JP7302093B2 - Ｗｒｓタンパク質に特異的に結合する抗体及びその用途 - Google Patents

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Description

本出願は、２０１９年７月１８日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００８７２３３号を優先権として主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
本発明は、ＷＲＳ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体及びその用途に関し、より具体的には、ＷＲＳ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）タンパク質において配列番号２で表されるアミノ酸配列のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体の断片、前記抗体を暗号化するポリヌクレオチド及びこれを含むベクター、これを用いて形質転換された細胞及びその用途に関する。
ＡＲＳ（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）は、特定のアミノ酸をその該当するｔＲＮＡにくっ付ける役割をする酵素であって、高等生物の場合、アミノ酸の種類による２０個の酵素以外に、ＡＩＭＰ１（ｐ４３）、（ＡＩＭＰ２）ｐ３８、（ＡＩＭＰ３）ｐ１８などのマルチシンテターゼ複合体（ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成に関与する３種類を含み、２３種の酵素で構成されており、マルチシンテターゼ複合体に参加する酵素以外に、いくつかは遊離型（ｆｒｅｅ ｆｏｒｍ）の形態でも存在する。しかし、最近になって、基本的な機能以外に、特定の環境で多様な異なる活性機能を有していることが報告されたが、ＷＲＳ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）がその一つである。
ＷＲＳは、細胞外に分泌され、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）活性を示すＡＲＳのうち最も先に報告されており、最近までも、大腸癌を始めとした多くの癌で重要なバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）としてのＷＲＳの可能性に対して多くの論文が発表されている（Ｇｈａｎｉｐｏｕｒ，Ａ ｅｔ ａｌ Ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎ ｃｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．１８（１１），２９４９－２９５５）。また、ＷＲＳは、バクテリア、ウイルス又はカビ（ｆｕｎｇｉ）の感染による感染疾患の発生時、体内のＷＲＳの水準が感染初期から速く増加し、特に、感染性炎症疾患を伴う場合は、ＷＲＳの水準が正常人に比べて大きく増加し、非感染性炎症疾患の場合は、ＷＲＳの水準と関連していないことなどから、ＷＲＳの水準は、感染疾患及びこれらの合併症を迅速且つ正確に診断できるマーカーとして使用可能であることが報告された（韓国公開特許第１０－２０１７－００２７３１３号）。
このような結果により、ＷＲＳは、癌及び感染性疾患患者の血清内に存在することができ、ＷＲＳがこれらの疾患の重要な診断バイオマーカーとして使用可能であることを示す。
しかし、ＷＲＳを始めとした各ＡＲＳに対するバイオマーカーとしての重要性にもかかわらず、各ＡＲＳは、タンパク質の構造上、類似する点が多いので、動物の免疫反応から得られる抗体は、他のＡＲＳにも結合する交差反応を示し、最初から高感度の抗体が生成されない場合が多い。
そこで、本発明者等は、ＷＲＳに特異的に結合する抗体を開発するために鋭意研究を重ねた結果、ＷＲＳタンパク質内で特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合しながら、特定のＣＤＲ（相補性決定部位）配列を有する各抗体がＷＲＳに非常に高い結合特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び結合親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を示し、その活用度が非常に高いことを発見し、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、ＷＲＳ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）タンパク質において配列番号２で表されるアミノ酸配列のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体の断片を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記抗体又は抗体の断片を暗号化するポリヌクレオチド、これを含むベクター、及び前記ベクターで形質転換された細胞を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下で培養し、軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階、及び前記細胞又はこれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含むヒトＷＲＳに結合する抗体又は抗体の断片生産方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、抗体又は抗体の断片を含む癌、感染疾患又は感染合併症診断用組成物を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、抗体又は抗体の断片からなる癌、感染疾患又は感染合併症診断用組成物を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、必須的に抗体又は抗体の断片からなる癌、感染疾患又は感染合併症診断用組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、癌診断用製剤を製造するための抗体又は抗体の断片の用途を提供することにある。
本発明の他の目的は、
ａ）個体から試料を取得する段階；
ｂ）前記試料において抗体又は抗体の断片でＷＲＳタンパク質の発現量を測定する段階；及び
ｃ）前記ｂ）段階で測定したタンパク質の発現量が増加する場合、癌であると判断する段階；を含む癌診断方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、感染疾患又は感染合併症診断用製剤を製造するための抗体又は抗体の断片の用途を提供することにある。
本発明の他の目的は、
ａ）個体から試料を取得する段階；
ｂ）前記試料において抗体又は抗体の断片でＷＲＳタンパク質の発現量を測定する段階；及び
ｃ）前記ｂ）段階で測定したタンパク質の発現量が増加する場合、感染疾患又は感染合併症であると判断する段階；を含む感染疾患又は感染合併症診断方法を提供することにある。
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、ＷＲＳ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）タンパク質において配列番号２で表されるアミノ酸配列のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体の断片を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記抗体又は抗体の断片を暗号化するポリヌクレオチド、これを含むベクター、及び前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下で培養し、軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階、及び前記細胞又はこれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含むヒトＷＲＳに結合する抗体又は抗体の断片生産方法を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、抗体又は抗体の断片を含む癌、感染疾患又は感染合併症診断用組成物を提供する。
また、本発明は、抗体又は抗体の断片からなる癌、感染疾患又は感染合併症診断用組成物を提供する。
本発明は、必須的に抗体又は抗体の断片からなる癌、感染疾患又は感染合併症診断用組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、癌診断用製剤を製造するための抗体又は抗体の断片の用途を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、
ａ）個体から試料を取得する段階；
ｂ）前記試料において抗体又は抗体の断片でＷＲＳタンパク質の発現量を測定する段階；及び
ｃ）前記ｂ）段階で測定したタンパク質の発現量が増加する場合、癌であると判断する段階；を含む癌診断方法を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、感染疾患又は感染合併症診断用製剤を製造するための抗体又は抗体の断片の用途を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、
ａ）個体から試料を取得する段階；
ｂ）前記試料において抗体又は抗体の断片でＷＲＳタンパク質の発現量を測定する段階；及び
ｃ）前記ｂ）段階で測定したタンパク質の発現量が増加する場合、感染疾患又は感染合併症であると判断する段階；を含む感染疾患又は感染合併症診断方法を提供する。
以下、本発明に対して詳細に説明する。
本発明は、ＷＲＳ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）タンパク質において配列番号２で表されるアミノ酸配列のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体の断片を提供する。
