KR20100100246A

KR20100100246A - 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드 유전자 및 항균펩타이드

Info

Publication number: KR20100100246A
Application number: KR1020090019022A
Authority: KR
Inventors: 김성렬; 황재삼; 박관호; 이광길; 강석우
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2009-03-05
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2010-09-15
Also published as: KR101099558B1

Abstract

본 발명은 나비목 곤충에 속하는 호랑나비 유충으로부터 면역반응을 유도하여 분리된 새로운 항균펩타이드의 유전자 및 항균펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 항균펩타이드는, 그람음성균 및 그람양성균 등의 각종 박테리아에 대하여 항균 활성을 나타내고 캔디다증을 유발하는 진균뿐만 아니라 내성균에도 항균 활성을 나타내며 세포독성이 없으므로, 세균성 질환 예방 및 치료에 천연 항생제로 유용하게 이용될 수 있다.

호랑나비, 유충, 항균펩타이드, 항생제

Description

호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드 유전자 및 항균펩타이드{ANTIMICROBIAL PEPTIDE GENE AND ANTIMICROBIAL PEPTIDE ISOLATED FROM LARVAE OF SWALLOWTAIL BUTTERFLY}

본 발명은 호랑나비(Papilio xuthus) 유충으로부터 분리한 새로운 항균펩타이드 유전자 및 항균펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나비목 곤충인 호랑나비 유충으로부터 분리한 신규한 항균펩타이드 유전자의 cDNA 염기서열 및 이를 암호화하는 항균펩타이드의 아미노산 서열 및 합성 펩타이드에 관한 것이다.

곤충은 다양한 환경에서 생존하기 위해서 외부 미생물 및 바이러스의 침입에 효과적으로 대항할 수 있는 생체방어 시스템을 소유하고 있다. 즉, 고등동물이 지닌 후천적 면역인자와는 달리 무척추동물과 같은 세포성 면역과 체액성 면역반응을 포함하는 선천적 면역인자를 분비함으로써 자신을 효과적으로 보호하는 면역체계를 가지고 있다. 이와 같은 선천적 면역은 곤충을 포함한 무척추동물에 있어서 초기감염에 대한 효과적인 방어인자로 중요한 역할을 한다. 곤충의 선천성 면역반응에서 세포성 면역은 세균, 곰팡이, 선충을 포함한 원생동물에 대한 식균작용, 결절형성과 캡슐형성을 포함하며, 체액성 면역반응에서는 병원체의 침입으로 인해 다양한 종류의 단백질 및 펩타이드가 지방체 및 혈구세포에서 합성되어 혈림프로 분비되는데 이들은 병원체에 대한 강력한 방어인자로 이용된다. 이와 같이 곤충의 체액성 면역반응의 일환으로 분비되는 항균성 단백질 및 펩타이드들은 천연 항생제로 인간의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종병원균에 의한 가축 및 농작물의 피해 방지 및 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

현재까지 발견된 곤충의 항균단백질 및 펩타이드는 보만(Boman) 박사 연구팀에 의해 세크로피아나방(Hyalophora cecropia)에서 세크로핀이 최초로 보고된 이래 약 200여종이 곤충으로부터 분리되어졌는데 이들은 구조와 크기에 따라 크게 세크로핀류, 디펜신류, 프롤린 및 글리신 아미노산을 많이 포함하고 있는 펩타이드로 나눌 수 있다.

세크로핀류는 31-39개의 아미노산으로 구성된 염기성 단백질로 N-말단의 양친매성 나선구조를 포함한 알파-헬릭스-힌지-알파-헬릭스(α-helix-hinge-α-helix) 구조를 가지며 열에 안정하고 다양한 균에 대하여 광범위한 항균 활성을 나타낸다(Boman and Hultmark, Annu. Rev. Micrbiol., 41: 1003-126, 1987).

