KR20230055967A - 목적단백질 제조를 위한 대장균 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 목적 단백질 발현을 위한 대장균 배양 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 목적단백질 제조를 위한 대장균의 배양방법에 관한 것이다.
2019년 중국 우한에서 발생한 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)는 2019년 후반기에 처음으로 인체 감염이 확인되었다는 의미에서 COVID-19로 명명되었으며, 사람이나 동물에게 호흡기 질환을 일으키는 바이러스로 감염되면 2~3일에서 최장 2주 정도 잠복기를 거쳤다가 다양한 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 주 증상으로는 무기력감, 37.5도 이상의 고열, 기침, 인후통, 가래, 근육통, 두통, 호흡곤란 및 폐렴 등의 증상이 발생하며, 폐 손상에 의한 호흡부전 등이 있으며, 심하면 사망에 이를 수 있다. 유사 질환으로는 메르스와 사스가 있으며, 메르스나 사스보다 치사율은 낮지만, 전염력이 훨씬 높은 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 COVID-19 예방을 위한 효율적인 백신 제조와, 백신용 항원 단백질의 생산을 위한 의료산업계의 요구가 증가되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 코로나바이러스 백신에 사용되는 단백질의 제조방법을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
(특허문헌 1) US 2021-0338807 A1
본 발명의 목적은 목적단백질 제조를 위한 대장균의 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 목적 단백질의 제조방법이다.
하나의 구체예에서, 상기 제조방법은 대장균 배양을 통한 목적 단백질의 제조방법이다.
앞선 구체예에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 균체 성장기(Growth phase)에 글리세롤을 포함하는 주입배지를 부가하면서 대장균을 유가식으로 배양하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 주입배지에 포함된 글리세롤 함량은 2% (v/v) 초과이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 주입배지에 포함된 글리세롤 함량은 2% (v/v) 초과 40% (v/v) 이하이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 주입배지에 포함된 글리세롤 함량은 2% (v/v) 초과 40% (v/v) 미만이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 유도기 (induction phase) 에 발현 유도물질을 부가하여 대장균을 배양하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 (i) 균체 성장기(Growth phase)에 글리세롤을 포함하는 주입배지를 부가하면서 대장균을 유가식으로 배양하는 단계; 및 (ii) 유도기 (induction phase) 에 발현 유도물질을 부가하여 대장균을 배양하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 발현 유도물질은 IPTG이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 주입배지는 25 내지 75 mL/h 의 유속으로 첨가된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 주입배지는 30 내지 70 mL/h 의 유속으로 첨가된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 주입배지는 12시간 내지 48시간 동안 투입된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 주입배지는 18시간 이상 24시간 이하 동안 투입된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 주입배지는 배양액의 흡광도(OD600)가 1 이상인 시점에서 주입된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 주입배지는 효모 추출물을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 목적 단백질은 서열번호 1 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 갖는 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 대장균은 서열번호 1 또는 이와 75% 이상 동일성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산서열; 또는 이를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 발현 벡터는 lac 오페론을 포함하는 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 발현벡터는 도 1에 표시된 개열지도를 가지는 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 배양 단계는 종배양(seed fermentation) 단계 이후 수행되는 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 대장균은 BL21 균주이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 발현 유도물질은 0 초과 2.0mM 이하의 농도로 첨가된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 발현 유도물질의 부가는 대장균의 성장이 대수기 후반에 진입했을 때 이루어진다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 발현 유도물질의 부가는 대장균의 배양액의 흡광도(OD600) 값이 20 내지 40일 때 이루어진다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 발현 유도물질을 부가하고 1시간 내지 30시간 동안 배양하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 서열번호 1의 목적 단백질을 발현하는 대장균을 배양하는 단계를 포함하고, (i) 균체 성장기(Growth phase)에 글리세롤을 2% (v/v) 초과 40% (v/v) 이하의 함량으로 포함하는 주입배지를 25 mL 내지 75 mL/h의 유속으로 부가하면서 대장균을 유가식으로 배양하는 단계; 및 (ii) 유도기 (induction phase) 에 IPTG를 0 초과 2.0mM 이하의 함량이 되도록 부가하여 대장균을 배양하는 단계를 포함한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본원에서, 용어 "및/또는"은 본원에 사용되는 경우에 2가지의 명시된 특색 또는 구성요소 각각을 다른 하나와 함께 또는 다른 하나 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포괄하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서, 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 본 발명에서 청구하는 대상의 특징이 불특정 성분의 존재에 실질적으로 영향을 받지 않는 경우, 상기 불특정 성분이 존재할 수 있음을 의미한다.
본원에서, 용어 "이루어지는(consisting of)"은 특정 성분(들)의 비율이 총 100%인 것을 의미한다. 용어 "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있다. 일부 구체예에서, "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징 외에, 다른 임의의 성분 또는 필수적이지 않은 성분은 배제될 수 있다.
