KR101424079B1 - 재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법 - Google Patents

재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101424079B1
KR101424079B1 KR1020100105590A KR20100105590A KR101424079B1 KR 101424079 B1 KR101424079 B1 KR 101424079B1 KR 1020100105590 A KR1020100105590 A KR 1020100105590A KR 20100105590 A KR20100105590 A KR 20100105590A KR 101424079 B1 KR101424079 B1 KR 101424079B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
recombinant
gene
escherichia coli
present
ksi
Prior art date
Application number
KR1020100105590A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120044167A (ko
Inventor
김성렬
강석우
구태원
박승원
이광길
황재삼
윤은영
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020100105590A priority Critical patent/KR101424079B1/ko
Publication of KR20120044167A publication Critical patent/KR20120044167A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101424079B1 publication Critical patent/KR101424079B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/03—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing C=C bonds (5.3.3)
    • C12Y503/03001—Steroid DELTA-isomerase (5.3.3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법은 호랑나비(Papilio xuthus) 유충 유래의 파필리오신 유전자를 갖는 형질전환된 재조합 대장균을 제조하는 단계와, 상기의 형질전환체인 재조합 대장균을 배양한 후, 이를 불용성 재조합 융합단백질로 발현한 후 분리 및 정제하여 파필리오신을 생산하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명에 의해, 재조합된 파필리오신은 그람음성 세균 및 그람양성 세균 등의 각종 박테리아에 대하여 높은 항균활성을 나타내므로 천연 항생제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법{MASS-PRODUCTED METHOD OF PAPILIOCIN USING RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI}
본 발명은 호랑나비(Papilio xuthus) 유충으로부터 분리된 항균펩타이드 파필리오신(Papiliocin)을 재조합 대장균을 이용하여 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항균력을 갖는 파필리오신을 효과적으로 대장균에서 과발현하기에 적합한 재조합 발현벡터 및 이를 포함하는 형질 전환된 대장균으로부터 실제로 파필리오신을 대량생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
곤충에서 분리 동정된 항생 펩타이드에는 구조와 크기에 따라 크게 양이온성 선형 나선 구조를 가지는 세크로핀류, 시스테인 결합을 갖는 디펜신류, 플로린 및 글리신 아미노산을 많이 포함하고 있는 펩타이드로 나눌 수 있다.
특히, 세크로핀류는 31-39개의 아미노산으로 구성된 염기성 단백질로 N-말단의 양친매성 나선구조를 포함한 α-helix-hinge-α-helix 구조를 가지면 열에 안정하고 넓은 항균 활성을 나타낸다.
주요 곤충유래 항균 단백질로는 쉬파리과(Sarcophaga peregrina)에서 발견된 sacotoxin Ⅲ, 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서 발견된 diptericin, 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia)에서 발견된 holotricin 3, 갈색거저리(Tenebrio molitor)에서 발견된 tenecin 3, 장수풍뎅이(Allomirina dichotoma)에서 발견된 Defensin, Coleoptericin A and B, 담배나방아과(Heliothis virescens)에서 발견된 heliomicin, 남방장수풍뎅이(Oryctes rhinoceros)에서 발견된 Rhinocerosin, Scarabaecin, 매미아과(Cicada flammata)에서 발견된 cicadin, 큰우단하늘소(Acalolepta luxuriosa)로부터 발견된 Cecropin, 담배거세미나방(Spodoptera litura)으로부터 발견된 Moricin analogue 등이 밝혀져 있다.
이와 같이 곤충의 체액성 면역반응의 일환으로 분비되는 항균성 펩타이드는 기존의 항생제들과 다른 작용기전과 선택성으로 내성을 유발할 가능성이 낮아 천연 항생제로 인간의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종병원균에 의한 가축 및 농작물의 피해 방지 및 치료제 등으로 산업적 응용 가능성이 매우 높다.
