)를 융합파트너로 사용하여 오클루딘 (occludin), 클로딘4 (claudin 4), 철환원효소 (ferric reductase) 및 칼륨채널 (potassium channel)이라는 인간 막 단백질의 발현에 성공했다는 보고를 한 바 있는데, 저자들은 이 방법이 목적 단백질의 아미노말단이 세포막 밖에 있는 경우 적용 불가능하다고 보고하였고, 발현량도 면역블랏으로 검출해야 할 만큼 적었다 (Neophytou, I. et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:375-381. 2007).
최근에는 대장균을 이용한 막 단백질 발현의 문제점을 인식하고 세포내 막 시스템이 발달된 효모를 이용한 발현시스템의 개발을 시도하고 있다. 녹색 형광 단백질 (Green fluorescent protein, GFP)을 발현 보고체로 사용하여 목적 막 단백질을 GFP와의 융합 단백질 형태로 효모 발현 벡터에 삽입한 후 GFP에서 나오는 형광의 유무를 따져 막 단백질의 발현 유무를 판단하는 방법이 최근에 개발되었다 (ㅦsterberg M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 103:11148-11153, 2006; 및 Newstead S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 104:13936-13941, 2007). 이 경우 효모 유래 단백질은 발현 성공 비율이 높은 반면, 인간을 포함하는 동물 유래 단백질의 경우 발현 성공률이 매우 낮았으며, 발현량도 쿠마시 염색으로 검출하기에는 너무 적은 경우가 대부분이다.
이에 본 발명자들은 진핵세포 또는 원핵세포 유래의 막 단백질을 효율적으로 발현시키기 위해 연구를 거듭하던 중, 목적 막 단백질을 융합파트너인 시스토비루스 phi6의 외피막 단백질 (major envelope protein) P9과 결합시켜 효과적으로 발현시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 막 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포를 이용한 막 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시스토비루스 phi6의 외피막 단백질 P9의 유전자, 목적 막 단백질을 삽입하기 위한 다중 클로닝 부위 (MCS) 및 P9 유전자와 MCS 사이에 위치한 프로테아제 인식부위를 연결하여 포함하는 막 단백질 발현벡터를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현벡터의 다중 클로닝 부위에 목적 막 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 후, 이를 세포에 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 막 단백질의 생산방법을 제공한다.
시스토비루스 phi6의 외피막 단백질 P9을 융합파트너로 포함하는 본 발명의 막 단백질 발현벡터를 사용하면 막 단백질을 효과적으로 과발현시킬 수 있으므로, 막 단백질을 작용점으로 하는 약제 개발이나 막효소를 이용한 생물전환 등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 발현벡터는 시스토비루스 phi6의 외피막 단백질 P9을 융합파트너로 사용하여 목적하는 막 단백질을 과발현시키는 것을 특징으로 하며, 상기 P9 단백질을 코딩하는 유전자의 5′-말단 또는 3′-말단에 목적 막 단백질을 코딩하는 유전자를 연결하여 포함함으로써 P9 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 목적 단백질이 융합된 융합단백질을 발현시킨다.
상기 P9 단백질은 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용되거나 특정 도메인이 중복되어 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명에서는 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 사용할 수 있으며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
상기 P9 단백질을 코딩하는 유전자는 유전자 코드 (genetic code)에 따라 상기 단백질의 아미노산 서열로부터 유추된 염기서열을 포함하고, 선택된 숙주세포에서 잘 발현될 수 있도록 코돈을 최적화할 수 있으며, 이러한 유전자의 대표적인 예로는 서열번호: 3 또는 4의 염기서열을 갖는 것을 들 수 있다. 서열번호: 3 및 4의 염기서열은 상기 서열번호: 1 및 2의 아미노산 서열을 각각 코딩한다.
본 발명의 발현벡터는 P9 단백질과, 목적 단백질이 삽입될 부위 사이에 프로테아제 인식부위 및 적절한 링커 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현벡터는 5′에서 3′ 방향으로 프로모터, P9을 코딩하는 유전자, 프로테아제 인식부위, 목적 단백질의 유전자가 삽입될 다중 클로닝 부위 (multicloning site, MCS) 및 히스티딘 태그 등을 번역 융합 (translational fusion)의 형태로 연결하여 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라 항생제 내성 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 P9 단백질과 프로테아제 인식부위 사이에 가외 의 막통과 도메인 (transmenbrane domain; TM 도메인)을 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 구조의 발현 벡터를 사용하면 자연 상태에서 N-말단이 세포막 내에 존재하는 막 단백질의 발현을 현저히 증가시킬 수 있다. 본 발명의 벡터에 추가될 수 있는 TM 도메인으로는 당 분야에 공지된 임의의 TM 도메인을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 시스토비루스 P9 단백질 또는 시스토비루스 P10 단백질, M13 파지의 주 코트단백질(major coat protein), 파지 Pf3 코트 단백질(coat protein)의 TM 도메인을 예시할 수 있고, P9 단백질의 TM 도메인이 바람직하다.
본 발명의 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 T7, T5 또는 tac 프로모터일 수 있으나, 선택한 숙주세포에서 목적 막 단백질을 잘 생산할 수 있는 적절한 다른 프로모터가 이용될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 상기 프로테아제는 트롬빈, 테브(TEV) 또는 엔테로키나제(Enterokinase) 일 수 있다.
또한, 본 발명은 목적 막 단백질이 시스토비루스 유래 융합파트너와 하나의 폴리펩타이드로 발현되도록 제조된 유전자를 제공하며, 이 조작된 융합유전자는 에피좀 (episome) 형태로, 또는 염색체 내에 삽입된 형태로 박테리아에 도입되어 목적 단백질을 생산할 수도 있고, 또는 세포내 도입 없이 시험관에서 무세포단백질생산 방법으로 목적 단백질을 생산할 수도 있다.
