CN113755472B

CN113755472B - 一种流感病毒防治用重组蛋白药物及其应用

Info

Publication number: CN113755472B
Application number: CN202111303304.1A
Authority: CN
Inventors: 赵兴卉; 翟俊辉; 王轲珑
Original assignee: Beijing Huapeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huaxia Biotechnology (Qingdao) Co.,Ltd.
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-11-05
Also published as: CN113755472A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种流感病毒防治用重组蛋白药物及其应用。本发明提供一种新型唾液酸酶的基因，本发明通过优化野生型唾液酸酶的基因序列，并结合筛选确定了表达效率大幅提高的最佳序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时提供了一种提高流感病毒防治用重组蛋白药物的表达水平的方法，即通过dnaB内含肽和新型唾液酸酶蛋白在基因水平进行融合从而实现新型唾液酸酶蛋白的高效表达。从而，本发明的新型唾液酸酶的基因及其重组蛋白药物更有利于用于制备预防或治疗由流感病毒引起的病毒感染的药物中。

Description

一种流感病毒防治用重组蛋白药物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种流感病毒防治用重组蛋白药物及其应用。

背景技术

流感具有高发病率和死亡率，它对社会经济直接或者间接的影响很巨大。流感病毒属于正黏病毒科，为负链RNA病毒。其表面分布着三种重要的蛋白刺突，其中两种是糖蛋白，分别是神经氨酸酶(neuraminidase，NA)和血凝素(hemagglutinin，HA)，第三种是基质蛋白(M2)。在流感病毒入侵宿主及传播的过程中，这三种蛋白都扮演着重要的角色。首先，流感病毒的血凝素(HA)识别宿主细胞表面的唾液酸受体并与之结合，吸附在细胞膜上，然后病毒通过受体介导的内吞作用，进入细胞内进行复制。基质蛋白负责在病毒外膜形成离子通道，以便于病毒遗传物质的释放和表达。复制的病毒蛋白等组分转运到细胞表面，植入细胞膜中，组装成新的病毒粒子，最后，成熟的流感病毒脱离宿主细胞，进行下一步传播。

抗病毒化合物已成为治疗流感的首选药物。市场上目前有两类抗病毒化合物：M2抑制剂，如金刚烷胺和金刚烷乙胺；NA抑制剂，包括奥斯他韦（达菲）和扎那米韦（乐瑞沙）。这两类药物均被证实在预防和治疗流感上有一定的效果。然而，近年来发现出现了药物使用产生的副作用和抗耐药株。因此，在应对流感大流行时，提供一种新的治疗或预防药物是非常有必要的。

流感病毒感染宿主细胞是由其表面糖蛋白血凝素(HA)与宿主细胞表面上的糖链受体唾液酸(sialic acid，SA)共同介导的，且流感病毒对糖链受体的识别具有特异性，人流感病毒HA主要识别末端为唾液酸α2-6半乳糖(galactose，Gal，SAα2-6Gal)的糖链受体，其存在于人呼吸道上皮细胞表面，而禽流感病毒HA主要识别末端为SAα2-3Gal的糖链受体，其广泛存在于禽肠胃道的上皮细胞表面。

本发明提供了一种新型唾液酸酶，其机制是通过去除宿主呼吸道上皮细胞表面的HA的唾液酸受体，达到阻止流感病毒进入细胞并且繁殖的目的。由于唾液酸酶是作用于宿主细胞，而非病毒本身，因此有可能成为一种广谱的抗流感药物。同时，本发明还提供了一种流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白，实现唾液酸酶高水平表达，为制备广谱的抗流感药物提供了高表达的重组蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型唾液酸酶蛋白。

本发明的再一目的在于提供一种新型唾液酸酶基因。

本发明的再一目的在于提供一种流感病毒防治用重组蛋白药物。

本发明的再一目的在于提供一种流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白。

本发明的再一目的在于提供编码前述表达蛋白的基因。

本发明的再一目的在于提供含有前述基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有前述基因或前述蛋白或前述重组蛋白药物或前述表达蛋白或前述编码表达蛋白的基因或前述重组表达载体的宿主细胞。

本发明的再一目的在于提供一种提高流感病毒防治用重组蛋白药物的表达水平的方法。

本发明的再一目的在于提供利用前述基因或前述重组表达载体制备新型唾液酸酶或重组蛋白药物或表达蛋白的方法。

本发明的再一目的在于提供前述基因或前述蛋白或前述重组蛋白药物或前述表达蛋白或前述编码表达蛋白的基因或前述重组表达载体或前述宿主细胞在制备预防或治疗由流感病毒引起的病毒感染的药物方面的应用。

根据本发明具体实施方式的新型唾液酸酶的设计优化后的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，SEQ ID NO.1：

GTGAAACGTAAAAAGAAAGGTGGTAAAAACGGTAAAAACCGTCGTAACCGTAAAAAGAAAAACCCTGGTGATCATCCTCAGACCACCCCTGCACCTGCACCTGATGCAAGCACCGAACTGCCTGCAAGCATGAGCCAGGCACAGCATCTGGCACCTAACACCGCAACCGATAACTATCGTATCCCTGCAATCACCACCGCACCTAACGGTGATCTGCTGATCAGCTATGATGAACGTCCTAAAGATAACGGTAACGGTGGTAGCGATGCACCTAACCCTAACCATATCGTGCAGCGTCGTAGCACCGATGGTGGTAAAACCTGGAGCGCACCTACCTATATCCATCAGGGTACCGAAACCGGCAAAAAGGTGGGTTATAGCGATCCTAGCTATGTGGTGGATCATCAGACCGGTACCGTGTTTAACTTTCATGTGAAAAGCTATGATCAGGGTTGGGGTGGTAGCCAGGCAGGTACCGATCCTGAAAACCGTGGTATCATCCAGGCAGAAGTGAGCACCAGCACCGATAACGGTTGGACCTGGACCCATCGTACCATCACCGCAGATATCACCAAAGATAAACCTTGGACCGCACGTTTTGCAGCAAGCGGTCAGGGTATCCAGATCCAGCATGGTCCTCATGCAGGTCGTCTGGTGCAGCAGTATACCATCCGTACCGCAGGTGGTGCAGTGCAGGCAGTGAGCGTGTATAGCGATGATCATGGTAAAACCTGGCAGGCAGGTACACCTATCGGTACCGGTATGGATGAAAACAAAGTGGTGGAACTGAGCGATGGTAGCCTGATGCTGAACAGCCGTGCAAGCGATGGTAGTGGTTTTCGTAAAGTGGCACATAGCACCGATGGCGGTCAGACCTGGAGCGAACCTGTGAGCGATCAGAACCTGCCTGATAGCGTGGATAACGCACAGATCATCCGTGCATTTCCTAACGCAGCACCTGATGATCCTCGTGCAAAAGTGCTGCTGCTGAGCCATAGCCCTAACCCTAAACCTTGGAGCCGTGATCGTGGTACCATCAGCATGAGCTGCGATGATGGTGCAAGCTGGACCACCAGCAAAGTGTTTCATGAACCTTTTGTGGGTTATACCACCATCGCAGTGCAGAGCGATGGTTCAATCGGTCTGCTGAGCGAAGATGCACATAACGGTGCAGATTATGGTGGTATCTGGTATCGTAACTTTACCATGAACTGGCTGGGTGAACAGTGCGGTCAGAAACCTGCAGAATAA

该序列是根据成熟的唾液酸酶蛋白序列优化而来，所述唾液酸酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

其中，SEQ ID NO.5：

VKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNPGDHPQTTPAPAPDASTELPASMSQAQHLAPNTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTVFNFHVKSYDQGWGGSQAGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDQNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPKPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAE

本发明还提供了一种流感病毒防治用重组蛋白药物，其包含新型唾液酸酶蛋白，其中，所述新型唾液酸酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了一种流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白，其包含dnaB内含肽和新型唾液酸酶蛋白，其中，所述表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

其中，SEQ ID NO.6：

MGSSHHHHHHSSGNNGLELRESGAISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKKLVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQLSPEIEKLSQSDIYWDSIVSITETGVEEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHNVKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNPGDHPQTTPAPAPDASTELPASMSQAQHLAPNTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTVFNFHVKSYDQGWGGSQAGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDQNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPKPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAE

本发明还提供了一种编码流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白的基因，其包含编码dnaB内含肽和新型唾液酸酶蛋白的表达蛋白的基因，其中，所述表达蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