주요 곤충 유래 항균 단백질로는 쉬파리과(Sarcophaga peregrina)에서 발견된 사코톡신 Ⅲ(Sacotoxin Ⅲ)(Baba et al, 1987), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서 발견된 딥터리신(Diptericin)(Wicker et al 1990), 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia)에서 발견된 홀로트리신 3(Holotricin 3)(Lee et al., Biol. Pharm. Bull., 18: 1049-1052, 1995), 갈색거저리(Tenebrio molitor)에서 발견된 테네신 3(Tenecin 3)(Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 218: 6- 11, 1996), 장수풍뎅이(Allomirina dichotoma)에서 발견된 디펜신(Defensin), 콜레옵테리신(Coleoptericin) A 및 B(Miyanoshita et al., 1996: Sakisaca et al., 2001) 담배나방아과의 담배나방(Heliothis virescens)에서 발견된 헬리오마이신(Heliomicin)(Lamberty et al., J. Biol. Chem. 274: 9320-9326, 1999), 남방장수풍뎅이(Oryctes rhinoceros)에서 발견된 리노세로신(Rhinocerosin), 스카라배신(Scarabaecin)(Yang et al., 1998: Tomie et al., 2003), 매미아과의 시카다 플라마타(Cicada flammata)에서 발견된 시카딘(Cicadin)(Wang and Ng, Peptides, 23: 7-11, 2002), 큰우단하늘소(Acalolepta luxuriosa)로부터 발견된 세크로핀(Cecropin)(saito et al., 2005), 담배거세미나방(Spodoptera litura)으로부터 발견된 모리신 유사체(Moricin analogue)(Orizumi et al., 2005) 등이 밝혀져 있다. 그러나, 호랑나비 유충에서 항균 활성을 나타내는 항균단백질 또는 항균펩타이드에 대해서는 알려져 있지 않다.

이에 본 발명자들은 면역유도시킨 호랑나비 유충으로부터 새로운 항균펩타이드의 유전자를 클로닝하고, 전체 염기 및 아미노산 서열을 밝히는 한편, 상기 유전자의 성숙 아미노산 영역(38개의 아미노산 잔기)을 화학적으로 합성한 펩타이드가 다양한 병원균에 항균 활성이 우수하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 호랑나비 유충으로부터, 인체 및 식물체에 발생하는 세균성 질환의 예방 및 치료에 천연 항생제로 유용하게 사용될 수 있는 새로운 항균펩 타이드 유전자를 분리하여 그 염기서열 및 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자의 성숙 아미노산 영역(38개의 아미노산 잔기)을 화학적으로 합성하여 이루어지는 합성 항균펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명은, 호랑나비 유충에서 분리한 다음과 같은 염기서열(서열번호 1)을 갖는 항균펩타이드 유전자를 제공한다:

본 발명은, 상기 염기서열에서 암호화된 다음과 같은 아미노산 서열로 이루어지는 항균펩타이드를 제공한다:

본 발명은, 상기 아미노산 서열의 N-말단 알파 헬릭스 영역의 아미노산 서열을 가지는 항균펩타이드를 제공한다:

본 발명은 호랑나비 유충으로부터 분리된 새로운 항균펩타이드 유전자의 cDNA 및 이를 암호화하는 아미노산의 서열을 제공한다. 본 발명의 항균펩타이드(파필리오신)는 그람음성균 및 그람양성균 등의 각종 박테리아에 대하여 항균 활성을 나타내며, 또한 캔디다증을 유발하는 진균(Candida albicans)뿐만 아니라 내성균(MDRPA, MRSA)에도 항균 활성을 나타낸다. 특히 본 발명의 항균펩타이드는 10㎍/㎖ 이하의 농도에서도 각종 장내세균의 생육이 억제됨을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 호랑나비 유래 항균펩타이드는 인체 또는 식물체에 발생하는 세균성 질환 예방 및 치료에 천연 항생제로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 호랑나비 유충으로부터 분리한 새로운 항균펩타이드 유전자 및 항균펩타이드에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

호랑나비 유충으로부터 항균펩타이드 유전자를 분리하기 위하여 먼저 호랑나비 유충에 비병원성 대장균(Escherichia coli JM109)을 주사하여 면역을 유도한 후, 액체질소로 급속 동결하여 전체 RNA를 분리하였다. 대조구로 면역을 유도하지 않은 호랑나비 유충에서도 전체 RNA를 분리하였다. 상기 분리된 전체 RNA들로부터 역전사효소반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction: RT-PCR)을 수행하여 각각의 cDNA를 제작하고 ACP(Annealing Control Primer)를 이용한 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)을 수행하여 차별적으로 발현되는 cDNA들을 선별하였다. 선별된 cDNA들은 pGEM-T 벡터(Promega, USA)에 클로닝하고 염기서열을 분석하였다. 유전자 상동성 분석(BLAST)을 통하여 상기 cDNA들로부터 세크로핀계 항균펩타이드 유전자를 선발하고 5'-말단신속증폭기술(5'-RACE)을 사용하여 5'-말단 부위의 염기서열이 포함된 전체 크기의 항균펩타이드 cDNA를 클로닝하여 염기서열을 결정하였다.

본 발명에 의한 상기 항균펩타이드의 cDNA 전체 크기는 503bp이며, 94번째 염기에서 개시되어 283번째 위치에서 종결되는 암호화 영역을 가지는 62개의 아미노산으로 구성되어 있고, 468번째 위치에 잠정 전사 종결 신호인 'AATAA'가 존재함을 확인하였으며, 상기 항균펩타이드의 아미노산 구조는 알파-헬릭스-힌지-알파-헬릭스로 구성된 전형적인 세크로핀류의 염기성 단백질임을 확인할 수 있었다.

비병원성 대장균에 의해 면역유도된 호랑나비 유충으로부터 상기 항균펩타이드 유전자는 대장균 주사 후 RNA의 전사가 유도되며 24시간까지도 전사가 진행됨을 역전사효소반응을 통하여 확인할 수 있었다.

상기 항균펩타이드 유전자에서 성숙 아미노산 영역을 화학 합성하여 병원성 대장균을 포함한 8종의 세균 및 1종의 진균에 대하여 항균 활성을 검정하였다. 그 결과 본 발명에 의해 합성된 항균펩타이드는 10㎍/㎖ 이하의 농도에서도 공시한 일부 세균들의 생육을 억제시킴을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 또한 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 항균 작용이 있는 본 발명에 의한 항균펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제용 약학적 조성물이 가능함이 당업자에게 당연할 것이다.

<실시예 1: 호랑나비 유충의 면역유도 및 항균펩타이드 유전자 선발>

(1) 호랑나비 유충의 면역유도

호랑나비 유충으로부터 새로운 항균펩타이드 유전자를 선발하기 위하여 호랑나비 유충을 면역화하였다. 즉, 대장균(JM109)을 TSB(Tryptic Soy Broth, Difco, USA) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 동안 1차 진탕배양 후, 동일한 조건하에서 다시 2시간 30분 동안 2차 배양한 다음, 세포수가 5×10⁵ 콜로니 형성 단위(Colony Forming Unit: CFU)의 농도를 미세주사기를 이용하여 호랑나비 종령 유충 체강에 주사하여 면역을 유도한 다음 25℃에서 24시간 사육하였다.

(2) cDNA 합성 및 항균펩타이드 관련 유전자 선발

면역유도 24시간 후 유충을 액체질소에서 마쇄하여 트리졸(Trizol)(Invitrogen, USA)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 또한 차별화 발현 유전자를 탐색하기 위해서 면역화되지 않은 정상 종령 유충에서도 전체 RNA를 분리하여 대조구로 사용하였다. 상기 분리된 각각의 전체 RNA 3㎍으로부터 GeneFishing^TM DEG Premix Kit(Seegene, Korea)를 이용한 역전사효소반응을 수행하 여 외가닥 사슬 cDNA을 합성하였다. 상기 제조된 외가닥 cDNA들을 주형으로 GeneFishing^TM DEG Premix Kit(Seegene, Korea)의 120 조합 ACP와 dT-ACP로 PCR을 수행하여 차별적 발현 유전자를 선발하였다. 상기 PCR 산물들은 2% 아가로오스 겔 전기영동으로 확인하고 대조구와 비교하여 특이적으로 발현되는 밴드를 절취하여 겔 추출 키트(Gel Extraction Kit)(Qiagen, USA)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 DNA를 용출하였다. 이렇게 얻은 면역반응에 특이적으로 발현이 높은 cDNA 단편들은 pGEM-T 벡터(Promega, USA)에 클로닝하고 플라스미드 추출 키트(Plasmid Extraction Kit)(Qiagen, USA)를 이용하여 목적 DNA을 포함하는 플라스미드를 분리하였다. 이후 벡터 내 목적 DNA의 염기서열은 ABI 370 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 결정하였다. 유전자 상동성 분석을 통하여 상기 선별된 여러 개의 cDNA 클론들 중 기존에 보고된 세크로핀 유전자와 상동성이 높은 cDNA 클론을 선발하였다.

<실시예 2 : 본 발명의 항균펩타이드 유전자의 cDNA 클로닝 및 연역 아미노산 서열>

선발된 단편 cDNA 클론에서 미지의 5'-말단 부위 염기서열을 결정하기 위해서 5'-말단신속증폭기술(5'-RACE) PCR을 수행하였다. 이를 위하여 앞서 언급한 것과 같이 면역유도된 종령 유충으로부터 전체 RNA를 분리한 후 이로부터 외가닥 사슬 cDNA를 역전사효소반응을 수행하여 합성하였다. 이렇게 얻어진 외가닥 사슬 cDNA의 5'-말단에 어뎁터 뉴클레오타이드 서열을 부착시킨 후, 이를 주형으로 어뎁 터 프라이머와 선발된 단편 cDNA의 염기서열을 이용하여 제작된 프라이머(5'-ACAGTTGCCGCTTGTCCAACTACC-3')(서열번호 4)를 사용하여 PCR을 실시하였다. 증폭된 생성물을 아가로오스 겔 전기영동으로 DNA 밴드를 확인한 후, 겔 추출 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 DNA를 용출하여 정제하였다. 이렇게 얻어진 DNA는 pGEM-T 벡터(Promega, USA)에 클로닝한 후, 염기서열을 분석하여 이미 밝혀진 항균펩타이드 유전자 단편의 5'-말단 영역임을 확인하였다. 따라서 궁극적으로 선발된 항균펩타이드 유전자의 5'-말단 영역을 포함한 항균펩타이드 전체 cDNA 염기서열을 결정하였다. 이렇게 얻은 항균펩타이드 cDNA는 전체 크기가 503bp이며, 94번째 염기에서 개시되어 283번째 위치에서 종결되는 암호화 영역(Open Reading Frame: ORF)을 가지는 62개의 아미노산으로 구성되어 있고, 468번째 위치에서 잠정 전사 종결 신호인 'AATAA'가 존재함을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

상기의 항균펩타이드 아미노산 서열 중 성숙 단백질(mature protein) 영역은 25번째 아르기닌(Arginine)부터 62번째 글리신(Glycine)까지 38개의 아미노산으로 구성되어 있으며 추정되는 항균펩타이드의 분자량은 4060.89 Da이다. 상기의 성숙 항균펩타드의 아미노산 서열은 CLUSTAL W 프로그램을 이용한 상동성 분석에서 세크로피아나방의 세크로핀과 78%, 배추흰나비(Artogeia rapae) 및 누에나방(Bombyx mori)의 세크로핀과 각각 76%와 75%의 높은 상동성을 나타내었다. 이에 호랑나비 유충으로부터 새롭게 발견한 항균펩타이드 유전자를 '파필리오신(Papiliocin)'이라 명명하였다.

<실시예 3 : 본 발명의 항균펩타이드 유전자의 발현양상 검정>

호랑나비 유충의 면역유도에 따른 선발된 항균펩타이드 유전자의 발현양상을 RT-PCR 방법으로 확인하였다. 즉, 호랑나비 종령 유충 체강에 면역유도원으로 비병원성 대장균(JM109)을 주사한 다음 12시간 및 24시간 경과 후 트리졸(Invitrogen, USA)을 사용하여 전체 RNA를 분리하고 전체 RNA 5㎍으로부터 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용한 역전사효소반응을 수행하여 외가닥 사슬 cDNA을 합성하였다.

상기 제조된 외가닥 cDNA을 주형으로 파필리오신 cDNA의 염기서열을 이용하여 제작된 한 쌍의 프라이머(5'-AGATGGAAGATATTCAAG-3'(서열번호 5), 5'-TCATCCTTTGACGACAGT-3'(서열번호 6))를 사용하여 PCR을 실시하였다. 증폭된 생성물은 1% 아가로오스 겔을 이용하여 DNA 전기영동으로 분석하였다. 대조구로 actin 유전자를 사용하였다. 그 결과 도 2에서 보는 바와 같이 항균펩타이드 유전자는 면역유도 후 발현량이 급속도로 증가하였으며 24시간에서도 전사가 진행됨을 확인하였다.

<실시예 4 : 본 발명의 항균펩타이드의 화학적 합성>

파필리오신의 아미노산 구조 분석 결과, 38개의 아미노산으로 구성된 성숙형태의 펩타이드는 알파-헬릭스-힌지-알파-헬릭스로 구성된 전형적인 세크로핀류의 염기성 단백질임을 확인할 수 있었다.

이에 상기 파필리오신 유전자의 성숙 아미노산 영역(Arg²⁵-Gly⁶²-NH₂)을 화학 적으로 합성하여 병원성 대장균을 포함한 9종의 세균에 대하여 항균력을 검정하였다.

상기 펩타이드는 자동화된 고상 펩타이드 합성기(Pioneer Applied Biosystems, Foster, Caclif.)를 이용하여 에니진(Kwangju, Korea)에서 합성하였다.

<실시예 5 : 본 발명의 합성 항균펩타이드의 항균 활성 분석>

항균 활성 분석은 방사상 확산 분석(Rradial Diffusion Assay: RDA) 방법과 최소성장저해농도(Minimum Inhibitory Concentration: MIC) 방법을 이용하였다.

(1) 각종 균주의 배양조건

항세균 활성분석(antibacterial assays)에 사용한 그람음성균(Escherichia coli ML35, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae), 그람양성균(Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mutans) 및 내성균(MDRPA, MRSA)들은 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth, Difco, USA) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕배양한 후, 다시 동일한 조건에서 4 x 10⁶CFU/㎖ 농도가 되도록 2시간 30분 동안 2차 배양하였다.

진균인 Candida albicans는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에서 30℃, 200rpm 조건으로 24시간 진탕배양한 후 사용하였다.

(2) RDA분석을 통한 파필리오신의 각종 세균 및 진균에 대한 항균력

멸균된 RDA용 언더레이 겔(underlay gel)(9mM sodium phosphate, 1mM sodium citrate, pH7.4, 1% low electroendosmosis agarose, 0.03% TSB)에 배양된 세균(4 X 10⁶CFU/㎖)을 혼합하여 100㎜ 사각플레이트에 부어 굳혔다. 언더레이 겔에 지름 3㎜의 구멍을 내어 합성 펩타이드(1㎎/㎖)를 5㎕씩 구멍에 넣었고, 펩타이드를 용해할 때 사용한 용매(0.01% 아세트산)를 대조군으로 사용하였다. 합성 펩타이드가 확산되도록 37℃에서 3시간 배양한 후, 그 위에 RDA용 오버레이 겔(overlay gel)(6% TSB, 1% 아가로오스)을 부어 굳힌 다음 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 합성 펩타이드의 항균 활성력은 세균이 자라지 못해 생기는 클리어 존(clear zone)의 크기로 확인할 수 있다(도 3 참조). 도 3에서 나타난 바와 같이 합성 파필리오신 펩타이드는 인체에 유해한 각종의 그람음성균(E. coli 등), 그람양성균(S. aureus 등) 및 캔디다증을 유발하는 진균(Candida albicans)뿐만 아니라 내성균(MDRPA, MRSA)에도 항균 활성이 있음을 확인하였다.

(3) MIC분석을 통한 파필리오신의 각종 세균 및 진균에 대한 항균력

본 발명의 합성 항균펩타이드에 대한 각종 세균의 최소성장저해농도(MIC)를 측정하기 위하여 마이크로플레이트 웰(microplate well)에 90㎕의 세균 배양액(2 × 10⁶CFU/㎖)을 넣고 여러 농도로 희석된 합성 파필리오신 펩타이드 10㎕를 첨가하였다. 37℃에서 18시간 배양한 후, 분광 광도계(595nm)에서 흡광도를 측정하여 합성 파필리오신 펩타이드에 의한 세균의 생장억제 정도를 관찰하였다(표 1 참조).

표 1에 나타난 바와 같이 파필리오신은 그람음성 장내세균인 대장균(E. coli), 녹농균(P. aeruginosa), 페렴막대균(K. pneumoniae) 및 내성균(MDRPA)에서 최소성장억제농도가 10㎍/㎖ 이하로 항균 활성이 비교적 높은 것을 확인할 수 있었다.

대상미생물		항균 활성 (MIC, ㎍/㎖)
그람음성균	Escherichia coli ML35	1-2
	Klebsiella pneumoniae	4-6
	Pseudomonas aeruginosa	8-10
그람양성균	Staphylococcus aureus	>100
	Staphylococcus epidermidis	>100
	Streptococcus mutans	>100
내성균	MDR Pseudomonas aeruginosa	8-10
내성균	MRSA	>100
이스터 곰팡이	Candida albicans	50-100

(4) 합성 펩타이드의 세포독성 검정

본 발명의 합성 항균펩타이드에 대한 세포독성 여부를 판별하기 위하여 인간 적혈구 용혈 활성을 측정하였다. 사람의 적혈구를 PBS(Phosphate-Buffered Saline: 35mM 포스페이트 완충용액/150mM NaCl의 혼합용액, pH 7.4)로 희석한 후 원심력 1000g으로 10분간 원심분리를 통하여 3회 세척하였다. PBS로 희석한 8% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트에 100㎕씩 분주한 후, 펩타이드 용액 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트를 1000g, 5분간 원심분리하여 상층액을 취한 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 대조구로 멜리틴을 상기 펩타이드와 동일한 조건으로 처리하여 사용하였다. 0.1% 트리톤 X-100을 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈로 계산하고, 펩타이드의 용혈 활성(세포파괴 정도)을 % 용혈 활성(Hemolysis)으로 수학식 1에 의하여 산출하였다.