本発明において、「ＷＲＳ」は、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）を意味し、トリプトファンｔＲＮＡ連結酵素（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ－ｔＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ）、ＴｒｐＲＳ、ＷＡＲＳなどとしても知られている。ＷＲＳは、アミノ酸トリプトファンとｔＲＮＡのアミノアシル化（ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ）反応を媒介する酵素である。ＷＲＳは、ヒトではＷＡＲＳ遺伝子によって暗号化され、タンパク質のアミノ酸配列とｍＲＮＡ塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）ＮＰ＿００４１７５．２（タンパク質）、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１８４．３（ｍＲＮＡ塩基配列）などで公知となっている。ＷＲＳには、細胞質型（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｏｒｍ）（ＷＡＲＳ又はｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）とミトコンドリア型（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｏｒｍ）（ＷＡＲＳ２又はｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）の二つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）がある。本発明におけるＷＲＳは、好ましくは細胞質型である。
本発明において、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ）とも呼ばれ、抗原に選択的に作用し、生体免疫に関与するタンパク質の総称である。自然で発見される全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、一般に、多くのドメインからなるポリペプチドである軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＬＣ）及び重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＨＣ）の２個のペアからなったり、これらのＨＣ／ＬＣの２個のペアからなる構造が基本単位として構成される。哺乳類の抗体を構成する重鎖の種類としては、ギリシア文字α、δ、ε、γ及びμで表される５つの類型があり、重鎖の種類によってそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭなどの異なる種類の抗体を構成するようになる。哺乳類の抗体を構成する軽鎖の種類としては、λ及びκで表される２つの種類が存在する。
抗体の重鎖と軽鎖は、構造的にアミノ酸配列の可変性によって可変領域と不変領域に区分される。重鎖の不変領域は、抗体の種類によってＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧ抗体）及びＣＨ４（ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体）などの３個又は４個の重鎖不変領域で構成されており、軽鎖は、１個の不変領域であるＣＬで構成されている。重鎖と軽鎖の可変領域は、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の一つのドメインからなっている。軽鎖と重鎖は、それぞれの可変領域と不変領域が並んで整列され、１個の共有ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）によって連結され、軽鎖と結合した二つの分子の重鎖は、２個の共有ジスルフィド結合を通じて連結されることによって全抗体の形態を形成する。全抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域を通じて抗原に特異的に結合し、全抗体は、２個の重鎖及び軽鎖のペア（ＨＣ／ＬＣ）で構成されているので、一つの分子の全抗体は、二つの可変領域を通じて同一の二つの抗原に結合する２価の単一特異性を有するようになる。抗原に結合する抗体可変領域を抗体の抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）と言い、抗原の表面で抗体によって認識される部分を抗原決定部（ｅｐｉｔｏｐｅ）と言う。
抗原結合部位を含んでいる抗体の可変領域は、配列可変性の少ない骨格部位（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と、配列可変性の高い過可変性部位（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）である相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）とに細分化される。ＶＨとＶＬは、それぞれ３個のＣＤＲ及び４個のＦＲがＮ－末端からＣ－末端の方向にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順に配列されている。抗体の可変領域内でも、配列可変性が最も高いＣＤＲは、抗原と直接結合する部位であって、抗体の抗原特異性において最も重要である。
本発明において、前記抗体又は抗体の断片は、ＷＲＳタンパク質又はその変異体タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体の断片であって、配列番号１で表されるＷＲＳタンパク質の４８番目乃至１０４番目のアミノ酸配列（配列番号２）を含むポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする。
本発明の「抗体」は、「抗ＷＲＳ抗体」、「ヒト化抗ＷＲＳ抗体」及び「変形ヒト化抗ＷＲＳ抗体」、「ａｎｔｉ－ＷＲＳ ａｎｔｉｂｏｄｙ」とも表現可能であり、本発明で最も広義の意味で使用される。具体的には、単一クローン抗体（モノクローナル抗体、完全長単一クローン抗体を含む）、多クローン抗体（ポリクローナル抗体）、多重特異抗体（例えば、二重特異抗体）、及び抗体の断片（例えば、可変領域及び目的とする生物活性（例えば、ＷＲＳとの結合）を示す抗体の他の部分）を含む。
本発明の抗体は、ＷＲＳと選択的に結合できるように特定のアミノ酸配列が軽鎖及び重鎖ＣＤＲに含まれている抗体であって、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を全て含み、好ましくはモノクローナル抗体であり得る。また、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化された抗体、及びヒト抗体を全て含み、好ましくはヒト抗体であり得る。
本発明のモノクローナル抗体は、実質的に同質の抗体の集団から取得された抗体を示し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、可能な天然的に存在する突然変異を除いては同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原決定部に非常に特異的に結合する。
本発明において、「モノクローナル」という用語は、抗体が実質的な相同性集団から取得されること及び抗体の特性を示しており、必ずしも抗体を特定の方法によって生産しなければならないことを意味するのではない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、文献（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５）に最初に記載されたハイブリドーマ方法によって製造したり、又は再組換えＤＮＡ方法（参照：米国特許第４，８１６，５６７号）によって製造することができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、文献（参照：Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７及びＰｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１）に記述された技術を用いてファージ抗体ライブラリから分離することができる。
本発明の抗体は、具体的にはキメラ抗体を含み、この場合、重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の種から起源したり、又は特定の抗体の相応する配列と同一であったり相同性を示すが、残りの部分は、本発明の抗体が好ましい生物学的活性（例えば、ＮＲＳとの選択的結合）を示す限り、他の種から起源したり、又は他の抗体の相応する配列と同一であったり相同性を示すものであっても構わない（米国特許第４，８１６,５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５）。
ヒト化された抗体は、ヒト及び非ヒト（例：マウス、ラット）抗体の配列を全て含む抗体であって、一般に、抗原決定部と結合する部位（ＣＤＲ）を除いた残りの部分はヒト抗体のものであって、抗原決定部と結合する部位（ＣＤＲ）は非ヒト由来の配列を含むことができる。完全なヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を言い、マウス、マウス細胞、又はマウス細胞から起源したハイブリドーマで生産したり、ファージディスプレイ方法で生産することができる。
本発明に係る抗体又は抗体の断片は、好ましくは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ２、及び配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ２、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ３を含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含むことを特徴とすることができる。