其中，SEQ ID NO.7：

ATGGGTAGCAGCCATCATCATCATCATCATAGCAGCGGTAACAACGGTCTGGAACTGCGTGAAAGCGGTGCAATCAGCGGTGATAGCCTGATCAGCCTGGCAAGCACCGGTAAACGTGTGAGCATCAAAGATCTGCTGGATGAAAAAGATTTTGAAATCTGGGCAATCAACGAACAGACCATGAAACTGGAAAGCGCAAAAGTGAGCCGTGTGTTTTGCACCGGTAAAAAGCTGGTGTATATCCTGAAAACCCGTCTGGGTCGTACCATCAAAGCAACCGCAAACCATCGTTTTCTGACCATCGATGGTTGGAAACGTCTGGATGAACTGAGCCTGAAAGAACATATCGCACTGCCTCGTAAACTGGAAAGTAGCAGCCTGCAGCTGAGCCCTGAAATCGAAAAACTGAGCCAGAGCGATATCTATTGGGATAGCATCGTGAGCATCACCGAAACCGGTGTGGAAGAAGTGTTTGATCTGACCGTGCCTGGTCCTCATAACTTTGTGGCAAACGATATCATCGTGCATAACGTGAAACGTAAAAAGAAAGGTGGTAAAAACGGTAAAAACCGTCGTAACCGTAAAAAGAAAAACCCTGGTGATCATCCTCAGACCACCCCTGCACCTGCACCTGATGCAAGCACCGAACTGCCTGCAAGCATGAGCCAGGCACAGCATCTGGCACCTAACACCGCAACCGATAACTATCGTATCCCTGCAATCACCACCGCACCTAACGGTGATCTGCTGATCAGCTATGATGAACGTCCTAAAGATAACGGTAACGGTGGTAGCGATGCACCTAACCCTAACCATATCGTGCAGCGTCGTAGCACCGATGGTGGTAAAACCTGGAGCGCACCTACCTATATCCATCAGGGTACCGAAACCGGCAAAAAGGTGGGTTATAGCGATCCTAGCTATGTGGTGGATCATCAGACCGGTACCGTGTTTAACTTTCATGTGAAAAGCTATGATCAGGGTTGGGGTGGTAGCCAGGCAGGTACCGATCCTGAAAACCGTGGTATCATCCAGGCAGAAGTGAGCACCAGCACCGATAACGGTTGGACCTGGACCCATCGTACCATCACCGCAGATATCACCAAAGATAAACCTTGGACCGCACGTTTTGCAGCAAGCGGTCAGGGTATCCAGATCCAGCATGGTCCTCATGCAGGTCGTCTGGTGCAGCAGTATACCATCCGTACCGCAGGTGGTGCAGTGCAGGCAGTGAGCGTGTATAGCGATGATCATGGTAAAACCTGGCAGGCAGGTACACCTATCGGTACCGGTATGGATGAAAACAAAGTGGTGGAACTGAGCGATGGTAGCCTGATGCTGAACAGCCGTGCAAGCGATGGTAGTGGTTTTCGTAAAGTGGCACATAGCACCGATGGCGGTCAGACCTGGAGCGAACCTGTGAGCGATCAGAACCTGCCTGATAGCGTGGATAACGCACAGATCATCCGTGCATTTCCTAACGCAGCACCTGATGATCCTCGTGCAAAAGTGCTGCTGCTGAGCCATAGCCCTAACCCTAAACCTTGGAGCCGTGATCGTGGTACCATCAGCATGAGCTGCGATGATGGTGCAAGCTGGACCACCAGCAAAGTGTTTCATGAACCTTTTGTGGGTTATACCACCATCGCAGTGCAGAGCGATGGTTCAATCGGTCTGCTGAGCGAAGATGCACATAACGGTGCAGATTATGGTGGTATCTGGTATCGTAACTTTACCATGAACTGGCTGGGTGAACAGTGCGGTCAGAAACCTGCAGAATAA

本发明还提供了一种重组表达载体，其包含前述的新型唾液酸酶基因或前述编码流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白的基因的重组表达载体。优选重组表达载体为pET-28a(+)。将本发明的新型唾液酸酶基因或前述编码流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白的基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将新型唾液酸酶基因或前述编码流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白的基因插入到质粒pET-28a(+)的Nhel和Notl双酶切限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，从而得到重组表达载体。

本发明还提供一种宿主细胞，其包含前述新型唾液酸酶基因，或包含前述新型唾液酸酶蛋白，或包含前述流感病毒防治用重组蛋白药物，或包含前述流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白，或前述编码流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白的基因，或包含前述任意一种的重组表达载体。宿主细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

本发明还提供一种提高流感病毒防治用重组蛋白药物的表达水平的方法，所述方法包括，通过dnaB内含肽和前述的新型唾液酸酶蛋白在基因水平进行融合从而实现新型唾液酸酶蛋白的高效表达，所述dnaB内含肽和所述新型唾液酸酶蛋白融合的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，优选地，所述dnaB内含肽和所述新型唾液酸酶蛋白融合的表达蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供制备新型唾液酸酶或流感病毒防治用重组蛋白药物或表达蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）用含有前述新型唾液酸酶基因或前述编码前述表达蛋白的基因或前述任意一种的重组表达载体转化宿主细胞；

（2）培养宿主细胞，诱导新型唾液酸酶或编码流感病毒防治用重组蛋白药物或表达蛋白的表达；

（3）回收并纯化所表达的新型唾液酸酶或编码流感病毒防治用重组蛋白药物或表达蛋白。

本发明还提供了前述新型唾液酸酶基因或前述新型唾液酸酶蛋白或前述重组蛋白药物或前述流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白或编码前述表达蛋白的基因或前述任意一种的重组表达载体或前述任意一种的宿主细胞在制备预防或治疗由流感病毒引起的病毒感染的药物中的用途。优选的，新型唾液酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。更优选的，编码流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO.7所示。运用基因工程手段产业化生产新型唾液酸酶基因的蛋白，并配以合适的药学佐剂，将其应用于预防或治疗由流感病毒引起的病毒感染的药物中。

本发明的有益效果：

由于流感病毒具有严格的糖链受体结合特异性，与流感病毒结合的宿主细胞表面糖链受体主要是位于细胞膜上的唾液酸。本发明根据大肠杆菌密码子偏爱性，构建了新型的可除去或者减少上皮细胞表面的唾液酸的新型唾液酸酶。经过本发明密码子优化后的dnaB内含肽和新型唾液酸酶在基因水平的融合，实现新型唾液酸酶蛋白的表达水平显著提高（如图1所示，泳道6，即SEQ ID NO.1克隆重组表达蛋白的产量达总蛋白的37%，而SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3克隆重组表达蛋白的产量达总蛋白的6%，SEQ ID NO.4克隆未检测到重组蛋白表达。因而，经过本发明密码子优化后的dnaB内含肽和新型唾液酸酶在基因水平的融合，最终实现新型唾液酸酶的克隆表达效率比经软件优化序列的克隆表达效率提高了约6倍，且GST基因与如SEQ ID NO.1所示的新型唾液酸酶基因构成的表达蛋白的基因融合后，未能筛选获得有效的表达菌株。充分表明优化后的dnaB内含肽和新型唾液酸酶的融合，实现新型唾液酸酶蛋白的表达水平显著提高，而新型唾液酸酶与其他基因的融合并不能实现相应的技术效果。在针对流感病毒H1N1的A/FM/1/47株的细胞水平试验，充分证实新型唾液酸酶具有明显抑制甲型流感病毒在MDCK细胞中增殖的作用，同时在较低浓度下（19ng/mL）即可抑制甲型流感病毒株的血凝活性。本发明的新型唾液酸酶或包含新型唾液酸酶的重组蛋白药物可用于治疗或预防流感病毒药物的生产中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示新型唾液酸酶表达克隆的筛选结果，M为分子量标准，其中，泳道1为SEQID NO.4；2和3为SEQ ID NO.3；4和5为SEQ ID NO.2；6和7为SEQ ID NO.1的克隆表达。

图2显示新型唾液酸酶表达分析结果，M为分子量标准，泳道1为全菌悬液，泳道2为超声后悬液，泳道3为超声后上清；

图3显示新型唾液酸酶的阳离子层析纯化结果；

图4显示新型唾液酸酶的阴离子层析纯化结果；

图5显示新型唾液酸酶的反相HPLC分析结果；

图6显示新型唾液酸酶有效抑制H1N1病毒对MDCK细胞的杀伤结果；

图7显示新型唾液酸酶可抑制H1N1流感病毒的血凝活性。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例