파필리오신은 38개의 아미노산을 가지는 세크로핀계의 항균펩타이드로 면역이 유도된 호랑나비 유충에서 분리되었으며 성숙 아미노산 영역을 화학 합성한 펩타이드가 다양한 병원균에 항균활성이 우수하다는 것이 보고된 바 있다.
하지만 상기의 유기 화학적인 합성 방법으로 생산된 파필리오신은 제조 단가가 높아 상업적으로 이용이 불가능하다는 문제점이 있다.
이러한 점에서 파필리오신의 상용화를 위해서는 재조합 미생물을 이용한 저가의 대량생산 방법 개발이 매우 중요하다.
한편 항균성 펩타이드를 미생물에서 대량으로 발현시키고 생산하는 방법으로 항균펩타이드의 미생물에 대한 독성 중화를 위한 결합단백질을 이용한 생산 방법 및 산성 펩타이드를 이용한 중합체 제조 등이 보고된바 있다.
즉,구루타사이온-S-트랜스페라제(GST)를 이용한 초파리의 항진균성 도로소마이신 생산, 유비퀴틴을 혼성 파트너로 펩타이드에 결합하여 발현하는 방법, 소유래 프로카모신을 항균성 펩타이드 P2에 결합하여 생산하는 방법, 뷰포린을 머게이닌의 산성 펩타이드과 결합하여 중화시킨 후 생산하는 방법 등이 있다.
본 발명자들은 항균성이 우수한 파필리오신을 상업적 이용을 위하여 상기와 같은 점을 착안하여, 파필리오신의 유전자 및 케토스테로이드 아이소머레이져 유전자를 결합하여 재조합 발현벡터를 디자인 및 제조하고, 또한 상기 발현벡터를 대장균에 도입하여 형질전환된 대장균에서 파필리오신을 대량생산하는 방법 및 생산된 재조합 파필리오신이 다양한 병원균에 항균활성이 우수하다는 것이 확인되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 호랑나비(Papilio xuthus) 유충으로부터 분리된 항균펩타이드 파필리오신(Papiliocin)을 재조합 대장균을 이용하여 대량생산하기 위한 것으로, 파필리오신의 성숙 아미노산 영역을 암호화하는 유전자를 불용성 단백질인 케토스테로이드 아이소머레이져 유전자와 융합시켜 대량생산에 효과적인 유전자 카세트 및 재조합 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균에서 파필리오신을 효과적으로 발현 및 분리 정제할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 생산된 재조합 파필리오신의 다양한 병원성 세균에 대한 항균효과를 검정하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 파필리오신 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pET-KSI/Papiliocin이 제공된다.
상기 파필리오신 유전자는 호랑나비(Papilio xuthus) 유충으로부터 유래됨이 바람직하다.
본 발명은 재조합 발현벡터 pET-KSI/Papiliocin에 의해 형질전환된 대장균BL21(DE3)<pET-KSI/Papiliocin>이 제공된다.
본 발명의 생산방법은 호랑나비(Papilio xuthus) 유충 유래의 파필리오신 유전자를 갖는 형질전환된 재조합 대장균을 제조하는 단계와, 상기의 형질전환체인 재조합 대장균을 배양한 후, 이를 불용성 재조합 융합단백질로 발현한 후 분리 및 정제하여 파필리오신을 생산하는 단계를 포함한다.
상기 재조합 대장균을 제조하는 단계에서 상기 파필리오신 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pET-KSI/Papiliocin를 통해 형질 전환됨이 바람직하다.
상기 대량생산방법을 통해 항균력을 갖는 재조합 파필리오신이 생산되며, 특히 그람 음성균 및 그람 양성균을 포함하는 박테리아(Bacteria), 캔디다증을 유발하는 진균(Candida albicans), 내성균(MDREC, MRSA) 중 선택된 1종 이상에 대해 항균력을 나타내는 것이 특징이다.