また、本発明に係る抗体又は抗体の断片は、前記軽鎖及び重鎖のＣＤＲ構成を含みながら、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；を含むことを特徴とすることができる。
本発明に係る抗体又は抗体の断片は、前記ＣＤＲ、ＶＨとＶＬ、又は軽鎖と重鎖の構成を有するものであればその種類に制限がなく、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤ形態の抗体であり得る。また、抗体は、好ましくはＩｇＧ形態の抗体であり得る。
本発明において、抗体の断片は、ＷＲＳ特異的結合力を維持している抗体の断片を意味し、好ましくは、前記断片は、親抗体のＷＲＳタンパク質親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上を保有する。具体的には、前記断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖなどの形態であり得る。
Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）は、抗体の抗原結合断片であって、重鎖と軽鎖のそれぞれの一つの可変ドメインと不変ドメインで構成されている。Ｆ（ａｂ'）２は、抗体をペプシンで加水分解させることによって生成される断片であって、二つのＦａｂが、重鎖ヒンジにおいてジスルフィド結合で連結された形態をしている。Ｆ（ａｂ'）は、Ｆ（ａｂ'）２断片のジスルフィド結合を還元して分離させたＦａｂに重鎖ヒンジが付加された形態の単量体抗体の断片である。Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖と軽鎖のそれぞれの可変領域のみで構成された抗体の断片である。ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）が柔軟なペプチドリンカーで連結されている再組換え抗体の断片である。ダイアボディは、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬが非常に短いリンカーで連結され、互いに結合できなく、同一の形態の他のｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨにそれぞれ結合することによって二量体を形成している形態の断片を意味する。
本発明の抗体又はその断片は、その生物学的活性を実質的に変更しない保存的アミノ酸置換（抗体の保存的変異体という）を含むことができる。
また、上述した本発明の抗体又はその断片は、酵素、蛍光物質、放射線物質及びタンパク質などと接合されたものであり得るが、これに限定されない。また、抗体に前記物質を接合する方法は当業界によく知られている。
本発明の抗体は、ヒトを含む哺乳動物、鳥類などを含む任意の動物から由来したものであり得る。好ましくは、前記抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリの抗体であり得る。また、前記抗体は、最も好ましくはヒト又はマウスであり得る。
前記ハイブリドーマ細胞は、当業界に公知となった方法を用いて製造することができる。具体的には、前記ハイブリドーマ細胞は、免疫原である配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドを動物に免疫させ、前記被免疫動物から由来した抗体生産細胞であるＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドーマを製造した後、そのうち配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択する方法で製造することができる。前記被免疫動物としては、マウスのみならず、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラット又はウサギなどの動物を使用することができる。
前記被免疫動物を免疫させる方法としては、当業界に既に公知となった方法を使用することができる。例えば、マウスを免疫させる場合、１回に１μｇ乃至１００μｇの免疫原を同量の生理食塩水及び／又はフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ ａｄｊｕｖａｎｔ）などの抗原補助剤で乳化させ、前記被免疫原動物の腹部の皮下又は腹腔内に２週～５週ごとに２回～６回接種させる方法で行うことができる。被免疫動物を免疫させた後は、最終免疫から３日～５日後に脾臓又はリンパ節を摘出し、当業界に既に公知となっている細胞融合法により、融合促進剤の存在下でこれらの組織に含まれているＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させるようになる。前記融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの物質を使用することができる。前記骨髄腫細胞としては、例えば、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ－１、Ｐ３ｘ６３．Ａｇ ８．６５３、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４などのマウス由来細胞、ＡＧ１、ＡＧ２などのラット由来細胞を使用することができる。また、前記当業界に公知となった細胞融合法は、例えば、Ｂ細胞と骨髄腫細胞を１：１～１０：１の比率で混合させ、これに分子量１，０００～６,０００のＰＥＧを１０％～８０％の濃度で添加し、３０℃～３７℃で１分～１０分間培養する方法で行うことができる。また、前記配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、例えば、ハイブリドーマのみが生存可能なＨＡＴ培地などの選択培地で培養し、ハイブリドーマ培養上清液中の抗体活性をＥＬＩＳＡなどの方法を用いて測定して選択することができる。最終的に、配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマに対して、限界希釈などの方法によってクローニングを繰り返すことによって選別することができる。
また、本発明は、抗体又は抗体の断片を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。
本発明において、「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド又は核酸と記載されることもあり、各ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又は誘電体（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）、各ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、各ヌクレオチド類似体を用いて生成された前記ＤＮＡ又はＲＮＡの各類似体（例えば、各ペプチド核酸及び非自然的に発生する各ヌクレオチド類似体）及びこれらの各ハイブリッドを含む。前記ポリヌクレオチドは、単一鎖（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）又は二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）になり得る。前記ポリヌクレオチドは、前記配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドに特異的なＣＤＲ構成、又はＶＨとＶＬの構成を有する重鎖及び軽鎖からなる抗体を暗号化する塩基配列を意味する。
本発明の抗体又はその断片を暗号化するポリヌクレオチドは、当業界によく知られている方法によって得ることができる。例えば、本発明の抗体又はその断片を暗号化するポリヌクレオチドは、前記抗体の重鎖及び軽鎖の一部分又は全部をコーディングするＤＮＡ配列又は該当のアミノ酸配列に基づいて、当分野によく知られているオリゴヌクレオチド合成技法、例えば、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）法などを用いて合成することができる。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明の「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、本発明の抗体又はその断片の再組換え生産のために、本発明のポリヌクレオチドの複製又は発現の目的で用いられ、一般に、シグナル配列、複製起源、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終決配列のうち一つ以上を含む。本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターであり得る。また、本発明のベクターは、さらに好ましくは、調節シーケンス、例えば、プロモーターに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含むベクターであり得る。
ベクターの一種であるプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）は、外部の各ポリヌクレオチド断片が結合され得る線形又は円形の二重螺旋のＤＮＡ分子を意味する。ベクターの他の形態は、ウイルス性ベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ；例えば、複製－欠乏レトロウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、各アデノウイルス及び各アデノ－連関ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ））であって、ここで、付加の各ＤＮＡ断片は、前記ウイルス性ゲノム（ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ）内に導入され得る。特定の各ベクターは、その内部にこれらが導入される宿主細胞（例えば、バクテリア由来（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｒｇｉｎ）及びエピソームの哺乳類ベクター（ｅｐｉｓｏｍａｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）を含む各バクテリア性ベクター（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ））内での自家複製（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を行うことができる。他の各ベクター（例えば、非エピソームの各哺乳動物ベクター（ｎｏｎ－ｅｐｉｓｏｍａｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｅｃｔｏｒｓ））は、宿主細胞内への導入によって宿主細胞のゲノム内に統合され、それによって前記宿主ゲノムと共に複製される。