基因的设计与全基因合成

根据大肠杆菌密码子偏爱性，在野生型唾液酸酶氨基酸序列的基础上进行密码子优化，共获得4条候选优化序列。

根据密码子的偏爱性、实验室以往的蛋白高效表达经验、mRNA二级结构等因素考虑，经人工优化获得SEQ ID NO.1：

经软件优化获得序列2如SEQ ID NO.2所示：

GTTAAGAGAAAGAAGAAGGGTGGTAAGAACGGAAAGAATAGAAGAAATAGAAAGAAGAAAAACCCAGGAGATCATCCACAAACAACTCCAGCTCCAGCTCCAGACGCTTCTACAGAATTGCCAGCTTCCATGTCTCAAGCTCAACACTTGGCTCCAAACACCGCTACCGACAACTACAGAATCCCAGCTATCACTACCGCTCCAAACGGTGATTTGTTGATTTCTTACGACGAAAGACCAAAAGATAACGGTAACGGTGGTTCTGACGCTCCAAACCCAAATCATATTGTTCAAAGAAGATCCACTGACGGTGGTAAAACTTGGTCTGCTCCTACTTACATCCATCAAGGTACCGAAACCGGAAAAAAGGTTGGTTACTCTGATCCATCTTACGTTGTTGATCATCAAACTGGTACTGTTTTTAACTTTCATGTTAAGTCTTACGATCAAGGTTGGGGTGGTTCTCAAGCTGGTACTGATCCAGAAAACAGAGGTATTATTCAAGCTGAAGTTTCTACTTCTACTGATAACGGTTGGACTTGGACTCATAGAACTATTACTGCTGATATTACTAAGGATAAGCCTTGGACTGCTAGATTTGCTGCTTCTGGTCAAGGTATTCAAATTCAACATGGTCCACATGCTGGTAGATTGGTTCAACAATACACTATTAGAACTGCTGGTGGTGCTGTTCAAGCTGTTTCTGTTTACTCTGATGATCATGGTAAGACTTGGCAAGCTGGTACTCCAATTGGTACTGGTATGGATGAAAACAAGGTTGTTGAATTGTCTGATGGTTCTTTGATGTTGAACTCTAGAGCTTCTGATGGTTCTGGTTTTAGAAAGGTTGCTCATTCTACTGATGGTGGTCAAACTTGGTCTGAACCAGTTTCTGATCAAAACTTGCCAGATTCTGTTGATAACGCTCAAATTATTAGAGCTTTTCCAAACGCTGCTCCAGATGATCCAAGAGCTAAGGTTTTGTTGTTGTCTCATTCTCCAAACCCAAAGCCTTGGTCTAGAGATAGAGGTACTATTTCTATGTCTTGTGATGATGGTGCTTCTTGGACTACTTCTAAGGTTTTTCATGAACCATTTGTTGGTTACACTACTATTGCTGTTCAATCTGATGGTTCTATTGGTTTGTTGTCTGAAGATGCTCATAACGGTGCTGATTACGGTGGTATTTGGTACAGAAACTTTACTATGAACTGGTTGGGTGAACAATGTGGTCAAAAGCCAGCTGAATAA

经软件优化获得序列3如SEQ ID NO.3所示：

GTGAAGAGGAAGAAGAAGGGCGGCAAGAACGGCAAAAACAGAAGGAATAGAAAGAAGAAGAACCCCGGCGACCACCCCCAGACAACACCTGCTCCTGCTCCAGACGCCAGTACCGAACTGCCAGCAAGCATGTCCCAGGCACAGCACCTGGCACCAAACACCGCAACCGACAACTACAGAATCCCCGCCATCACCACCGCCCCAAACGGAGATCTGCTGATCTCCTACGACGAAAGGCCCAAAGACAACGGCAACGGAGGCTCCGACGCCCCTAATCCTAACCACATCGTGCAGAGACGCTCCACCGACGGAGGAAAAACCTGGTCCGCCCCTACCTACATCCACCAGGGAACCGAAACCGGCAAAAAGGTGGGATACTCCGACCCCTCCTACGTGGTGGACCACCAGACAGGAACCGTGTTCAACTTTCATGTGAAATCCTATGACCAGGGCTGGGGCGGCTCCCAGGCTGGAACAGATCCTGAAAATAGGGGCATCATCCAGGCCGAGGTGAGCACATCCACCGACAACGGATGGACCTGGACCCACAGGACCATCACCGCTGACATCACCAAGGACAAGCCCTGGACCGCCAGATTCGCCGCTAGTGGACAGGGAATCCAGATCCAGCACGGACCACACGCCGGAAGACTGGTGCAGCAGTACACCATCCGCACCGCTGGAGGAGCAGTGCAGGCTGTGTCTGTGTATTCCGACGACCACGGCAAAACCTGGCAGGCAGGTACCCCTATCGGCACAGGAATGGACGAAAATAAGGTGGTGGAGCTGAGCGACGGAAGCCTGATGCTGAACAGTAGGGCCTCTGACGGCAGCGGATTTAGGAAGGTGGCCCACTCCACAGACGGCGGACAGACATGGAGCGAGCCTGTGAGTGATCAGAACCTGCCCGACTCTGTGGACAACGCACAGATCATCAGGGCCTTTCCTAACGCCGCCCCAGACGATCCTAGGGCTAAAGTGCTGCTGCTGAGCCACTCCCCCAACCCTAAACCCTGGTCCCGAGACAGGGGCACAATCTCAATGAGCTGCGACGACGGCGCCTCCTGGACAACATCAAAGGTGTTCCACGAACCCTTCGTGGGCTACACCACCATCGCCGTGCAGAGTGACGGCTCTATCGGACTGCTGAGCGAGGACGCTCACAACGGAGCTGACTACGGCGGAATCTGGTACAGGAATTTCACAATGAACTGGCTGGGCGAGCAGTGCGGCCAGAAACCTGCTGAATAA

经软件优化获得序列4如SEQ ID NO.4所示：

GTCAAGCGCAAGAAGAAGGGTGGTAAGAACGGCAAGAACAGAAGGAACAGGAAGAAGAAGAACCCTGGCGATCACCCTCAGACAACCCCCGCTCCTGCCCCAGACGCTAGCACCGAGCTGCCCGCTAGCATGAGCCAGGCTCAGCACCTGGCCCCCAACACCGCCACCGACAACTACCGCATCCCTGCTATCACCACCGCCCCCAACGGTGACCTGCTCATCTCCTACGACGAGCGCCCTAAGGACAACGGAAACGGTGGTTCCGACGCTCCCAACCCCAACCACATCGTCCAGCGCCGCTCCACCGACGGCGGAAAGACCTGGAGCGCTCCTACCTACATCCACCAAGGCACCGAAACCGGCAAGAAGGTGGGTTACTCCGACCCTTCCTACGTCGTCGACCACCAAACCGGTACAGTCTTCAACTTCCACGTGAAGAGCTACGATCAGGGCTGGGGCGGCTCCCAGGCTGGTACTGACCCCGAAAACAGAGGCATCATCCAAGCTGAGGTGTCTACCTCCACCGACAACGGCTGGACCTGGACCCACCGCACAATCACCGCTGACATCACCAAGGACAAGCCCTGGACTGCTCGCTTCGCCGCCAGCGGACAGGGCATCCAAATCCAGCACGGCCCTCACGCTGGCAGACTGGTGCAGCAATACACCATCCGCACCGCTGGAGGCGCCGTGCAAGCCGTGTCCGTGTACTCCGACGATCACGGAAAGACCTGGCAGGCTGGCACCCCCATCGGTACCGGTATGGACGAAAACAAGGTCGTCGAGCTGTCCGACGGTAGCTTGATGCTGAACTCCCGCGCTAGCGACGGTTCCGGTTTCAGGAAGGTGGCTCACTCCACCGACGGTGGCCAGACATGGAGCGAGCCTGTGTCCGATCAGAACCTCCCTGACAGTGTGGACAACGCTCAGATCATCCGTGCCTTCCCTAACGCTGCTCCCGACGACCCTCGCGCTAAGGTGCTGCTGCTCTCCCACTCCCCTAACCCTAAGCCCTGGTCCCGCGACAGAGGCACCATCTCCATGTCCTGCGACGACGGTGCCTCCTGGACCACCTCCAAGGTGTTCCACGAGCCATTCGTCGGTTACACCACCATCGCCGTCCAATCCGACGGTTCCATCGGACTCCTGTCCGAGGACGCCCACAACGGTGCTGACTACGGTGGTATCTGGTACAGAAACTTCACCATGAACTGGCTCGGCGAACAATGCGGCCAGAAGCCTGCTGAATAA