본원에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 용어 이하에 기재되는 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재를 의미하며, 하나 이상의 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 본원에서 "포함하는" 이하에 기재되는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있으나, 일부 구체예에서는 다른 임의의 혹은 필수적이지 않은 성분 또는 특징을 더 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "포함하는" 은, 일부 구체예에서, "본질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"을 지칭하는 것으로 수정될 수 있다.
본원에서 아미노산 서열과 관련하여, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "포함하는" 폴리펩티드, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 "이루어진" 폴리펩티드, 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "갖는" 폴리펩티드 또는 단백질이라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 하나의 양태는 목적 단백질을 발현하는 대장균을, (ⅰ) 균체 성장기(Growth phase)에 글리세롤을 포함하는 주입배지를 부가하면서 유가식으로 배양하는 단계; 및 (ⅱ) 유도기 (induction phase) 에 발현 유도물질을 부가하여 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 "목적 단백질"은 면역원성 조성물의 제조에 사용되는, 항원 또는 항원 단편을 표시하는 다량체성 단백질 조립체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 상기 목적 단백질은 WO2019-169120, US 9630994 B2에 개시된 단백질일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 목적 단백질은 서열번호 1로 표시되는 단백질일 수 있으나, 이와 동일한 기능을 가지는 것은 제한없이 포함한다.
일 구현예로, 본 발명의 단백질은 다량체 혹은 다량체성 단백질 조립체로의 조립을 교란시키지 않는 임의의 변형을 포함할 수 있으며, 예를 들어 아미노산의 추가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형을 포함할 수 있다. 그 예로 보존적 서열 변형을 포함하는 경우를 들 수 있다.
본 발명에서, "보존적 서열 변형"은 목적 단백질의 구조적 특성에 유의하게 영향을 끼치거나 변화시키지 않는 아미노산 변형을 의미할 수 있다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 이러한 치환은 일반적으로 소수성도, 친수성도, 전하, 크기 등과 같은 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성에 기초한 것이다. 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 기술 분야에서 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트 산, 글루타민 산), 비대전 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향성 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
일 구현예로, 본 발명의 목적 단백질은 서열번호 1 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 목적 단백질은 서열번호 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 이루어지거나(consisting essentially of) 또는 이루어진 것일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 목적 단백질은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 식별된 계면(interface) 위치에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 목적 단백질에 있어서, 조립되어 나노 구조를 형성하도록 하는 계면에 존재하는 것으로 식별된 계면 잔기는, 서열번호 1의 N-말단으로부터 24, 28, 36, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 135, 및 139일 수 있다. 본원에서 서열번호 1의 단백질은 "Component B"로 지칭할 수 있다. 복수 개의 단리된 서열번호 1의 단백질 단량체는 상호작용을 통해 자가-조립(self-assembly)되어 오량체(pentamer)를 형성할 수 있다. 이러한 조립은 비공유성 단백질-단백질 상호작용 반응을 통해 이루어질 수 있다.
이와 같은 Component B는 다른 단백질과 자가조립되어 면역원성 조성물을 형성할 수 있으며, 본원의 목적상 코로나바이러스에 대한 백신의 일 구성요소일 수 있다. 이와 같은 백신을 대량 생산하기 위한 원료 의약품으로서 Component B를 고순도 및/또는 다량 생산 및/또는 정제가 필요하며, 본 발명은 상기 Component B를 고수율로 생산할 수 있는 제조방법을 제공한다.
일 구현예로, 상기 대장균은 예를 들어 E.coli BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α 또는 W3110 균주일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 대장균은 E.coli BL21 균주일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 대장균은 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 것일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명에서 제공하는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명에서 제공하는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질의 발현을 가능하게 하는 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 발현 벡터에 따라, 벡터로 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 전 폴리뉴클레오티드를 조작하는 것이 필요할 수 있다. 그와 같은 조작은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "발현"은 폴리펩티드의 생성에 관여하는 임의의 단계, 예를 들어 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pET28, pET29, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 발현 벡터는 lac 오페론을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서, "오페론"은 하나의 발현 조절 서열에 의해 발현이 조절되는 유전자군을 포함하는 DNA의 기능적 단위이며, lac 오페론은 락토오스(lactose) 또는 이의 유사체의 존재하에 전사가 이루어지는 오페론을 지칭한다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 발현 벡터 내의 lac 작동유전자(operator)는 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명에서 "작동 가능하게 연결된"이란 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 조절 서열이 적절한 위치에 배치되는 구성을 의미한다. 따라서 본 발명의 본 발명의 발현 벡터 내의 lac 작동유전자(operator)와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 경우 락토오스 또는 이의 유사체의 존재하에 본 발명의 단백질 발현이 유도될 수 있다.