세포파괴 정도(% Hemolysis) = (A-C/ B-C) X 100

상기 수학식에서 A는 펩타이드 용액에서의 흡광도이고, B는 0.1% 트리톤 X-100에서의 흡광도이고, C는 PBS 용액에서의 흡광도를 나타낸다.

표 2에 합성 파필리오신 펩타이드 및 멜리틴의 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 나타내었다.

펩타이드	% Hemolysis (μM)
펩타이드	100	50	25	12.5	6.25	3.13
파필리오신	0	0	0	0	0	0
멜리틴	100	100	100	100	98	98

표 2에 나타나 있는 바와 같이, 벌독 유래의 항균펩타이드인 멜리틴은 인간 적혈구에 대하여 높은 용혈 활성을 나타내는 반면, 본 발명의 항균펩타이드는 인간의 적혈구에 대해서 전혀 용혈 활성을 나타내지 않았다. 따라서 본 발명의 합성 펩타이드는 인체에 무해한 항생 펩타이드로서의 가능성을 확인할 수 있었다.

도 1은 면역유도된 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드 유전자의 전체 cDNA 염기서열 및 연역된 아미노산 서열을 나타낸 도이다.

도 2는 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드 유전자의 면역화에 의한 유도 발현양상을 알아보기 위해 면역유도한 후 경과시간별 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.

도 3은 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드 유전자의 성숙 아미노산 영역(38개의 아미노산 잔기)을 화학 합성하여 RDA 방법을 사용하여 항균 활성을 검정한 도이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> ANTIMICROBIAL PEPTIDE GENE AND ANTIMICROBIAL PEPTIDE ISOLATED FROM LARVAE OF SWALLOWTAIL BUTTERFLY <130> P09-033-RDA <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 503 <212> DNA <213> Papilio xuthus <400> 1 cggatccaga cgctgcgctt tgctggcttt gatgaaaata cagcaacagt ctttcaacgc 60 tttcatatta aaatattaca ttcttttttt aaaatgaatt ttggtaaaat tttatttttc 120 gtaatggctt gtttggctgc tcttagttta acaacggcca gtcctagatg gaagatattc 180 aagaaaattg aaaaagttgg tagaaacgtt cgcgatggta tcatcaaagc gggaccagca 240 gtggcggtag ttggacaagc ggcaactgtc gtcaaaggat gaatattacc gtgtgtttcc 300 gagacttaaa tatctgtgta aaacatgtca tccttgtctt tcatctttga caaaacagag 360 ataacaatat gttttaaacg gggatattat tctcagaaac ccatggttac ttcaaactag 420 tctacataat tactctaagt tttaattaag ttattgtaaa tactgccaat aaattcttac 480 ctcatcaaaa aaaaaaaaaa aaa 503 <210> 2 <211> 62 <212> PRT <213> Papilio xuthus <400> 2 Met Asn Phe Gly Lys Ile Leu Phe Phe Val Met Ala Cys Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Thr Ala Ser Pro Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile 20 25 30 Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro 35 40 45 Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala Ala Thr Val Val Lys Gly 50 55 60 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> Papilio xuthus <400> 3 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg 1 5 10 15 Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala 20 25 30 Ala Thr Val Val Lys Gly 35 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 acagttgccg cttgtccaac tacc 24 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 agatggaaga tattcaag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tcatcctttg acgacagt 18

Claims

호랑나비 유충에서 분리한 다음과 같은 염기서열(서열번호 1)을 갖는 항균펩타이드 유전자:
청구항 1의 염기서열에서 암호화된 다음과 같은 아미노산 서열로 이루어지는 항균펩타이드(서열번호 2):
청구항 2의 아미노산 서열의 N-말단 알파 헬릭스 영역의 아미노산 서열을 가지는 항균펩타이드(서열번호 3):
청구항 2 또는 3의 항균펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.