根据大肠杆菌密码子偏爱性，在野生型dnaB内含肽氨基酸序列的基础上进行密码子优化，并与唾液酸酶优化后的基因构建了融合基因，共获得4条候选优化序列。

根据密码子的偏爱性、实验室以往的蛋白高效表达经验、mRNA二级结构等因素考虑，人工优化获得SEQ ID NO.7：

其中，dnaB内含肽优化后的基因序列如SEQ ID NO.7的第1-531位所示。

经软件优化获得序列如SEQ ID NO.8所示：

ATGGGATCTTCTCACCACCACCACCATCACTCCTCTGGAAACAACGGTTTGGAATTGAGAGAATCTGGAGCTATTTCTGGAGATTCTTTGATTTCCTTGGCTTCTACCGGTAAGAGAGTTTCTATTAAGGACTTGTTGGACGAAAAAGATTTTGAGATTTGGGCTATTAACGAGCAGACTATGAAGTTGGAGTCTGCTAAGGTTTCTAGAGTTTTTTGTACTGGAAAGAAGTTGGTTTACATTTTGAAGACTAGATTGGGAAGAACTATTAAGGCTACTGCTAACCATAGATTTTTGACTATCGATGGTTGGAAGAGATTGGATGAGTTGTCTTTGAAGGAGCATATCGCTTTGCCAAGAAAGTTGGAATCCTCTTCTTTGCAATTGTCACCAGAAATTGAGAAGTTGTCTCAGTCTGACATTTACTGGGATTCCATTGTTTCTATTACTGAGACTGGTGTTGAGGAAGTTTTCGATTTGACTGTTCCTGGTCCTCATAACTTTGTTGCTAACGACATTATTGTTCATAACGTTAAGAGAAAGAAGAAGGGTGGTAAGAACGGAAAGAATAGAAGAAATAGAAAGAAGAAAAACCCAGGAGATCATCCACAAACAACTCCAGCTCCAGCTCCAGACGCTTCTACAGAATTGCCAGCTTCCATGTCTCAAGCTCAACACTTGGCTCCAAACACCGCTACCGACAACTACAGAATCCCAGCTATCACTACCGCTCCAAACGGTGATTTGTTGATTTCTTACGACGAAAGACCAAAAGATAACGGTAACGGTGGTTCTGACGCTCCAAACCCAAATCATATTGTTCAAAGAAGATCCACTGACGGTGGTAAAACTTGGTCTGCTCCTACTTACATCCATCAAGGTACCGAAACCGGAAAAAAGGTTGGTTACTCTGATCCATCTTACGTTGTTGATCATCAAACTGGTACTGTTTTTAACTTTCATGTTAAGTCTTACGATCAAGGTTGGGGTGGTTCTCAAGCTGGTACTGATCCAGAAAACAGAGGTATTATTCAAGCTGAAGTTTCTACTTCTACTGATAACGGTTGGACTTGGACTCATAGAACTATTACTGCTGATATTACTAAGGATAAGCCTTGGACTGCTAGATTTGCTGCTTCTGGTCAAGGTATTCAAATTCAACATGGTCCACATGCTGGTAGATTGGTTCAACAATACACTATTAGAACTGCTGGTGGTGCTGTTCAAGCTGTTTCTGTTTACTCTGATGATCATGGTAAGACTTGGCAAGCTGGTACTCCAATTGGTACTGGTATGGATGAAAACAAGGTTGTTGAATTGTCTGATGGTTCTTTGATGTTGAACTCTAGAGCTTCTGATGGTTCTGGTTTTAGAAAGGTTGCTCATTCTACTGATGGTGGTCAAACTTGGTCTGAACCAGTTTCTGATCAAAACTTGCCAGATTCTGTTGATAACGCTCAAATTATTAGAGCTTTTCCAAACGCTGCTCCAGATGATCCAAGAGCTAAGGTTTTGTTGTTGTCTCATTCTCCAAACCCAAAGCCTTGGTCTAGAGATAGAGGTACTATTTCTATGTCTTGTGATGATGGTGCTTCTTGGACTACTTCTAAGGTTTTTCATGAACCATTTGTTGGTTACACTACTATTGCTGTTCAATCTGATGGTTCTATTGGTTTGTTGTCTGAAGATGCTCATAACGGTGCTGATTACGGTGGTATTTGGTACAGAAACTTTACTATGAACTGGTTGGGTGAACAATGTGGTCAAAAGCCAGCTGAATAA

其中，dnaB内含肽优化后的基因序列如SEQ ID NO.8的第1-531位所示。

经软件优化获得序列如SEQ ID NO.9所示：

ATGGGAAGCTCCCACCACCACCACCATCACTCCTCCGGAAACAACGGCCTGGAGCTGCGAGAATCCGGCGCTATTTCCGGCGACTCCCTGATCTCCCTGGCCTCTACAGGCAAAAGGGTGTCCATCAAGGACCTGCTGGACGAAAAAGACTTCGAGATCTGGGCTATCAACGAGCAGACAATGAAACTGGAGTCCGCTAAAGTGTCCAGGGTGTTCTGCACCGGCAAGAAGCTGGTGTATATTCTGAAAACCAGGCTGGGAAGGACAATCAAGGCCACCGCAAACCACAGGTTCCTGACCATCGACGGGTGGAAAAGGCTGGACGAGCTGAGCCTGAAGGAGCACATCGCCCTGCCTAGGAAACTGGAGTCTAGCAGTCTGCAGCTGTCCCCAGAGATCGAGAAGCTGAGCCAGAGCGACATTTATTGGGACTCCATCGTGTCCATCACCGAGACCGGCGTGGAGGAAGTGTTCGACCTGACCGTGCCCGGACCACATAACTTTGTGGCCAATGACATTATCGTGCACAACGTGAAGAGGAAGAAGAAGGGCGGCAAGAACGGCAAAAACAGAAGGAATAGAAAGAAGAAGAACCCCGGCGACCACCCCCAGACAACACCTGCTCCTGCTCCAGACGCCAGTACCGAACTGCCAGCAAGCATGTCCCAGGCACAGCACCTGGCACCAAACACCGCAACCGACAACTACAGAATCCCCGCCATCACCACCGCCCCAAACGGAGATCTGCTGATCTCCTACGACGAAAGGCCCAAAGACAACGGCAACGGAGGCTCCGACGCCCCTAATCCTAACCACATCGTGCAGAGACGCTCCACCGACGGAGGAAAAACCTGGTCCGCCCCTACCTACATCCACCAGGGAACCGAAACCGGCAAAAAGGTGGGATACTCCGACCCCTCCTACGTGGTGGACCACCAGACAGGAACCGTGTTCAACTTTCATGTGAAATCCTATGACCAGGGCTGGGGCGGCTCCCAGGCTGGAACAGATCCTGAAAATAGGGGCATCATCCAGGCCGAGGTGAGCACATCCACCGACAACGGATGGACCTGGACCCACAGGACCATCACCGCTGACATCACCAAGGACAAGCCCTGGACCGCCAGATTCGCCGCTAGTGGACAGGGAATCCAGATCCAGCACGGACCACACGCCGGAAGACTGGTGCAGCAGTACACCATCCGCACCGCTGGAGGAGCAGTGCAGGCTGTGTCTGTGTATTCCGACGACCACGGCAAAACCTGGCAGGCAGGTACCCCTATCGGCACAGGAATGGACGAAAATAAGGTGGTGGAGCTGAGCGACGGAAGCCTGATGCTGAACAGTAGGGCCTCTGACGGCAGCGGATTTAGGAAGGTGGCCCACTCCACAGACGGCGGACAGACATGGAGCGAGCCTGTGAGTGATCAGAACCTGCCCGACTCTGTGGACAACGCACAGATCATCAGGGCCTTTCCTAACGCCGCCCCAGACGATCCTAGGGCTAAAGTGCTGCTGCTGAGCCACTCCCCCAACCCTAAACCCTGGTCCCGAGACAGGGGCACAATCTCAATGAGCTGCGACGACGGCGCCTCCTGGACAACATCAAAGGTGTTCCACGAACCCTTCGTGGGCTACACCACCATCGCCGTGCAGAGTGACGGCTCTATCGGACTGCTGAGCGAGGACGCTCACAACGGAGCTGACTACGGCGGAATCTGGTACAGGAATTTCACAATGAACTGGCTGGGCGAGCAGTGCGGCCAGAAACCTGCTGAATAA