본 발명에 있어서 상기 막 단백질은 막 수용체 (membrane receptors), 이온채널, 막 수송체 (membrane transporter), 펌프 (pump), 막 효소 (membrane enzyme), 세포-세포 소통을 위한 리간드와 수용체, 세포-세포를 연결하는 링커, 세포내 물질 수송을 위한 소낭 (membrane vesicle)의 리간드와 수용체, 엔도 및 엑소 사이토시스 (endo- and exocytosis)의 리간드와 수용체, 비루스 생활사 (viral life cycle)에 관여하는 생체막 단백질, 항체 또는 그 일부분 및 독소단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 예시적으로, 상기 막 단백질은 인간 G-단백질과 연결된 수용체 (GPCR)인 A3 아데노신수용체 (A3 adenosine receptor, Adora; Genbank Accession No. NM_000677), 엔도텔린 수용체 A (Endothelin receptor type A, Endo; Genbank Accession No. BC022511), 리소포스파티딕산 수용체 2 (Lysophosphatidic acid receptor 2, Lyso; Genbank Accession No. BC030615), 도파민 수용체 D2 (dopamine receptor D2, Dopa; Genbank Accession No. BC021195), 시스테이닐 류코트리엔 수용체 1 (cysteinyl leukotriene receptor 1, Leuko; Genbank Accession No. BC035750), 멜라노코틴 1 수용체 (melanocortin 1 receptor, MC1R; Genbank Accession No. NM_002386), 프로스타글란딘 E 수용체 (prostaglandin E receptor 3, Prost; Genbank Accession No. BC024229); 인간 다중막 단백질인 GPCR의 일종인 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1 (Neuropeptide Y receptor Y1, Neuro; Genbank Accession No. BC036657), 용질운반체 (Solute carrier)의 일종인 티아민 운반체 (Thiamine transporter, ThiaT; Genbank Accession No. BC018514) 및 여닫이 이온 채널 (gated ion channel)의 일종인 세로토닌 수용체 (5-Hydroxytryptamine receptor 3A, Sero; Genbank Accession No. BC004453); 다중막 단백질인 용질운반체의 일종인 포도당운반체 (Facilitated glucose transporter member 4, GLUT4; Genbank Accession No. BC014282), 및 생체막효소의 일종인 프로스타글란딘 E 합성효소 (Prostaglandin E synthase, mPGES; Genbank Accession No. NM_004878)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 세포는 대장균, 녹농균 등의 박테리아와 같은 미생물 또는 동물세포일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 융합파트너로서 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 시스토비루스의 외피막 단백질 P9을 포함하는 발현벡터 pRphi6-9을 제조한 후 (도 1 및 2 참조), 이를 이용하여 대장균 BL21(DE3) 또는 EPI300을 형질전환시키고, 상기 형질전환된 EPI300 대장균 균주를 EPI300/pRphi6-9로 명명하여 이를 한국 유전자 은행에 2008년 8월 1일자 기탁번호 제 KCTC 11373BP호로 기탁하였다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발현벡터의 다중 클로닝 부위에 목적 막 단백질을 코딩하는 DNA를 삽입한 후, 이를 세포에 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 막 단백질의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 발현벡터 pRphi6-9의 MCS에 진핵세포 유래의 다양한 목적 막 단백질들을 삽입한 후 대장균에서 과발현을 유도하였고(도 5 내지 8), 이 과발현된 단백질들이 라우릴다이메틸아민-옥사이드 (Lauryldimethylamine-oxide, LDAO)와 같은 순한 용제로 잘 추출되는 것으로 보아 응집체가 아니라 세포막에 박힌 상태로 생산되는 것을 확인하였으며(도 4), 이들을 Ni-NTA 컬럼 등을 사용하여 정제함으로써, 본 발명에 따른 발현벡터를 사용하면 다양한 막 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 발현벡터 pRphi6-9에 TM 도메인이 추가된 pRphi6-9RevTM의 MCS에, 자연 상태에서 N-말단이 세포막 내에 존재하는 막 단백 질, 예를 들어, GLUT4, P2X, 또는 Adora의 mPGES 유전자를 삽입한 후 대장균에서 발현을 유도한 결과, pRphi6-9을 이용하여 발현한 경우보다 5배 이상 발현량이 증가함을 확인하였다(도 15).
본 발명의 실시예는 박테리오파지 phi6의 단백질을 대상으로 실시되었으나, 이들 결과가 시스토비루스에 속하는 다른 박테리오파지, 예를 들어, phi8, phi12, phi13 등의 외피막 단백질 P9에도 적용될 수 있으리라는 것은 당 기술분야에서 자명한 것이다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 대장균을 숙주세포로 사용하고 있으나, 녹농균과 같은 다른 박테리아가 숙주로 사용될 수 있으리라는 것 또한 자명하다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조되고 목적 단백질이 막에 발현된 세포는 이러한 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 막 단백질의 활성측정 방법, 리간드-수용체 결합 검출 시스템의 개발 등에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 발현벡터에 의해 생체막에 발현된 P9 단백질-목적 단백질의 융합 단백질을 항원으로서 척추동물에 투여하여 면역반응을 유도하고, 상기 면역반응에 의해 생성된 항체를 회수함으로써 항체를 생산할 수도 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 한정하지는 않는다.
실시예 1: 시스토비루스 phi6의 P9을 과발현하는 재조합 벡터 pRphi6-9의 제조
시스토비루스 phi6의 P9을 과발현하는 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 파지 phi6의 외피막 단백질 P9 (서열번호: 2)을 코딩하는 서열번호: 4의 전체 유전자를 합성하였다. 이때, 합성유전자의 코돈은 대장균용으로 최적화하였으며, 개시코돈 주변에는 제한효소 NdeI, 종결코돈을 제거한 부위에는 제한효소 XhoI의 인식 서열을 각각 삽입하였다. 또한, XhoI 다음에는 트롬빈 인식부위를 코드하는 염기 서열, 다중 클로닝 부위, 6개의 His 코돈 (6× His) 및 종결코돈이 차례로 위치하도록 DNA 조각을 합성한 다음 (서열번호: 5의 염기서열 참조), 상업용 발현벡터인 pRSET A (Invitrogen)의 NdeI/HindIII 위치에 삽입하여 도 1 및 2의 구조를 갖는 재조합 벡터를 제조하였으며, 이 벡터를 pRphi6-9로 명명하였다.
상기 벡터를 이용하여 통상의 방법에 따라 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켰으며, IPTG로 재조합 단백질의 발현을 유도한 전후에 대장균 세포를 수거하여 초음파 파쇄하여 얻은 전체 단백질을 전기영동 (SDS-PAGE)하여 약 12 kD의 P9이 과발현됨을 확인하였다 (도 3).
또한, 상기 벡터 pRphi6-9로 대장균 EPI300 균주(입수처: Epicentre, 미국)를 형질전환시키고 이를 대장균 EPI300/pRphi6-9로 명명하여 이를 한국 유전자 은행에 2008년 8월 1일자 기탁번호 제 KCTC 11373BP호로 기탁하였다.
실시예 2: 파지 phi6의 P9 단백질의 정제 및 항체 제조
상기 실시예 1에서 제조한 대장균 형질전환체를 초음파로 파쇄한 후, 12,000 rpm (high speed centrifuge)으로 원심분리하여 상등액을 얻고, 이를 다시 50,000 rpm (ultracentrifuge, 100,000g)의 속도로 원심분리하여 세포막 조각이 포함된 침전물을 얻었다. 39 mM LDAO를 함유하는 Tris-HCl 완충용액(pH7.5)을 가하여 침전물을 분산시킨 후 재차 50,000 rpm으로 원심분리하여 막단백질이 녹아나온 상등액을 얻었다. LDAO로 용출된 막단백질은 통상의 방법에 따라 Ni-NTA 친화크로마토그래피 (NTA affinity chromatography; 컬럼: His TrapTM HP(GE Healthcare); 이동상: 완충용액- 39 mM LDAO를 포함하는 20mM Tris-HCl(pH7.5), 이미다졸 농도 구배- 20 ~ 500 mM)와 슈퍼로스 6 겔 여과 (Superose 6 gel filtration; 컬럼: SuperdexTM 75 10/300 GL(GE Healthcare); 이동상: 13 mM LDAO를 포함하는 20mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액)을 차례로 거쳐 히스티딘 태그 (His-tag)와 트롬빈 인식부위를 포함하는 P9 단백질을 정제한 후, 이를 이용하여 통상의 방법에 따라 생쥐에서 항체를 제조하였다.
한편, 상기 대장균 형질전환체의 전체 단백질 시료를 12,000 rpm (high speed centrifuge) 및 50,000 rpm (ultracentrifuge)의 속도로 각각 원심분리하여 얻은 상등액 및 침전물, 및 50,000 rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물에 LDAO를 가한 후 다시 50,000 rpm으로 원심분리하여 얻은 상등액 및 침전물에 대하여, 상기 항체를 이용하여 통상의 방법에 따라 면역블랏 (immunoblot)을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 제조된 P9 단백질은 12,000 rpm의 원심분리 속도에서는 상등액에 존재하고, 50,000 rpm의 속도에서는 펠렛으로 침전되었다가 LDAO로 추출한 후 원심분리하면 상등액에서 검출되었다. 따라서, 과발현된 단백질이 세포막에 박혀있는 상태임을 알 수 있다.