이렇게 생산된 재조합 파필리오신을 유효성분으로 포함하여 항생제용 약학적 조성물이 제공되게 된다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명에서 파필리오신 유전자가 도입된 형질전환 대장균으로부터 항균력을 갖는 파필리오신을 대량으로 손쉽게 생산할 수 있다.
따라서, 대량생산으로 경제성을 가지므로 항균제로 상용화하는 것이 가능하다.
본 발명에 의해 대량 생산된 재조합 파필리오신은 그람 음성균 및 그람 양성균 등의 각종 박테리아에 대하여 항균활성을 나타내며, 또한 캔디다증을 유발하는 진균(Candida albicans)뿐만 아니라 내성균(MDREC, MRSA)에도 항균 활성을 나타내었다.
특히, 재조합 파필리오신은 2μM 이하의 농도에서도 각종 장내세균의 생육이 억제됨을 MIC분석 방법을 통해서 확인할 수 있었으며, 이에 대장균을 이용한 대량생산으로 경제성을 가지므로 항균제로 상용화하는 것이 가능할 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명의 재조합 파필리오신은 인체에 발생하는 세균성 질환 예방 및 치료에 천연 항생제로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 파필리오신 성숙 아미노산 영역의 유전자 및 불용성 결합단백질인 케토스테로이드 아이소머레이져 유전자가 삽입된 pET-KSI/Papiliocin 발현 벡터의 개열지도를 나타낸 도면.
도 2는 불용성 융합단백질(KSI-Papiliocin)로부터 시안화브롬(CNBr)에 의해 절단되는 재조합 파필리오신의 아미노산 구조를 도시한 도면.
도 3은 불용성 융합단백질(KSI-Papiliocin)를 대장균으로부터 IPTG 유도를 통해 발현시킨 후, 친화성 수지를 통하여 순수하게 분리한 단백질 용액의 전기영동 결과를 나타낸 도면.
도 4는 정제된 KSI-Papiliocin 융합단백질의 시안화브롬(CNBr) 절단 후 불용성 및 수용성으로 분획된 단백질 용액의 전기영동 결과를 나타낸 도면.
도 5의 (A)는 시안화브롬(CNBr) 절단 후 수용성 단백질 용액으로부터 파필리오신 순수 분리를 위한 FPLC의 실험결과를 나타낸 도면, (B)는 순수 정제된 파필리오신의 전기영동 결과를 나타낸 도면.
본 발명은 호랑나비 유충에서 분리된 파필리오신을 항생제로 상용화하기 위해서 재조합 대장균으로부터 대량으로 생산하는 방법 개발에 관한 것이다
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 파필리오신을 재조합 대장균을 이용하여 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 파필리오신을 효과적으로 대장균에서 과발현하기에 적합한 재조합 발현벡터 및 이를 포함하는 형질 전환된 대장균을 제공하고 이로부터 생산된 파필리오신의 분리, 정제 방법 및 항균활성 검정에 관한 것이다
설명하면, 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 파필리오신 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
바람직하게는 케토스테로이드 아이소머레이져(KSI) 유전자 및 파필리오신 유전자가 순서적으로 연결되고 C-말단에 6개의 히스티딘 아미노산을 코딩하는 유전자가 연결되어 있는 유전자 카세트를 포함하는 pET-KSI/Papiliocin 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균, pET-KSI/Papiliocin 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 형질전환체를 배양하여 불용성 상태로 융합단백질을 과발현 및 대장균으로부터 회수하는 단계, 상기 회수된 불용성 융합단백질을 니켈-친화성 이온교환 크로마토그래피로 정제하는 단계, 상기 정제된 불용성 융합단백질을 산성조건에서 시안화브롬(CNBr)로 절단하여 불용성 및 수용성 단백질 용액으로 분획하는 단계 및 상기 분리된 수용성 단백질 용액으로부터 액상 크로마토그래피(FPLC)를 수행하여 파필리오신을 회수하는 단계를 포함한 생산방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 생산 방법으로부터 생산된 항균력을 가지는 재조합 파필리오신을 제공한다.