其中，dnaB内含肽优化后的基因序列如SEQ ID NO.9的第1-531位所示。

经软件优化获得序列如SEQ ID NO.10所示：

ATGGGCTCCTCCCACCACCACCACCACCACTCCTCCGGCAACAACGGCCTGGAACTCCGCGAGTCCGGCGCCATCTCCGGCGATTCCCTCATCTCCCTCGCCTCCACCGGTAAGCGCGTGTCCATCAAGGACCTCCTCGACGAAAAGGACTTCGAAATCTGGGCTATCAACGAACAGACAATGAAGCTGGAGTCCGCTAAGGTCTCCCGCGTGTTCTGCACCGGCAAGAAGCTCGTGTATATTCTGAAGACCCGCCTGGGAAGAACCATCAAGGCCACCGCTAACCACAGGTTCCTGACCATCGACGGTTGGAAGAGGCTGGACGAATTGTCCCTGAAGGAGCACATCGCTCTGCCCCGCAAGCTGGAATCCTCTAGCCTGCAACTGTCCCCTGAGATCGAAAAGTTGTCCCAATCCGACATCTACTGGGACTCCATCGTGTCCATCACCGAGACCGGCGTCGAGGAAGTGTTCGACCTGACCGTGCCCGGTCCCCACAACTTCGTGGCTAACGACATCATCGTGCACAACGTCAAGCGCAAGAAGAAGGGTGGTAAGAACGGCAAGAACAGAAGGAACAGGAAGAAGAAGAACCCTGGCGATCACCCTCAGACAACCCCCGCTCCTGCCCCAGACGCTAGCACCGAGCTGCCCGCTAGCATGAGCCAGGCTCAGCACCTGGCCCCCAACACCGCCACCGACAACTACCGCATCCCTGCTATCACCACCGCCCCCAACGGTGACCTGCTCATCTCCTACGACGAGCGCCCTAAGGACAACGGAAACGGTGGTTCCGACGCTCCCAACCCCAACCACATCGTCCAGCGCCGCTCCACCGACGGCGGAAAGACCTGGAGCGCTCCTACCTACATCCACCAAGGCACCGAAACCGGCAAGAAGGTGGGTTACTCCGACCCTTCCTACGTCGTCGACCACCAAACCGGTACAGTCTTCAACTTCCACGTGAAGAGCTACGATCAGGGCTGGGGCGGCTCCCAGGCTGGTACTGACCCCGAAAACAGAGGCATCATCCAAGCTGAGGTGTCTACCTCCACCGACAACGGCTGGACCTGGACCCACCGCACAATCACCGCTGACATCACCAAGGACAAGCCCTGGACTGCTCGCTTCGCCGCCAGCGGACAGGGCATCCAAATCCAGCACGGCCCTCACGCTGGCAGACTGGTGCAGCAATACACCATCCGCACCGCTGGAGGCGCCGTGCAAGCCGTGTCCGTGTACTCCGACGATCACGGAAAGACCTGGCAGGCTGGCACCCCCATCGGTACCGGTATGGACGAAAACAAGGTCGTCGAGCTGTCCGACGGTAGCTTGATGCTGAACTCCCGCGCTAGCGACGGTTCCGGTTTCAGGAAGGTGGCTCACTCCACCGACGGTGGCCAGACATGGAGCGAGCCTGTGTCCGATCAGAACCTCCCTGACAGTGTGGACAACGCTCAGATCATCCGTGCCTTCCCTAACGCTGCTCCCGACGACCCTCGCGCTAAGGTGCTGCTGCTCTCCCACTCCCCTAACCCTAAGCCCTGGTCCCGCGACAGAGGCACCATCTCCATGTCCTGCGACGACGGTGCCTCCTGGACCACCTCCAAGGTGTTCCACGAGCCATTCGTCGGTTACACCACCATCGCCGTCCAATCCGACGGTTCCATCGGACTCCTGTCCGAGGACGCCCACAACGGTGCTGACTACGGTGGTATCTGGTACAGAAACTTCACCATGAACTGGCTCGGCGAACAATGCGGCCAGAAGCCTGCTGAATAA

其中，dnaB内含肽优化后的基因序列如SEQ ID NO.10的第1-531位所示。

实施例

唾液酸酶的诱导表达

将如SEQ ID NO.7、8、9、10所示的编码流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白的基因，以及GST基因与如SEQ ID NO.1所示的新型唾液酸酶基因的构成的表达蛋白的基因，利用NdeI和NotI酶切位点进行双酶切后，克隆至经过同样酶切的表达载体pET-28a(+)中，获得表达载体pET28a-Sialidase。

将pET-28a-Sialidase重组载体转化到大肠杆菌BL21中（含卡那霉素100 μg /mL)，200r/min培养到OD=0.6，加入乳糖(终浓度为2 g/L)，200 r/min 37℃振荡诱导培养4h。诱导后的菌液，加入SDS样品缓冲液，混匀后煮沸几分钟，高速离心约1min，取20μL上清液进行SDS-PAGE电泳分析（15%浓度的分离胶）。

菌体超声裂解物的SDS-PAGE结果（图1）显示，在相对分子质量44 000 处出现一条特有蛋白条带，结果与预期相符。该结果表明唾液酸酶基因在大肠杆菌中获得表达。通过分析全菌悬液、超声悬液以及超声上清，发现重组蛋白以可溶形式表达，结果如图2所示。另，GST基因与如SEQ ID NO.1所示的新型唾液酸酶基因构成的表达蛋白的基因融合后，未能筛选获得有效的表达菌株。

实施例 3 唾液酸酶的分离纯化

低温离心(8000×r，30min，4℃) 收集菌体，然后用缓冲液A（20mmol /L 磷酸盐缓冲液，pH7.0）重悬菌体，超声破碎大肠杆菌细胞30min(250W，开1s /关2s) 后，低温离心（8000×r，30min，4℃）弃细胞碎片，收集上清液进行以下层析纯化。

第一步采用阳离子交换层析法纯化目的蛋白，使用Sepharose bigbeads层析柱(1.6 cm×12.0cm)即SP阳离子层析柱进行纯化。上柱前预先用平衡液A平衡层析柱，超声破碎上清液上柱后以平衡液A平衡洗脱杂蛋白，再用洗脱液B（平衡液+ 1 mol /LNaCl）洗脱重组蛋白（方法：0~30%B，5min；30%B~100%B，10min），所有收集样品利用SDS-PAGE进行电泳分析，用考马斯亮蓝法检测蛋白。

第二步采用阴离子交换层析法纯化目的蛋白，使用Q-HPSepharose阴离子层析柱（1.6 cm×10 cm）进行纯化。将SP纯化样品以1:10（V／V）的体积比用pH8.5的20 mmol/LTris-HCl 缓冲液（A液）重悬。用缓冲液A（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.5）平衡，上样，缓冲液A平衡，缓冲液B（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.5，1 mol/L NaCl）洗脱（20%B直接洗脱），样品利用SDS-PAGE进行电泳分析。

如图3、图4结果显示，如SEQ ID NO.5所示的唾液酸酶经SP阳离子层析柱和Q-HP阴离子层析柱两步纯化后，经SDS-PAGE分析，杂蛋白去除完全，目的蛋白条带均一，无拖尾或眉毛等现象（图3、图4）。

实施例4新型重组蛋白的反相HPLC分析

蛋白纯度分析采用反向高压液相进行分析。反相高压液相的流动相A为含0.1%TFA的纯水，流动相B为含0.1%TFA的色谱级乙腈。取样品1支。打开高效液相色谱仪，用注射用水清洗管路。换B液充满管路后，接好柱子，柱温为25˚Ϲ，流速0.5ml/min活化柱子10min，再换A液冲洗柱子，设定流速为0.5ml/min，设定检测器波长为280nm，采集基线，待基线平稳后进样。执行已设定的运行方法，流速为0.5ml/min，检测波长为280nm，检测时间20min，流动相采用梯度变换方式，0-20分钟为100%~0%的A流动相梯度变换为B流动相，记录色谱图。操作完毕，用50%乙腈保存柱子。