本発明において、前記「ベクター」は、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」と同一の意味で理解可能であり、これは、前記ポリヌクレオチドの発現可能なベクターの一つの形態である。一つのポリヌクレオチドシーケンスは、調節シーケンスが前記ポリヌクレオチドシーケンスの発現（例えば、水準、タイミング又は発現の位置）に影響を与える場合、前記調節シーケンス（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に「作動可能に連結」される。前記調節シーケンスは、それが作動可能に連結される核酸の発現（例えば、水準、タイミング又は発現の位置）に影響を与える配列である。前記調節シーケンスは、例えば、調節された核酸に直接、又は、一つ又はそれ以上の他の分子（例えば、前記調節シーケンス及び／又は前記核酸に結合する各ポリペプチド）の作用を通じてその影響を及ぼすことができる。前記調節シーケンスには、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）及び他の各発現調節要素が含まれる。本発明のベクターは、好ましくは、ｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ－ＴＯＰＯ及びｐｃＤＮＡＴＭ３．３－ＴＯＰＯであり得る。
また、本発明は、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
本発明の細胞は、本発明の発現ベクターに含まれた抗体又はその断片を暗号化するポリヌクレオチドを発現するのに使用可能な細胞であれば、その種類が特に制限されない。本発明に係る発現ベクターで形質転換された細胞（宿主細胞）は、原核生物（例えば、大腸菌）、真核生物（例えば、酵母又は他の菌類）、植物細胞（例えば、タバコ又はトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター（ｈａｍｓｔｅｒ）細胞、ラット細胞（ｒａｔ ｃｅｌｌ）、マウス細胞（ｍｏｕｃｅ ｃｅｌｌ）、昆虫細胞又はこれらから由来したハイブリドーマでもあり得る。好ましくは、本発明に係る発現ベクターで形質転換された細胞（宿主細胞）は、ヒトを含む哺乳類から由来した細胞であり得る。
本目的に適した原核生物は、グラム陰性又はグラム陽性の有機体、例えば、エンテロバクテリアシー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含み、例えば、Ｅ．コライ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）及びプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）などのエスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、Ｂ．サブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などのバシリ（Ｂａｃｉｌｌｉ）、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）を含む。本発明の細胞は、本発明のベクターを発現可能なものであれば特に制限されないが、好ましくはＥ．コライであり得る。
本発明の細胞として、真核生物は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が最も頻繁に使用される。しかし、多くの他の属、種及び菌株としては、これに限定されないが、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス宿主、例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ウィッカラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びＫ．マークシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４））；ノイロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワンニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワンニオマイセス・オキシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；及びフィラメント性真菌、 例えば、ニューロスポーラ、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が使用可能である。
前記「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」という用語は、外来性ポリヌクレオチドの導入による宿主細胞の遺伝子型の変形を意味し、その形質転換に使用された方法と関係なく、外来性ポリヌクレオチドが宿主細胞内に導入されたことを意味する。宿主細胞内に導入された外来性ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム内に統合されて維持されたり、宿主細胞のゲノム内に統合されない状態で維持され得るが、本発明は両者を全て含む。
本発明に係るＷＲＳタンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片を発現できる再組換え発現ベクターは、当業界に公知となった方法、例えば、これに限定されないが、一時的形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム媒介形質感染（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン－媒介形質感染（ＤＥＡＥ ｄｅｘｔｒａｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン－媒介形質感染（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）及び細胞内に核酸を流入させるための公知の方法によって抗体又はその断片を生産するための細胞の内部に導入して形質転換することができる。
また、本発明の細胞は、本発明のポリヌクレオチド又はこれを含むベクターで形質転換されたり、又は形質感染され得る培養された細胞であって、これは、継続して前記宿主細胞内で発現され得る。再組換え細胞は、発現されなければならないポリヌクレオチドで形質転換されたり、又は形質感染された細胞を言う。また、本発明の細胞は、本発明のポリヌクレオチドを含むが、調節シーケンスが前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されるように前記細胞内に導入されない限り、これを所望の水準に発現しない細胞になり得る。
本発明の細胞は、多様な培地で培養され得る。商業的に利用可能な培地、例えば、ハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ１Ｏ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、及びダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）改質イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）が細胞を培養するのに適している。前記培地には、必要であれば、ホルモン及び／又は他の成長因子、塩、緩衝液、ヌクレオチド、抗生剤、微量元素、及びグルコース又は同等のエネルギー源が追加され得る。
本発明は、前記細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下で培養し、軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階、及び前記細胞又はこれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含むＷＲＳに結合する抗体又はその断片の生産方法を提供する。
本発明において、生産方法の細胞に対しては上述した通りであり、本発明の抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含んでいる。前記生産方法のポリペプチドは、本発明の抗体又はその断片自体であってもよく、本発明の抗体又はその断片以外の他のアミノ酸配列が追加的に結合されたものであってもよい。
この場合、他のアミノ酸配列は、本技術分野の通常の技術者によく知られている方法を用いて本発明の抗体又はその断片から除去することができる。前記培養は、前記細胞の種類によって培地組成及び培養条件が変わり得る。また、培地組成及び培養条件は、本技術分野の通常の技術者が適宜選択及び調節することができる。
前記抗体分子は、細胞の細胞質内に蓄積されたり、細胞から分泌されたり、適切な信号配列によってペリプラズム又は細胞外培地（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）に標的化（ｔａｒｇｅｔｅｄ）され得る。また、前記抗体分子は、ペリプラズム又は細胞外培地に標的化されることが好ましい。また、生産された抗体分子を本技術分野の通常の技術者によく知られている方法を用いてリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）させ、機能的形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を持たせることが好ましい。前記ポリペプチドの回収は、生産されたポリペプチドの特性及び細胞の特性によって変わり得る。また、ポリペプチドの特性及び細胞の特性は、本技術分野の通常の知識を有する者が適宜選択及び調節することができる。