일 예로, 상기 발현벡터는 항생제 저항성 유전자, Lac 오페론(Operon) 및 T7 프로모터(Promoter) 영역, 다중클로닝부위 (Multiple cloning site) 를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 발현벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 유가식 배양(fed-batch culutre) 이란 배양의 진행과 동시에 영양배지를 발효조에 서서히 첨가하면서 배양종료까지 발효조에서 배양액을 뽑지 않는 배양방법을 의미한다. 유가식 배양은 특정 물질의 첨가속도를 미생물에 의한 소비속도와 비례하게 함으로써 배양 중 그 성분의 농도를 임의의 설정값으로 제어할 수가 있다는 장점이 있어, 기질저해, 생성물저해, 증식저해를 일으키는 배양연구에 사용되거나 빵효모, 아미노산, 항생물질 등의 발효산업에 사용된다. 본 발명의 목적상 상기 유가식 배양은 일정수준으로 증식된 대장균으로부터 목적하는 재조합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 목적 단백질인 Component B의 경우 대량 생산을 위한 최적의 공정 필요성이 대두되고 있는바, 놀랍게도 기존 회분 배양에 비해 본 배양 시 특정 조건의 글리세롤을 포함하는 배지를 이용한 유가식 배양이 목적단백질을 발현하는 대장균을 보다 대량으로 생산할 수 있는 새로운 배양 방법을 개발하여 이를 제공한다.
일 구현예로, 상기 제조방법의 (ⅰ) 균체 성장기(Growth phase)에 글리세롤을 포함하는 주입배지를 부가하면서 대장균을 유가식으로 배양하는 단계에서, 주입배지에 포함된 글리세롤 함량은 2% (v/v) 를 초과한다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 글리세롤 함량은 2% (v/v) 초과 40% (v/v) 이하이다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 글리세롤 함량은 2% (v/v) 초과 40% (v/v) 미만이다. 그 예로, 상기 글리세롤 함량은 약 2% (v/v) 초과 35% (v/v) 이하, 2% (v/v) 초과 30%(v/v) 이하, 2% (v/v) 초과 25% (v/v) 이하, 5% (v/v) 이상 25% (v/v) 이하, 10% (v/v) 이상 25% (v/v) 이하, 15% (v/v) 이상 25% (v/v) 이하, 또는 약 20% (v/v) 일 수 있다.
글리세롤이 2% 초과 함량으로 주입배지에 포함된 경우, 글리세롤을 2% 이하의 함량으로 포함하는 배지에 비해 세포 성장이 증가하고 단백질 발현량 역시 증가하여 목적 단백질을 대량 생산할 수 있다.
일 예로 글리세롤이 2% 초과, 40% 미만의 함량으로 주입배지에 포함된 경우, 글리세롤을 2% 이하 또는 40% 이상의 함량으로 포함하는 배지에 비해 세포 성장이 증가하고 단백질 발현량 역시 증가하여 목적 단백질을 대량 생산할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 주입배지는 약 25 내지 75 mL/h 의 유속으로 첨가될 수 있다. 그 예로, 상기 주입배지는 약 25 내지 70 mL/h, 약 25 내지 65 mL/h, 약 25 내지 60 mL/h, 약 25 내지 55 mL/h, 약 30 내지 70 mL/h, 약 30 내지 65 mL/h, 약 30 내지 60 mL/h, 약 30 내지 55 mL/h, 약 35 내지 70 mL/h, 약 35 내지 65 mL/h, 약 35 내지 60 mL/h, 약 35 내지 55 mL/h, 약 40 내지 70 mL/h, 약 40 내지 65 mL/h, 약 40 내지 60 mL/h, 약 40 내지 55 mL/h, 약 45 내지 70 mL/h, 약 45 내지 65 mL/h, 약 45 내지 60 mL/h, 약 45 내지 55 mL/h 또는 약 50 mL/h의 유속으로 첨가될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 주입배지는 질소원을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 주입배지는 제품명 Soytone, APS, 효모 추출물 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 예로 상기 주입배지는 효모 추출물을 질소원으로서 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 주입배지는 약 12시간 내지 48시간 동안 투입되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 주입배지는 약 12시간 내지 36시간, 약 16시간 내지 32시간, 약 24시간 또는 약 23시간 동안 투입되는 것일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 주입배지는 배양액의 흡광도(OD600)가 약 1 이상인 시점에서 주입이 시작되는 것일 수 있다.
OD600이란 600㎚ 파장에서의 광학 밀도를 말하며, 균주의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 일 예로 E. coli의 경우 OD600에서 흡광도 1.0이 약 1X109CFU/mL로 환산되므로 OD600 값을 측정하여 균주의 절대량을 확인할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 목적 단백질을 제조하는 방법은 상기 균주를 글리세롤을 포함하는 배지에서 배양하는 단계 이후 배지에 발현 유도물질을 첨가하여 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 발현 유도물질은 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)일 수 있다. IPTG는 락토오스와 유사한 구조를 가지며, lac 오페론의 유도자로 작용하여 오페론의 전사를 유발할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 발현 유도물질의 첨가는 대장균의 성장이 대수기 후반에 진입했을 때 이루어질 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 발현 유도물질의 첨가는 균주의 배양액의 흡광도(OD600) 값이 약 20 내지 40이 되는 시점 혹은 그 전후에 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 균주의 배양액의 흡광도(OD600) 값이 약 20 내지 40이 되는 시점에서 대장균의 성장이 대수기 후반에 진입한 것으로 판단할 수 있다.