본 발명에 따르면 파필리오신 유전자가 도입된 형질전환 대장균으로부터 항균력을 갖는 파필리오신을 대량으로 손쉽게 생산할 수 있다.
따라서 대량생산으로 경제성을 가지므로 항균제로 상용화하는 것이 가능하다.
본 발명에 의해 대량 생산된 재조합 파필리오신은 그람 음성균 및 그람 양성균 등의 각종 박테리아에 대하여 항균활성을 나타내며, 또한 캔디다증을 유발하는 진균(Candida albicans)뿐만 아니라 내성균(MDREC, MRSA)에도 항균 활성을 나타내었다. 특히 재조합 파필리오신은 2uM 이하의 농도에서도 각종 장내세균의 생육이 억제됨을 MIC분석 방법을 통해서 확인할 수 있었다.
또한 대장균을 이용한 대량생산으로 경제성을 가지므로 항균제로 상용화하는 것이 가능할 것으로 기대된다.
따라서 본 발명의 재조합 파필리오신은 인체에 발생하는 세균성 질환 예방 및 치료에 천연 항생제로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
또한, 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 항균 작용이 있는 본 발명에 의한 재조합 파필리오신을 유효성분으로 함유하는 항생제용 약학적 조성물이 가능함이 당업자에게 당연할 것이다.
이러한 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 함유될 수도 있는데 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피하 주입 또는 피부를 통한 국소 투여(경피 투여)가 바람직하다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상적인 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 파필리오신 발현벡터 제조
(1) 파필리오신 유전자 클로닝
파필리오신 유전자는 이미 보고되어 서열목록에 기재된 염기서열 (Kim et al., Molecules and cells, 29, 419 (2010))를 바탕으로 프라이머를 제작하여 PCR를 통하여 확보하였다.
즉, 호랑나비 종령 유충 체강에 면역 유도원으로 비병원성 대장균(JM109)을 주사한 다음 12시간 및 24시간 경과 후 Trizol(Invitrogen, USA)을 사용하여 전체 RNA를 분리하고 전체 RNA 5㎍으로부터 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용한 역전사 효소반응을 수행하여 외가닥 사슬 cDNA을 합성하였다.
상기 제조된 외가닥 cDNA을 주형으로 하기에 기재된 서열번호 1 및 2로 표시되는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR를 실시하였다.
증폭된 생성물을 아가로오스 젤 전기영동으로 DNA 밴드를 확인한 후, Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 아가로오스 젤로부터 DNA를 용출하여 정제한 다음 pGEM-T 이지 벡터(Promega, USA)에 클로닝 하였다.
서열번호 1의 프라이머 : 5‘-ATGAATTTTGGTAAAATTTTATTT-3'
서열번호 2의 프라이머 : 5‘-TCATCCTTTGACGACAGTTGCCGC-3’
(2) 파필리오신 유전자를 포함하는 재조합 벡터 제작
먼저 NcoI 및 XhoI의 제한효소 사이트를 포함하는 하기에 기재된 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머를 파필리오신 염기서열을 바탕으로 제작하였다.
이때, 각 프라이머는 융합 단백질로부터 파필리오신을 절단하여 분리하기 위해 시안화브롬(CNBr)에 의해 분해되는 메샤이오닌 잔기를 코딩하는 ATG를 포함한다(도 2 참조).
상기 제작된 프라이머를 이용하여 상기에 제작된 pGEM-T 이지 벡터에 클로닝되어 있는 파필리오신의 유전자를 주형으로 PCR를 수행하였다.
상기 PCR를 통해 수득한 파필리오신 및 과발현벡터인 pET-29b(Novagen)를 NcoI 및 XhoI의 제한효소(Takara)로 절단한 후 결합(ligation) 과정을 거쳐 pET-Papiliocin 플라스미드를 제작하였다.
