JP2018527590A - トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を利用した感染症又は感染合併症の診断用組成物と診断マーカー検出方法 - Google Patents

トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を利用した感染症又は感染合併症の診断用組成物と診断マーカー検出方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素を利用した感染症の診断用組成物及び診断マーカーの検出方法に関するもので、より詳細には、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症診断用組成物、診断用キット、感染症の診断に必要な情報を提供するためのWRSを検出する方法、WRSを利用した感染症の死亡危険度を判別する方法に関するものである。本発明によれば、WRSは、感染で誘発される感染症でのみ増加されるので、非感染性疾患と区別され、感染初期に急速に増加する。また、WRSのレベルは、感染で誘発される疾患又は合併症の重症度及び予後と密接な相関関係を有している。従って、WRSは従来の感染症又はその合併症のマーカーよりも、迅速かつ正確な診断マーカーとして使用することができる。

Description

本出願は、2015年9月1日に出願された大韓民国特許出願第10-2015-0123743号及び2016年3月2日に出願された大韓民国特許出願第10-2016-0025329号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は参照により本出願に援用する。
本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素（tryptophanyl-tRNA synthetase、WRS）を利用した感染症の診断用組成物と診断マーカー検出方法に関するもので、より詳細には、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症診断用組成物、診断用キット、感染症の診断に必要な情報を提供するためのWRSを検出する方法、WRSを利用した感染症に対する死亡危険度判別方法に関するものである。
感染症は、菌、細菌、ウイルス等の外来物が、血液、体液及び組織内に出現し、生育を始めることで発症する疾患であって、これらの正確な同定及び適切な治療が行われない場合、命を失う疾病である。衛生水準の向上に従って、感染症の罹病率は概して減少するように思われるが、抗生剤投与の乱用、移植による免疫抑制剤使用の増加、抗癌治療による免疫力減少、糖尿病、高血圧等、基礎疾患保有者の増加等により、致命的な結果をもたらす感染症の脅威は増加する状況である。
現在、感染に対する診断ツールは、患者の症状を基にする臨床医の経験的判断に加えて、代表的に血液と尿からの直接的な微生物培養と、感染した器官を確認するためのポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、PCR)がある。しかし実験室での微生物培養の結果は陰性の場合が殆どであり、PCR法は時間的な制限がある。カルシトニンのプロホルモン（prohormone of calcitonin、PCT)は、殆どの細菌とカビが、感染から感染初期3-4時間内に数値が増加するが、より高いレベルの変化は他の病原体よりもグラム陰性細菌により引き起こされる。また、このホルモンレベルがウイルス感染によっても上昇するか否かは明らかではない。このように過去の研究を通じて、感染症の多くの微生物の検出にかなりの進歩があったが、現在利用されている診断方法は、依然と多くの労力を必要とし、感度及び特異性が低いのが実情である。
特に感染症は、殆どの感染部位の炎症反応を伴い、その中の一部は全身炎症反応を起こして致命的な結果をもたらすこともある。このような全身炎症反応は、その原因によって治療法が異なり、非感染性原因により誘発された各種全身炎症反応（systemic inflammatory response）と、病原体感染による炎症反応とを、速やかに区別して診断することは、適切な治療のために極めて重要である。特に、感染症によりもたらされる感染性炎症は死亡に至ることもあり得る等、できるだけ早く適切な抗生剤治療を始めることが重要なため、このような診断は急性感染性炎症患者の生存のために不可欠である。
現在、Ｃ反応性蛋白質（C-reactive protein、CRP)が、様々な炎症疾患のための一般的な診断マーカーとして使用されている。しかし、CRP値は感染及び非感染による炎症疾患の両方において、すべての数値が増加するため、感染性炎症を区別することができない。従って、早い段階で感染による炎症を区別できる診断用試薬の開発が必要である。
［技術的課題］
ここに本発明者らは、バクテリア、ウイルス又はカビの感染による感染症発生時の体内トリプトファニルtRNA合成酵素(tryptophanyl-tRNA synthetase、TrpRS、WRS)レベルが、感染初期から急速に増加し、特に感染性炎症疾患を伴う場合、WRSのレベルが標準時と比べて大きく増加し、非感染性炎症疾患の場合はWRSのレベルと関連が無い等、WRSのレベルは、感染症とこれらの合併症を、速やかかつ正確に診断できるマーカーとして使用できることを見出して、本発明を完成した。
従って、本発明の目的は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症の診断用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症診断用キットを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、感染症の診断に必要な情報を提供するために、（a)被検体の試料を提供する段階;（b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階;及び（c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルを標準と比べ、標準よりもトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルが増加した彼検体を感染症に罹病したと判定する段階を含む、トリプトファニルtRNA合成酵素を検出する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症による死亡危険度判別用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、（a)被検体の試料を提供する段階;（b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階;及び（c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルが高いほど死亡危険度が高いと判定する段階を含む、感染症による死亡危険度を判別する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、感染症の診断用製剤を製造するための、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤の使用を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、被検体の試料内のトリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定することを特徴とする、感染症を診断する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、感染症による死亡危険度判別用製剤を製造するための、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤の使用を提供することである。
［技術的解決方法］
前記のような目的を達成するために、本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症の診断用組成物を提供する。
また、本発明は、本質的に、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤からなる、感染症の診断用組成物を提供する。
また、本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤からなる、感染症の診断用組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症診断用キットを提供する。
また本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤からなる、感染症診断用キットを提供する。
また、本発明は、本質的に、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤からなる、感染症診断用キットを提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、感染症の診断に必要な情報を提供するために(a)被検体の試料を提供する段階;（b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階;及び（c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルを標準と比べてさらに、標準よりもトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルが増加した被検体を、感染症に罹病したものと判定する段階を含む、トリプトファニルtRNA合成酵素を検出する方法を提供する。
また、本発明は、感染症の診断に必要な情報を提供するために、（a)被検体の試料を提供する段階;（b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階;及び（c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルを標準と比べてさらに、標準よりもトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルが増加した被検体を、感染症に罹病したと判定する段階からなる、トリプトファニルtRNA合成酵素を検出する方法を提供する。
また、本発明は、本質的に、感染症の診断に必要な情報を提供するために、(a)被検体の試料を提供する段階;（b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階;及び（c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルを標準と比べてさらに、標準よりもトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルが増加した被検体を、感染症に罹病したものと判定する段階からなる、トリプトファニルtRNA合成酵素を検出する方法を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する段階を含む、感染症による死亡危険度判別用組成物を提供する。
また、本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤からなる、感染症による死亡危険度判別用組成物を提供する。
また、本発明は、本質的に、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤からなる、感染症による死亡危険度判別用組成物を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、(a)被検体の試料を提供する段階；(b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階；及び(c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルが高いほど、死亡危険度が高いことと判定する段階を含む、感染症による死亡危険度を判別する方法を提供する。
さらに、本発明は、(a)被検体の試料を提供する段階；(b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階；及び(c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルが高いほど、死亡危険度が高いことと判定する段階からなる、感染症による死亡危険度を判別する方法を提供する。
さらに、本発明は、本質的に、 (a)被検体の試料を提供する段階；(b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階；及び(c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルが高いほど、死亡危険度が高いと判定する段階からなる、感染症による死亡危険度を判別する方法を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、感染症の診断用製剤を製造するためのトリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤の使用を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、被検体の試料内のトリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定することを特徴とする、感染症を診断する方法を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、感染症による死亡危険度判別用製剤を製造するためのトリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質、又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤の使用を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症の診断用組成物を提供する。
本発明者らは、バクテリア、ウイルス又はカビによる感染によりWRSの発現レベルが感染初期から急速に増加し、感染合併症により肺炎や敗血症のような症状が表われる場合、標準対照群よりも著しく増加することを初めて確認した。さらに敗血症患者の場合、WRS発現レベルは敗血症の重症度及び予後と高い相関関係を有しており、WRSは感染性炎症でのみ増加するため、感染性炎症疾患と非感染性炎症疾患とを速やかにかつ正確に区別することができ、新たな感染症及び感染合併症における診断マーカーとしての価値が極めて高いことを確認した。
本発明者らがWRSと感染症の診断と関連して確認したことは、具体的には次の通りである。
本発明の一実施例では、WRSはバクテリア、ウイルス又はカビによる感染から大きく増加したことを確認した。ヒトの末梢血液単核球細胞（PBMC）が、サルモネラ菌（Salmonella typhimurium)又はRSV、PR8等のウイルスに感染すると、感染初期、遅くとも感染後1時間以内に、これらのPBMCから細胞外部に分泌されるWRSレベルが急速に増加する。また、ウイルス性肺炎患者の血清に存在するWRSの量も、標準対照群に比べて増加した。
本発明の他の一実施例では、特にバクテリア又はカビ感染による敗血症又は敗血症性ショック患者の血清から、WRSの量が健康な標準対照群の血清に比べて著しく増加したことを確認した。細胞外部に分泌される他の種類のアミノアシルtRNA重合酵素のGRSとKRSは、敗血症患者と標準対照群の間に差がなく、感染によるWRSの増加は、ARSの一般的な現象ではなく、WRS特異的なことであることが分かった。
グラム陰性菌バクテリア、グラム陽性菌バクテリア及びカビ感染による敗血症患者それぞれにおけるWRSの増加傾向に統計学的に有意性のある差がないことから、グラム陰性菌バクテリア、グラム陽性菌バクテリア又はカビ感染による敗血症診断に全て有用に使用できることを確認した。また、単一感染患者と多重感染患者との間でも血中WRS値に有意性ある差が表われないことから、単一感染又は多重感染による敗血症診断に全て有用に使用できることを確認した。
特に、全身性炎症反応症候群（systemic inflammation reactive symptom、SIRS）、非感染性慢性炎症疾患である喘息とリウマチ関節炎、シェーグレン症候群等、自己免疫疾患患者の血清では、WRSの量が標準対照群と比べて統計的に有意な差がなかった。従って、WRSの発現レベルは、全ての炎症反応で増加するのではなく、バクテリア、ウイルス又はカビ感染により誘発された炎症反応でのみ特異的に増加するものと確認された。また、WRSのレベルは敗血症患者においてより、敗血症性ショック患者においてさらに増加し、WRSの発現レベルが、敗血症重症度とも関連があるものと示された。つまり、WRSの発現レベルが、敗血症重症度とも関連があるものと示された。つまりWRSの発現レベルが高いほど、敗血症性症状が甚だしいものと判断することができる。
本発明の他の一実施例では、WRSのROC曲線分析を通じて、WRSが、感染により誘発された炎症の診断において、感度（sensitivity)と特異度（specificity)が優れていることを確認した。また、SOFAスコアで表示される敗血症の重症度との相関関係においても、WRSは従来の炎症診断マーカーのCRPよりさらに高い相関関係を有するものと分析された。つまり、WRSの発現レベルが高いほど、SOFAスコアが高いので、敗血症による器官機能喪失（organ failure)が発生する確率が高いものと判断することができる。
敗血症診断の28日後に死亡した敗血症患者のWRSレベルは、生存した敗血症患者よりも著しく高く、WRSが敗血症重症度及び予後と高い相関関係があることをさらに証明した。つまり、WRSの発現レベルが高いほど敗血症の重症度が高く、予後が良くないことを予測することができる。
また、本発明の一実施例では、120人の標準、(感染症以外の原因による)18人のSIRS患者、166人の敗血症患者及び160人の敗血症性ショック患者の血清(serum)を対象に、研究者臨床実験を通じて、従来使用されたマーカーのプロカルシトニン（procalcitonin)と比べて、WRSによる結果が、プロカルシトニンの結果と関連性はあるが、WRSの場合、感染症の合併症に対してのみ特異的に区分して検出され、死亡の恐れがある患者の選別も可能であることを確認できた。
前述したWRSの発現レベルと、肺炎及び敗血症の重症度との間の密接な相関関係を利用して、従来の敗血症診断マーカーよりさらに効率的な敗血症の診断マーカーとして利用できることが分かった。特に、WRSは敗血症特異的に増加し、感染初期に急速に増加するため、感染性炎症疾患の敗血症と非感染性炎症疾患とを速やかに区分することにより、炎症の原因を知らなかったため発生する初期対応の遅延を防止して、患者が最も適切な治療を受けるようにすることができる。
本発明者らの発見を基に、本発明はWRSの発現レベル、すなわちWRS蛋白質又はWRS mRNAレベルを測定する製剤を含む、感染症診断用組成物を提供する。
本発明において、“WRS”とは、トリプトファニルtRNA合成酵素を意味し、トリプトファニルtRNA連結酵素（tryptophan-tRNA ligase）、TrpRS、WARS等とも知られている。WRSは、アミノ酸トリプトファンとtRNAのアミノアシル化（aminoacylation）反応を媒介する酵素である。WRSは、ヒトにおいてはWARS遺伝子により符号化され、蛋白質のアミノ酸配列とmRNA塩基配列はGenbank accession number NP_004175.2（蛋白質）、Genbank accession number NM_004184.3（mRNAの塩基配列）等で公知されている。WRSは、細胞質型（WARS又はtryptophanyl-tRNA synthetase、cytoplasmic)とミトコンドリア型（WARS2又はtryptophanyl-tRNA synthetase、mitochondrial)の二種の亜型（isoform)がある。本発明におけるWRSは、好ましくは細胞質型である。
本発明において、“発現（expression）”とは、細胞から蛋白質又は核酸が生成されることを意味する。“蛋白質”とは、“ポリペプチド”又は“ペプチド”と互換性を有して使用され、例えば、自然状態の蛋白質から一般的に発見されるように、アミノ酸残基の重合体を意味する。“ポリヌクレオチド”又は“核酸”とは、単一又は二重鎖の形態で形成されたデオキシリボヌクレオチド（DNA)又はリボヌクレオチド（RNA)を意味する。他の制限がない限り、自然的に生成されるヌクレオチドと類似した方法で核酸に混成化される自然的ヌクレオチドの公知のアナログも含まれる。“mRNA”とは、蛋白質合成過程で特定遺伝子からアミノ酸配列を特定にする、リボソームに遺伝情報を伝達するRNAである。
“診断”とは、病理状態の存在又は特徴を確認することを意味する。本発明での診断は、WRS遺伝子の発現レベル、つまりWRS蛋白質又はWRS mRNAのレベルを測定して、感染症の病理存在又は発病の可否を確認することである。
本発明の診断用組成物がWRS蛋白質の発現レベルを測定するためのものである場合には、WRS蛋白質発現レベルを測定する製剤は、WRS蛋白質に特異的に結合する抗体でもある。
前記WRS蛋白質は、ヒトを含む哺乳類に由来したものでもあって、好ましくは配列番号１で表示されるヒトのWRSアミノ酸配列を含むものでもある。
“抗体”とは、抗原性部位に特異的に結合する免疫グロブリンを意味する。本発明における抗体は、WRS以外には、他の種類のアミノアシルtRNA合成酵素を含む他の蛋白質には反応せず、WRS蛋白質にのみ特異的に結合する抗体である。WRS抗体は、WRS遺伝子を発現ベクターにクローニングして前記遺伝子によりコードされる蛋白質を得て、得られた蛋白質から当該技術分野の通常的な方法により製造することができる。WRS抗原性部位を含むWRS蛋白質の断片を利用してWRS蛋白質特異的な抗体を製造することもできる。本発明の抗体の形態は特に制限されず、ポリクローナル抗体（polyclonal antibody)又はモノクローナル抗体（monoclonal antibody)を含む。また、抗原抗体結合性を有するものであれば、全体抗体の一部も本発明の抗体に含まれ、WRSに特異的に結合する全ての種類の免疫グロブリン抗体が含まれる。例えば、2つの全長の軽鎖及び2つの全長の重鎖を有する完全な形態の抗体だけでなく、抗体分子の機能的な断片、つまり抗原結合機能を有するFab、F(ab')、F(ab')2及びFv等を含む。さらに本発明の抗体には、WRS蛋白質に特異的に結合できるものであればヒト化抗体、キメラ抗体等の特殊抗体と組換え抗体も含まれる。
本発明において、WRS蛋白質は、好ましくは配列番号１で表示されるヒトのWRSアミノ酸配列を含むものであって、本発明において、WRS蛋白質に特異的に結合する抗体は、好ましくは、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体でもある。前記WRS特異的な抗体を、WRSの発現レベルを測定する製剤として含む本発明の診断用組成物は、公知の蛋白質を感知する方法に必要な製剤を追加的に含むことができ、本組成物を利用して公知の蛋白質を感知する方法を制限なく使用して、被検体からのWRS蛋白質のレベルを測定することができる。
一方、本発明の診断用組成物がWRS mRNAの発現レベルを測定するためのものである場合には、WRS mRNA発現レベルを測定する製剤は、WRS mRNAに特異的に結合するプローブ又はプライマーセットでもある。
前記WRS mRNAは、ヒトを含む哺乳類に由来したものでもあって、好ましくは、配列番号２で表示されるヒトのWRS mRNA塩基配列を含むものでもある。前記WRS mRNA特異的なプローブ又はプライマーセットを、WRSの発現レベルを測定する製剤として含む本発明の診断用組成物は、公知のRNAを検出する方法に必要な製剤を追加的に含むことができる。本組成物を利用して、公知のRNAを感知する方法を制限なく使用して、被検体からWRS mRNAのレベルを測定することができる。
“プライマー”とは、DNA合成の開始点として作用する短い単鎖オリゴヌクレオチドである。プライマーは、適切な緩衝液と温度条件で鋳型（template）であるポリヌクレオチドに特異的に結合して、DNAポリメラーゼが、プライマーに、鋳型DNAと相補的な塩基を有するヌクレオチド三リン酸を追加して連結することにより、DNAが合成される。プライマーは、一般的に15乃至30個の塩基配列からなり、塩基構成と長さによって鋳型鎖に結合する温度(melting temperature、Tm)が異なる。
プライマーの配列は、鋳型の一部塩基配列と完全に相補的な配列を有する必要が無く、鋳型と混合されてプライマー固有の作用ができる範囲内での、十分な相補性を有すれば十分である。従って、本発明でWRS mRNAの発現レベルを測定するためのプライマーは、WRS遺伝子配列と完璧に相補的な配列を有する必要がなく、DNA合成を通じてWRS mRNA又はWRS cDNAの特定区間を増幅して、WRS mRNAの量を測定する目的に適合した長さと相補性を有するものであれば十分である。前記増幅反応のためのプライマーは、増幅しようとするWRS mRNAの特定区間の両側端部の鋳型(sense)と反対側(antisense)にそれぞれ相補的に結合するセットからなる。プライマーは、当業者であれば、WRS mRNA又はcDNAの塩基配列を参照して容易にデザインすることができる。
本発明のプライマーは、好ましくは、配列番号２で表示されるWRS mRNA塩基配列に特異的に結合するセット又は一対でもあって、最も好ましくは、配列番号３と配列番号４の塩基配列で表示されるプライマーセットでもある。
“プローブ”とは、特定遺伝子のmRNAやcDNA(complementary DNA)に特異的に結合できる、短くは数個乃至長くは数百個の塩基(base pair)長さのRNA又はDNA等のポリヌクレオチドの断片を意味し、標識(labeling)されていて、結合する対象mRNAやcDNAの存在の有無、発現量等を確認することができる。本発明の目的のためには、WRS mRNAに相補的なプローブを彼検体の試料とハイブリダイゼーション(hybridization)反応を行い、WRS mRNAの発現量を測定することにより、感染性炎症疾患の診断に利用することができる。プローブの選択及びハイブリダイゼーション条件は当業界に公知された技術により適切に選択することができる。
本発明のプライマー又はプローブは、ホスホロアミダイト(phosphoramidite)固体支持体合成法や、その他公知された方法を利用して化学的に合成することができる。さらに、プライマー又はプローブは、WRS mRNAとのハイブリダイゼーションを妨害しない範囲で、当該技術分野に公知された方法により多様に変形することができる。このような変形の例には、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチド一つ以上の同族体への置換及びヌクレオチド間の変形、例えば、荷電されていないリンカー(例えば、メチルホスホン酸エステル、リン酸トリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバミン酸エステル)又は荷電された連結体(例えば、チオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル)、さらに蛍光又は酵素を利用した標識物質(labeling material)の結合等がある。
本発明において、感染は、一つ又は二種類以上の外因性バクテリア(細菌、グラム陰性菌又はグラム陽性菌を含んでいる)、ウイルス、カビ(菌)が体内に侵入して定着、増殖、寄生状態になることを意味し、感染症は、病原体の感染結果として生体から反応を起こして発生する全ての疾患でもある。感染症の結果として表れる反応は、炎症、痛症、発熱、疲労感、浮腫、血圧降下等があり得る。好ましくは、本発明の感染症は、サルモネラ症(salmonellosis)、食中毒、腸チフス、パラチフス、肺炎、肺結核、結核、敗血症(sepsis)、敗血症性ショック(septic shock)、尿路感染、膀胱炎、腎盂腎炎、尿道炎、前立腺炎、上気道感染、中耳炎でもあって、より好ましくは、サルモネラ症、食中毒、肺炎、敗血症、敗血症性ショックでもある。
本発明において、前記敗血症は、感染症の合併症として示される全身性炎症反応症候群であって、原因を初期に速やかかつ正確に診断できなかった場合には、重症敗血症(severe sepsis)又は敗血症性ショック、肺、腎臓、肝臓、循環器等の機能障害までも招く多臓器不全(multiple organ dysfuction syndrome、MODS)、播種性血管内凝固症候群(DIC)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は急性腎不全(AKI)に進行して、死亡に至る致命的な疾患である。
本明細書で使用される敗血症は、敗血症の最終段階と関連した敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック及び敗血症に伴う多臓器不全、播種性血管内凝固症候群、急性呼吸窮迫症候群又は急性腎不全の発病を含むが、これに制限されず、敗血症の全ての段階を含む。
さらに、本発明は、WRS蛋白質又はWRS mRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症診断用キットを提供する。
本発明の診断用キットには、WRSの発現レベルを測定するための、選択的にWRS蛋白質をマーカーとして認識する抗体又はWRS mRNAをマーカーとして認識するプライマー、プローブだけでなく、分析方法に適した一種類又はそれ以上の他の合成成分組成物、溶液又は装置が含まれ得る。
具体的な態様として、前記診断キットは、逆転写ポリメラーゼ反応を行うために、必要な必須要素を含むことを特徴とする診断用キットでもある。逆転写ポリメラーゼ反応キットは、マーカー遺伝子に対する特異的なそれぞれのプライマーの対を含む。プライマーは、各マーカー遺伝子の核酸配列に特異的な配列を有するヌクレオチドとして、約7bp乃至50bpの長さ、より好ましくは約10bp乃至30bpの長さである。また、対照群遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーを含むことができる。その逆転写ポリメラーゼ反応キットは、テストチューブ又は他の適切なコンテナー、反応緩衝液(pHとマグネシウム濃度は多様)、デオキシヌクレオチド(dNTPs)、Taqポリメラーゼ及び逆転写酵素と同じ酵素、DNase、RNase阻害剤、DEPC水、滅菌水を含むことができる。
さらに、他の態様には、DNAマイクロアレイを行うために必要な必須要素を含むことを特徴とする診断用キットでもある。DNAマイクロアレイキットは、遺伝子又はその断片に該当するcDNA又はオリゴヌクレオチドが付着されている基板、及び蛍光標識プローブを製作するための試薬、製剤、酵素等を含むことができる。さらに、基板は対照群遺伝子又はその断片に該当するcDNA又はオリゴヌクレオチドを含むことができる。
最も好ましくは、ELISAを行うために必要な必須要素を含むことを特徴とする診断用キットでもある。ELISAキットはマーカー蛋白質に対する特異的な抗体を含む。抗体は、各マーカー蛋白質に対する特異性及び親和性が高く、他の蛋白質に対する交差反応性が殆どない抗体であって、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又は組替え抗体である。さらに、ELISAキットは、対照群蛋白質に特異的な抗体を含むことができる。その他にELISAキットは、結合された抗体を検出できる試薬、例えば、標識された２次抗体、発色団(chromophores)、酵素(抗体とコンジュゲートされた形)及びその基質又は抗体と結合できる他の物質等を含むことができる。さらに、本発明のキットは、酵素と発色反応する基質、及び結合されていない蛋白質等は除去して結合された蛋白質マーカーだけを保有できる洗浄液又は溶離液を含むことができる。
分析のために使用される試料は、血液、血清、尿、漏液、唾液等標準的な状態と区別できる感染性炎症疾患に特異的な蛋白質を確認できる生体試料を含む。好ましくは、生物学的液体試料、例えば、血液、血清、血漿から測定できる。試料は蛋白質マーカーの探知感度を増加させるように準備できるが、例えば、患者から得た血清試料は、陰イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー(size exclusion chromatography)、液体クロマトグラフィー、連続抽出(sequential extraction)又はゲル電気泳動等の方法を利用して前処理することができる。
さらに、本発明は、感染症の診断に必要な情報を提供するために、
(a)被検体の試料を提供する段階；
(b)前記試料からWRSの発現レベルを測定する段階；及び
(c)前記WRSレベルを標準と比べて、標準よりもWRSの発現レベルが増加した被検体を感染症に罹病したものと判定する段階を含む、WRSを検出する方法を提供する。
本発明者らは、WRSが新規な感染症のマーカーとして機能できることを初めて発見し、WRSの発現レベルを測定して感染症の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。以下、本発明の方法を段階別に説明する。
本発明の方法の（a)段階は、被検体の試料を提供する段階である。
前記試料は、感染症の可否を診断する被検体から採取されたものであれば制限なく使用することができ、例えば、生検等で得られた細胞又は組織、血液、全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、各種分泌物、尿、糞等でもある。好ましくは血液、血漿、血清、唾液、鼻汁、喀痰、関節嚢液、羊水、腹水、子宮頸部又は腟分泌物、尿及び脳脊髄液である。最も好ましくは血液、血漿、又は血清でもある。
本発明の方法の（b)段階は、（a)段階で提供した試料からWRSの発現レベルを測定する段階である。前記WRSの発現レベルはWRS蛋白質又はWRS mRNAの発現レベルでもある。
WRS蛋白質のレベルは、WRS蛋白質に特異的に結合する抗体を利用して検出するか又は測定することができる。WRS蛋白質特異的な抗体は、本発明の診断用組成物で述べた通りである。WRS蛋白質の発現レベルを測定する方法は、当業界で公知されている方法は制限なく使用することができ、その例としてウェスタンブロッティング(western blotting)、ドットブロッティング(dot blotting)、酵素結合免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay、ELISA)、放射能免疫分析法（RIA)、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈降法(immunoprecipitation)、補体固定分析法、フローサイトメトリー(FACS)又は蛋白質マイクロアレイ方法等があるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ELISA法を利用することができる。
WRS mRNAレベルは、WRS mRNAに特異的に結合するプライマーセットやプローブを利用して、被検体の試料からWRSのmRNAやcDNAを増幅するか、又はプローブとハイブリダイゼーション反応を利用して、被検体試料内のWRS mRNAの存在と発現量を測定することができる。WRSのプライマーとプローブは、本発明の診断用組成物で述べた通りである。WRS mRNA発現レベルの測定は、当業界で通常的な発現レベル確認方法を制限なく使用することができ、分析方法の例に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(reverse transcription polymerase chain reaction、RT-PCR)、競合RT-PCR(competitive RT-PCR)、リアルタイムRT-PCR(real-time RT-PCR)、RNaseプロテクションアッセイ法(RPA、RNase protection assay)、ノーザンブロッティング(northern blotting)、DNAマイクロアレイチップ(microarray chip)、RNA塩基配列分析(RNA sequencing)、ナノストリング（nanostring）を利用したハイブリダイゼーション法、組織切片のin situハイブリダイゼーション法(in situ hybridization)等があるが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法の(c)段階は、(b）段階で測定した被検体試料のWRSのレベルを標準と比べて、標準よりもWRSの発現レベルが増加した彼検体を感染性疾患に罹病したものと判定する段階である。
前述した(b)段階の方法で測定した被検体のWRSの発現レベルを、同じ方法で測定した標準のWRSレベルと比較する。WRSの発現レベルが健康な標準に比べて増加した彼検体を、感染性疾患に罹病したと判定する。また、感染性疾患が敗血症の場合、WRSの発現レベルが高いほど敗血症が重症であると判断することができる。診断の基準になるWRS発現レベル増加の程度に対しては、選択したWRS発現レベル測定方法に合わせて、当業界に公知の技術によってWRSの発現レベルと敗血症重症度間の相関性を分析して、WRS発現レベルの範囲によって敗血症の重症度を示すように適切な診断の基準を提供することもできる。本発明では、敗血症の重症度として、重症敗血症と敗血症性ショック、SOFAスコア、敗血症の診断後28日目の生存可否等、様々な指標を利用して、WRSの発現レベルが高いほど、敗血症重症度も高くなる密接な相関関係があることを示している。
一方、本発明の一実施例では、研究者の臨床実験を通じて、死亡患者の血清でのWRSの発現量が、生存患者に比べて有意に増加していることを確認し、これは従来使用されているマーカーでのプロカルシトニン（procalcitonin)では区別できないものであることを確認した。
従って、本発明は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症による死亡危険度判別用組成物を提供する。
本発明で死亡危険度は、感染症による死亡危険度を意味し、感染による死亡は、炎症反応、高熱、痛症、呼吸困難、低体温、血圧降下等の一部又は全部の症状を示し、ショック、一部又は多発性の臓器不全により死亡に至ることを意味する。
従って、本発明は、
(a）被検体の試料を提供する段階;及び
(b）前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階;及び
(c）前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルが高いほど死亡危険度が高いことと判定する段階を含む、感染症による死亡危険度を判別する方法を提供する。
本発明の判別方法での試料等については前記の通りである。
本発明は、感染症の診断用製剤を製造するためのトリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤の使用を提供する。
本発明は、被検体の試料内のトリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定することを特徴とする、感染症を診断する方法を提供する。
本発明は、感染症による死亡危険度判別用製剤を製造するための、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤の使用を提供する。
本発明の前記被検体とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあって、より好ましくは診断が必要なヒト又は患者でもある。
本発明で前記感染症を診断する方法の“診断”とは、測定した被検体試料のWRSのレベルを標準と比べ、標準よりもWRSの蛋白質又はmRNA発現レベルが増加した彼検体を感染性疾患に罹病したものと診断する段階である。このような標準との比較は、上述した通りである。
本発明の用語“〜を含む(comprising)”とは、“含有する”又は“特徴とする”と同じく使用され、組成物又は方法において、記載されていない追加的な成分要素又は方法段階等を排除しない。用語“〜からなる(consisting of)”とは、個別に記載されていない追加的な要素、段階又は成分等を排除する。用語“本質的に〜からなる(essentially consisting of)”とは、組成物又は方法の範囲において、記載された物質又は段階と共にこれの基本的な特性に実質的に影響を与えない物質又は段階等を含むことを意味する。
［有利な効果］
従って、本発明によると、WRSは、感染により誘発される感染症でのみ増加されるため、非感染性疾患と差別され、感染初期に急速に増加する。また、WRSのレベルは、感染により誘発される疾患又は合併症の重症度及び予後と密接な相関関係を有している。従って、WRSは従来の感染症又はこれの合併症のマーカーよりさらに迅速かつ正確な診断マーカーとして使用できる。
図１は、サルモネラ菌(S. typhimurium、ST)を106、107又は108 CFUで腹腔注射したマウスの腹腔滲出液(peritoneal lavage fluid)からELISAで測定した、感染からの時間によるWRSの変化を示す。横軸はST感染後、腹腔滲出液を取得した時間(hr)を示す。 図２は、ウイルス感染に伴うWRS分泌の様相を測定するELISA実験結果を示す。 図２Ａは、RSV（MOI=2)又はPR8ウイルス（MOI=2)で感染した末梢血液単核球細胞（PBMC）の培養液に存在するWRSレベルの時間による変化を示す。図２Ｂは標準（HC、n=20）と、ウイルス性肺炎（viral pneumonia、n=5)患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す。統計的有意性は、マンホイットニー検定を利用して判断し、＊表示のp値は0.04である。 図３Ａは、健康な標準(healthy control、HC)、重症敗血症(severe sepsis)、敗血症性ショック(septic shock)患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す。図３Ｂ及び図３Ｃは、それぞれ健康な標準(HC)と敗血症患者の血清に存在するGRS又はKRSのレベルを測定するELISA実験結果を示したものである（統計的有意性は、図３Ａの場合クラスカル・ウォリス検定後のダン検定で判断した。図３Ｂ及び図３Ｃは、マンホイットニーの両側検定で判断した。***はp<0.001、*はp<0.05を示す。n.sは統計的に有意でないことを示す）。 図４Ａは、健康な標準とカビ感染敗血症患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す。図４Ｂ及び図３Ｂと図３Ｃは、それぞれ健康な標準と敗血症患者の血清に存在するGRS又はKRSのレベルを測定するELISA実験結果を示したものである（統計的有意性は、マンホイットニーの両側検定で判断し、***はp<0.001、*はp<0.05を示す。n.sは、統計的に有意でないことを示す）。 図５Ａは、グラム陰性菌感染患者、グラム陽性菌感染患者及びカビ感染患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す。図５Ｂは、単一感染患者及び多重感染患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す（統計的有意性はクラスカル・ウォリス検定後のダン検定で判断し、***はp<0.001、*はp<0.05を示す。n.sは、統計的に有意でないことを示す）。 図６は、全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome、SIRS、図６Ａ）、慢性無菌性炎症（sterile chronic inflammatory diseases)疾患である喘息asthma、ASA、図６Ｂ）、リウマチ関節炎（rheumatoid arthritis、RA、図６Ｃ）とシェーグレン症候群（Sjogren's syndrome、SS、図６Ｃ）患者のWRSのレベルを健康な標準対照群（healthy control、HC）と比較した結果を示したものである。 図７は、WRSのROC曲線を示す。 図８は、WRSとCRPの、SOFAスコアとの相関性を示すグラフである。rはピアソン相関係数、pは確率値を示す。 図９は、敗血症診断28日後生存した患者と死亡した患者の、WRSレベルを示す。統計的有意性は、マンホイットニーを利用し、***で表示したp値は0.0007である。 図１０は、血清でのWRSとプロカルシトニン（procalcitonin)レベルを、スピアマン相関分析を通じて確認したものある。
以下、本発明を詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
臨床実験
実験方法は、ソウル大学検討委員会(institutional review board)の許可を得て行った（許可番号1502-001-010）。健康対照群の血清サンプルは、ソウル大学健康センターから収集した。99人の敗血症患者の血清サンプルは、重症敗血症や敗血症性ショック重患者室を通じて入手した。実験に使用した血清を提供した患者らは、ソウルの大学連携病院の重患者室に入院していた患者らで、バクテリア感染が確認された患者だけが実験に参加した。重症敗血症や敗血症性ショックの診断は、ACCP/SCCM consensus conference（1992年）の基準により行われた。実験は、検討委員会の方針に応じて実験に参加した全ての患者らに対して、告知に基づいた同意を得て行われた。実験はさらに、ソウル峨山病院の検討委員会の許可を得た。2014年1月と2015年7月の間に、ソウルセブランス病院アレルギー喘息クリニックに入院した合計35人の患者が実験に参加した。実験は26人の健康な対照群と、アレルギー専門医により症状と肺機能検査結果（気管支拡張剤（bronchodilator）使用後、１秒間の強制呼気量（forced expiratory volume for 1 second、FEV1）の増加率が12％を超える）を基に、喘息と診断された35人の安定した喘息患者らを含めた。前記安定した喘息は、最近１ヶ月間に薬剤投与量の増加がなく、通常の薬剤投与量を維持してきた喘息患者らと定義した。臨床実験は、セブランス病院と延世大学校医療システムの許可を得た（許可番号4-2013-0397)。42人の原発性シェーグレン症候群患者（primary Sjogren's syndrome、pSS)、35人のリウマチ関節炎患者、さらに20人の健康な対照群の血清を収集した。原発性シェーグレン症候群は、American-European Consensus Group criteria for pSS又は2012 American College of Rheumatology criteriaにより診断された。リウマチ関節炎は1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis又は2010 rheumatoid arthritis classification criteriaにより診断された。ヘルシンキ宣言の原則に従い、実験に参加した全ての患者と、健康な対照群から、実験に対する告知に基づいた同意を受けた。前記実験はソウル聖母病院検討委員会の許可を得た（KC13ONMI0646）。
臨床実験プロカルシトニンとの比較実験
120人の標準、18人の（感染症以外の原因による）SIRS患者、166人の敗血症患者及び160人の敗血症性ショック患者を対象に、各機関の検討委員会の方針により実験に参加した全ての患者らについて、告知に基づいた同意を得て行われた。患者の場合、ソウルの大学病院重患者室に入院していた患者らから得たもので、全身性炎症反応症候群（SIRS）、敗血症や敗血症性ショックの診断は、ACCP/SCCM consensus conference（1992年）の基準により行われた。
血清のプロカルシトニン(RayBiotech、USA、Cat.No.:ELH-PROCALC)とWRS(CUSABIO、China、Cat.No.:CSB-E11789h)レベルは、それぞれのELISAキットを利用して測定したものでメーカーが提示した方法により測定した。
細胞培養
ヒトの末梢血液単核球細胞(peripheral blood monocuclear cell、PBMC)はクエン酸ナトリウムを含む細胞調製チューブを利用して分離した。
バクテリアの種類と感染
Salmonella typhimurium（ATCC 14028）は、韓国微生物保存センター(Seoul)で入手した。バクテリアは、BD bioscience社の栄養培地を利用して通常的に培養した。感染前に、バクテリアは一夜培養して、1X108 CFUの密度で得た。バクテリアの密度は600nmの吸光度と検定線（calibration curve)を利用して推算した。PBMCやマウス感染実験のために、バクテリアはPBSで洗浄して、血清を含まない培地やPBSに再分散した。
酵素結合免疫測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay、ELISA)
マウスとヒトのWRS、KRSの定量的分析のために、培養培地や血清に分泌された蛋白質の量を、ELISAキットを利用して測定した。WRS ELISAキットはCusabio(Wuhan、China、Cat.No.:CSB-E11789h)から購入し、KRSはUSCN(Wuhan、China、Cat.No.:SED002Hu)から購入して測定した。
統計（Statistics）
確率値(provability value、p-value)が0.05未満の場合、統計的有意性があるものと判断した。全ての統計的計算はGraphpad prism 5.0を利用して実施した。
＜実施例１＞
バクテリア又はウイルス感染に因るWRSレベル増加
＜1-1＞サルモネラ菌感染によるWRS分泌
マウス腹腔にサルモネラ菌を注入し、腹腔滲出液に存在するWRSの量を確認した。
9〜10週齢C57BL/6雌に106、107又は108 CFUのサルモネラ菌を腹腔注射し、バクテリア感染後４時間まで、１時間ごとに、5〜11匹のマウスから腹腔滲出液を得て、腹腔滲出液に存在するWRSの量をELISAで測定した(図１)。
腹腔滲出液に分泌されたWRSは、サルモネラ菌感染後、極めて初期段階から分泌され、サルモネラ菌濃度依存的に増加し、感染後１時間でWRSの量は殆ど最高値に達した。
＜1-2＞ウイルス感染によるWRS分泌
バクテリアの他に、ウイルス感染によりWRSの分泌が起こるか否かを、ヒトの末梢血液単核球細胞とウイルス性肺炎患者の血清を利用して調べた。
ヒトの末梢血液単核球細胞（PBMC）を、呼吸器細胞融合ウイルス(respiratory syncytial virus、RSV)とインフルエンザウイルス(influenza virus)のPR8ウイルスに感染させたとき、細胞培養培地では、感染後30分からWRSが大きく増加し、実験を行った感染後４時間まで、分泌されたWRSのレベルが維持されることを確認した(図２Ａ)。また、ウイルス性肺炎(viral pneumonia)患者の血清において、標準対照群（HC）と比べてWRSの量が著しく増加したことを確認した(図２Ｂ)。
以上の実験結果は、ウイルス感染によってWRSのレベルが増加したことを示す。
＜実施例２＞
感染性炎症疾患でのWRS特異的分泌
＜2-1＞敗血症と敗血症性ショック患者におけるWRSの増加
感染による合併症の敗血症と敗血症性ショック患者のWRSのレベルを、標準対照群と比較した。
本実験に参加した敗血症患者らは、ソウル峨山病院の重患者室に入院したバクテリア感染が確認された重症敗血症患者と敗血症性ショック患者らで、患者らから検出されたバクテリア及びカビは、表１に記載した通りである。
重症敗血症患者と敗血症性ショック患者の血清からは、健康な標準よりもWRSのレベルが大きく増加したことを確認した(図３Ａ)。測定されたWRSの数値は、健康な標準人では0.18±0.06 ng/mlの（n=20）であるに対し、敗血症患者からは2.63±0.62 ng/ml（n=37）で、約20倍増加した。また、敗血症性ショック患者のWRS数値は6.35±0.90 ng/ml（n=63）で、標準対照群に比べて約50倍増加した。敗血症性ショック患者のWRS数値は、重症敗血症患者よりもさらに増加しており、WRSのレベルが敗血症の重症度とも密接な関連があることが分かった。
敗血症患者からWRSレベルが標準より大きく増加したこととは対照的に、他の種類の分泌されるアミノアシルtRNA合成酵素(aminoacyl tRNA synthetase、ARS)のグリシルtRNA合成酵素(glycyl-tRNA synthetase、GRS)及びリシルtRNA合成酵素(lysyl-tRNA synthetase、KRS)は有意な変化を示さなかった(図３Ｂ及び図３Ｃ)。
一方、図４に示した通り、バクテリア感染症だけでなく、カビ敗血症患者の血清からも、WRSの数値は増加しているものと確認され（n=8、4.52±1.83 ng/mL、マンホイットニー検定)、GRS及びKRSの血清数値からは有意な変化が表れなかった。
前記敗血症患者の内、グラム陰性菌バクテリア感染患者（n=62、5.98±0.93 ng/mL)及びグラム陽性菌バクテリア感染患者（n=25、2.87±0.72 ng/mL)、カビ感染症（n=8、4.52±1.83 ng/mL）の間では有意な差が観察されず、多重病原菌感染患者（n=11、3.53±1.22 ng/mL)及び単一病原菌感染患者（n=94、5.01±0.67 ng/mL)の間でも有意的な差が観察されなかった(図５)。
＜2-2＞非感染性炎症性疾患におけるWRSレベル
感染によらない全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome、SIRS）、慢性無菌性炎症（sterile chronic inflammatory diseases)疾患の喘息（asthma）、リウマチ関節炎及びシェーグレン症候群（Sjogren's syndrome)患者のWRSのレベルを健康な標準対照群と比較した。
これらの非感染性炎症性疾患患者の血清に存在するWRSのレベルは、健康な標準対照群と大きく変わらないことを観察した(図６)。全身性炎症反応症候群(図６Ａ)、喘息患者(図６Ｂ)、リウマチ関節炎患者(図６Ｃ)、さらに、シェーグレン症候群患者(図６Ｃ)の血清から感知されるWRSは、健康な標準対照群と比べて統計的に有意な差は表れなかった。
＜実施例３＞
感染性炎症疾患の診断マーカーとしてのWRSの効率性
＜3-1＞感染性炎症疾患のマーカーとしてWRSの性能
感染性炎症疾患のマーカーとしてのWRSの性能を確認するために、収容者作用特徴曲線（receiver operating characteristics curve、ROC curve)を作成した。
バクテリア感染敗血症患者100人のデータで算出したROC曲線に示されたWRSのAUCは0.90（p<0.0001)、cut off値は0.28 ng/mL、感度（sensitivity)は82％、さらに特異度（specificity)は80％であることが明らかになった(図７)。
＜3-2＞WRSのレベルと感染性炎症疾患重症度及び予後間の関係
感染性炎症疾患のマーカーとしてのWRSの性能をさらに確認するために、WRSのレベルと敗血症重症度と敗血症予後の相関性を調べた。
敗血症患者の予後を示す順次器官の機能喪失の評価スコア（sequential organ failure assessment score、SOFA score)と、患者の血清から感知されるWRS又はCRPのレベルをグラフで示し、ピアソン相関係数(Pearson correlation coefficient)を計算して相関性の有無を判断した(図８)。WRSのピアソン相関係数は0.43で、CRPの0.15より大幅に高く、統計的にも有意な相関性を示した。つまり、WRSのレベルは、従来の炎症指標であるCRPよりも、敗血症患者のSOFAスコアとさらに密接な相関関係を有していることが分かった。
また、敗血症患者の予後を示す他の指標として、敗血症診断後28日の生存可否とWRSのレベルを確認したホイットニー検定で統計的有意性を判断した(図９)。敗血症の診断後28日に死亡した患者らにおいては、生存した患者よりもWRSレベルが統計的にも有意な大きな差を示した(死亡 n=27、WRS 9.14±1.63 ng/mL、生存n=72、WRS 3.36±0.49 ng/mL)。つまり、WRSレベルが高いほど敗血症生存予後が良くないことが分った。
＜実施例４＞
プロカルシトニン（procalcitonin)との比較
＜4-1＞血清内の含量比較
120人の標準、18人の（感染症以外の原因による）SIRS患者、166人の敗血症患者及び160人の敗血症性ショック患者の血清（serum）を対象に、これらの各患者からのWRS（CUSABIO, China, Cat No: CSB-E11789h）と、主な炎症マーカーで知られているプロカルシトニン（RayBiotech, USA Cat No: ELH-PROCALC）とを対象に、これらの量をメーカーの指示に基づいてELISA方法で定量的に測定した。
その結果、下記表２に示した通り、プロカルシトニンの場合、標準よりも、非感染性全身性炎症症状のSIRSが区分され、感染症の合併症である敗血症や敗血症性ショックでは、より多くの量が検出されるのに対し、WRSの場合、感染症の合併症に対してのみ特異的に区分されることが分かった。
＜4-2＞生存可否による含量の比較
敗血症、敗血症性ショック患者に対して、28日経過時の生存可否によって、生存者と死亡者の群を分けた。各群の患者血清からのWRSと、プロカルシトニンの含量を、前記実施例<4-1>の通り、定量的に測定した。
その結果、下記表３に示した通り、プロカルシトニンの場合は、患者の内、生存者と死亡者との間で区別がなされなかったが、WRSの場合、統計的に意義があるように区分され、死亡リスクのある患者の選別ができることを確認できた。
＜4-3＞プロカルシトニンとの関連性分析
従来使用されたプロカルシトニンとWRSの診断結果の相互関連性を確認するために、敗血症患者に対して、WRSとプロカルシトニンにおける測定値を利用して、スピアマン関連分析(Spearman’s correlation analysis)を行った。
その結果、図10に示した通り、WRSとプロカルシトニン間にスピアマンのρ値（r)が0.127、p値が0.022で示され、関連性を示すことを確認することができた。
以上述べた通り、WRSは、感染により誘発される感染症でのみ増加されるので、非感染症と区別され、感染初期に急速に増加する。また、WRSのレベルは、感染により誘発される疾患又は合併症の重症度及び予後と密接な相関関係を有している。従って、WRSは、従来の感染症又はその合併症のマーカーよりも、迅速かつ正確な診断マーカーとして使用することができる。
図１は、サルモネラ菌(S. typhimurium、ST)を106、107又は108 CFUで腹腔注射したマウスの腹腔滲出液(peritoneal lavage fluid)からELISAで測定した、感染からの時間によるWRSの変化を示す。横軸はST感染後、腹腔滲出液を取得した時間(hr)を示す。 図２は、ウイルス感染に伴うWRS分泌の様相を測定するELISA実験結果を示す。 図２Ａは、RSV（MOI=2)又はPR8ウイルス（MOI=2)で感染した末梢血液単核球細胞（PBMC）の培養液に存在するWRSレベルの時間による変化を示す。図２Ｂは標準（HC、n=20）と、ウイルス性肺炎（viral pneumonia、n=5)患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す。統計的有意性は、マンホイットニー検定を利用して判断し、＊表示のp値は0.04である。 図３Ａは、健康な標準(healthy control、HC)、重症敗血症(severe sepsis)、敗血症性ショック(septic shock)患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す。図３Ｂ及び図３Ｃは、それぞれ健康な標準(HC)と敗血症患者の血清に存在するGRS又はKRSのレベルを測定するELISA実験結果を示したものである（統計的有意性は、図３Ａの場合クラスカル・ウォリス検定後のダン検定で判断した。図３Ｂ及び図３Ｃは、マンホイットニーの両側検定で判断した。***はp<0.001、*はp<0.05を示す。n.sは統計的に有意でないことを示す）。 図４Ａは、健康な標準とカビ感染敗血症患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す。図４Ｂ及び図４Ｃは、それぞれ健康な標準と敗血症患者の血清に存在するGRS又はKRSのレベルを測定するELISA実験結果を示したものである（統計的有意性は、マンホイットニーの両側検定で判断し、***はp<0.001、*はp<0.05を示す。n.sは、統計的に有意でないことを示す）。 図５Ａは、グラム陰性菌感染患者、グラム陽性菌感染患者及びカビ感染患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す。図５Ｂは、単一感染患者及び多重感染患者の血清に存在するWRSのレベルを測定するELISA実験結果を示す（統計的有意性はクラスカル・ウォリス検定後のダン検定で判断し、***はp<0.001、*はp<0.05を示す。n.sは、統計的に有意でないことを示す）。 図６は、全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome、SIRS、図６Ａ）、慢性無菌性炎症（sterile chronic inflammatory diseases)疾患である喘息asthma、ASA、図６Ｂ）、リウマチ関節炎（rheumatoid arthritis、RA、図６Ｃ）とシェーグレン症候群（Sjogren's syndrome、SS、図６Ｃ）患者のWRSのレベルを健康な標準対照群（healthy control、HC）と比較した結果を示したものである。 図７は、WRSのROC曲線を示す。 図８は、WRSとCRPの、SOFAスコアとの相関性を示すグラフである。rはピアソン相関係数、pは確率値を示す。 図９は、敗血症診断28日後生存した患者と死亡した患者の、WRSレベルを示す。統計的有意性は、マンホイットニーを利用し、***で表示したp値は0.0007である。 図１０は、血清でのWRSとプロカルシトニン（procalcitonin)レベルを、スピアマン相関分析を通じて確認したものである。

Claims (18)

  1. トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症の診断用組成物。
  2. 前記感染は、ウイルス、バクテリア及びカビからなる群より選ばれた一つ以上による感染であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
  3. 前記バクテリアは、グラム陰性菌又はグラム陽性菌であることを特徴とする、請求項２記載の組成物。
  4. 前記製剤は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質に特異的に結合する抗体であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
  5. 前記トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４記載の組成物。
  6. 前記製剤は、トリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAに特異的に結合するプローブ又はプライマーセットであることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
  7. 前記トリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAは、配列番号２で表示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項６記載の組成物。
  8. 前記プライマーセットは、配列番号３及び配列番号４で表示されることを特徴とする、請求項６記載の組成物。
  9. 前記感染症はサルモネルラ症(salmonellosis)、食中毒、腸チフス、パラチフス、肺炎、肺結核、結核、敗血症(sepsis)、敗血症性ショック(septic shock)、尿路感染症、膀胱炎、腎盂腎炎、尿道炎、前立腺炎、上気道感染症、中耳炎からなる群より選ばれたことを特徴とする、請求項１記載の組成物。
  10. トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症診断用キット。
  11. 感染症の診断に必要な情報を提供するために
    （a)被検体の試料を提供する段階;
    （b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階;及び
    （c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを標準と比べ、標準よりもトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルが増加した被検体を、感染症に罹病したと判定する段階を含む、トリプトファニルtRNA合成酵素を検出する方法。
  12. 前記試料は、血液、血漿、血清、唾液、鼻汁、喀痰、関節嚢液、羊水、腹水、子宮頸部又は膣分泌物、尿及び脳脊髄液からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
  13. 前記トリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階は、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNAが合成酵素のmRNAの発現レベルを測定することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
  14. トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤を含む、感染症による死亡危険度判別用組成物。
  15. （a)被検体の試料を提供する段階;
    （b)前記試料からトリプトファニルtRNA合成酵素の発現レベルを測定する段階;及び
    （c)前記トリプトファニルtRNA合成酵素のレベルが高いほど死亡危険度が高いと判定する段階を含む、感染症による死亡危険度を判別する方法。
  16. 感染症の診断用製剤を製造するためのトリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤の使用。
  17. 被検体の試料内のトリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定することを特徴とする、感染症を診断する方法。
  18. 感染症による死亡危険度判別用製剤を製造するための、トリプトファニルtRNA合成酵素蛋白質又はトリプトファニルtRNA合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する製剤の使用。

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