상기 발현 유도물질은 미생물에 의해 분해되거나 사용되지 않는 것일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 발현 유도물질의 배지 내 함량은 0mM 초과이면서 약 5.0mM 이하, 구체적으로 4.5mM 이하, 4.0mM 이하, 3.9mM 이하, 3.8mM 이하, 3.7mM 이하, 3.6mM 이하, 3.5mM 이하, 3.0mM 이하, 2.9mM 이하, 2.8mM 이하, 2.7mM 이하, 2.6mM 이하, 2.5mM 이하, 2.4mM 이하, 2.3mM 이하, 2.2mM 이하, 2.1 mM 이하, 또는 2.0mM 이하일 수 있다. 그 예로, 약 1.9mM 이하, 1.8mM 이하, 1.7mM 이하, 1.6mM 이하, 1.5mM 이하, 1.4mM 이하, 1.3mM 이하, 1.2mM 이하, 1.1mM 이하, 1.0mM 이하일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 발현 유도물질을 주입한 후 미생물을 배양하는 시간은 약 1시간 내지 30시간일 수 있고, 그 예로, 약 2시간 내지 25시간, 2시간 내지 20시간, 2시간 내지 16시간, 2시간 내지 15시간, 3시간 내지 25시간, 3시간 내지 20시간, 3시간 내지 16시간, 3시간 내지 15시간, 4시간 내지 25시간, 4시간 내지 20시간, 4시간 내지 16시간, 5시간 내지 25시간, 5시간 내지 20시간, 5시간 내지 16시간, 5시간 내지 15시간, 4시간 내지 15시간, 4시간 내지 14시간, 4시간 내지 13시간, 4시간 내지 12시간, 4시간 내지 11시간, 4시간 내지 10시간, 4시간 내지 9시간, 또는 4시간 내지 8시간일 수 있다. 일 예로, 상기 발현 유도물질을 주입한 후 미생물을 배양하는 시간은 약 6시간일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 목적 단백질은 균주로부터 회수될 수 있다.
상기 회수 방법은 상기 균주를 파쇄하는 단계를 포함할 수 있다.
세포의 파쇄(lysis) 방법은 알칼리, 계면활성제, 유기 용매 또는 효소 (라이소자임 등)의 사용, 초음파처리(sonication) 또는 고압분쇄기(French Press)의 사용, 주기적인 고온, 압력, 냉동 또는 해동 사이클을 적용하여 수행될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 균주를 파쇄하는 단계 이후 뉴클레아제(nuclease)를 처리할 수 있다. 상기 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제일 수 있고, 그 예로 벤조네이즈(Benzonasae: Serratia marcescens endonuclease), 옴니클레이브(Omnicleave) (Epicentre) 또는 DNase I를 이용할 수 있다.전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 목적 단백질은 봉입체(inclusion body) 형태로 회수될 수 있다. 봉입체 형태의 상태를 풀고, 정상 단백질 형태로 되돌리는 것이 단백질 가용화 및 재접힘이다. 상기 봉입체 형태로 회수된 목적 단백질을 정상 단백질 형태로 되돌리기 위해 가용화 버퍼가 사용될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 목적 단백질은 코로나-19 백신용 항원 단백질일 수 있다.
본 발명의 목적 단백질인 Component B가 포함되는 다량체성 단백질 조립체는 "나노 구조(체)"로도 지칭할 수 있다. 상기 다량체성 단백질 조립체는 SARS-CoV-2 Spike 단백질의 면역원성을 나타내는 단편을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "면역원성" 이란 특이적인 단백질, 또는 상기 특이적인 단백질과 높은 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대해 면역 반응을 유발하는 상기 특이적인 단백질 또는 이의 특이적인 영역의 능력을 지칭한다. 다량체성 단백질 조립체는 본 발명의 목적 단백질의 오량체를 12개 포함하는 구조를 가질 수 있다. 따라서 상기 다량체성 단백질 조립체는 Component B의 60개 카피를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적 단백질을 포함하는 다량체성 단백질 조립체는 면역원성 조성물의 성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 방법을 통해 고수율로 목적하는 단백질을 수득할 수 있다.
도 1은 목적 단백질(Component B)의 발현 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 2는 배양 배지의 글리세롤 첨가량에 따른 균주 생장 수준을 확인한 것이다.
도 3은 IPTG 첨가량에 따른 발현량 차이를 확인한 것이다.
도 4는 유도기 (induction phase) 돌입 시 세포 성장 정도 (및 유도기 지속 시간에 따른 목적 단백질의 상대적 발현량을 시험계획법에 따라 측정하여 나타낸 것이다. 대수기 초반, 대수기 중반, 대수기 후반을 각각 -1, 0, 1로 표시하였다.
도 5는 유가식 배양에서 성장기 (Growth phase)의 주입배지에 포함된 글리세롤 함량을 변경하며 배양하여 균주 생장 수준을 흡광도(OD600)측정을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 유가식 배양에서 성장기 (Growth phase)의 주입배지에 포함된 질소원 APS의 함량을 변경하며 배양하여 균주 생장 수준을 흡광도(OD600)측정을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 유가식 배양에서 성장기 (Growth phase)의 주입배지에 포함된 질소원의 종류를 변경하며 배양하여 균주 생장 수준을 흡광도(OD600)측정을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 배양 배지의 글리세롤 첨가량에 따른 균주 생장 수준을 확인한 것이다.