结果如图5所示，如SEQ ID NO.5所示的唾液酸酶经过RP-HPLC分析，样品在0.5ml/min的流速下出峰时间为14.354min，峰高为96mAU，并且前后无杂峰，纯度为100%的单一峰型。

实施例5流感病毒的扩增

按照文献所述方法将Madin-Darby犬肾细胞系（MDCK)中的病毒株置于加有0.3%牛血清白蛋白和0.5毫克每毫升胰蛋白酶的低盐基本培养基(MEM)中培养，孵育48到72 h后，低速离心对培养基进行澄清，利用超速离心和25%蔗糖缓冲沉淀并纯化病毒颗粒。将纯化的病毒重悬于50%甘油-0.1 M Tris 缓冲液（pH 7.3)，保存于-20℃。

实施例 6 细胞水平唾液酸酶的抗流感病毒效果

取处于指数生长期的MDCK 细胞铺于96 孔板上，细胞密度为1×l0⁴/孔，24 h 后细胞长成单层后去掉培养基，将各种浓度的唾液酸酶（初始质量浓度为1000μg/mL，倍比稀释）100 μL加入MDCK细胞培养物中，37 ℃孵育1h。用新鲜培养基洗涤细胞去掉病毒和唾液酸酶的混合物，立即加0.01至1 MOI的流感病毒共孵育。1 h后再次洗涤细胞，培养3至5 d。用结晶紫对活细胞染色以估计病毒感染的致细胞病变效应，试验结束时于570 nm波长测量细胞的光吸收以对病变效应进行定量。利用血凝方法检测上清病毒的滴度。阴性对照孔只加病毒，空白对照孔加入不含病毒与药物的细胞上清液。

结果如图6所示，细胞水平研究表明，如SEQ ID NO.5所示的唾液酸酶对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)株活病毒有明显抑制病毒在MDCK细胞中的增殖作用，并呈明显量效关系。并且如图7所示，因流感病毒对红细胞有血凝活性，即可以在孔板中发现有血凝现象，为了分析如SEQ ID NO.5所示的唾液酸酶是否具有抑制流感病毒株病毒活性，可通过抑制流感病毒的血凝活性来反映重组唾液酸酶活性。研究发现当其质量浓度为19ng/mL时，明显观察到唾液酸酶对血凝的抑制作用，即红细胞不再凝结，而随时间沉降至孔板底部，形成红点。结果表明当唾液酸酶的质量浓度为19ng/mL时，能明显抑制甲型流感病毒FM_1株的血凝活性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 北京华芢生物技术有限公司

<120> 一种流感病毒防治用重组蛋白药物及其应用

<130> 2021003

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgaaacgta aaaagaaagg tggtaaaaac ggtaaaaacc gtcgtaaccg taaaaagaaa 60

aaccctggtg atcatcctca gaccacccct gcacctgcac ctgatgcaag caccgaactg 120

cctgcaagca tgagccaggc acagcatctg gcacctaaca ccgcaaccga taactatcgt 180

atccctgcaa tcaccaccgc acctaacggt gatctgctga tcagctatga tgaacgtcct 240

aaagataacg gtaacggtgg tagcgatgca cctaacccta accatatcgt gcagcgtcgt 300

agcaccgatg gtggtaaaac ctggagcgca cctacctata tccatcaggg taccgaaacc 360

ggcaaaaagg tgggttatag cgatcctagc tatgtggtgg atcatcagac cggtaccgtg 420

tttaactttc atgtgaaaag ctatgatcag ggttggggtg gtagccaggc aggtaccgat 480

cctgaaaacc gtggtatcat ccaggcagaa gtgagcacca gcaccgataa cggttggacc 540

tggacccatc gtaccatcac cgcagatatc accaaagata aaccttggac cgcacgtttt 600

gcagcaagcg gtcagggtat ccagatccag catggtcctc atgcaggtcg tctggtgcag 660

cagtatacca tccgtaccgc aggtggtgca gtgcaggcag tgagcgtgta tagcgatgat 720

catggtaaaa cctggcaggc aggtacacct atcggtaccg gtatggatga aaacaaagtg 780

gtggaactga gcgatggtag cctgatgctg aacagccgtg caagcgatgg tagtggtttt 840

cgtaaagtgg cacatagcac cgatggcggt cagacctgga gcgaacctgt gagcgatcag 900

aacctgcctg atagcgtgga taacgcacag atcatccgtg catttcctaa cgcagcacct 960

gatgatcctc gtgcaaaagt gctgctgctg agccatagcc ctaaccctaa accttggagc 1020

cgtgatcgtg gtaccatcag catgagctgc gatgatggtg caagctggac caccagcaaa 1080

gtgtttcatg aaccttttgt gggttatacc accatcgcag tgcagagcga tggttcaatc 1140

ggtctgctga gcgaagatgc acataacggt gcagattatg gtggtatctg gtatcgtaac 1200

tttaccatga actggctggg tgaacagtgc ggtcagaaac ctgcagaata a 1251

<210> 2

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttaagagaa agaagaaggg tggtaagaac ggaaagaata gaagaaatag aaagaagaaa 60

aacccaggag atcatccaca aacaactcca gctccagctc cagacgcttc tacagaattg 120

ccagcttcca tgtctcaagc tcaacacttg gctccaaaca ccgctaccga caactacaga 180

atcccagcta tcactaccgc tccaaacggt gatttgttga tttcttacga cgaaagacca 240

aaagataacg gtaacggtgg ttctgacgct ccaaacccaa atcatattgt tcaaagaaga 300

tccactgacg gtggtaaaac ttggtctgct cctacttaca tccatcaagg taccgaaacc 360

ggaaaaaagg ttggttactc tgatccatct tacgttgttg atcatcaaac tggtactgtt 420

tttaactttc atgttaagtc ttacgatcaa ggttggggtg gttctcaagc tggtactgat 480

ccagaaaaca gaggtattat tcaagctgaa gtttctactt ctactgataa cggttggact 540

tggactcata gaactattac tgctgatatt actaaggata agccttggac tgctagattt 600

gctgcttctg gtcaaggtat tcaaattcaa catggtccac atgctggtag attggttcaa 660

caatacacta ttagaactgc tggtggtgct gttcaagctg tttctgttta ctctgatgat 720

catggtaaga cttggcaagc tggtactcca attggtactg gtatggatga aaacaaggtt 780

gttgaattgt ctgatggttc tttgatgttg aactctagag cttctgatgg ttctggtttt 840

agaaaggttg ctcattctac tgatggtggt caaacttggt ctgaaccagt ttctgatcaa 900

aacttgccag attctgttga taacgctcaa attattagag cttttccaaa cgctgctcca 960

gatgatccaa gagctaaggt tttgttgttg tctcattctc caaacccaaa gccttggtct 1020

agagatagag gtactatttc tatgtcttgt gatgatggtg cttcttggac tacttctaag 1080

gtttttcatg aaccatttgt tggttacact actattgctg ttcaatctga tggttctatt 1140

ggtttgttgt ctgaagatgc tcataacggt gctgattacg gtggtatttg gtacagaaac 1200

tttactatga actggttggg tgaacaatgt ggtcaaaagc cagctgaata a 1251

<210> 3

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgaagagga agaagaaggg cggcaagaac ggcaaaaaca gaaggaatag aaagaagaag 60

aaccccggcg accaccccca gacaacacct gctcctgctc cagacgccag taccgaactg 120

ccagcaagca tgtcccaggc acagcacctg gcaccaaaca ccgcaaccga caactacaga 180

atccccgcca tcaccaccgc cccaaacgga gatctgctga tctcctacga cgaaaggccc 240

aaagacaacg gcaacggagg ctccgacgcc cctaatccta accacatcgt gcagagacgc 300

tccaccgacg gaggaaaaac ctggtccgcc cctacctaca tccaccaggg aaccgaaacc 360

ggcaaaaagg tgggatactc cgacccctcc tacgtggtgg accaccagac aggaaccgtg 420

ttcaactttc atgtgaaatc ctatgaccag ggctggggcg gctcccaggc tggaacagat 480

cctgaaaata ggggcatcat ccaggccgag gtgagcacat ccaccgacaa cggatggacc 540

tggacccaca ggaccatcac cgctgacatc accaaggaca agccctggac cgccagattc 600

gccgctagtg gacagggaat ccagatccag cacggaccac acgccggaag actggtgcag 660

cagtacacca tccgcaccgc tggaggagca gtgcaggctg tgtctgtgta ttccgacgac 720

cacggcaaaa cctggcaggc aggtacccct atcggcacag gaatggacga aaataaggtg 780

gtggagctga gcgacggaag cctgatgctg aacagtaggg cctctgacgg cagcggattt 840

aggaaggtgg cccactccac agacggcgga cagacatgga gcgagcctgt gagtgatcag 900

aacctgcccg actctgtgga caacgcacag atcatcaggg cctttcctaa cgccgcccca 960

gacgatccta gggctaaagt gctgctgctg agccactccc ccaaccctaa accctggtcc 1020

cgagacaggg gcacaatctc aatgagctgc gacgacggcg cctcctggac aacatcaaag 1080

gtgttccacg aacccttcgt gggctacacc accatcgccg tgcagagtga cggctctatc 1140

ggactgctga gcgaggacgc tcacaacgga gctgactacg gcggaatctg gtacaggaat 1200

ttcacaatga actggctggg cgagcagtgc ggccagaaac ctgctgaata a 1251

<210> 4

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcaagcgca agaagaaggg tggtaagaac ggcaagaaca gaaggaacag gaagaagaag 60