실시예 3: 인간 G-단백질과 연결된 수용체 (GPCR) 발현 플라스미드의 제조 및 GPCR 단백질의 발현 (1)
인간 GPCR인 A3 아데노신수용체 (A3 adenosine receptor, Adora; Genbank Accession No. NM_000677), 엔도텔린 수용체 A (Endothelin receptor type A, Endo; Genbank Accession No. BC022511) 및 리소포스파티딕산 수용체 2 (Lysophosphatidic acid receptor 2, Lyso; Genbank Accession No. BC030615)를 코딩하는 cDNA를 주형으로 하고, Adora는 서열번호 6과 7, Endo는 서열번호 8과 9, Lyso는 서열번호 10과 11의 프라이머를 각각 사용하여 PCR 반응 (Adora는 94℃ 3 분 94℃ 1 분 55℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클, 다시 72℃ 10 분; Endo와 Lyso는 94℃ 3 분 후, 94℃ 1 분 60℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클, 다시 72℃ 10 분)을 수행하였다. 증폭된 DNA를 Adora는 제한효소 EcoRV 및 EcoRI로, Endo는 PvuII 및 HindIII로, Lyso는 PvuII 및 HindIII로 각각 절단한 후 pRphi6-9의 제한효소 자리 (Adora는 SmaI/EcoRI, Endo와 Lyso는 SmaI/HindIII)에 각각 삽입하여 인간 GPCR 단백질 발현 플라스미드를 제조하였으며, 이를 각각 pRphi6-9Adora, pRphi6-9Endo 및 pRphi6-9Lyso로 명명하였다.
이들 발현벡터를 이용하여 T7 RNA 폴리머라제가 들어있는 대장균 숙주 BL21(DE3) 및 Rosetta(DE3) (Novagen)를 형질전환시킨 후, 형질전환체를 배양하면서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하고 각 GPCR 단백질의 발현 정도를 돗블랏 (dot blot)을 이용하여 다음과 같이 정량하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 정제한 파지 phi6의 P9 단백질을 100 ng 부터 출발하여 1/2씩 반복 희석한 용액들을 만든 후, 각 희석 용액으로부터 1 ㎕ 씩 취하여 나일론 막에 떨어뜨렸다. 다음으로 GPCR 단백질을 유도한 각각의 세포를 수거하여 초음파로 파쇄한 후, 단백질 농도가 1 ㎍/㎕가 되도록 희석하였다. 이 전체 단백질 추출액으로부터 1 ㎕를 취하여 1/2씩 반복 희석한 후, 각 희석 용액 1 ㎕를 나일론 막에 떨어뜨렸다. 이 나일론 막에 실시예 2에서 제조한 항체를 1:10,000의 농도로 결합시킨 후, 화학발광법 (chemiluminescence)으로 결합된 항체를 검출하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 각 목적 단백질에 대한 시료는 왼쪽은 BL21(DE3)로부터, 오른쪽은 Rosetta(DE3)로부터 얻은 것이다.
도 5에 나타난 바와 같이, Adora의 경우에는 벡터만 들어있는 시료보다 BL21(DE3/pRphi6-9Adora)로부터 얻은 시료의 점이 더 진한 것으로 보아 Adora 단백질이 적은 양이기는 하지만 발현된 것을 알 수 있다. 또한, Endo와 Lyso의 경우에는 BL21(DE3) 또는 Rosetta(DE3)를 숙주로 사용한 경우 최대 총단백질의 10% 이상으로 많은 양이 생산되었다. 본 발명이 시도한 첫 목적 단백질이 발현이 어렵기로 잘 알려진 인간 GPCR임을 고려할 때, 도 5의 결과는 막 단백질 발현 기술에서 대단 한 진전을 이루었음을 보여준다.
실시예 4: GPCR 발현 플라스미드의 제조 및 GPCR 단백질의 발현 (2)
인간 다중막 단백질인 GPCR의 일종인 도파민 수용체 D2 (dopamine receptor D2, Dopa; Genbank Accession No. BC021195), 시스테이닐 류코트리엔 수용체 1 (cysteinyl leukotriene receptor 1, Leuko; Genbank Accession No. BC035750), 멜라노코틴 1 수용체 (melanocortin 1 receptor, MC1R; Genbank Accession No. NM_002386), 프로스타글란딘 E 수용체 (prostaglandin E receptor 3, Prost; Genbank Accession No. BC024229)를 코딩하는 cDNA를 주형으로 하고, Dopa는 서열번호 12와 13, Leuko는 서열번호 14와 15, MC1R은 서열번호 16과 17, Prost는 서열번호 18과 19의 프라이머를 각각 사용하여 PCR 반응 (94℃ 3 분, 94℃ 1 분 60℃ 1 분 72℃ 1 분 28 사이클 후 72℃ 10 분)을 수행하였다. 증폭된 DNA를 Dopa와 Leuko는 SmaI/HindIII로, MC1R과 Prost는 EcoRV/HindIII로 각각 절단한 후, pRphi6-9의 제한효소 자리 SmaI/HindIII에 각각 삽입하여 인간 다중막 단백질 발현 플라스미드를 제조하였으며, 이를 각각 pRphi6-9Dopa, pRphi6-9Leuko, pRphi6-9MC1R 및 pRphi6-9Prost로 명명하였다.
이들 발현벡터를 T7 RNA 폴리머라제가 들어있는 대장균 숙주 BL21(DE3) 및 Rosetta(DE3)에 형질전환한 후, 형질전환체를 배양하면서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하고 각 목적 단백질의 발현 정도를 실시예 3과 동일한 방법으로 정량하였으 며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 각 목적 단백질에 대한 시료는 왼쪽은 BL21(DE3)로부터, 오른쪽은 Rosetta(DE3)로부터 얻은 것이다.
도 6에 나타난 바와 같이, Leuko와 Prost의 경우 BL21(DE3) 숙주에서, Dopa의 경우 Rosetta(DE3) 균주에서 최대 발현을 보였으며, MC1R의 경우 두 숙주 모두에서 높은 발현을 보였다.
실시예 5: 인간 다중막 단백질 발현 플라스미드의 제조 및 목적 단백질의 발현 (1)
인간 다중막 단백질인 GPCR의 일종인 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1 (Neuropeptide Y receptor Y1, Neuro; Genbank Accession No. BC036657), 용질운반체 (Solute carrier)의 일종인 티아민 운반체 (Thiamine transporter, ThiaT; Genbank Accession No. BC018514) 및 여닫이 이온 채널 (gated ion channel)의 일종인 세로토닌 수용체 (5-Hydroxytryptamine receptor 3A, Sero; Genbank Accession No. BC004453)를 코딩하는 cDNA를 주형으로 하고, Neuro는 서열번호 20과 21, ThiaT는 서열번호 22와 23, Sero는 서열번호 24와 25의 프라이머를 사용하여 PCR 반응 (94℃ 3 분, 94℃ 1 분 63℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클 후 72℃ 10 분)을 수행하였다. 증폭된 DNA를 Neuro는 SspI/HindIII로, ThiaT는 PvuII/HindIII로, Sero는 PvuII/HindIII로 각각 절단한 후 pRphi6-9의 제한효소 자리 SmaI/HindIII에 각각 삽입하여 인간 다중막 단백질 발현 플라스미드를 제조하였으며, 이를 각각 pRphi6-9Neuro, pRphi6-9ThiaT 및 pRphi6-9Sero로 명명하였다.