또한, 파필리오신의 기주에 대한 독성을 중화시킬수 있는 결합 단백질을 탐색한 결과 케토스테로이드 아이소머레이져(KSI)가 선별되어 125개의 아미노산으로 구성된 박테리아 KSI를 BglII 및 KpnI 제한효소 사이트를 포함하는 하기에 기재된 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여 확보하였다.
이 후, BglII 및 KpnI 제한효소(Takara)로 절단된 상기 KSI 유전자를 회수한 후 BglII 및 KpnI로 자른 pET-Papiliocin 플라스미드에 삽입하여 본 발명의 파필리오신 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터인 pET-KSI/Papiliocin을 제작하였다.
상기 재조합의 발현벡터의 지도는 도 1에 기재하였다.
상기 재조합 발현벡터는 pET29b내에 존재하는 카나마이신 저항성 유전자, 박테리아의 생존 및 복제 유전자, IPTG에 유도되는 프로모터/오페론 영역, 리보좀 결합부위 유전자, KSI 유전자, 파필리오신을 코딩하는 유전자 및 6개의 히스티딘이 번역되는 유전자들로 구성되어 있다.
또한 파필리오신 유전자의 바로 앞쪽과 뒤쪽에 메샤이오닌 잔기를 번역하는 ATG 염기서열을 포함하고 있다.
서열번호 3의 프라이머 : 5‘-GCATATGTGGAAGATATTCAAGAAA-3’
서열번호 4의 프라이머 : 5‘-CTCGAGCATTCCTTTGACGACAGTT-3’
서열번호 5의 프라이머 : 5‘-CAGATCTGATGCATACCCCAGAAC-3’
서열번호 6의 프라이머 : 5‘-GGGTACCCTGGCATGCGTGAATAT-3’
<실시예 2> KSI-파필리오신 융합단백질 발현 및 정제
상기 실시예 1에서 제조된 재조합 발현벡터 pET-KSI/Papiliocin을 대장균 BL21(DE3)(Novagen)에 열충격(heat shock) 방법으로 형질 전환하여 pET-KSI/ Papiliocin 형질전환체를 제작하였다.
상기 형질전환체를 50㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 LB배지에 접종하여 37 ℃에서 16시간 배양하였고, 이를 다시 LB 배지에 접종한 후 37 ℃에서 OD600가 0.5에 도달할 때까지 배양하였다.
이후 단백질 발현을 유도하기 위해 배양액에 0.4mM의 IPTG 첨가하고 37℃에서 4시간 배양한 다음 배양액을 4,500rpm으로 원심분리하여 대장균 세포 펠렛을 수득하였다.
상기 펠렛을 히스-결합 버퍼(20mM 트리스-염산, 0.5M 염화나트륨, 5mM 이미다졸, pH 7.9)로 혼탁시킨 후, 소닉 디스멤브라터(Fisher Scientific)로 초음파 처리를 수행하여 파쇄하였으며, 14,000rpm에서 20분간 원심분리하여 용해성 분획(soluble fraction)과 침전물인 불용해성 분획(insoluble fraction)을 얻었다.
각각의 단백질 분획 용액은 SDS-PAGE를 통하여 단백질 발현 특성을 분석하였다.
그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KSI-파필리오신 융합단백질 대부분은 불용해성 분획에서 확인할 수 있었다(도 3의 3번 레인).
이 결과를 토대로 상기 수득한 침전물인 불용해성 분획에 8M 우레아가 포함된 히스-결합 버퍼(20mM 트리스-염산, 0.5M 염화나트륨, 5mM 이미다졸, pH 7.9)를 첨가하여 실온에서 30분간 용해시키고 14,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다.
상기 수득한 상층액으로부터 단백질 정제는 Ni-NTA 레진을 이용한 직접적인 히스 정제 키드(Novagen)를 이용하여 수행하였고, 용출된 단백질 용액은 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다(도 3의 5번 레인).