aaccctggcg atcaccctca gacaaccccc gctcctgccc cagacgctag caccgagctg 120

cccgctagca tgagccaggc tcagcacctg gcccccaaca ccgccaccga caactaccgc 180

atccctgcta tcaccaccgc ccccaacggt gacctgctca tctcctacga cgagcgccct 240

aaggacaacg gaaacggtgg ttccgacgct cccaacccca accacatcgt ccagcgccgc 300

tccaccgacg gcggaaagac ctggagcgct cctacctaca tccaccaagg caccgaaacc 360

ggcaagaagg tgggttactc cgacccttcc tacgtcgtcg accaccaaac cggtacagtc 420

ttcaacttcc acgtgaagag ctacgatcag ggctggggcg gctcccaggc tggtactgac 480

cccgaaaaca gaggcatcat ccaagctgag gtgtctacct ccaccgacaa cggctggacc 540

tggacccacc gcacaatcac cgctgacatc accaaggaca agccctggac tgctcgcttc 600

gccgccagcg gacagggcat ccaaatccag cacggccctc acgctggcag actggtgcag 660

caatacacca tccgcaccgc tggaggcgcc gtgcaagccg tgtccgtgta ctccgacgat 720

cacggaaaga cctggcaggc tggcaccccc atcggtaccg gtatggacga aaacaaggtc 780

gtcgagctgt ccgacggtag cttgatgctg aactcccgcg ctagcgacgg ttccggtttc 840

aggaaggtgg ctcactccac cgacggtggc cagacatgga gcgagcctgt gtccgatcag 900

aacctccctg acagtgtgga caacgctcag atcatccgtg ccttccctaa cgctgctccc 960

gacgaccctc gcgctaaggt gctgctgctc tcccactccc ctaaccctaa gccctggtcc 1020

cgcgacagag gcaccatctc catgtcctgc gacgacggtg cctcctggac cacctccaag 1080

gtgttccacg agccattcgt cggttacacc accatcgccg tccaatccga cggttccatc 1140

ggactcctgt ccgaggacgc ccacaacggt gctgactacg gtggtatctg gtacagaaac 1200

ttcaccatga actggctcgg cgaacaatgc ggccagaagc ctgctgaata a 1251

<210> 5

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Val Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn

1 5 10 15

Arg Lys Lys Lys Asn Pro Gly Asp His Pro Gln Thr Thr Pro Ala Pro

20 25 30

Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln

35 40 45

His Leu Ala Pro Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile

50 55 60

Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro

65 70 75 80

Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile

85 90 95

Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr

100 105 110

Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp

115 120 125

Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Val Phe Asn Phe His

130 135 140

Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Gln Ala Gly Thr Asp

145 150 155 160

Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp

165 170 175

Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys

180 185 190

Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln

195 200 205

Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile

210 215 220

Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp

225 230 235 240

His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp

245 250 255

Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser

260 265 270

Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp

275 280 285

Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Gln Asn Leu Pro Asp

290 295 300

Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro

305 310 315 320

Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro

325 330 335

Lys Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp

340 345 350

Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly

355 360 365

Tyr Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser

370 375 380

Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn

385 390 395 400

Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu

405 410 415

<210> 6

<211> 593

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Asn Asn Gly

1 5 10 15

Leu Glu Leu Arg Glu Ser Gly Ala Ile Ser Gly Asp Ser Leu Ile Ser

20 25 30

Leu Ala Ser Thr Gly Lys Arg Val Ser Ile Lys Asp Leu Leu Asp Glu

35 40 45

Lys Asp Phe Glu Ile Trp Ala Ile Asn Glu Gln Thr Met Lys Leu Glu

50 55 60

Ser Ala Lys Val Ser Arg Val Phe Cys Thr Gly Lys Lys Leu Val Tyr

65 70 75 80

Ile Leu Lys Thr Arg Leu Gly Arg Thr Ile Lys Ala Thr Ala Asn His

85 90 95

Arg Phe Leu Thr Ile Asp Gly Trp Lys Arg Leu Asp Glu Leu Ser Leu

100 105 110

Lys Glu His Ile Ala Leu Pro Arg Lys Leu Glu Ser Ser Ser Leu Gln

115 120 125

Leu Ser Pro Glu Ile Glu Lys Leu Ser Gln Ser Asp Ile Tyr Trp Asp

130 135 140

Ser Ile Val Ser Ile Thr Glu Thr Gly Val Glu Glu Val Phe Asp Leu

145 150 155 160

Thr Val Pro Gly Pro His Asn Phe Val Ala Asn Asp Ile Ile Val His

165 170 175

Asn Val Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg

180 185 190

Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro Gly Asp His Pro Gln Thr Thr Pro Ala

195 200 205

Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala

210 215 220

Gln His Leu Ala Pro Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg

245 250 255

Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His

260 265 270

Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro

275 280 285

Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser

290 295 300

Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Val Phe Asn Phe

305 310 315 320

His Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Gln Ala Gly Thr

325 330 335

Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr

340 345 350

Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr

355 360 365

Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile

370 375 380

Gln Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr

385 390 395 400

Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp

405 410 415

Asp His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met

420 425 430

Asp Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn

435 440 445

Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr

450 455 460

Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Gln Asn Leu Pro

465 470 475 480

Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala

485 490 495

Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn

500 505 510

Pro Lys Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp

515 520 525

Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val

530 535 540

Gly Tyr Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu

545 550 555 560

Ser Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg

565 570 575

Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala

580 585 590

Glu

<210> 7

<211> 1782

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgggtagca gccatcatca tcatcatcat agcagcggta acaacggtct ggaactgcgt 60