도 3은 IPTG 첨가량에 따른 발현량 차이를 확인한 것이다.
도 4는 유도기 (induction phase) 돌입 시 세포 성장 정도 (및 유도기 지속 시간에 따른 목적 단백질의 상대적 발현량을 시험계획법에 따라 측정하여 나타낸 것이다. 대수기 초반, 대수기 중반, 대수기 후반을 각각 -1, 0, 1로 표시하였다.
도 5는 유가식 배양에서 성장기 (Growth phase)의 주입배지에 포함된 글리세롤 함량을 변경하며 배양하여 균주 생장 수준을 흡광도(OD600)측정을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 유가식 배양에서 성장기 (Growth phase)의 주입배지에 포함된 질소원 APS의 함량을 변경하며 배양하여 균주 생장 수준을 흡광도(OD600)측정을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 유가식 배양에서 성장기 (Growth phase)의 주입배지에 포함된 질소원의 종류를 변경하며 배양하여 균주 생장 수준을 흡광도(OD600)측정을 통해 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. Component B 발현 숙주세포의 제조
Thermofisher사에서 분양된 BL21 competent 세포에 Component B 단백질 발현 유전자가 도입된 벡터로 균주를 형질전환하였다.
Component B 단백질 발현 유전자가 도입된 vector(Genscript)는 Institute for Protein Design at the University of Washington (IPD)에서 SK바이오사이언스로 이관되어 대장균 연구용 세포주 제조에 사용되었다. 유전자의 도입을 위한 벡터는 pET29b+를 사용하였다.
제조된 플라스미드를 대장균 BL21주에 형질전환하고 카나마이신(Kanamycin) 내성을 갖는 대장균 균주를 선별하고, 선별된 대장균 BL21주를 효모추출물을 포함한 대두기반 배지에 접종하여 37℃에서 200 rpm으로 흡광도가 1.8 이상이 될 때까지 진탕 배양하였다. 배양이 완료되면 멸균된 글리세롤을 최종농도가 25%가 되도록 첨가하여 연구용 세포은행을 구축하였다.
실험예 1. 숙주세포 배양
실험예 1-1. 종배양(Seed Fermentation)
제조예 1에서 제조한 대장균(E. coli) 제조용 세포은행 1 바이알을 실온에서 녹인 후 효모추출물을 포함한 대두기반배지 500 mL이 들어있는 1 L 플라스크에 최종 농도가 30 ㎍/mL 이 되도록 카나마이신 용액을 첨가하고 제조용 균주 0.15 mL을 접종하여 종배양액을 제조하였다. 이 때 종배양 조건은 37℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하여 최종 흡광도가 1.5 가 초과되도록 8시간 이상 배양하였다.
실험예 1-2. 본배양
효모추출물을 포함한 대두기반배지 50 L가 들어있는 75 L 발효조에 최종 농도가 30 ug/mL 이 되도록 카나마이신을 첨가하고 종배양액 전량을 접종한 뒤 흡광도가 25가 될 때까지 37℃에서 200 rpm으로 배양하였다(Growth phase). 흡광도가 25가 되면 발효기 설정을 배양온도 18℃, 교반 속도 150 rpm으로 변경하고, IPTG를 최종 농도가 0.5mM이 되도록 첨가하고 10 시간 배양(Induction phase)한 후 본배양을 종료하였다.
한편, Growth phase의 배지 조성 및 Induction phase의 온도, IPTG 첨가량 및 배양시간 조건을 변경하면서 최적의 배양 조건을 탐색하였다.
실험예 2. 숙주세포 배양 조건의 최적화
실험예 2-1. Growth phase 배지의 글리세롤 함량 최적화
Growth phase에서 배지에 글리세롤을 첨가하여 균주의 생장 및 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
글리세롤 0% (미 첨가), 2% 및 4% (v/v) 농도로 첨가하여, 농도에 따른 세포 성장을 도 2 및 표 1에 나타냈으며, 회수 후 세포 무게를 확인하였다. 실험결과 글리세롤 추가 시 최대 세포 성장이 개선되는 것을 확인하였다.
또한, 시험 계획법 (Design of experiment, DoE)에 따라 글리세롤 농도가 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하였으며, 표 1에 나타내었다.