이들 발현벡터를 이용하여 T7 RNA 폴리머라제가 들어있는 대장균 숙주 BL21(DE3) 및 Rosetta(DE3)를 형질전환시킨 후, 형질전환체를 배양하면서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하고 각 목적 단백질의 발현 정도를 실시예 3과 동일한 방법으로 정량하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 각 목적 단백질에 대한 시료는 왼쪽은 BL21(DE3)로부터, 오른쪽은 Rosetta(DE3)로부터 얻은 것이다.
도 7에 나타난 바와 같이, Neuro의 경우 BL21(DE3) 숙주에서, ThiaT와 Sero의 경우 Rosetta(DE3)균주에서 최대 발현을 보였으며, 모두 최대 발현량은 총 단백질의 10% 이상으로 측정되었다.
실시예 6: 인간 다중막 단백질 발현 플라스미드의 제조 및 목적 단백질의 발현 (2)
다중막 단백질인 용질운반체의 일종인 포도당운반체 (Facilitated glucose transporter member 4, GLUT4; Genbank Accession No. BC014282), 및 생체막효소의 일종인 프로스타글란딘 E 합성효소 (Prostaglandin E synthase, mPGES; Genbank Accession No. NM_004878)를 코딩하는 cDNA를 주형으로 하고, GLUT4는 서열번호 26과 27, mPGES는 서열번호 28과 29의 프라이머를 각각 사용하여 PCR 반응 (GLUT4는 94℃ 3 분, 94℃ 1 분 60℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클 후, 72℃ 10 분; mPGES는 94℃ 3 분, 94℃ 1 분 65℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클 후 72℃ 10 분)을 수행하였다. 증폭된 DNA를 GLUT4는 EcoRV/HindIII로, mPGES는 PvuII/HindIII로 각각 절단한 후 pRphi6-9의 제한효소 자리 SmaI/HindIII에 각각 삽입하여 다중막 단백질 발현 플라 스미드를 제조하였으며, 이를 각각 pRphi6-9GLUT4 및 pRphi6-9mPGES로 명명하였다.
이들 발현벡터를 이용하여 T7 RNA 폴리머라제가 들어있는 대장균 숙주 BL21(DE3) 및 Rosetta(DE3)를 형질전환시킨 후, 형질전환체를 배양하면서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하고 각 목적 단백질의 발현 정도를 실시예 3과 동일한 방법으로 정량하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 각 목적 단백질에 대한 시료는 왼쪽은 BL21(DE3)로부터, 오른쪽은 Rosetta(DE3)로부터 얻은 것이다.
도 8에 나타난 바와 같이, Rosetta(DE3)를 숙주로 사용하면 GLUT4 및 mPGES이 다량 발현됨을 확인하였다.
실시예 7: 발현된 막 단백질의 SDS-PAGE와 면역블랏 및 막 토폴로지 (membrane topology)와의 상관관계
상기의 실시예 3 내지 6에서 사용한 돗블랏 방법은 발현량 (quantity)을 측정하기에는 편리하나 발현된 단백질이 완전한지 분해되어 조각이 됐는지 등 발현된 단백질의 질 (quality)을 측정하기에는 적절치 않다. 따라서, 과발현된 단백질이 완전한 상태로 존재하는지 확인하기 위해 발현벡터 pRphi6-9Adora, pRphi6-9Endo와 pRphi6-9Neuro를 대장균 숙주 BL21(DE3)에, 그리고 발현벡터 pRphi6-9Lyso, pRphi6-9Sero, pRphi6-9ThiaT, pRphi6-9GLUT4와 pRphi6-9mPGES를 대장균 숙주 Rosetta(DE3)에 형질전환시킨 후 형질전환체를 배양하면서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하고 각 목적 단백질의 발현을 통상의 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하여 확인 하였다. 목적 단백질의 검출은 쿠마시염색 후 단백질 밴드를 직접 관찰하거나 실시예 2에서 제조된 P9 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역블랏으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, Endo, Lyso, Neuro, Sero 및 ThiaT의 경우 쿠마시염색 겔에서 진한 밴드로 나타나며(a), 이 밴드가 목적 단백질임은 면역블랏으로 확인하였다(b). 또한, mPGES의 경우 상기 단백질들보다는 적은 양이긴 하지만 예측된 크기에서 뚜렷하고 완전한 밴드로 나타났다(c).
또한, 목적단백질의 발현량과 막 토폴로지와의 상관관계를 알아보기 위해 실시예 3 내지 6에서 사용된 막 단백질에 대한 막 토폴로지를 컴퓨터를 이용하여 예측하였으며 (pubMed, http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html; TMMHMM, http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/; 및 hmmtop, http://www.enzim.hu/hmmtop/), 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 실시예 3 내지 6의 목적 단백질들은 TM 도메인 (transmembrane domain)이 3개에서 12개까지 다양하며, GPCR에서부터 막 효소까지 기능적으로도 다양한 단백질들이다.
실시예 7: P9 단백질에 가외 TM 도메인의 추가를 통한 막단백질 발현양의 증진
도 10에 나타낸 GLUT4 처럼 N-말단이 세포막 안에 존재하는 목적단백질의 경우에는 융합파트너의 C-말단 역시 세포막 내에 존재해야 생산된 막단백질이 안정화 될 것으로 여겨진다. 융합파트너에 가외 TM 도메인 (extra transmembrane domain)을 첨가하여 TM 도메인을 두 개로 만들면 융합파트너의 C-말단이 세포막 안쪽에 위치하게 될 것으로 유추하고, TM 도메인이 두 개인 융합파트너를 다음과 같이 제조하였다.
우선 PCR을 통하여 C-말단이 줄어든 P9 변이단백질 생산 플라스미드 세 개를 제조하였다. 서열번호 30과 31, 30과 32, 30과 33의 프라이머 쌍을 각각 이용하고, pRphi6-9를 주형으로 하여 PCR 반응 (94℃ 3 분, 94℃ 1 분 63℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클 후 72℃ 10 분)을 수행한 후 얻어진 DNA 산물을 pRphi6-9의 NdeI/XhoI 자리에 삽입하여 pRphi6-9Rev1, pRphi6-9Rev2 및 pRphi6-9Rev3 플라스미드를 각각 제조하였다. 이들은 각각 C-말단으로부터 4, 9, 14개의 아미노산이 제거된 P9 단백질을 생산하는 벡터이다.
다음으로, P9 단백질(서열번호: 2)의 TM 도메인 (아미노산 52번부터 71번까지)을 포함하는 P9 단백질의 아미노산 48번부터 77번까지의 부분을 위에서 제조한 세 플라스미드에 삽입하기 위해 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 즉, TM 도메인의 아미노산 순서는 보존하면서 DNA 서열에 변화를 줄 수 있도록 변화된 코돈을 포함하는 서열번호 34의 프라이머와 His-tag에 상보적인 서열을 포함하는 서열번호 35의 프라이머를 사용하고, pRphi6-9를 주형으로 하여 PCR 반응 (94℃ 1 분, 94℃ 30 초 72℃ 1 분 28 사이클, 72℃ 10 분)을 수행함으로써 TM 도메인, 트롬빈 인식부위, MCS 및 His-tag을 포함하는 DNA 단편을 얻은 후, 이를 SalI/HindII로 절단하여 pRphi6-9Rev1, pRphi6-9Rev2 및 pRphi6-9Rev3의 XhoI/HindIII자리에 각각 삽입함으 로써 TM 도메인이 두개인 벡터 pRphi6-9Rev1TM(도 12), pRphi6-9Rev2TM(도 13) 및 pRphi6-9Rev3TM(도 14)을 제작하였다. 이들 세 벡터("pRphi6-9RevTM"으로 통칭함)는 모두 두 개의 TM 도메인을 가지나, 두 TM 도메인 사이의 거리가 서로 다르다(도 11). 벡터 pRphi6-9Rev1TM, pRphi6-9Rev2TM, 및 pRphi6-9Rev3TM에 포함된, p9의 개시코돈부터 His-tag 다음의 종결코돈까지를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열 및 이에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호 36과 37; 38과 39; 및 40과 41로 나타내어진다.
TM 도메인 두 개를 가지고 있는 상기 세 벡터의 MCS에, Adora, GLUT4, mPGES및 퓨린수용체 (Purinergic receptor P2XR4, P2X; Genbank Accession No. BC033826) 유전자를 삽입한 후 그 발현 양을 pRphi6-9를 사용했을 때의 발현 양과 비교하였다. 이 때 Adora는 실시예 3, GLUT4와 mPGES는 실시예 5에서 사용한 플라스미드의 XhoI/Hind 조각을 2TM 벡터 pRphi6-9Rev1TM, pRphi6-9Rev2TM 및 pRphi6-9Rev3TM의 XhoI/HindIII자리에 각각 삽입하였다. P2X는 cDNA clone을 주형으로 하고 서열번호 42 및 43의 프라이머를 사용한 PCR (94℃ 3 분, 94℃ 1 분 60℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클 후, 72℃ 10 분) 반응에 의해 얻은 DNA 산물을 EcoRV/HindIII로 절단하여 상기 pRphi6-9Rev1TM, pRphi6-9Rev2TM 및 pRphi6-9Rev3TM의 SmaI/HindIII 자리에 넣었다.
가외로 삽입한 TM 도메인의 발현 증진 효과를 알아보기 위해, 목적 막단백질 유전자가 pRphi6-9에 들어있는 벡터와 pRphi6-9Rev1TM, pRphi6-9Rev2TM 및 pRphi6-9Rev3TM에 들어있는 벡터들을 T7 RNA 폴리머라제를 함유하는 대장균 숙주 BL21(DE3) 또는 Rosetta(DE3)에 형질전환시킨 후, 각 형질전환체를 배양하면서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하고 통상의 방법에 따라 SDS-PAGE한 후 각 목적 단백질의 발현 정도를 P9 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역블랏으로 관찰하였다 (도 15). 도 15에 보여준 각 단백질의 왼쪽 시료는 TM 도메인이 하나인 발현벡터에서, 오른쪽 시료는 TM 도메인이 두 개인 발현벡터에서 온 것으로, GLUT4는 pRphi6-9GLUT4(왼쪽)와 pRphi6-9Rev1TMGLUT4(오른쪽), P2X의 경우 pRphi6-9P2X(왼쪽)과 pRphi6-9Rev1TMP2X(오른쪽), Adora는 pRphi6-9Adora(왼쪽)과 pRphi6-9Rev2TMAdora(오른쪽), mPGES는 pRphi6-9mPGES(왼쪽)과 pRphi6-9Rev3TMmPGES(오른쪽)로부터 온 것이다. 사용된 숙주는 GLUT4, P2X, Adora는 Rosetta(DE3), mPGES는 BL21(DE3)이다. 도 15에서 보는 바와 같이 GLUT4, P2X, Adora, mPGES 모두 TM 도메인이 두 개인 발현벡터를 사용할 경우 TM 도메인이 하나인 발현벡터를 사용하는 경우보다 발현된 단백질의 양이 5배 정도 많았다.
실시예 8: 과발현된 막 단백질의 용제 추출 (detergent extraction)
대장균에서 과발현된 단백질들은 종종 폴리펩타이드가 잘못 접혀져 기능을 잃은 응집체 (inclusion body) 형태로 존재하는 문제가 있음은 잘 알려져 있다. 이에 본 발명에 따라 발현된 막 단백질이 자연 상태에서와 같이 세포막에 존재하는지 또는 기능을 잃은 응집체 형태로 존재하는지 알아보기 위해 발현된 단백질의 용제추출을 시도하였다.
구체적으로, 실시예 3 내지 5에서 제조된, 각 발현된 단백질을 포함하는 대장균 세포를 파쇄한 후 초고속 원심분리 (100,000g, 1 시간)하면 수용성 단백질은 상등액으로 가고, 막에 박힌 단백질은 막 조각들과 함께 침전물로 떨어지게 된다. 이 초고속 침전물에 트리톤 (Triton) X100이나 LDAO (Lauryldimethylamine-oxide)와 같은 순한 용제를 처리하면 막에 박힌 단백질은 용액으로 녹아 나온다. 만일 과발현된 단백질이 응집체 상태로 있다면 트리톤 X100이나 LDAO 같은 순한 용제로는 추출되지 않아 단백질은 침전물에 그대로 남는다. 일반적으로 초고속 원심분리 침전물을 순한 용제를 가해 분산시킨 후 재차 초고속 원심분리하여 목적 단백질이 상등액으로 나오면 그 단백질은 세포막에 삽입된 형태라 판단하고 침전물에 그대로 남으면 응집체로 존재한다고 판단한다.
이에, Endo가 과발현된 세포를 초음파 파쇄 후 100,000g에서 1시간 동안 원심분리하여 침전물을 모은 후, 이 침전물에 용제로서 DDM (n-dodecyl-β-D-maltoside), LDAO, OG (n-Octyl-beta-D-glucopyranoside), 트리톤 X100 및 사르코실 (Sarkosyl)을 첨가하여 막 단백질의 추출을 시도하였다. 용제를 첨가 분산시킨 후 100,000g에서 재차 초고속 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리하였다. 이 상등액과 침전물을 통상의 방법에 따라 SDS-PAGE한 후 쿠마시염색과 면역블랏으로 목적 단백질을 검출하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 과발현된 Endo는 OG로는 전혀 추출되지 않았고, DDM과 트리톤 X100으로는 소량만 추출되었다. 반면에 LDAO는 발현된 양의 50% 정도, 사르코실은 거의 모두를 추출해 냈다. 따라서, 대장균에서 과발현된 Endo가 순 한 용제인 LDAO 등으로 추출되는 것으로 보아 과발현된 Endo는 응집체로 존재하는 것이 아니라 세포막에 박힌 형태로 존재함을 알 수 있다.
또한, 과발현된 다른 막 단백질들에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 세포막에 존재하는지 알아보았으며 면역블랏의 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 과발현된 모든 단백질은 사르코실로는 거의 모두 상등액으로 추출되었으며, LDAO로는 90% 이상 (mPGES와 ThiaT) 추출되는 것, 75% 정도 추출되는 것 (Lyso와 Sero), 50% 정도 추출되는 것 (Endo)이 있었다. 또한 과발현된 단백질의 상당 부분이 트리톤 X100 (mPGES와 ThiaT), 혹은 OG (Lyso)로도 어느 정도 추출되었다. 목적 단백질이 이와 같이 순한 용제로 추출되는 것으로 보아 과발현된 6개의 막 단백질 모두 응집체가 아닌 막 삽입 상태로 존재함을 알 수 있다.
실시예 9: 과발현된 막 단백질의 정제
본 발명의 벡터를 이용하여 Endo, Lyso, mPGES, Sero 및 thiaT 단백질을 과발현한 후 정제를 시도하였다.
구체적으로, 실시예 3 내지 5에서 제조된, 상기 단백질들의 발현 플라스미드를 보유한 BL21(DE3) 세포를 25℃에서 광학밀도 (OD)=0.8이 될 때까지 영양배지 (Difco LB broth)에서 배양한 후, IPTG를 넣고 6시간 더 배양하였다. 세포를 수거하여 세포 파쇄 완충용액 (Sonication buffer; 20 mM Tris-cl pH8.0, 0.3M NaCl, 10% glycerol)에 녹인 후 초음파 분쇄하였다. 분쇄액을 100,000 g에서 1시간 동안 초고속 원심분리한 후 침전물을 모았다. 상기 침전물을 39 mM LDAO가 첨가된 세포 파쇄 완충용액에 녹인 후 재차 100,000 g에서 1시간 동안 초고속 원심분리하여 목적단백질이 추출된 상등액을 얻었다. 상기 상등액에 이미다졸을 가하여 농도가 10 mM이 되게 맞춘 후, Ni-NTA 컬럼에 걸었다. 컬럼을 로딩버퍼 (20 mM Tris-cl pH8.0, 0.3 M NaCl, 10% glycerol, 5 mM Imidazole)로 충분히 씻어준 후 이미다졸 농도 구배 (10 mM 내지 500 mM)를 이용하여 목적 단백질을 컬럼에서 분리하였다. 분리된 단백질을 SDS-PAGE와 면역블랏으로 확인하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타난 바와 같이, 5개의 목적 단백질은 모두 Ni-NTA 컬럼 하나만 사용해도 상당한 정도의 정제가 가능할 정도로 효과적으로 과발현되었다.
도 1은 본 발명에 따른 막 단백질 발현용 벡터 pRphi6-9의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 상기 발현벡터 pRphi6-9에서 P9 단백질 및 링커가 삽입된 부분의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균의 재조합 단백질 유도 전후의 전체 단백질을 전기영동 (SDS-PAGE)한 결과를 나타낸 것이다. 화살표는 과발현된 P9 단백질을 나타낸다.
도 4는 상기 발현벡터로부터 발현된 P9 단백질이 세포막에 삽입된 것임을 확인하기 위한 면역블랏의 결과이다. 이때, T는 총단백질, S는 상등액 및 P는 펠렛을 나타낸다.
도 5 내지 8은 상기 발현벡터에 삽입된 A3 아데노신수용체 (Adora), 엔도텔린 수용체 A (Endo), 리소포스파티딕산 수용체 2 (Lyso), 도파민 수용체 D2 (Dopa), 시스테이닐 류코트리엔 수용체 1 (Leuko), 멜라노코틴 1 수용체 (MC1R), 프로스타글란딘 E 수용체 (Prost), 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1 (Neuro), 세로토닌 수용체 (Sero), 티아민 운반체 (ThiaT), 포도당 운반체 (GLUT4) 및 프로스타글란딘 E 합성효소 (mPGES)의 대장균 BL21(DE3)(왼쪽) 및 Rosetta(DE3)(오른쪽)에서의 발현량을 돗블랏 방법을 이용하여 확인한 결과이다.
도 9는 상기 8종의 단백질의 발현량을 SDS-PAGE(a)와 항체를 이용한 면역블랏 방법(b 및 c)으로 확인한 결과이다.
도 10은 상기 8종의 단백질 중, 일부의 막 토폴로지를 P9 단백질과 비교한 것이다.
도 11은 상기 도 1에 나타낸 막 단백질 발현용 벡터 pRphi6-9의 XhoI 자리에 가외 TM 도메인 (extra transmembrane domain)을 삽입하여 융합파트너의 TM 도메인이 두개가 되도록 만든 벡터 (pRphi6-9RevTM: pRphi6-9Rev1TM, pRphi6-9Rev2TM, pRphi6-9Rev3TM)의 모식적인 구조이다.
도 12는 TM 도메인 둘을 함유하는 발현벡터 pRphi6-9Rev1TM에서, P9 단백질의 개시 코돈부터 히스태그(His tag) 및 종결코돈 까지의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 13은 TM 도메인 둘을 함유하는 발현벡터 pRphi6-9Rev2TM에서, P9 단백질의 개시 코돈부터 히스태그(His tag) 및 종결코돈 까지의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 14는 TM 도메인 둘을 함유하는 발현벡터 pRphi6-9Rev3TM에서, P9 단백질의 개시 코돈부터 히스태그(His tag) 및 종결코돈 까지의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 15는 TM 도메인이 하나인 발현 벡터 pRphi6-9와 TM 도메인이 두 개인 발현벡터 (pRphi6-9Rev1TM, pRphi6-9Rev2TM, pRphi6-9Rev3TM)에서 목적 단백질 GLUT4, P2X, Adora, mPGES의 발현 정도를 SDS-PAGE 후 면역블랏으로 비교한 것이다. 각 단백질의 왼쪽 시료는 TM 도메인이 하나인 벡터로부터, 오른쪽 시료는 TM 도메인이 두 개인 벡터로부터 얻은 것이다.
도 16은 과발현된 Endo 단백질이 세포막에 존재하는지를 확인하기 위하여 상기 단백질을 용제로 추출한 후, 이의 발현양상을 SDS-PAGE(a)와 면역블랏(b)으로 확인한 결과이다.
도 17은 과발현된 Endo, Lyso, Neuro, Sero, ThiaT 및 mPGES 단백질들이 세포막에 존재하는지를 확인하기 위하여 용제 추출 및 SDS-PAGE를 거쳐 면역블랏으로 발현양상을 확인한 결과이다.
도 18은 과발현된 Endo, Lyso, Sero, ThiaT 및 mPGES 단백질들을 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 정제한 후, 정제된 단백질을 SDS-PAGE(a)와 면역블랏(b)으로 확인한 결과이다.
<110> FOUNDATION OF UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION, SOONGSIL UNIVERSITY <120> MEMBRANE PROTEIN EXPRESSION VECTOR COMPRISING MAJOR ENVELOPE PROTEIN P9 OF CYSTOVIRUS phi6 AS A FUSION PARTNER AND METHOD FOR PRODUCING THE MEMBRANE PROTEIN USING SAME <130> FPD/200805-0065 <160> 43 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 90 <212> PRT <213> Wild type P9 protein of Cystovirus phi6 <400> 1 Met Pro Phe Pro Leu Val Lys Gln Asp Pro Thr Ser Lys Ala Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ala Ser Glu Arg Ser Thr Gly Thr Gln Ile Leu Asp Val Val Lys 20 25 30 Ala Pro Ile Gly Leu Phe Gly Asp Asp Ala Lys His Glu Phe Val Thr 35 40 45 Arg Gln Glu Gln Ala Val Ser Val Val Ser Trp Ala Val Ala Ala Gly 50 55 60 Leu Ile Gly Glu Leu Ile Gly Tyr Arg Gly Ala Arg Ser Gly Arg Lys 65 70 75 80 Ala Ile Leu Ala Asn Ile Pro Phe Leu Ala 85 90 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant P9 protein of Cystovirus phi6 <220> <221> VARIANT <222> (67) <223> 67th glycine is changed to cystein <400> 2 Met Pro Phe Pro Leu Val Lys Gln Asp Pro Thr Ser Lys Ala Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ala Ser Glu Arg Ser Thr Gly Thr Gln Ile Leu Asp Val Val Lys 20 25 30 Ala Pro Ile Gly Leu Phe Gly Asp Asp Ala Lys His Glu Phe Val Thr 35 40 45 Arg Gln Glu Gln Ala Val Ser Val Val Ser Trp Ala Val Ala Ala Gly 50 55 60 Leu Ile Cys Glu Leu Ile Gly Tyr Arg Gly Ala Arg Ser Gly Arg Lys 65 70 75 80 Ala Ile Leu Ala Asn Ile Pro Phe Leu Ala 85 90 <210> 3 <211> 273 <212> DNA <213> Wild type P9 protein of Cystovirus phi6 <400> 3 atgccatttc ctctggtaaa gcaagaccca acctcgaagg ctttcactga agccagtgaa 60 cgctccaccg gcacccagac cctggacgtc gtcaaggccc ctatcggcct gttcggcgac 120 gatgccaaac acgagttcgt gacccgtcag gaacaagccg tctccgtcgt cagctgggca 180 gttgctgccg gtctgatcgg cgagctgatc ggctaccgtg gtgcgcgttc gggtcgcaaa 240 gcgatcctgg ccaacatccc tttcctggcc taa 273 <210> 4 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant P9 protein of Cystovirus phi6 <400> 4 atgccgtttc cgctggtgaa acaggacccg accagcaaag cgttcaccga agccagcgaa 60 cgctccaccg gcacccagat cctggacgtc gtgaaggccc cgatcggcct gttcggcgac 120 gatgccaaac acgagttcgt gacccgtcag gaacaagcgg tcagcgttgt cagctgggcg 180 gttgcggccg gtctgatctg cgagctgatc ggctaccgtg gtgcgcgctc gggtcgcaaa 240 gcgatcctgg ccaacattcc gtttctggcg taa 273 <210> 5 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRphi6-9 plasmid comprising start codon, p9DNA, Xhol site, thrombin site, polylinker, 6XHis and stop codon <400> 5 atgccgtttc cgctggtgaa acaggacccg accagcaaag cgttcaccga agccagcgaa 60 cgctccaccg gcacccagat cctggacgtc gtgaaggccc cgatcggcct gttcggcgac 120 gatgccaaac acgagttcgt gacccgtcag gaacaagcgg tcagcgttgt cagctgggcg 180 gttgcggccg gtctgatctg cgagctgatc ggctaccgtg gtgcgcgctc gggtcgcaaa 240 gcgatcctgg ccaacattcc gtttctggcg atctcgagcc tggtgccgcg cggctcccgg 300 gctgcagctg gtaccatgga agcttctcac catcaccatc accattaa 348 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Adora <400> 6 aagctgcaga tatccccaac aacagcactg ct 32 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Adora <400> 7 ggggtaccaa ttgctactca gaattcttct c 31 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Endo <400> 8 tgaccagctg aaaccctttg cctcaggg 28 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Endo <400> 9 agctaagctt ggttcatgct gtccttatgg 30 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Lyso <400> 10 tgaccagctg ctgccatctc tacttccatc cc 32 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Lyso <400> 11 agctaagctt gaaccacaga gtggtcattg 30 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Dopa <400> 12 cccgggtgga tccactgaat ctgtcctgg 29 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Dopa <400> 13 aagcttcgca gtggaggatc ttcaggaa 28 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Leuko <400> 14 cccgggacga tgaaacagga aatctgaca 29 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Leuko <400> 15 aagcttctac tttacatatt tcttctcc 28 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for MC1R <400> 16 gatatcctgc tgtgcaggga tcccagaga 29 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MC1R <400> 17 aagcttccca ggagcacgtc agcacctc 28 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Prost <400> 18 gatatcacaa ggagacccgg ggctacgga 29 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Prost <400> 19 aagcttcatt tccccaaaat tcctcttg 28 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Neuro <400> 20 atgacaatat tcaacattat tttcccagg 29 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Neuro <400> 21 agctaagctt gattttttca ttatcatcat tg 32 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ThiaT <400> 22 gacagctgat gtgcccggcc cggtgtc 27 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ThiaT <400> 23 ggaagcttct gaagtggtta cttgagaact 30 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Sero <400> 24 gacagctgtg ctgctgtggg tccagcag 28 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Sero <400> 25 ggaagcttca gcgtactgcc agatggacca 30 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GLUT4 <400> 26 gagatatctg ccgtcgggtt tccagcag 28 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GLUT4 <400> 27 ggaagcttcg tcattctcat ctggccctaa 30 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mPGES <400> 28 gacagctgtg cctgcccaca gcctggtga 29 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mPGES <400> 29 ggaagcttcc aggtggcggg ccgcttccca 30 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mutant P9 protein <400> 30 ggagatatac atatgccgtt tc 22 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mutant P9 protein, Rev1 <400> 31 cctcgagatg ttggccagga tcgctt 26 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mutant P9 protein, Rev2 <400> 32 cctcgaggct ttgcgacccg agcgcg 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mutant P9 protein, Rev3 <400> 33 cctcgagcgc gcaccacggt agccga 26 <210> 34 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for extra TM <400> 34 gttgtcgacc cgccaagagc aggccgtttc ggttgtgtca tgggccgtgg cagcaggtct 60 gattggtgaa ctgattggtt atcgcggcgc acgttcgggt cgcaaag 107 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for extra TM <400> 35 agctccggac ttaagttaat ggtgatggtg atggtgagaa gcttc 45 <210> 36 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRphi6-9Rev1TM <400> 36 atgccgtttc cgctggtgaa acaggacccg accagcaaag cgttcaccga agccagcgaa 60 cgctccaccg gcacccagat cctggacgtc gtgaaggccc cgatcggcct gttcggcgac 120 gatgccaaac acgagttcgt gacccgtcag gaacaagcgg tcagcgttgt cagctgggcg 180 gttgcggccg gtctgatctg cgagctgatc ggctaccgtg gtgcgcgctc gggtcgcaaa 240 gcgatcctgg ccaacatctc gacccgccaa gagcaggccg tttcggttgt gtcatgggcc 300 gtggcagcag gtctgattgg tgaactgatt ggttatcgcg gcgcacgttc gggtcgcaaa 360 gcgatcctgg ccaacattcc gtttctggcg atctcgagcc tggtgccgcg cggctcccgg 420 gctgcagctg gtaccatgga agcttctcac catcaccatc accattaact taag 474 <210> 37 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pRphi6-9Rev1TM <400> 37 Met Pro Phe Pro Leu Val Lys Gln Asp Pro Thr Ser Lys Ala Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ala Ser Glu Arg Ser Thr Gly Thr Gln Ile Leu Asp Val Val Lys 20 25 30 Ala Pro Ile Gly Leu Phe Gly Asp Asp Ala Lys His Glu Phe Val Thr 35 40 45 Arg Gln Glu Gln Ala Val Ser Val Val Ser Trp Ala Val Ala Ala Gly 50 55 60 Leu Ile Cys Glu Leu Ile Gly Tyr Arg Gly Ala Arg Ser Gly Arg Lys 65 70 75 80 Ala Ile Leu Ala Asn Ile Ser Thr Arg Gln Glu Gln Ala Val Ser Val 85 90 95 Val Ser Trp Ala Val Ala Ala Gly Leu Ile Gly Glu Leu Ile Gly Tyr 100 105 110 Arg Gly Ala Arg Ser Gly Arg Lys Ala Ile Leu Ala Asn Ile Pro Phe 115 120 125 Leu Ala Ile Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Arg Ala Ala Ala Gly 130 135 140 Thr Met Glu Ala Ser His His His His His His 145 150 155 <210> 38 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRphi6-9Rev2TM <400> 38 atgccgtttc cgctggtgaa acaggacccg accagcaaag cgttcaccga agccagcgaa 60 cgctccaccg gcacccagat cctggacgtc gtgaaggccc cgatcggcct gttcggcgac 120 gatgccaaac acgagttcgt gacccgtcag gaacaagcgg tcagcgttgt cagctgggcg 180 gttgcggccg gtctgatctg cgagctgatc ggctaccgtg gtgcgcgctc gggtcgcaaa 240 gcctcgaccc gccaagagca ggccgtttcg gttgtgtcat gggccgtggc agcaggtctg 300 attggtgaac tgattggtta tcgcggcgca cgttcgggtc gcaaagcgat cctggccaac 360 attccgtttc tggcgatctc gagcctggtg ccgcgcggct cccgggctgc agctggtacc 420 atggaagctt ctcaccatca ccatcaccat taacttaag 459 <210> 39 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pRphi6-9Rev2TM <400> 39 Met Pro Phe Pro Leu Val Lys Gln Asp Pro Thr Ser Lys Ala Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ala Ser Glu Arg Ser Thr Gly Thr Gln Ile Leu Asp Val Val Lys 20 25 30 Ala Pro Ile Gly Leu Phe Gly Asp Asp Ala Lys His Glu Phe Val Thr 35 40 45 Arg Gln Glu Gln Ala Val Ser Val Val Ser Trp Ala Val Ala Ala Gly 50 55 60 Leu Ile Cys Glu Leu Ile Gly Tyr Arg Gly Ala Arg Ser Gly Arg Lys 65 70 75 80 Ala Ser Thr Arg Gln Glu Gln Ala Val Ser Val Val Ser Trp Ala Val 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Ile Gly Glu Leu Ile Gly Tyr Arg Gly Ala Arg Ser 100 105 110 Gly Arg Lys Ala Ile Leu Ala Asn Ile Pro Phe Leu Ala Ile Ser Ser 115 120 125 Leu Val Pro Arg Gly Ser Arg Ala Ala Ala Gly Thr Met Glu Ala Ser 130 135 140 His His His His His His 145 150 <210> 40 <211> 444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRphi6-9Rev3TM <400> 40 atgccgtttc cgctggtgaa acaggacccg accagcaaag cgttcaccga agccagcgaa 60 cgctccaccg gcacccagat cctggacgtc gtgaaggccc cgatcggcct gttcggcgac 120 gatgccaaac acgagttcgt gacccgtcag gaacaagcgg tcagcgttgt cagctgggcg 180 gttgcggccg gtctgatctg cgagctgatc ggctaccgtg gtgcgcgctc gacccgccaa 240 gagcaggccg tttcggttgt gtcatgggcc gtggcagcag gtctgattgg tgaactgatt 300 ggttatcgcg gcgcacgttc gggtcgcaaa gcgatcctgg ccaacattcc gtttctggcg 360 atctcgagcc tggtgccgcg cggctcccgg gctgcagctg gtaccatgga agcttctcac 420 catcaccatc accattaact taag 444 <210> 41 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pRphi6-9Rev3TM <400> 41 Met Pro Phe Pro Leu Val Lys Gln Asp Pro Thr Ser Lys Ala Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ala Ser Glu Arg Ser Thr Gly Thr Gln Ile Leu Asp Val Val Lys 20 25 30 Ala Pro Ile Gly Leu Phe Gly Asp Asp Ala Lys His Glu Phe Val Thr 35 40 45 Arg Gln Glu Gln Ala Val Ser Val Val Ser Trp Ala Val Ala Ala Gly 50 55 60 Leu Ile Cys Glu Leu Ile Gly Tyr Arg Gly Ala Arg Ser Thr Arg Gln 65 70 75 80 Glu Gln Ala Val Ser Val Val Ser Trp Ala Val Ala Ala Gly Leu Ile 85 90 95 Gly Glu Leu Ile Gly Tyr Arg Gly Ala Arg Ser Gly Arg Lys Ala Ile 100 105 110 Leu Ala Asn Ile Pro Phe Leu Ala Ile Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly 115 120 125 Ser Arg Ala Ala Ala Gly Thr Met Glu Ala Ser His His His His His 130 135 140 His 145 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for P2X <400> 42 gagatatctg gcgggctgct gcgccgcg 28 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for P2X <400> 43 ggaagcttcc tggtccagct cactagcaag 30

Claims (17)

  1. 시스토비루스 (Cystovirus) phi6의 외피막 단백질 (major envelope protein) P9의 유전자, 목적 막 단백질을 삽입하기 위한 다중 클로닝 부위 (MCS) 및 P9 유전자와 MCS 사이에 위치한 프로테아제 인식부위를 연결하여 포함하는 막 단백질 발현벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 P9 단백질이 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 발현벡터.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 P9 단백질의 유전자가 서열번호: 3 또는 4의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 발현벡터.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 발현벡터가 5′에서 3′방향으로 프로모터, P9 단백질의 유전자, 프로테아제 인식부위, 다중 클로닝 부위 및 히스티딘 태그를 번역 융합 (translational fusion)의 형태로 연결하여 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현벡터.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 발현벡터가 서열번호: 5의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현벡터.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 발현벡터가 상기 P9 단백질의 유전자와 상기 프로테아제 인식부위 사이에 가외 TM 도메인(extra transmembrane domain)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현벡터.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 가외 TM 도메인이 시스토비루스 P9 단백질, 시스토비루스 P10 단백질, 슈도모나스 파지 Pf3의 주 코트단백질(Pf3 major coat protein), 박테리오파지 M13의 주 코트 단백질 (M13 major coat protein)로 이루어진 군에서 선택된 TM 도메인-함유 단백질에서 유래한 것임을 특징으로 하는, 발현벡터.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 발현벡터가 서열번호: 37, 39 또는 41로 나타내어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현벡터.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 염기 서열이 서열번호: 36, 38 또는 40으로 나타내어지는 것을 특징으로 하 는, 발현벡터.
  10. 제 4 항에 있어서,
    상기 프로모터가 T7, T5 또는 tac 프로모터임을 특징으로 하는, 발현벡터.
  11. 제 4 항에 있어서,
    상기 프로테아제가 트롬빈 혹은 테브(Tev)임을 특징으로 하는, 발현벡터.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 발현벡터가 pRphi6-9(기탁번호 KCTC 11373BP)임을 특징으로 하는, 발현벡터.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포가 미생물 또는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포가 대장균 EPI300/pRphi6-9 (기탁번호 제 KCTC 11373BP호)인 것을 특징으로 하는 세포.
  16. 제 1 항의 발현벡터의 다중 클로닝 부위에 목적 막 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 후, 이를 세포에 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 목적 막 단백질의 생산방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 막 단백질이 막 수용체 (membrane receptors), 이온채널, 물질수송체 (membrane transporter), 펌프 (pump), 막 효소 (membrane enzyme), 세포-세포 소통을 위한 리간드와 수용체, 세포-세포를 연결하는 링커, 세포내 물질 수송을 위한 소낭 (membrane vesicle)의 리간드와 수용체, 엔도 및 엑소사이토시스(endo- and exocytosis)의 리간드와 수용체, 비루스 생활사 (viral life cycle)에 관여하는 생체막 단백질, 항체 또는 그 일부분, 및 독소단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 목적 막 단백질의 생산방법.
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