<실시예 3> KSI-파필리오신 융합단백질로부터 파필리오신 분리 및 정제
상기 실시예 2에서 용출된 KSI-파필리오신 융합단백질 용액은 염분 및 우레아를 제거하기위해서 투석막을 사용하여 증류수에 투석과정을 실시하였다.
증류수에 투석하는 과정에서 불용성으로 변한 단백질들을 원심분리에 의해 다시 회수한 다음, 70% 포름산(formic acid)에 용해시키고, 시안화브롬(CNBr, Sigma) 0.5g을 첨가하여 약 18시간 실온에서 교반하여 상기 융합단백질로부터 KSI 과 파필리오신을 절단하였다.
상기 혼합물로부터 포름산 및 CNBr를 제거하기 위해서 스피드 백 동결건조기를 이용하여 동결 건조한 후, 증류수로 용해하고 다시 동결 건조하는 과정을 2회 실시하였다.
최종적으로 동결 건조된 혼합물은 0.01% 초산 용액에 용해시킨 후, 14,000rpm에서 20분간 원심분리하여 용해성 분획(soluble fraction)과 침전물인 불용해성 분획(insoluble fraction)으로 분리하여 수거하였다.
분획된 각각의 단백질 시료는 16.5% 트리스-트리신 PAGE를 통하여 분석하였다.
그 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이, 결합 단백질인 KSI는 불용성 분획(도 4의 1번 레인)에서 또한 대부분의 파필리오신은 용해성 분획(도 4의 2번 레인)에서 확인할 수 있었다.
파필리오신이 포함된 상기 용해성 분획은 Superdex Peptide 컬럼(Pharmacia)을 이용한 액상 크로마토크라픽(FPLC)를 사용하여 파필리오신을 순수 정제하였고(도 5의 A), 16.5% 트리스-트리신 PAGE를 통하여 정제도 및 분자량을 분석하였다(도 5의 B).
전기영동 결과, 대장균에서 발현시킨 파필리오신은 화학적으로 합성한 종래의 파필리오신의 분자량과 유사함을 확인하였다.
상기 정제된 파필리오신은 Applied Biosystems Procise Sequencer를 사용하여 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다.
분석한 펩타이드의 아미노산 서열은 Gly-Arg-Trp-Lys-Ile-Phe-Lys이였고, 이는 파필리오신의 N-말단 아미노산 서열과 일치하였다.
따라서 재조합 대장균에서 성공적으로 파필리오신을 생산하였음을 확인하였다.
<실시예 4> 분리 정제한 파필리오신의 항균 활성 검정
상기 실시예 2 및 3의 방법에 의해 파필리오신을 분리 정제한 후 MIC(minimum inhibitory concentration) 방법을 이용하여 항균력을 조사하였다.
(1) 각종 균주의 배양조건
항세균 활성분석(antibacterial assays)에 사용한 그람음성 세균(Escherichia coli ML35, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae), 그람양성 세균(Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mutans) 및 내성균(MDRPA, MRSA)들은 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth, Difco, USA) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕배양한 후, 다시 동일한 조건에서 4 x 106CFU/㎖ 농도가 되도록 2시간 30분간 2차 배양하였다.
진균인 Candida albicans는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에서 30℃, 200rpm 조건으로 24시간 진탕배양한 후 사용하였다.
(2) MIC분석을 통한 재조합 파필리오신의 각종 세균 및 진균에 대한 항균력
본 발명의 상기 재조합 파필리오신에 대한 각종 세균의 최소성장저해농도(MIC, minimal inhibitory concentration)를 측정하기 위하여 microplate well에 90㎕의 세균 배양액(2×106CFU/㎖)을 넣고 여러 농도로 희석된 재조합 파필리오신 10㎕를 첨가하였다.
37℃에서 18시간 배양한 후, 분광 광도계(595nm)에서 흡광도를 측정하여 재조합 파필리오신에 의한 세균의 생장억제 정도를 관찰하였다(표 1).