gaaagcggtg caatcagcgg tgatagcctg atcagcctgg caagcaccgg taaacgtgtg 120

agcatcaaag atctgctgga tgaaaaagat tttgaaatct gggcaatcaa cgaacagacc 180

atgaaactgg aaagcgcaaa agtgagccgt gtgttttgca ccggtaaaaa gctggtgtat 240

atcctgaaaa cccgtctggg tcgtaccatc aaagcaaccg caaaccatcg ttttctgacc 300

atcgatggtt ggaaacgtct ggatgaactg agcctgaaag aacatatcgc actgcctcgt 360

aaactggaaa gtagcagcct gcagctgagc cctgaaatcg aaaaactgag ccagagcgat 420

atctattggg atagcatcgt gagcatcacc gaaaccggtg tggaagaagt gtttgatctg 480

accgtgcctg gtcctcataa ctttgtggca aacgatatca tcgtgcataa cgtgaaacgt 540

aaaaagaaag gtggtaaaaa cggtaaaaac cgtcgtaacc gtaaaaagaa aaaccctggt 600

gatcatcctc agaccacccc tgcacctgca cctgatgcaa gcaccgaact gcctgcaagc 660

atgagccagg cacagcatct ggcacctaac accgcaaccg ataactatcg tatccctgca 720

atcaccaccg cacctaacgg tgatctgctg atcagctatg atgaacgtcc taaagataac 780

ggtaacggtg gtagcgatgc acctaaccct aaccatatcg tgcagcgtcg tagcaccgat 840

ggtggtaaaa cctggagcgc acctacctat atccatcagg gtaccgaaac cggcaaaaag 900

gtgggttata gcgatcctag ctatgtggtg gatcatcaga ccggtaccgt gtttaacttt 960

catgtgaaaa gctatgatca gggttggggt ggtagccagg caggtaccga tcctgaaaac 1020

cgtggtatca tccaggcaga agtgagcacc agcaccgata acggttggac ctggacccat 1080

cgtaccatca ccgcagatat caccaaagat aaaccttgga ccgcacgttt tgcagcaagc 1140

ggtcagggta tccagatcca gcatggtcct catgcaggtc gtctggtgca gcagtatacc 1200

atccgtaccg caggtggtgc agtgcaggca gtgagcgtgt atagcgatga tcatggtaaa 1260

acctggcagg caggtacacc tatcggtacc ggtatggatg aaaacaaagt ggtggaactg 1320

agcgatggta gcctgatgct gaacagccgt gcaagcgatg gtagtggttt tcgtaaagtg 1380

gcacatagca ccgatggcgg tcagacctgg agcgaacctg tgagcgatca gaacctgcct 1440

gatagcgtgg ataacgcaca gatcatccgt gcatttccta acgcagcacc tgatgatcct 1500

cgtgcaaaag tgctgctgct gagccatagc cctaacccta aaccttggag ccgtgatcgt 1560

ggtaccatca gcatgagctg cgatgatggt gcaagctgga ccaccagcaa agtgtttcat 1620

gaaccttttg tgggttatac caccatcgca gtgcagagcg atggttcaat cggtctgctg 1680

agcgaagatg cacataacgg tgcagattat ggtggtatct ggtatcgtaa ctttaccatg 1740

aactggctgg gtgaacagtg cggtcagaaa cctgcagaat aa 1782

<210> 8

<211> 1782

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggatctt ctcaccacca ccaccatcac tcctctggaa acaacggttt ggaattgaga 60

gaatctggag ctatttctgg agattctttg atttccttgg cttctaccgg taagagagtt 120

tctattaagg acttgttgga cgaaaaagat tttgagattt gggctattaa cgagcagact 180

atgaagttgg agtctgctaa ggtttctaga gttttttgta ctggaaagaa gttggtttac 240

attttgaaga ctagattggg aagaactatt aaggctactg ctaaccatag atttttgact 300

atcgatggtt ggaagagatt ggatgagttg tctttgaagg agcatatcgc tttgccaaga 360

aagttggaat cctcttcttt gcaattgtca ccagaaattg agaagttgtc tcagtctgac 420

atttactggg attccattgt ttctattact gagactggtg ttgaggaagt tttcgatttg 480

actgttcctg gtcctcataa ctttgttgct aacgacatta ttgttcataa cgttaagaga 540

aagaagaagg gtggtaagaa cggaaagaat agaagaaata gaaagaagaa aaacccagga 600

gatcatccac aaacaactcc agctccagct ccagacgctt ctacagaatt gccagcttcc 660

atgtctcaag ctcaacactt ggctccaaac accgctaccg acaactacag aatcccagct 720

atcactaccg ctccaaacgg tgatttgttg atttcttacg acgaaagacc aaaagataac 780

ggtaacggtg gttctgacgc tccaaaccca aatcatattg ttcaaagaag atccactgac 840

ggtggtaaaa cttggtctgc tcctacttac atccatcaag gtaccgaaac cggaaaaaag 900

gttggttact ctgatccatc ttacgttgtt gatcatcaaa ctggtactgt ttttaacttt 960

catgttaagt cttacgatca aggttggggt ggttctcaag ctggtactga tccagaaaac 1020

agaggtatta ttcaagctga agtttctact tctactgata acggttggac ttggactcat 1080

agaactatta ctgctgatat tactaaggat aagccttgga ctgctagatt tgctgcttct 1140

ggtcaaggta ttcaaattca acatggtcca catgctggta gattggttca acaatacact 1200

attagaactg ctggtggtgc tgttcaagct gtttctgttt actctgatga tcatggtaag 1260

acttggcaag ctggtactcc aattggtact ggtatggatg aaaacaaggt tgttgaattg 1320

tctgatggtt ctttgatgtt gaactctaga gcttctgatg gttctggttt tagaaaggtt 1380

gctcattcta ctgatggtgg tcaaacttgg tctgaaccag tttctgatca aaacttgcca 1440

gattctgttg ataacgctca aattattaga gcttttccaa acgctgctcc agatgatcca 1500

agagctaagg ttttgttgtt gtctcattct ccaaacccaa agccttggtc tagagataga 1560

ggtactattt ctatgtcttg tgatgatggt gcttcttgga ctacttctaa ggtttttcat 1620

gaaccatttg ttggttacac tactattgct gttcaatctg atggttctat tggtttgttg 1680

tctgaagatg ctcataacgg tgctgattac ggtggtattt ggtacagaaa ctttactatg 1740

aactggttgg gtgaacaatg tggtcaaaag ccagctgaat aa 1782

<210> 9

<211> 1782

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgggaagct cccaccacca ccaccatcac tcctccggaa acaacggcct ggagctgcga 60

gaatccggcg ctatttccgg cgactccctg atctccctgg cctctacagg caaaagggtg 120

tccatcaagg acctgctgga cgaaaaagac ttcgagatct gggctatcaa cgagcagaca 180

atgaaactgg agtccgctaa agtgtccagg gtgttctgca ccggcaagaa gctggtgtat 240

attctgaaaa ccaggctggg aaggacaatc aaggccaccg caaaccacag gttcctgacc 300

atcgacgggt ggaaaaggct ggacgagctg agcctgaagg agcacatcgc cctgcctagg 360

aaactggagt ctagcagtct gcagctgtcc ccagagatcg agaagctgag ccagagcgac 420

atttattggg actccatcgt gtccatcacc gagaccggcg tggaggaagt gttcgacctg 480

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atccgcaccg ctggaggagc agtgcaggct gtgtctgtgt attccgacga ccacggcaaa 1260

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<210> 10

<211> 1782

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgggctcct cccaccacca ccaccaccac tcctccggca acaacggcct ggaactccgc 60

gagtccggcg ccatctccgg cgattccctc atctccctcg cctccaccgg taagcgcgtg 120

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gagccattcg tcggttacac caccatcgcc gtccaatccg acggttccat cggactcctg 1680

tccgaggacg cccacaacgg tgctgactac ggtggtatct ggtacagaaa cttcaccatg 1740

aactggctcg gcgaacaatg cggccagaag cctgctgaat aa 1782

Claims

1.一种新型唾液酸酶蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种新型唾液酸酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种流感病毒防治用重组蛋白药物，其特征在于：包含权利要求1所述的新型唾液酸酶蛋白。

4.一种流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白，其特征在于：包含dnaB内含肽和权利要求1所述的新型唾液酸酶蛋白，其中，所述表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.编码权利要求4所述的表达蛋白的基因，其特征在于：所述表达蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

6.一种重组表达载体，其特征在于：包含权利要求2所述的新型唾液酸酶基因或权利要求5所述的编码表达蛋白的基因的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述表达载体选自pET-28a(+)。

8.一种宿主细胞，其特征在于：包含权利要求1所述的新型唾液酸酶蛋白，或包含权利要求2所述的新型唾液酸酶基因，或包含权利要求4所述的流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白，或包含权利要求5所述的编码表达蛋白的基因，或包含权利要求6所述的重组表达载体。

9.一种提高流感病毒防治用重组蛋白的表达水平的方法，其特征在于：所述方法包括，通过dnaB内含肽和权利要求1所述的新型唾液酸酶蛋白在基因水平进行融合从而实现新型唾液酸酶蛋白的高效表达，所述dnaB内含肽和所述新型唾液酸酶蛋白融合的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述dnaB内含肽和所述新型唾液酸酶蛋白融合的表达蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

11.一种制备新型唾液酸酶或重组蛋白或表达蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）用含有权利要求2所述的新型唾液酸酶基因或权利要求5所述的编码表达蛋白的基因或权利要求6所述的重组表达载体转化宿主细胞；

（2）培养宿主细胞，诱导新型唾液酸酶或重组蛋白或表达蛋白的表达；

（3）回收并纯化所表达的新型唾液酸酶或重组蛋白或表达蛋白。

12.权利要求1所述的新型唾液酸酶蛋白或权利要求2所述的新型唾液酸酶基因或权利要求3所述的重组蛋白药物或权利要求4所述的流感病毒防治用重组蛋白药物的表达蛋白或权利要求5所述的编码表达蛋白的基因或权利要求6所述的重组表达载体或权利要求8所述的宿主细胞在制备预防或治疗由甲型流感病毒引起的病毒感染的药物中的用途。