前記ポリペプチドは、細胞内、周辺細胞質空間に生産されたり、培地内に直接分泌され得る。ポリペプチドが細胞内で生産されると、この細胞は、第１段階としてタンパク質を放出するために破壊され得る。粒子状破片、宿主細胞又は溶解された断片は、例えば、遠心分離又は限外ろ過によって除去される。抗体が培地内に分泌される場合、このような発現システムからの上清液を、一般に先に商業的に利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）又はミリポアペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）の限外ろ過ユニットを用いて濃縮させる。タンパク質分解を抑制するために、プロテアーゼ抑制剤、例えば、ＰＭＳＦが任意の先行段階に含まれてもよく、偶発的な汚染物の成長を防止するために抗生剤が含まれてもよい。細胞から製造された抗体は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができ、本発明の抗体は、好ましくは親和性クロマトグラフィーを通じて精製することができる。
本発明の抗体又はその断片は、ＷＲＳと特異的に結合するので、例えば、特定の細胞、組織、又は血清内のＷＲＳ発現を検出する、ＷＲＳタンパク質を検出して定量するための診断分析に有用である。
したがって、本発明は、抗体又はその断片を試料と接触させる段階、及び前記抗体又はその断片を検出する段階を含むＷＲＳ特異的検出方法を提供する。前記抗体又はその断片を「検出」するために、抗体又はその断片は、一般に検出可能なモイアティで標識され得る。
例えば、放射性同位元素又は蛍光標識での標識は、文献［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ 1 ａｎｄ ２，１９９１，Ｃｏｌｉｇｅｎ等，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ］に記述された技術を用いて行うことができる。放射能は、例えば、シンチレーション計数（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）によって測定され得る。また、蛍光は、蛍光計を用いて定量され得る。又は、多様な酵素－基質標識が利用可能であり、前記酵素的標識の例は、ショウジョウハエルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）、２，３－ジヒドロフタルアジネジオン、マレートジヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ（ｕｒａｓｅ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）、ヘテロサイクリックオキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどを含む。抗体に酵素を接合させる技術は、例えば、文献［Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ等，１９８１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ－抗体Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ ＆ Ｈ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，７３：１４７－１６６］に記述されている。
標識は、多様な公知の技術を用いて抗体に間接的に接合され得る。例えば、抗体は、ビオチンに接合され得る。また、前記言及した３種の広範囲なカテゴリーに属する任意の各標識がアビジンと、又はその反対に接合され得る。ビオチンは、アビジンに選択的に結合し、したがって、この標識は、このような間接的な方式で抗体に接合され得る。又は、抗体への標識の間接的接合を達成するために、抗体は、小さいハプテン（ｈａｐｔｅｎ）（例えば、ジゴキシン［ｄｉｇｏｘｉｎ］）と接合され得る。また、前記言及した互いに異なる類型の各標識の一つが抗－ハプテン抗体に接合され得る（例えば、抗－ジゴキシン抗体）。よって、抗体に対する標識の間接的接合が達成され得る。
本発明の抗体又はその断片は、競争的結合分析、直接及び間接サンドイッチ分析、及び免疫沈降分析などの任意の公知の分析方法に使用され得る。
本発明の抗体又はその断片は、診断キット、すなわち、診断分析を行うための診断キット、すなわち、使用説明書と共に予め指定された量で各試薬の包装された組み合わせに使用され得る。抗体が酵素で標識された場合、キットは、基質及び発色団又は蛍光団を提供する基質前駆体として酵素によって要求される補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）を含むことができる。また、安定化剤、緩衝液（例えば、遮断緩衝液又は溶解緩衝液）などの他の添加剤が含まれ得る。多様な試薬の相対的な量は、分析の敏感度を十分に最適化させる試薬の溶液内の濃度を提供するために幅広く変化し得る。試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供するようになる賦形剤を含む、一般に凍結・乾燥した乾燥粉末として提供され得る。
本発明の抗体によって検出されるＷＲＳは、細胞外に分泌され、サイトカイン活性を示すＡＲＳのうち最も先に報告されており、最近までも、大腸癌を始めとした多くの癌で重要なバイオマーカーとしてのＷＲＳの可能性に対する多くの論文が発表されている（Ｇｈａｎｉｐｏｕｒ，Ａ ｅｔ ａｌ Ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎ ｃｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．１８（１１），２９４９－２９５５）。
したがって、ＷＲＳは、検出を通じて特定の癌の診断、病気の進行状態及び治療前後の予後評価のための診断マーカーとして使用され得る。本発明に係る癌の診断及び予後評価は、生物学的試料のうちＷＲＳタンパク質を検出することによって行うことができる。
したがって、本発明は、本発明の抗体又はその断片を有効成分として含む癌診断用組成物を提供する。
前記癌は、その種類が特に制限されなく、例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部癌、皮膚又は眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門付近癌、結腸癌、乳癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌、膣癌、陰門癌腫、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、ＣＮＳ腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髓腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫であり得る。好ましくは、前記癌は、例えば、大腸癌や膵臓癌であり得る。
一方、ＷＲＳは、バクテリア、ウイルス又はカビによる感染によって発現水準が感染初期から急速に増加し、感染合併症として肺炎や敗血症などの症状が表れるようになる場合、正常人対照群よりも著しく増加することが報告された。さらに、敗血症患者の場合、ＷＲＳの発現水準は、敗血症の重症度及び予後と高い相関関係を有しており、ＷＲＳは、感染性炎症でのみ増加するので、感染性炎症疾患と非感染性炎症疾患を迅速且つ正確に区分することができ、新しい感染疾患及び感染合併症での診断マーカーとしての価値が非常に高い。特に、バクテリア又はカビ感染による敗血症又は敗血症性ショック患者の血清におけるＷＲＳの量が健康な正常人対照群の血清に比べて著しく増加し、グラム－陰性菌バクテリア、グラム－陽性菌バクテリア及びカビ感染による敗血症患者のそれぞれにおいてＷＲＳの増加傾向に統計学的に有意な差がないので、グラム－陰性菌バクテリア、グラム－陽性菌バクテリア又はカビ感染による敗血症の診断にＷＲＳが全て有用に使用され得る。特に、全身性炎症反応症侯群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｙｍｐｔｏｍ、ＳＩＲＳ）、非感染性慢性炎症疾患である喘息及び関節リウマチ、シェーグレン症侯群などの自家免疫疾患患者の血清において、ＷＲＳの量は、正常人対照群と比較して統計的に有意な差がないと知られており、したがって、ＷＲＳの発現水準は、全ての炎症反応で増加するのではなく、バクテリア、ウイルス又はカビ感染で誘発された炎症反応でのみ特異的に増加する。また、ＷＲＳの水準は、敗血症患者よりも敗血症性ショック患者でさらに増加し、ＷＲＳの発現水準が敗血症の重症度とも関連している。すなわち、ＷＲＳの発現水準が高いほど、敗血症の症状が激しいと判断することができる（韓国公開特許第１０－２０１７－００２７３１３）。すなわち、生物学的試料のうちＷＲＳの発現程度を検出することによって、感染疾患又は感染合併症を診断し、その予後を予測することができる。
したがって、本発明は、本発明の抗体又はその断片を有効成分として含む感染疾患又は感染合併症診断用組成物を提供する。
前記生物学的試料には、血液及び生物学的起源のその他の液状試料、生検標本、組織培養などの固形組織試料又はこれから由来した細胞が含まれる。より具体的には、前記生物学的試料は、例えば、これに限定されないが、組織、抽出物、細胞溶解物、全血、血漿、血清、唾、眼球液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水液、滑液、腹膜液などであり得る。前記試料は個体から取得され得る。前記個体は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを含む。前記試料は、検出に使用する前に前処理することができる。また、前記試料は、例えば、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加などを含むことができる。また、前記試料から核酸及びタンパク質を分離し、これを検出に使用することができる。
前記検出に関しては、上記で説明した通りである。
本発明において、感染は、一つ又は二種類以上の外因性バクテリア（細菌、グラム陰性菌又はグラム陽性菌を全て含む。）、ウイルス、カビ（菌）が体中に侵入し、定着、増殖、寄生状態になることを意味し、感染疾患は、病原体の感染の結果として生体で反応を起こすことによって発生する全ての疾患であり得る。感染疾患の結果として表れる反応としては、炎症、痛症、発熱、疲労感、浮腫、血圧降下などがあり得る。好ましくは、本発明の感染疾患は、サルモネラ症（ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、食中毒、腸チフス、パラチフス、肺炎、肺結核、結核、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症性ショック（ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、尿路感染、膀胱炎、腎盂腎炎、尿道炎、前立腺炎、上気道感染、中耳炎であり得、さらに好ましくは、サルモネラ症、食中毒、肺炎、敗血症、敗血症性ショックであり得、最も好ましくは、敗血症又は敗血症性ショックであり得る。
本発明において、前記敗血症は、感染疾患の合併症として表れる全身性炎症反応症侯群であって、原因を早期に迅速且つ正確に診断できない場合は、重症敗血症（ｓｅｖｅｒｅ ｓｅｐｓｉｓ）や敗血症性ショック、肺、腎臓、肝臓、循環器などの機能障害まで引き起こされる多臓器機能障害症侯群（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＯＤＳ）、播種性血管内凝固症侯群（ＤＩＣ）、急性呼吸促迫症侯群（ＡＲＤＳ）又は急性腎不全（ＡＫＩ）に進行して死亡し得る致命的な疾患である。
本明細書で使用される敗血症は、敗血症の最終段階と関連した敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック及び敗血症に伴う多臓器機能障害症侯群（ＭＯＤＳ）、播種性血管内凝固症侯群（ＤＩＣ）、急性呼吸促迫症侯群（ＡＲＤＳ）又は急性腎不全（ＡＫＩ）の発病を含むが、これに制限されなく、敗血症の全ての段階を含む。
また、本発明は、癌診断用製剤を製造するための抗体又は抗体の断片の用途を提供する。
また、本発明は、
ａ）個体から試料を取得する段階；
ｂ）前記試料において抗体又は抗体の断片でＷＲＳタンパク質の発現量を測定する段階；及び
ｃ）前記ｂ）段階で測定したタンパク質の発現量が増加する場合、癌であると判断する段階；を含む癌診断方法を提供する。
一つの実施様態において、本発明は、下記の段階を含む個体（被検体）の癌診断及び治療方法を提供する：
ｉ）個体から試料を取得する段階；
ｉｉ）前記試料からＷＲＳタンパク質の発現水準を測定する段階；
ｉｉｉ）前記ｉｉ）段階で測定されたタンパク質が全て発現された場合、癌であると判断する段階；及び
ｉｖ）前記判断された個体に癌を治療するための治療薬物（抗癌剤など）を投与したり、放射線を照射したり、手術を行うことによって癌を治療する段階。
前記ｉ）乃至ｉｖ）段階を含む各方法は、上述したａ）乃至ｃ）段階を含む方法に準じて理解される。
前記ｉｖ）段階は、前記ｉｉｉ）段階で疾患が診断された個体に抗癌剤などの治療薬物を投与したり、放射線を照射したり、手術などを行うことによって前記疾患の治療を行う段階である。
また、本発明は、感染疾患又は感染合併症診断用製剤を製造するための抗体又は抗体の断片の用途を提供する。
また、本発明は、
ａ）個体から試料を取得する段階；
ｂ）前記試料において抗体又は抗体の断片でＷＲＳタンパク質の発現量を測定する段階；及び
ｃ）前記ｂ）段階で測定したタンパク質の発現量が増加する場合、感染疾患又は感染合併症であると判断する段階；を含む感染疾患又は感染合併症診断方法を提供する。
一つの実施様態において、本発明は、下記の段階を含む個体（被検体）の感染疾患又は感染合併症診断及び治療方法を提供する：
ｉ）個体から試料を取得する段階；
ｉｉ）前記試料からＷＲＳタンパク質の発現水準を測定する段階；
ｉｉｉ）前記ｉｉ）段階で測定されたタンパク質が全て発現された場合、感染疾患又は感染合併症であると判断する段階；及び
ｉｖ）前記判断された個体に感染疾患又は感染合併症を治療するための治療薬物を投与したり、手術を行うことによって感染疾患又は感染合併症を治療する段階。
前記ｉ）乃至ｉｖ）段階を含む各方法は、上述したａ）乃至ｃ）段階を含む方法に準じて理解される。
前記ｉｖ）段階は、前記ｉｉｉ）段階で疾患が診断された個体に治療薬物を投与したり、手術などを行うことによって前記疾患の治療を行う段階である。
本発明の前記「治療」は、癌又は癌の症状／感染疾患、感染合併症又はその症状を改善することを包括的に称し、これは、前記疾患を治癒したり、前記疾患を実質的に予防したり、又は前記疾患の状態を改善することを含むことができ、前記疾患から始まった一つの症状又はほとんどの症状を緩和、治癒又は予防することを含むが、これに制限されない。
本発明において、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含有する」又は「特徴とする」と同一に使用され、組成物又は方法において、言及していない追加的な成分要素又は方法段階などを排除しない。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、別途に記載されていない追加的な要素、段階又は成分などを除外することを意味する。「必須的に～からなる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、組成物又は方法の範囲において、記載された成分要素又は段階と共に、その基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない成分要素又は段階などを含むことを意味する。
本発明の抗体又はその断片は、ＷＲＳに特異的に結合し、同一のＡＲＳファミリーを含む他のタンパク質との交差反応性がなく、ＷＲＳ検出及び抑制が可能であるので、ＷＲＳ検出及びＷＲＳと関連する疾患である癌、炎症性疾患又は感染疾患の診断に効果的に使用することができる。
本発明で選別されたＷＲＳに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列及びこれを暗号化するヌクレオチド配列を示した図である。
配列番号１のアミノ酸配列で表されるＷＲＳタンパク質（１－４７１）及びその各断片ペプチド（４８－４７１、１－１０４、１－１５４及び４８－１５４）を製作した後、電気泳動を通じて大略的な分子量及びバンド位置を確認した結果を示した図である。
本発明の実施例で製造されたモノクローナル抗体が特異的に認識するＷＲＳ内のポリペプチド配列を確認するために、本発明の抗体を用いたウェスタンブロッティングを通じてＷＲＳタンパク質（１－４７１）及びその各断片ペプチド（４８－４７１、１－１０４、１－１５４及び４８－１５４）を検出した結果を示した図である。
図３の実験結果で確認されたウェスタンブロッティング実験結果に基づいて、本発明の実施例で製造されたモノクローナル抗体が特異的に認識するＷＲＳ内のポリペプチドを表示した模式図である。
本発明の実施例で製造されたモノクローナル抗体のＷＲＳに対する結合特異性を２種の商用抗体と比較した結果を示した図である。
本発明の実施例で製造されたモノクローナル抗体の交差反応性の有無を間接ＥＬＩＳＡアッセイ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ）で評価した結果を示した図である。
以下、本発明を下記の実施例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明がこれらによって制限されることはない。
実施例１：モノクローナル抗体の製造
（１）ハイブリドーマ細胞の製作
１）動物免疫化と細胞融合
－免疫原の準備：１．５ｍｇ～２ｍｇのＷＲＳタンパク質（純度＞７５％、濃度＞０．４ｍｇ／ｍｌ）
－動物免疫化：Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫原を接種し、抗体生産を誘発した。
－細胞融合：マウスから得たＢ細胞とマウスの骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ）を電気融合（ｅｌｅｃｔｒｏ－ｆｕｓｉｏｎ）し、少なくとも１０，０００個のハイブリドーマ細胞を得た。
２）ハイブリドーマ細胞の選別
－１次選別：間接ＥＬＩＳＡを通じて抗原に結合する抗体を生産するハイブリドーマ細胞を選別した。
－２次選別：１次選別で得た陽性クローンを用いて、ウェスタンブロッティングで抗原に結合するハイブリドーマ細胞株１種を選別し、選別されたハイブリドーマ細胞株で生産される抗体を４Ｄ１０Ｇ６と命名した。
－アイソタイピング（Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）：選別作業中、最も結果が良いクローン５個を選び、アイソタイピングを進行した。
３）サブクローニング（Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）、細胞増量、凍結保管、抗体生産
－サブクローニング、細胞増量、凍結保管：結果が良いクローンに対してサブクローニング、細胞増量、凍結保管を進行した。
－抗体生産：選別作業中、最も結果が良いハイブリドーマ細胞株において少なくとも２ｍｇの抗体が生産されるように抗体を生産した。
２．腹水（Ａｓｃｉｔｅｓ）の製作
１）マウスが３日以上の適応期間を経ると、プリスタンアジュバント（Ｐｒｉｓｔａｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を１００μｌ／ｍｏｕｃｅで投与した。ハイブリドーマ細胞株は、プリスタンアジュバントを投与してから５日～７日が経過したときに注入できるように培養した。
２）培養したハイブリドーマ細胞株を５０ｍｌのチューブに集め、１０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄して遠心分離した。
３）遠心分離が終了すると、上清液は、サクションで除去した後、必要な量の細胞が１００μｌに入るように計算し、１Ｘ ＰＢＳを入れてよく混ぜた後、これを１．５ｍｌのチューブに移して収容した。
４）１ｍｌのシリンジに前記溶液を置いた後、針が上に向かうようにし、シリンジ内の空気を除去した。
５）Ｂａｌｂ／ｃマウス１匹当たり１００μｌの溶液を腹腔に注射した後、これをケージに入れ、腹水が充填されるかどうかを観察した。
６）ハイブリドーマ細胞株を注入したマウスに対して、注入してから５日が経過した後からは毎日観察し、腹が膨らんだかどうかを確認した。
７）腹が膨らんだ場合、注射針が２３Ｇ以下である製品（３ｍｌ又は５ｍｌのシリンジ）を用いてマウスの腹腔を刺し、腹水を収集した。
８）収集し、チューブに入れた腹水に対しては、赤血球が凝集されるようにＲＴで１０分間インキュベートして遠心分離した。
９）遠心分離が終了すると、上清液のみを新しい１．５ｍｌのチューブに入れ、これを－７０℃で保管した。
３．抗体の生産
１）生産した腹水は、－７０℃で取り出し、４℃で溶かし、精製する抗体のサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）を確認し、使用するビードを決定した。使用されるビードの量は、腹水の０．５ｖｏｌｕｍｅであった。
２）５ｍｌのクロマトグラフィーカラムによく混ぜたプロテインＡビードやＧビードを計算した通りに入れ、１Ｘ ＰＢＳ ５ｍｌをカラムに流し、ビード洗浄を進行した。
３）洗浄が全て終了すると、溶かした腹水を入れ、カラムのキャップを被せた。
４）ビードと抗体が結合されるように、４℃で１時間にわたって回転結合（ｒｏｔａｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）を進行した。
５）回転結合が終了した後、全ての溶液はフロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）過程を経た。
６）１Ｘ ＰＢＳ １００ｍｌを入れ、カラム洗浄を進行した。
７）１．５ｍｌのチューブに中和バッファー（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を１００μｌずつ入れ、カラムに１ｍｌのＩｇＧ溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を加えた後、ＩｇＧが溶出されると直ぐ中和できるようにした。同一の条件で、合計１０個の断片（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を受け取った。
８）各断片の一部を１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングし、ゲル染色を通じてバンドを確認した。染色する間、断片は４℃で保管した。
９）バンドが明確な断片を集め、透析チューブ（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｕｂｉｎｇ）に入れ、クリップで漏れないように密封した。１Ｘ ＰＢＳ １Ｌが入っているビーカーに透析チューブと攪拌子（ｓｔｉｒｒｅｒ ｂａｒ）を入れ、１時間にわたって４℃でスターラー（ｓｔｉｒｒｅｒ）を用いて透析を進行した。
１０）新しい１Ｘ ＰＢＳ １Ｌを用いて、一晩中（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）（１５時間）前記９）と同じ条件で透析を進行した。
１１）翌日、透析チューブで溶液を収集した後、直ぐＢＣＡアッセイキットを用いて定量した。
実施例２：配列シーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
総ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬の技術マニュアルによってハイブリドーマ細胞から分離した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔの技術マニュアルにより、汎用プライマーを用いて総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させた。重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗体の断片は、ＲＡＣＤ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）によって増幅した。増幅された抗体の断片を標準クローニングベクターに別途にクローニングした。コロニーＰＣＲは、正確な大きさの挿入物を有するクローンをスクリーニングするために行われた。正確な大きさのインサートを有する５個以上のコロニーがそれぞれの断片に対して配列化された。異なるクローンの配列を整列し、これらのクローンのコンセンサス配列を提供した。
シーケンシングされた本発明のモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列及びこれを暗号化するポリヌクレオチドの配列の一例を図１に示した。
実施例３：モノクローナル抗体が特異的に結合するＷＲＳ内のポリペプチドの確認
前記実施例１で製造したモノクローナル抗体が認識するポリペプチド領域を確認するために、４７１個のアミノ酸からなる配列番号１のＷＲＳタンパク質（１－４７１）及びタンパク質の断片（４８－４７１、１－１０４、１－１５４及び４５－１５４）を準備した。
１）再組換えＷＲＳタンパク質及びその断片ペプチドを精製するために、ｐＥＴ２８ａベクターにＷＲＳタンパク質及びその断片遺伝子がクローニングされたプラスミドをタンパク質発現のためのコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に形質転換する。
２）形質転換された細胞は、ＬＢ（＋Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）プレートに拡散させた後、３７℃で１５時間培養する。
３）翌日、１個のコロニーを３ｍｌのＬＢ（＋Ｋａｎ）に接種した後、２００ｒｐｍ及び３７℃で３時間培養する。
４）小さく培養した細胞を５００ｍｌのＬＢ（＋Ｋａｎ）に全て入れ、３７℃及び２００ｒｐｍで４時間培養する。
５）０．８＜ＯＤ値＜１と測定されるとき、１ＭのＩＰＴＧストックを２５０μｌずつ入れ（最終的に０．５ｍＭのＩＰＴＧ）、１８℃及び２００ｒｐｍで一晩中（１５時間）誘導する。
６）翌日、誘導を進行した細胞を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
７）上清液を除去し、それぞれのペレットに洗浄バッファー１を１０ｍｌずつ入れ、ペレットを懸濁する。
８）ソニケーター（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）する。ＡＭＰＬ３５％で２秒間進行し、１分間アイスに保管する。この方式を１４回繰り返す。（合計１５回の超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ））
９）１５，０００ｒｐｍ及び４℃で３０分間遠心分離し、ペレットと上清液を分離する。
１０）ポリプレップクロマトグラフィーカラム（Ｐｏｌｙ－Ｐｒｅｐ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎｓ）にＮｉ－ＮＴＡビードを２００μｌ入れ、５ｍｌの洗浄バッファー１を入れた後、均衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）状態にする。
１１）遠心分離が終了した５０ｍｌのチューブにおいて、上清液を０．４５μｍのフィルターを用いてフィルタリングし、ビードが入っているカラムに流入させる。これを再度進行する。
１２）洗浄バッファー１を入れ、洗浄を進行する。
１３）洗浄バッファー２を入れ、洗浄を進行する。
１４）洗浄バッファー３を入れ、洗浄を進行する。
１５）洗浄バッファー４を入れ、洗浄を進行する。
１６）１．５ｍｌのチューブに洗浄が終了したカラムを載せ、溶出バッファーを入れた後、溶出液（ｅｌｕａｔｅ）を集める。
１７）１．５ｍｌのチューブに５Ｘサンプルバッファー及びＤＷを入れてフロースルー過程を行い、洗浄バッファー及び溶出液を入れた後、５分間ヒートブロック（ｈｅａｔ ｂｌｏｃｋ）で沸騰させる。
１８）予め作っておいた１５ｃｏｍｂ及び１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルをカセットに組み立て後、これをタンクに入れ、ゲルの内側と外側のタンクに１Ｘランニングバッファーを充填する。
１９）タンパク質マーカー及びサンプルを順次ローディングする。
２０）ゲルをローディングする間、透析チューブを１００℃で１０分間ＤＷに湯煎する。新しいＤＷに取り替えた後、２回さらに繰り返し、これを冷たくなった１Ｘ ＰＢＳ ２００ｍｌに入れて冷す。
ローディングが終了すると、カセットからゲルを分離し、ゲルが浸るまでインスタントブルー（ｉｎｓｔａｎｔ ｂｌｕｅ）を注ぎ、染色を進行する（図２）。
前記方法を通じて製造したＷＲＳタンパク質、その各断片、及び１次抗体として前記実施例１で製造されたモノクローナル抗体を用いて通常の方法によってウェスタンブロットを行った。
その結果、図３に示したように、前記モノクローナル抗体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＷＲＳタンパク質の１－４７１アミノ酸のうち４８－１０４番目のアミノ酸からなる断片（配列番号２）を特異的に認識することを確認することができた。
実施例４：抗体の結合親和性分析
前記実施例１で製造されたモノクローナル抗体及び商用抗体２種（Ａｂｎｏｖａ、抗－ＷＲＳ抗体（Ｃａｔ＃ Ｈ００００７４５３－Ｍ０２）及びＮｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、抗－ＷＲＳ抗体（Ｃａｔ＃ ＮＢＰ２－３２１８６））の結合親和性を評価するために、配列番号１の全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）ＷＲＳタンパク質に対する間接ＥＬＩＳＡアッセイを行った。
簡略には、次のような方法によって抗体の結合親和性を評価した：
１）ＷＲＳタンパク質は、ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、９６－ウェルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌローディングした後、常温で１時間反応させることによってウェルにコーティングする。
２）コーティングが完了すると、ＰＢＳＴ（０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０）バッファーで１回洗浄した後、３％ＢＳＡ及びＰＢＳＴ（０．１％ ｔｗｅｅｎ－２０）を分注し、常温で１時間反応させることによってブロッキングを行う。
３）ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）が付着した抗体を各濃度によってブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で希釈した後、これを常温で１時間反応させる。
４）ＰＢＳＴ（０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０）で洗浄を行う。
５）ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）－ＨＲＰをブロッキングバッファーで希釈した後、これを常温で１時間反応させる。
６）ＰＢＳＴ（０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０）で５回洗浄を行い、付着していない残余物質を全て除去する。
７）ＴＭＢを５０μｌ／ｗｅｌｌ入れ、これを常温で５分間反応した後、２ＭのＨ２ＳＯ４を同量添加することによって反応を終了させる。
８）分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｓｕｎｒｉｓｅ、Ｔｅｃａｎ）で吸光度を測定する。（４５０ｎｍ）
９）８）の結果を通じてＥＣ５０値を計算する。
これに対する結果を下記の表１に示した。
Figure 0007302093000001
前記表１で確認できるように、本発明に係る抗体は、商用抗体２種と比較してＷＲＳタンパク質に対する親和性が著しく高いことを確認することができた。
実施例５：抗体の結合特異性分析
前記実施例１で製造されたモノクローナル抗体及び商用抗体２種（Ａｂｎｏｖａ、抗－ＷＲＳ抗体（Ｃａｔ＃ Ｈ００００７４５３－Ｍ０２）及びＮｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、抗－ＷＲＳ抗体（Ｃａｔ＃ ＮＢＰ２－３２１８６））の結合特異性を評価するために、ＨＣＴ１１６細胞の溶解物２０μｇに対して下記の条件によるそれぞれの１次抗体及び２次抗体を処理し、通常の方法によってウェスタンブロットを行った：
＊１次抗体（常温、１時間）
４Ｄ１０Ｇ６：１μｇ／ｍｌ
Ａｂｎｏｖａ Ａｂ：１：５，０００ｄｉｌｕｔｉｏｎ
Ｎｏｖｕｓ Ａｂ：１：１０，０００ｄｉｌｕｔｉｏｎ
＊２次抗体（常温、１時間）
抗マウス（Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ１８１Ｐ）：１：１０，０００ｄｉｌｕｔｉｏｎ：Ａｂｎｏｖａ、４Ｄ１０Ｇ６
抗ウサギ（Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ）ＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ１８７Ｐ）：１：１０，０００ｄｉｌｕｔｉｏｎ：Ｎｏｖｕｓ
これに対する結果を図５に示した。
図５に示したように、本発明に係る抗体は単一バンドを示す一方で、商用抗体２種の場合は、複数個のバンドを示すことが確認された。
すなわち、本発明に係る抗体の結合特異性は、各商用抗体と比較して著しく高いことを確認することができた。
実施例６：交差反応性検証
前記実施例１で製造されたモノクローナル抗体が、ＷＲＳ以外に細胞外に分泌される更に他のＡＲＳ（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）タンパク質であるＣＲＳ（Ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＡＩＭＰ１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＧＲＳ（Ｇｌｙｃｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）及びＫＲＳ（Ｌｙｓｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）に対して交差反応性を示すかどうかを確認するために、次のような方法によって間接ＥＬＩＳＡアッセイを行った：
１）抗原コーティング：ＰＢＳ内の１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ、４℃、一晩コーティング（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｃｏａｔｉｎｇ）
２）洗浄：０．０５％ＰＢＳＴ（０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０）、２００μｌ／ｗｅｌｌ、３回
３）ブロッキング：０．０５％ＰＢＳＴ内の０．５％ＢＳＡ、２００μｌ／ｗｅｌｌ、ＲＴ、１時間
４）１次抗体結合：０．０５％ＰＢＳＴ内の５００ｎｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ、ＲＴ、１時間
５）２次抗体結合：０．０５％ＰＢＳＴ内の抗マウスＨＲＰ（ＡＰ１６０Ｐ）１：１０，０００、１００μｌ／ｗｅｌｌ、ＲＴ、１時間
６）ＴＭＢ検出
７）反応中止（２Ｍ Ｈ２ＳＯ４）
８）吸光度測定：４５０ｎｍ
これに対する結果を図６に示した。
図６に示したように、本発明に係る抗体は、ＷＲＳ以外の他のＡＲＳタンパク質には結合しないことが確認された。
本発明の抗体又はその断片は、ＷＲＳに特異的に結合し、同一のＡＲＳファミリーを含む他のタンパク質との交差反応性がなく、ＷＲＳ検出及び抑制が可能であるので、ＷＲＳ検出及びＷＲＳと関連した疾患である癌、炎症性疾患又は感染疾患の診断に効果的に使用することができ、産業上の利用可能性が高い。

Claims (17)

  1. ＷＲＳ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）タンパク質において配列番号２で表されるアミノ酸配列のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体の断片であって、
    前記抗体は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ２、及び配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ２、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ３を含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と、を含む、抗体又は抗体の断片。
  2. 前記抗体又は抗体の断片は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体又は抗体の断片。
  3. 前記抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又は抗体の断片。
  4. 前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又は抗体の断片。
  5. 前記抗体の断片は、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又は抗体の断片。
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の断片をコードするポリヌクレオチド。
  7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  8. 請求項７に記載のベクターで形質転換された細胞。
  9. 請求項８に記載の細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下で培養し、軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階、及び前記細胞又はこれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含むＷＲＳに結合する抗体又は抗体の断片生産方法。
  10. 請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の断片を含む癌診断用組成物。
  11. 請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の断片を含む感染疾患又は感染合併症診断用組成物。
  12. 前記感染疾患は感染性炎症疾患であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断用組成物。
  13. 前記感染性炎症疾患は、敗血症又は敗血症性ショックであることを特徴とする、請求項１２に記載の診断用組成物。
  14. 癌診断用製剤を製造するための請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の断片の使用。
  15. ａ）個体から取得された試料において請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の断片でＷＲＳタンパク質の発現量を測定する段階；及び
    ｂ）前記ａ）段階で測定したタンパク質の発現量が増加する場合、癌であると判定する段階；を含む癌の検査方法。
  16. 感染疾患又は感染合併症診断用製剤を製造するための請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の断片の使用。
  17. ａ）個体から取得された試料において請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の断片でＷＲＳタンパク質の発現量を測定する段階；及び
    ｂ）前記ａ）段階で測定したタンパク質の発現量が増加する場合、感染疾患又は感染合併症であると判定する段階；を含む感染疾患又は感染合併症の検査方法。
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