대상 미생물 항균활성
(MIC, uM)
그람음성 세균 Escherichia coli ML35 0.25
Klebsiella pneumoniae 1
Pseudomonas aeruginosa 2
그람양성 세균 Staphylococcus aureus 10
Staphylococcus epidermidis 10
Streptococcus mutans 20
내성균 MDREC 0.25
MRSA 10
이스터 곰팡이 Candida albicans 5 ∼10
상기 표 1에는 그람양성 세균, 그람음성 세균, 내성균 및 이스터 곰팡이인 Candida albicans에 대한 재조합 파필리오신의 최소성장억제농도(MIC)를 나타낸 표이다.
표 1에 나타난 바와 같이 재조합 파필리오신은 그람음성 장내세균인 대장균(E. coli), 녹농균(P. aeruginosa), 페렴막대균(K. pneumoniae) 및 내성균인 다중약물내성 대장균(MDREC)에서 최소성장억제농도가 2 μM 이하로 항균 활성이 비교적 높았고, 또한 그람양성 세균 및 캔디다증을 유발하는 진균(Candida albicans)뿐만 아니라 내성균에도 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> OVERPRODUCTIVE METHOD OF PAPILIOCIN IN THE RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 114 <212> DNA <213> Papiliocin <400> 1 agatggaaga tattcaagaa aattgaaaaa gttggtagaa acgttcgcga tggtatcatc 60 aaagcgggac cagcagtggc ggtagttgga caagcggcaa ctgtcgtcaa agga 114

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 불용성 결합단백질인 케토스테로이드 아이소머레이져 유전자에 하기 서열번호 1로 표현되며, 호랑나비(Papilio xuthus) 유충으로부터 유래되는 파필리오신의 성숙 아미노산 영역을 암호화하는 유전자를 순서적으로 융합시키고 C-말단에 6개의 히스티딘 아미노산을 코딩하는 유전자가 연결되어 있는 유전자 카세트를 포함하되,
    pET29b내에 존재하는 카나마이신 저항성 유전자, 박테리아의 생존 및 복제 유전자, IPTG에 유도되는 프로모터/오페론 영역, 리보좀 결합부위 유전자, KSI 유전자, 파필리오신을 코딩하는 유전자 및 6개의 히스티딘이 번역되는 유전자들로 구성되며,
    상기 파필리오신 유전자의 바로 앞쪽과 뒤쪽에 메샤이오닌 잔기를 번역하는 ATG 염기서열을 포함하여 구성된 도 1의 개열지도를 갖는 pET-KSI/Papiliocin 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    상기 pET-KSI/Papiliocin 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하여 형질전환된 재조합 대장균을 제조하는 단계; 및
    상기 형질전환체인 재조합 대장균을 카나마이신이 함유된 배지에 접종하여 1차 배양후 단백질 발현 유도물질인 IPTG(이소프로필 1-티오-β-D-갈락토시드)을 첨가하여 2차 배양한 다음 원심 분리하여 대장균 세포 펠렛을 수득한 후 초음파 처리를 통해 파쇄하여 상기 케토스테로이드 아이소머레이져-파필리오신 융합단백질이 함유된 불용해성 분획물을 얻는 단계 및,
    상기 케토스테로이드 아이소머레이져-파필리오신 융합단백질이 함유된 불용해성 분획물을 우레아가 포함된 버퍼용액으로 용해한 후, 시안화브롬으로 화학적인 절단으로 상기 결합단백질과 파필리오신이 분리한 다음 정제하여 정제된 파필리오신을 생산하는 단계;를 포함하는,
    항균제용 재조합 파필리오신의 대량생산방법.