실험결과 글리세롤 2% 첨가 시 단백질 발현 량이 최대치를 보였으며, 글리세롤 미 첨가 군 대비 약 25% 발현량 증대를 확인하였다.
| 분류 | 글리세롤 농도 (%) | 최대 세포 성장 (OD600) |
| 시험 군 1 | 0 | 23 |
| 시험 군 2 | 2 | 56 |
| 시험 군 3 | 4 | 50 |
실험예 2-2. Induction phase 조건 최적화
Induction phase에서 IPTG 첨가량(0, 0.5mM, 1mM, 2mM: 도 3) 을 조절하며 최적의 조건을 확인하였다.
| 시료 정보 |
Relative
Expression (%) |
Main fermentation Result | ||
| Time (h) | Harvest OD | |||
| IPTG 농도 | 0mM | 100.0 | 18.5 | 53 |
| 0.5mM | 104.6 | 18.5 | 51 | |
| 1mM | 107.7 | 18.5 | 50 | |
| 2mM | 104.8 | 18.5 | 50 | |
실험 결과 IPTG 첨가군 모두 단백질 발현이 증가하였으며, 특히 0.5mM 내지 1mM 첨가 시 최적의 발현 조건임을 확인하였다(도 3).
또한, 시험계획법에 따라 유도기 (induction phase) 돌입 시 세포 성장 정도 (대수기 초반, 대수기 중반, 대수기 후반, 도 4에서는 각 -1, 0, 1로 표기 됨) 및 유도기 지속 시간에 따른 목적 단백질의 상대적 발현 량을 도 4에 나타내었다.
시험결과, 대수기 후반 유도기에 진입하는 것이 대수기 초반 유도기 진입보다 약 25%의 목적 단백질 증가를 확인할 수 있었다. 유도기 지속시간의 경우, 10시간의 유도기가 최대의 목적 단백질 발현을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1. 배양 공정의 추가 개선
앞서 실험예에서 도출한 회분 배양(batch culture)의 최적 조건에 따르면 OD 45.7, 단백질 발현량 (protein expression) 5.5mg/mL 으로 단백질 생산이 최적화됨을 확인하였다. 단백질 수율을 추가로 개선하고자 대장균의 본배양 단계에서 유가식 배양(fed-batch culture)을 적용하였다. 회분 배양과 유가 배양에서 변경한 파라미터를 하기 표에 나타내었다.
| Process | Unit process | Parameter | Batch culture | Fed-batch |
|
본배양
(Main fermentation) |
성장기
(Growth phase) |
Scale (L) | 5 | 5 |
| 접종량 Inoculation ratio (v/v, %) |
0.4 | 0.4 | ||
| 회전수 Agitation (rpm) |
1000 | 1000 | ||
| 온도 Temperature (℃) |
37 | 37 | ||
| 용존산소 Dissolved oxygen (%) |
10 | 10 | ||
| 기체 분사 속도 Air flow (VVM) |
1 | 1 | ||
| 발효 시간 Fermentation time (h) |
Until 11.5 | Until 23 (18~24) |
||
| 주입 배지의 조성Composition of Feed media | N/A | 10X yeast extract + 20% (v/v) glycerol | ||
| 주입 시기Feeding timing | N/A | OD ≥ 1 | ||
| 주입 속도Feeding rate | N/A | 50 mL/h | ||
|
유도기
(Induction phase) |
온도 Temperature (℃) |
18 | 18 | |
| 회전수 Agitation (rpm) |
500 | 500 | ||
| 기체 분사 속도Air flow (VVM) | 0.5 | 0.5 | ||
| IPTG (mM) | 0.5 | 0.5 | ||
| 유도 시간Induction time (h) | Until 10 | Until 6 (4~8) |
상기 표에 기재된 배양 조건은 주입 배지 조성을 최적화한 조건으로, 이하 실험에서는 상기 표에 기재된 배양 조건에서 글리세롤의 농도, 및 질소 공급원의 함량 및 종류만을 변경하여 실험하였다.
실시예 1-1. 성장기 주입 배지의 글리세롤 함량 최적화 실험
주입 배지의 글리세롤 함량을 2% (v/v) 및 20% (v/v)로 변경하여 배양하면서 흡광도(OD600)를 측정하였다. 결과를 하기 표 및 도 5에 나타내었다.
| No. | 항목 | Feed media 조성 | 배양 결과 |
| 1 | Control (Batch culture) |
N/A | 49 |
| 2 | 2% Glycerol | 1X APS + 2% glycerol | 51 |
| 3 | 20% Glycerol | 1X APS + 20% glycerol | 58 |
실험 결과 글리세롤 함량의 증가에 따라 흡광도가 개선되는 것을 확인하였다.
실시예 1-2. 성장기 주입 배지의 질소원 함량 최적화 실험
주입 배지에 포함되는 질소원의 함량을 다음과 같이 변경하며 흡광도(OD600)를 측정하였다. 질소원으로는 BD사의 Alternative Protein Source (APS)를 사용하였고 결과를 하기 표 및 도 6에 나타내었다.
| No. | 항목 | Feed media 조성 | 배양 결과 |
| 1 | 1X APS | 1X APS + 20% glycerol | 58 |
| 2 | 3X APS | 3X APS + 20% glycerol | 78 |
| 3 | 5X APS | 5X APS + 20% glycerol | 108 |
실험 결과 질소원 함량 증가에 따라 흡광도가 개선되는 것을 확인하였다.
실시예 1-3. 성장기 주입 배지의 질소원 종류 최적화 실험
주입 배지에 포함되는 질소원의 종류를 다음과 같이 변경하며 흡광도(OD600)를 측정하였다. 하기 표 및 도 7에 결과를 나타내었다.
| No. | 항목 | Feed media 구성 | 배양 결과 |
| 1 | 5X APS | 5X APS + 20% glycerol | 96 |
| 2 | 10X soytone | 10X soytone + 20% glycerol | 64 |
| 3 | 10X yeast extract | 10X yeast extract + 20% glycerol | 112 |
실험 결과 효모 추출물을 사용하는 경우 흡광도가 개선되는 것을 확인하였다. 이로부터 성장기 주입 배지의 최적 조성은 질소원으로 효모 추출물을 사용하고 글리세롤을 20% 포함하는 구성임을 도출하였으며, 이 때의 단백질 발현량은 14.2mg/mL 로 기존 회분 배양 공정에서의 5.5mg/mL 발현량과 비교하여 2배 이상 크게 개선되는 것을 확인하였다.
실시예 1-4. 글리세롤 함량 추가 최적화 실험
실시예 1-1 및 실시예 1-3 의 결과를 종합하여, 주입 배지의 글리세롤 최적 함량 확인을 위한 실험을 수행하였다. 질소원을 실시예 1-3 에서 최적 효과를 확인한 10X yeast extract로 고정하고 글리세롤 함량을 변경하며 흡광도(OD600)를 측정하였다. 하기 표 8에 결과를 나타내었다.
| No. | 항목 | Feed media 구성 | 배양 결과 |
| 1 | 10% (v/v) Glycerol | 10X yeast extract + 10% glycerol | 94 |
| 2 | 20% (v/v) Glycerol | 10X yeast extract + 20% glycerol | 122 |
| 3 | 40% (v/v) Glycerol | 10X yeast extract + 40% glycerol | 104 |
실험 결과 글리세롤 함량이 40%를 넘는 경우에는 OD600값이 하락하는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
| # | ||
| 1 | Component B AA | MNQHSHKDHETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAMRDIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVNGGIYRHEFVASAVINGMMNVQLNTGVPVLSAVLTPHNYDKSKAHTLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAREKIAA |
| 2 | Component B nt | ATGAACCAGCACAGTCACAAGGACCACGAAACGGTAAGAATAGCGGTAGTGCGTGCGCGTTGGCATGCGGAAATTGTGGACGCCTGTGTGAGTGCGTTTGAAGCCGCGATGCGTGATATTGGCGGCGATCGTTTTGCCGTGGATGTGTTTGATGTGCCGGGTGCGTACGAAATTCCACTGCATGCGCGTACCCTGGCGGAAACCGGCCGTTATGGCGCGGTGTTAGGCACCGCCTTTGTGGTGAATGGTGGCATTTATCGTCACGAATTTGTGGCGAGCGCGGTTATTAACGGCATGATGAATGTGCAGCTGAACACGGGCGTGCCAGTGTTAAGTGCCGTGCTGACCCCACACAACTATGATAAAAGCAAAGCCCATACCCTGCTGTTCTTAGCGCTGTTTGCGGTGAAAGGCATGGAAGCGGCGCGTGCCTGCGTGGAGATTTTAGCGGCCCGTGAAAAGATTGCGGCGTGA |
| 3 | plasmid | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaccagcacagtcacaaggaccacgaaacggtaagaatagcggtagtgcgtgcgcgttggcatgcggaaattgtggacgcctgtgtgagtgcgtttgaagccgcgatgcgtgatattggcggcgatcgttttgccgtggatgtgtttgatgtgccgggtgcgtacgaaattccactgcatgcgcgtaccctggcggaaaccggccgttatggcgcggtgttaggcaccgcctttgtggtgaatggtggcatttatcgtcacgaatttgtggcgagcgcggttattaacggcatgatgaatgtgcagctgaacacgggcgtgccagtgttaagtgccgtgctgaccccacacaactatgataaaagcaaagcccataccctgctgttcttagcgctgtttgcggtgaaaggcatggaagcggcgcgtgcctgcgtggagattttagcggcccgtgaaaagattgcggcgtgactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat |
| 4 | synthetically constructed nanostructure polypeptide | MNQHSHKDYE TVRIAVVRAR WHADIVDACV EAFEIAMAAI GGDRFAVDVF DVPGAYEIPL 60 HARTLAETGR YGAVLGTAFV VNGGIYRHEF VASAVIDGMM NVQLSTGVPV LSAVLTPHRY 120 RDSAEHHRFF AAHFAVKGVE AARACIEILA AREKIAA |
| 5 | MNQHSHKDYE TVRIAVVRAR WHAEIVDACV SAFEAAMADI GGDRFAVDVF DVPGAYEIPL 60HARTLAETGR YGAVLGTAFV VNGGIYRHEF VASAVIDGMM NVQLSTGVPV LSAVLTPHRY 120 RDSDAHTLLF LALFAVKGME AARACVEILA AREKIAA |
|
| 6 | MNQHSHKDYE TVRIAVVRAR WHADIVDQCV RAFEEAMADA GGDRFAVDVF DVPGAYEIPL 60HARTLAETGR YGAVLGTAFV VNGGIYRHEF VASAVIDGMM NVQLSTGVPV LSAVLTPHRY 120 RSSREHHEFF REHFMVKGVE AAAACITILA AREKIAA |
|
| 7 | MNQHSHKDHE TVRIAVVRAR WHADIVDACV EAFEIAMAAI GGDRFAVDVF DVPGAYEIPL 60HARTLAETGR YGAVLGTAFV VNGGIYRHEF VASAVIDGMM NVQLDTGVPV LSAVLTPHRY 120 RDSDEHHRFF AAHFAVKGVE AARACIEILN AREKIAA |
|
| 8 | MNQHSHKDHE TVRIAVVRAR WHADIVDACV EAFEIAMAAI GGDRFAVDVF DVPGAYEIPL 60HARTLAETGR YGAVLGTAFV VDGGIYDHEF VASAVIDGMM NVQLDTGVPV LSAVLTPHEY 120 EDSDEDHEFF AAHFAVKGVE AARACIEILN AREKIAA |
|
| 9 | MNQHSHKDHE TVRIAVVRAR WHAEIVDACV SAFEAAMRDI GGDRFAVDVF DVPGAYEIPL 60HARTLAETGR YGAVLGTAFV VNGGIYRHEF VASAVIDGMM NVQLDTGVPV LSAVLTPHRY 120 RDSDAHTLLF LALFAVKGME AARACVEILA AREKIAA |
|
| 10 | MNQHSHKDHE TVRIAVVRAR WHAEIVDACV SAFEAAMRDI GGDRFAVDVF DVPGAYEIPL 60HARTLAETGR YGAVLGTAFV VDGGIYDHEF VASAVIDGMM NVQLDTGVPV LSAVLTPHEY 120 EDSDADTLLF LALFAVKGME AARACVEILA AREKIAA |
|
| 11 | MNQHSHKDXE TVRIAVVRAR WHADIVDACV EAFEIAMAAI GGDRFAVDVF DVPGAYEIPL 60HARTLAETGR YGAVLGTAFV VXGGIYXHEF VASAVIDGMM NVQLXTGVPV LSAVLTPHXY 120 XDSXEXHXFF AAHFAVKGVE AARACIEILX AREKIAA |
Claims (16)
- 서열번호 1 또는 이와 75% 이상 동일성을 가지는 목적 단백질을 발현하는 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법으로, 상기 제조방법은
(ⅰ) 균체 성장기(Growth phase)에 글리세롤을 포함하는 주입배지를 부가하면서 대장균을 유가식으로 배양하는 단계; 및
(ⅱ) 유도기 (induction phase) 에 발현 유도물질을 부가하여 대장균을 배양하는 단계를 포함하고,
상기 주입배지에 포함된 글리세롤 함량은 2% (v/v) 초과인 것인,
목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 주입배지에 포함된 글리세롤 함량은 2% (v/v) 초과 40% (v/v) 이하인 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 주입배지는 25 내지 75 mL/h 의 유속으로 첨가되는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 주입배지는 30 내지 70 mL/h 의 유속으로 첨가되는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 주입배지는 효모 추출물을 포함하는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 주입배지는 12시간 내지 48시간 동안 투입되는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 주입배지는 18시간 이상 24시간 이하 동안 투입되는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 주입배지는 배양액의 흡광도(OD600)가 1 이상인 시점에서 주입되는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대장균은 서열번호 1 또는 이와 75% 이상 동일성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산서열; 또는 이를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 발현벡터는 lac 오페론을 포함하는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 1에 표시된 개열지도를 가지는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (i) 및 (ii)의 배양 단계는 종배양(seed fermentation) 단계 이후 수행되는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대장균은 BL21 균주인, 목적 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (ii)의 발현 유도물질의 부가는 대장균의 성장이 대수기 후반에 진입했을 때 이루어지는 것인, 목적 단백질의 제조방법.
- 서열번호 1의 목적 단백질을 발현하는 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법으로, 상기 제조방법은
(ⅰ) 균체 성장기(Growth phase)에 글리세롤을 2% (v/v) 초과 40% (v/v)이하의 함량으로 포함하는 주입배지를 25 mL 내지 75 mL/h의 유속으로 부가하면서 대장균을 유가식으로 배양하는 단계; 및
(ⅱ) 유도기 (induction phase) 에 IPTG를 0 초과 2.0mM 이하 함량이 되도록 부가하면서 대장균을 배양하는 단계를 포함하는,
목적 단백질의 제조방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 단백질은 코로나-19 백신용 항원 단백질인 것인, 제조방법.
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|---|---|---|---|---|
| US20210338807A1 (en) | 2020-06-03 | 2021-11-04 | Humane Genomics | Covid19 vaccines and related methods |
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2022
- 2022-10-14 KR KR1020220132698A patent/KR20230055967A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210338807A1 (en) | 2020-06-03 | 2021-11-04 | Humane Genomics | Covid19 vaccines and related methods |
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