    서열번호 1:
    agatggaaga tattcaagaa aattgaaaaa gttggtagaa acgttcgcga tggtatcatc 60
    aaagcgggac cagcagtggc ggtagttgga caagcggcaa ctgtcgtcaa agga 114
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
KR1020100105590A 2010-10-27 2010-10-27 재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법 KR101424079B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100105590A KR101424079B1 (ko) 2010-10-27 2010-10-27 재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100105590A KR101424079B1 (ko) 2010-10-27 2010-10-27 재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120044167A KR20120044167A (ko) 2012-05-07
KR101424079B1 true KR101424079B1 (ko) 2014-08-04

Family

ID=46264088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100105590A KR101424079B1 (ko) 2010-10-27 2010-10-27 재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101424079B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100500371B1 (ko) * 2002-03-13 2005-07-12 (주) 디지탈바이오텍 재조합 베타아밀로이드 및 이의 대량 생산 방법
KR20100100246A (ko) * 2009-03-05 2010-09-15 대한민국(농촌진흥청장) 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드 유전자 및 항균펩타이드

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100500371B1 (ko) * 2002-03-13 2005-07-12 (주) 디지탈바이오텍 재조합 베타아밀로이드 및 이의 대량 생산 방법
KR20100100246A (ko) * 2009-03-05 2010-09-15 대한민국(농촌진흥청장) 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드 유전자 및 항균펩타이드

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession Number FJ438394 (2010.07.01.) *
GenBank Accession Number FJ438394 (2010.07.01.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120044167A (ko) 2012-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5032574A (en) Novel antimicrobial peptide
Lee et al. Acidic peptide-mediated expression of the antimicrobial peptide buforin II as tandem repeats inEscherichia coli
TW200950800A (en) Use of defensins against tuberculosis
KR101615551B1 (ko) 흰점박이꽃무지 유충 유래의 항균 펩티드 및 이의 용도
KR101726951B1 (ko) 동애등에 유충에서 분리한 항균펩타이드
Cao et al. Expression and purification of antimicrobial peptide adenoregulin with C-amidated terminus in Escherichia coli
KR20010042735A (ko) 헬리오미신을 코딩하는 유전자 및 이의 용도
Wang et al. High level expression and purification of bioactive human α-defensin 5 mature peptide in Pichia pastoris
US7629438B2 (en) Group of synthetic antimicrobial peptides
Zhou et al. TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli
EP3423476B1 (en) New antimicrobial peptides, their variants and uses
Cheng et al. Expression and purification of antimicrobial peptide CM4 by N pro fusion technology in E. coli
US7173007B1 (en) Therapy for microbial infections
WO2011060613A1 (zh) 人α-防御素5突变体多肽及其制备方法和应用
KR101424079B1 (ko) 재조합 대장균을 이용한 파필리오신의 대량 생산방법
RU2316595C1 (ru) Способ получения антимикробного пептида ареницина
US8357509B2 (en) Microbial expression of tobacco osmotin for biocidal and medical applications
Wu et al. High-level expression and novel purification strategy of recombinant thanatin analog in Escherichia coli
AU2016327453A1 (en) Generation of peptides
KR20130007783A (ko) 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드 파필리오신2의 유전자, 이를 이용한 재조합 항균펩타이드 파필리오신2 및 이의 대량생산방법
US5210027A (en) DNA encoding novel antimicrobial polypeptide and methods for obtaining such polypeptide
Lee et al. Multimeric expression of the antimicrobial peptide buforin II in Escherichia coli by fusion to a cysteine-rich acidic peptide
RU2698037C1 (ru) Способ получения рекомбинантного антимикробного пептида UBI18-35, рекомбинантная плазмидная ДНК pET31b-2хUBI18-35 и штамм-продуцент Escherichia coli BL21 Rosetta DE3 pLysS/ pET31b-2хUBI18-35 антимикробного пептида UBI18-35
KR100809391B1 (ko) 양이온성 항균 펩타이드의 생산방법 및 그 용도
EP3423477B1 (en) New antimicrobial peptides, their variants and uses

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant