ES2911270T3 - Composición para diagnosticar enfermedades infecciosas o complicaciones infecciosas mediante el uso de triptofanil-arnt sintetasa y método para detectar el marcador de diagnóstico - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, comprendiendo el método: (a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en una muestra humana que se ha proporcionado; y (b) comparar el nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana en el sujeto humano con el nivel de un sujeto humano sano, y (c) determinar que el sujeto humano que tiene un nivel de expresión aumentado de triptofanil-ARNt sintetasa humana en comparación con el sujeto sano ha sido infectado con la enfermedad infecciosa.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para diagnosticar enfermedades infecciosas o complicaciones infecciosas mediante el uso de triptofanilarnt sintetasa y método para detectar el marcador de diagnóstico
CAMPO TECNICO
[0001] La presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano y a un método in vitro para determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa midiendo el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en una muestra humana. La presente invención se refiere además a un uso in vitro de una composición que comprende un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, o para determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa. La invención se refiere además al uso de un kit en dichos métodos, comprendiendo dicho kit un agente para medir el nivel de expresión de la proteína o del ARNm de la triptofanil sintetasa humana.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Las enfermedades infecciosas son enfermedades que se producen cuando aparecen cuerpos extraños como bacterias, hongos y virus que viven en la sangre, los fluidos corporales y los tejidos. A menos que se identifiquen correctamente y se traten de forma adecuada, pueden convertirse en enfermedades potencialmente mortales. Aunque la tasa de prevalencia de las enfermedades infecciosas suele disminuir en función de la mejora del nivel de higiene, la amenaza de las enfermedades infecciosas, que pueden ser mortales, está aumentando por el abuso de antibióticos, el mayor uso de agentes inmunosupresores tras los trasplantes, la reducción de la inmunidad debida a la quimioterapia y el aumento del número de pacientes con enfermedades subyacentes como la diabetes y la hipertensión.
[0003] Actualmente, la herramienta de diagnóstico de la infección es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar los órganos infectados y el cultivo microbiano directo de la sangre y la orina del paciente, así como el juicio empírico del facultativo basado en los síntomas del paciente. Sin embargo, los resultados del cultivo microbiano en el laboratorio son en su mayoría negativos, y el método PCR tiene un límite de tiempo. La prohormona de la calcitonina (PCT) se eleva en las primeras tres o cuatro horas de la infección en la mayoría de las infecciones bacterianas y fúngicas, pero su cambio es mayor en bacterias gram negativas que en otros patógenos. Tampoco se sabe si este nivel hormonal puede ser elevado por una infección vírica. Por lo tanto, aunque se han producido avances considerables en la detección de muchos microbios en las enfermedades infecciosas a través de estudios anteriores, los métodos de diagnóstico que se utilizan actualmente siguen requiriendo una gran cantidad de trabajo con una sensibilidad y especificidad pobres.
[0004] En particular, las enfermedades infecciosas vienen acompañadas en su mayoría de una reacción inflamatoria en el lugar de la infección, mientras que algunas de ellas pueden provocar una reacción inflamatoria sistémica, con un resultado fatal. Esta reacción inflamatoria sistémica difiere en su método de tratamiento dependiendo de su causa. Por lo tanto, para un tratamiento adecuado es muy importante identificar y diagnosticar rápidamente las distintas respuestas inflamatorias sistémicas inducidas por causas no infecciosas y las respuestas inflamatorias inducidas por la infección de patógenos. Es importante iniciar un tratamiento antibiótico adecuado lo antes posible, sobre todo porque la inflamación provocada por enfermedades infecciosas puede conducir a la muerte. Por lo tanto, este diagnóstico es esencial para la supervivencia de un paciente con una inflamación infecciosa aguda.
[0005] Actualmente, la proteína C reactiva (CRP) se utiliza como un marcador de diagnóstico común para una diversidad de enfermedades inflamatorias. Sin embargo, los niveles de CRP no pueden utilizarse de forma distintiva para identificar la inflamación infecciosa porque su nivel aumenta tanto en las enfermedades inflamatorias no infecciosas como en las infecciosas. Por lo tanto, es necesario desarrollar un reactivo de diagnóstico que pueda identificar rápidamente la inflamación causada por la infección.
[0006] En la Patente EP 0 843 014 A2 se describen proteínas de triptofanil-ARNt sintetasa de streptococcus pneumonia que comprenden una secuencia de aminoácidos particular o una variante de la misma. Además, se describe el ADN (ARN) codificante de dichos polipéptidos de triptofanil-ARNt sintetasa. Además, se describen en D1 métodos para producir dichos polipéptidos mediante técnicas recombinantes. También se describen métodos para utilizar polipéptidos de triptofanil-ARNt sintetasa para seleccionar compuestos antibacterianos.
[0007] B. Hjelm et al., New Biotechnology, vol. 27, n.° 2, mayo de 2010, páginas 129-137 describe el análisis de los epítopos de los anticuerpos generados hacia la triptofanil-ARNt sintetasa humana (WARS) utilizando la visualización bacteriana combinatoria y la matriz de lecho de suspensión. Se utiliza una combinación de métodos de mapeo para ilustrar una ruta de análisis sistemático de los epítopos reconocidos por los anticuerpos.
[0008] T Matsunaga et al., Scand. J. Immunol., 56, 593-601, 2002 informa sobre la expresión genética diferencial durante la maduración de las células dendríticas inmaduras (iDC) derivadas de monocitos de sangre periférica en comparación con las células dendríticas maduras (mDC). La expresión génica se evaluó utilizando el método de visualización diferencial tras la activación de las iDC con una baja concentración de lipopolisacáridos (LPS) para inducir su maduración. Se comprobó que la triptofanil-ARNt sintetasa se regulaba positivamente durante al menos 24 horas después de la activación. La triptofanil-ARNt sintetasa se describe como una molécula que cataliza el primer paso de la síntesis de proteínas, y se informa de que es uno de los marcadores genéticos de la maduración de monocitos a macrófagos. Dado que esta molécula se regula de forma sostenida en las células dendríticas (DC) estimuladas con LPS, TNF-a y TNF-p, los autores consideran que esta molécula es un buen marcador de la etapa final de maduración y diferenciación de las DC derivadas de monocitos.
[0009] Turpaev K. T. et al., Eur. J. Biochem. 240, 732-737 (1996) informan sobre el procesamiento alternativo del ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa de células humanas tratadas con interferón. Se analizaron las vías de corte y empalme alternativo de los transcriptores del gen de la triptofanil-ARNt-sintetasa. Se forman dos transcritos primarios a partir de dos sitios de inicio de la transcripción, el pre-ARN 1 del sitio distal principal P1 y el pre-ARN 2 del sitio proximal principal P2. La formación de isoformas de ARNm a partir del pre-ARN se analizó con los cebadores A1 y A2 situados entre los puntos de inicio de la transcripción P1 y P2. El análisis de RT-PCR con estos cebadores reveló isoformas de ARNm que se originan en el pre-ARN 1. El análisis de la RT-PCR con los cebadores codificantes A3 o A4 reveló isoformas de ARNm que se originaban en el pre-ARN 2. Los resultados presentados en el estudio sugieren que la diferencia en el número de nucleótidos entre el per-ARNm 1 y el pre-ARNm 2 regula las rutas de procesamiento posterior a los transcritos primarios.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
PROBLEMA TÉCNICO
[0010] En consecuencia, los presentes inventores han completado la presente invención después de haber descubierto que el nivel de expresión de una triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS o WRS, en lo sucesivo "WRS") aumenta rápidamente desde la fase inicial de la infección debida a una infección por bacterias, virus u hongos y, en particular el nivel de la WRS aumenta significativamente en comparación con el de un sujeto sano cuando se trata de una enfermedad inflamatoria infecciosa, y que una enfermedad inflamatoria no infecciosa no se asocia con el nivel de la WRS, lo que sugiere que el nivel de la WRS puede utilizarse como marcador para diagnosticar rápidamente y con precisión una enfermedad infecciosa y sus complicaciones.
[0011] En consecuencia, un aspecto de la presente invención es proporcionar un método in vitro para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en una muestra humana que se ha proporcionado; y
(b) comparar el nivel de triptofanil-ARNt sintetasa en el sujeto humano con el nivel de un sujeto sano, y
(c) determinar que el sujeto humano que tiene un nivel de expresión aumentado de triptofanil-ARNt sintetasa humana en comparación con el sujeto sano ha sido infectado con la enfermedad infecciosa.
[0012] Otro aspecto más de la presente invención es proporcionar un método in vitro para determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa en una muestra humana que se ha proporcionado; y
(b) determinar que el riesgo de mortalidad del sujeto humano aumenta de forma proporcional al incremento del nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana.
[0013] Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un uso in vitro de una composición que comprende un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, o para determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa,
donde el agente se selecciona entre grupo que consiste en
- un anticuerpo que se une específicamente a la proteína triptofanil-ARNt sintetasa humana, y
- una sonda o un conjunto de cebadores que se unen específicamente al ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana.
[0014] Otro aspecto de la presente invención es proporcionar el uso de un kit en el método descrito anteriormente, comprendiendo dicho kit un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana,
[0015] En el que el agente se selecciona entre grupo que consiste en
- un anticuerpo que se une específicamente a la proteína triptofanil-ARNt sintetasa humana, y
- una sonda o un conjunto de cebadores que se unen específicamente al ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana.
SOLUCIÓN TÉCNICA
[0016] Una realización según un aspecto de la presente invención proporciona un método in vitro para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en una muestra humana que se ha proporcionado; y
(b) comparar el nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana en el sujeto humano con el nivel de un sujeto humano sano, y
(c) determinar que el sujeto humano que tiene un nivel de expresión aumentado de triptofanil-ARNt sintetasa humana en comparación con el sujeto sano ha sido infectado con la enfermedad infecciosa.
[0017] Además, otra realización según la presente invención proporciona un método in vitro para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, consistiendo el método esencialmente en:
(a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en una muestra humana que se ha proporcionado; y
(b) comparar el nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana en el sujeto humano con el nivel de un sujeto sano, y (c) determinar que el sujeto humano que tiene un nivel de expresión aumentado de triptofanil-ARNt sintetasa humana en comparación con el sujeto sano ha sido infectado con la enfermedad infecciosa.
[0018] Una realización según otro aspecto más de la presente invención proporciona un método in vitro para determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en una muestra humana que se ha proporcionado; y
(b) determinar que el riesgo de mortalidad del sujeto humano aumenta de forma proporcional al incremento del nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana.
[0019] Además, otra realización según la presente invención proporciona un método in vitro para determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa, consistiendo el método esencialmente en:
(a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en la muestra humana que se ha proporcionado; y
(b) determinar que el riesgo de mortalidad del sujeto humano aumenta de forma proporcional al incremento del nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana.
[0020] Una realización según otro aspecto más de la presente invención proporciona el uso in vitro de una composición que comprende un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, o determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa,
donde el agente se selecciona entre grupo que consiste en
- un anticuerpo que se une específicamente a la proteína triptofanil-ARNt sintetasa humana, y
- una sonda o un conjunto de cebadores que se unen específicamente al ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana.
[0021] Una realización según otro aspecto más de la presente invención proporciona el uso de un kit en los métodos definidos anteriormente, comprendiendo dicho kit un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptófanil sintetasa humana,
donde el agente se selecciona entre grupo que consiste en
- un anticuerpo que se une específicamente a la proteína triptofanil-ARNt sintetasa humana, y
- una sonda o un conjunto de cebadores que se unen específicamente al ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana.
[0022] En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle.
[0023] Los presentes inventores fueron los primeros en confirmar que el nivel de expresión de la WRS aumenta rápidamente desde la fase inicial de la infección por bacterias, virus u hongos y que era significativamente mayor que el de un control sano cuando aparecen síntomas como la neumonía o la septicemia como complicaciones infecciosas.
[0024] Además, el nivel de expresión de WRS en pacientes con septicemia está altamente correlacionado con la gravedad y el pronóstico de la septicemia, y dado que la WRS aumenta sólo en la inflamación infecciosa, es posible distinguir rápidamente y con precisión entre la enfermedad inflamatoria infecciosa y la enfermedad inflamatoria no infecciosa. Así, se confirmó que el valor de un marcador de diagnóstico en las complicaciones infecciosas es muy alto.
[0025] Los inventores de la presente invención han confirmado específicamente lo siguiente en relación con la WRS y el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
[0026] Según una realización de la presente invención, se ha confirmado que la WRS aumenta en gran medida en las infecciones causadas por bacterias, virus u hongos.
[0027] Cuando las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se infectan con Salmonella typhimurium o con el virus VRS o PR8, el nivel de la WRS liberada por estas PBMC al exterior de la célula aumenta rápidamente en la hora siguiente a la infección. Además, la cantidad de WRS presente en el suero de los pacientes con neumonía vírica estaba aumentada en comparación con el control sano.
[0028] En otra realización de la presente invención, se confirmó que la cantidad de la WRS en el suero de un paciente con septicemia o choque séptico debido a una infección con bacterias u hongos se incrementó significativamente en comparación con el suero del control sano.
[0029] La GRS y la KRS, que son diferentes tipos de aminoacil-ARNt sintetasa (ARS) secretada fuera de la célula, no fueron diferentes entre los pacientes con septicemia y el control sano, y se encontró que el aumento de la WRS debido a la infección era específico de la WRS, no del fenómeno general de la ARS.
[0030] No hubo diferencias estadísticamente significativas en la tendencia al alza de la WRS en cada paciente con septicemia debido a las infecciones de bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas y hongos, y por lo tanto se confirmó que la WRS puede ser utilizada eficazmente para el diagnóstico de la septicemia debida a infecciones de bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas y hongos. Además, no hubo diferencias significativas en los niveles de WRS en sangre entre los pacientes con una sola infección y los que tienen varias, lo que indica que puede utilizarse para el diagnóstico de la septicemia debida a infecciones únicas o múltiples.
[0031] En particular, no hubo diferencias estadísticamente significativas en la cantidad de la WRS en el suero de los pacientes con enfermedades autoinmunes, tales como el síntoma de inflamación reactiva sistémica (SIRS), enfermedades inflamatorias crónicas no infecciosas como el asma y la artritis reumatoide, y el síndrome de Sjogren, en comparación con los controles sanos. Así, el nivel de expresión de la WRS no aumentó en todas las respuestas inflamatorias, sino que se confirmó que se incrementó específicamente sólo en las respuestas inflamatorias inducidas por infecciones bacterianas, víricas o fúngicas. Además, el nivel de la WRS aumentó más en los pacientes con choque séptico que en los pacientes con septicemia, por lo que se confirmó que el nivel de expresión de la WRS también estaba asociado con la gravedad de la septicemia. Es decir, puede determinarse que cuanto mayor sea el nivel de expresión de la WRS, más graves pueden ser los síntomas de la septicemia.
[0032] En otra realización de la presente invención, se confirmó mediante el análisis de la curva ROC de la WRS que ésta tiene una excelente sensibilidad y especificidad para diagnosticar la inflamación causada por una infección. En correlación con la gravedad de la septicemia marcada por la puntuación SOFA, también se encontró que la WRS tenía una mayor correlación que la CPR, un marcador de diagnóstico de inflamación existente. En otras palabras, cuanto mayor sea el nivel de expresión de WRS, mayor será la puntuación SOFA. Por lo tanto, puede predecirse que la probabilidad de fallo orgánico debido a la septicemia es alta.
[0033] El nivel de WRS en los pacientes que murieron de septicemia después de 28 días del diagnóstico de septicemia fue significativamente mayor que el de los pacientes de septicemia que sobrevivieron, lo que confirma aún más que la WRS tiene una alta correlación con la gravedad de la septicemia y el pronóstico. Es decir, a medida que aumenta el nivel de expresión de WRS, se puede predecir que la gravedad de la septicemia es mayor y el pronóstico es peor.
[0034] Asimismo, se sometieron a estudios clínicos muestras de suero de 120 personas sanas, 18 pacientes con SIRS (por causas distintas a las enfermedades infecciosas), 166 pacientes con septicemia y 160 pacientes con choque séptico y se compararon con un marcador utilizado convencionalmente, la procalcitonina. Como resultado, aunque los resultados de la WRS están correlacionados con los de la procalcitonina, la WRS sólo se detectó específicamente para las complicaciones de las enfermedades infecciosas y se confirmó que puede seleccionar pacientes preocupados por la muerte.
[0035] Utilizando la estrecha correlación entre el nivel de expresión de la WRS descrito anteriormente y la gravedad de la neumonía y la septicemia, puede utilizarse como un marcador de diagnóstico de la septicemia que es más eficaz que los marcadores de diagnóstico de la septicemia existentes. En particular, dado que la WRS aumenta específicamente en la septicemia y se incrementa rápidamente en la fase inicial de la infección, es posible evitar el retraso del tratamiento inicial debido a causas desconocidas de inflamación y permitir que el paciente reciba el tratamiento más adecuado al distinguir rápidamente entre enfermedades inflamatorias infecciosas como la septicemia y enfermedades inflamatorias no infecciosas.
[0036] Basándose en el descubrimiento de los presentes inventores, una composición para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa comprende un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana.
[0037] En la presente invención, "WRS" significa triptofanil-ARNt sintetasa, que también se conoce como triptófano-ARNt ligasa, TrpRS y WARS. La WRS es una enzima que media en la reacción de aminoacilación del triptófano y el ARNt. La WRS está codificada por el gen WARS en los seres humanos, y la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos del ARNm de la proteína se conocen con el número de acceso del Genbank NP_004175.2 (proteína) y el número de acceso del Genbank NM_004184.3 (secuencia de nucleótidos del ARNm). La WRS tiene dos isoformas: una forma citoplasmática (WARS o triptofanil-ARNt sintetasa, citoplasmática) y una forma mitocondrial (WARS2 o triptofanil-ARNt sintetasa, mitocondrial). La WRS en la presente invención es preferentemente una forma citoplasmática.
[0038] En la presente invención, "expresión" significa que una proteína o un ácido nucleico se produce en una célula. "Proteína" se utiliza indistintamente con "polipéptido" o "péptido" y, por ejemplo, se refiere a un polímero de restos de aminoácidos como los que se encuentran habitualmente en las proteínas en estado natural. Un "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refiere al desoxirribonucleótido (ADN) o al ribonucleótido (ARN) en forma de cadena simple o doble. A menos que se limite de otro modo, también incluye análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan a los ácidos nucleicos de manera similar a los nucleótidos de origen natural. El "ARNm" es un ARN que transfiere la información genética (secuencia de nucleótidos específica de un gen) a los ribosomas que especifican la secuencia de aminoácidos de un gen específico durante la síntesis de proteínas.
[0039] "Diagnóstico" significa identificar la presencia o la característica de una condición patológica. El diagnóstico en la presente invención es determinar el nivel de expresión del gen WRS, es decir, se mide el nivel de la proteína WRS o del ARNm de WRS para determinar la presencia patológica o la enfermedad infecciosa.
[0040] Cuando la composición de diagnóstico se utiliza para medir el nivel de expresión de la proteína WRS, el agente para medir el nivel de expresión de la proteína WRS puede ser un anticuerpo que se une específicamente a la proteína WRS.
[0041] La proteína WRS puede derivarse de un humano, preferentemente la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ. ID NO: 1.
[0042] "Anticuerpo" significa inmunoglobulina que se une específicamente a un sitio antigénico. El anticuerpo de la presente invención no reacciona con otras proteínas que contienen esta enzima sintética que no sea la WRS, y es un anticuerpo que se une específicamente sólo a la proteína WRS. El anticuerpo WRS puede producirse clonando el gen WRS en un vector de expresión para obtener una proteína codificada por el gen y puede prepararse a partir de la proteína obtenida según un método convencional en la técnica. Puede utilizarse un fragmento de la proteína WRS que incluya un sitio antigénico de WRS para preparar un anticuerpo específico de la proteína WRS. La forma del anticuerpo no está particularmente limitada e incluye un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Además, si tiene una propiedad de unión antígeno-anticuerpo, algunos de los anticuerpos enteros también se incluyen en los anticuerpos de la presente invención, e incluye todo tipo de anticuerpos de inmunoglobulina que se unen específicamente a la WRS. Por ejemplo, incluye un anticuerpo de forma completa que tiene dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, así como fragmentos funcionales de moléculas de anticuerpos, es decir, (Fab), F(ab ')2 , F(ab')2 y Fv que tienen una función de unión al antígeno. Además, el anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo específico, tal como un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo recombinante siempre que pueda unirse específicamente a la proteína WRS.
[0043] La proteína WRS comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos WRS humana representada por la SEQ ID NO: 1. El anticuerpo que se une específicamente a la proteína WRS puede ser preferentemente un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1. La composición de diagnóstico que comprende el anticuerpo específico de WRS como agente para medir el nivel de expresión de WRS puede incluir además una preparación necesaria para un método convencional de detección de proteínas, y puede utilizarse para medir el nivel de la proteína WRS en un sujeto utilizando ilimitadamente un método conocido en la técnica para detectar proteínas conocidas.
[0044] Al mismo tiempo, cuando la composición de diagnóstico es para medir el nivel de expresión del ARNm de WRS, el agente para medir el nivel de expresión del ARNm de WRS puede ser una sonda o un conjunto de cebadores que se unen específicamente al ARNm de WRS.
[0045] El ARNm de WRS puede derivarse de un ser humano, y preferentemente puede incluir la secuencia de ARNm representada por la SEQ ID NO: 2 de WRS humana. La composición de diagnóstico, que comprende un agente para medir el nivel de expresión de WRS mediante una sonda o un conjunto de cebadores específicos para el ARNm de WRS, puede comprender además una preparación necesaria para un método convencional de detección de ARN. Los métodos para detectar el ARN conocido utilizando esta composición pueden utilizarse, sin limitación, para determinar el nivel de ARNm de WRS en un sujeto.
[0046] Un "cebador" es un oligonucleótido corto de una sola cadena que actúa como punto de partida para la síntesis de ADN. El cebador se une específicamente a un polinucleótido como plantilla en unas condiciones adecuadas de tampón y temperatura, y el ADN se sintetiza mediante la adición de nucleósido trifosfato que tiene una base complementaria al ADN de la plantilla por la ADN polimerasa. El cebador se compone generalmente de 15 a 30 secuencias de nucleótidos, y la temperatura de fusión (Tm) varía dependiendo de la estructura de las bases y la longitud.
[0047] La secuencia del cebador no necesita tener una secuencia completamente complementaria a una secuencia parcial de nucleótidos de la plantilla, y es suficiente que el nucleótido complementario tenga suficiente complementariedad dentro de un rango capaz de hibridarse con la plantilla y actuar como cebador. Por lo tanto, el cebador para medir el nivel de expresión del ARNm de WRS en la presente invención no necesita tener una secuencia completamente complementaria a la secuencia del gen de WRS, sino que es suficiente que la longitud específica del ARNm de WRS o del ADNc de WRS se amplifique a través de la síntesis de ADN para tener una longitud y complementariedad con el propósito de medir la cantidad de ARNm de WRS. El cebador para la reacción de amplificación se compone de un conjunto (par) que se une complementariamente a una plantilla (o sentido) y a una región opuesta (antisentido) en los extremos de una región específica del ARNm de la WRS que se va a amplificar, respectivamente. Los expertos en la materia pueden diseñar fácilmente los cebadores con referencia a la secuencia del ARNm o del ADNc de la WRS.
[0048] El cebador es preferiblemente un conjunto o un par que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos del ARNm de WRS representado por la SEQ ID NO: 2, más preferentemente el conjunto de cebadores representado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y la Se Q ID NO: 4.
[0049] Una "sonda" se refiere a un fragmento de un polinucleótido, como el ARN o el ADN que tiene una longitud de pares de bases de varios a varios cientos, que puede unirse específicamente al ARNm o al ADNc (ADN complementario) de un gen específico. Además, la sonda está marcada para poder confirmar la presencia o el nivel de expresión del ARNm o del ADNc que se va a unir. Para los propósitos de la presente invención, una sonda complementaria al ARNm de WRS puede utilizarse para el diagnóstico de enfermedades inflamatorias infecciosas midiendo el nivel de expresión del ARNm de WRS mediante la realización de una hibridación con una muestra de un sujeto. Las condiciones de selección e hibridación de las sondas pueden seleccionarse adecuadamente según las técnicas conocidas en la técnica.
[0050] El cebador o la sonda pueden sintetizarse químicamente utilizando un método de síntesis de soporte sólido de fosforamidita u otros métodos bien conocidos. Además, el cebador o la sonda pueden modificarse de diversas maneras según métodos conocidos en la técnica, siempre que no interfieran con la hibridación con el ARNm de la WRS. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la metilación, protección con capucha, la sustitución con uno o más de los análogos naturales de los nucleótidos y las modificaciones entre nucleótidos, tales como los enlazadores no cargados (por ejemplo, metilfosfonato, fosfotriéster, fosforamidato y carbamato) o los conjugados cargados (por ejemplo, fosforotioato y fosforoditioato), y la combinación de material de etiquetado mediante fluorescencia o enzimas.
[0051] En la presente invención, infección se refiere a la infiltración de uno o dos o más tipos de bacterias extrañas (incluyendo bacterias, bacterias gram-negativas o bacterias gram-positivas), virus y hongos en el cuerpo para asentarse, multiplicarse y parasitar. Las enfermedades infecciosas pueden ser cualquier enfermedad causada por una reacción en un cuerpo vivo como resultado de una infección de un patógeno. Las respuestas resultantes de las enfermedades infecciosas pueden incluir inflamación, dolor, fiebre, fatiga, edema e hipotensión. Preferentemente, las enfermedades infecciosas de la presente invención incluyen la salmonelosis, la intoxicación alimentaria, la fiebre tifoidea, la paratifoidea, la neumonía, la tuberculosis pulmonar, la tuberculosis, la septicemia, el choque séptico, la infección del tracto urinario, la cistitis, la pielonefritis, la uretritis, la prostatitis, la infección del tracto respiratorio superior, la otitis media, y más preferentemente la salmonelosis, la intoxicación alimentaria, la neumonía, la septicemia y el choque séptico.
[0052] En la presente invención, la septicemia es un síndrome de reacción inflamatoria sistémica que es una complicación de una enfermedad infecciosa. Cuando la causa de la septicemia no se puede diagnosticar de forma rápida y precisa, se convierte en una enfermedad letal que causa la muerte, como la septicemia grave, el choque séptico, el síndrome de disfunción multiorgánica (SDMO) que provoca disfunciones como las del pulmón, el riñón, el hígado y el sistema circulatorio, la coagulación intravascular diseminada (CID), el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) o la lesión renal aguda (LRA).
[0053] Tal como se utiliza en el presente documento, la septicemia incluye la septicemia asociada a la fase final de la septicemia, la septicemia grave, el choque séptico y el síndrome de disfunción multiorgánica (SDMO), el síndrome de coagulación intravascular diseminada (CID), el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) o la lesión renal aguda (LRA) asociada a la septicemia, pero no se limita a ello.
[0054] La presente invención también proporciona el uso de un kit para diagnosticar una enfermedad infecciosa, comprendiendo el kit un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa.
[0055] El kit de diagnóstico puede incluir uno o más componentes, soluciones o dispositivos adecuados para el método de ensayo, así como un anticuerpo que reconozca selectivamente la proteína WRS como marcador o cebadores y sondas que reconozcan el ARNm de WRS como marcador.
[0056] En una realización específica, el kit de diagnóstico puede ser un kit de diagnóstico que comprende los elementos esenciales necesarios para realizar una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). El kit de RT-PCR contiene un par de cebadores específicos para el gen marcador. El cebador es un nucleótido que tiene una secuencia específica para la secuencia de ácido nucleico de cada gen marcador, y tiene una longitud de aproximadamente 7 pb a 50 pb, más preferiblemente de aproximadamente 10 pb a 30 pb. También puede contener un cebador específico para la secuencia de ácido nucleico del gen de control. Otros kits de RT-PCR consisten en tubos de ensayo u otros recipientes adecuados, tampones de reacción (pH y diversas concentraciones de magnesio), desoxinucleótidos (dNTP), enzimas como la Taq polimerasa y la transcriptasa inversa, ADNasa, inhibidor de ARNasa DEPC Agua (DEPC-agua) y agua estéril.
[0057] Otro aspecto de la presente invención puede ser un uso in vitro de un kit de diagnóstico caracterizado por incluir elementos esenciales necesarios para realizar un chip de ADN. El kit de chip de ADN puede consistir en una placa en la que se fija un ADNc o un oligonucleótido correspondiente a un gen o un fragmento del mismo, y reactivos, preparaciones y enzimas para producir una sonda marcada con fluorescencia. La placa también puede comprender un ADNc u oligonucleótido correspondiente a un gen de control o un fragmento del mismo. Más preferentemente, puede ser un kit de diagnóstico caracterizado por comprender los elementos esenciales necesarios para realizar un ELISA. Los kits ELISA contienen anticuerpos específicos para la proteína marcadora. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o anticuerpos recombinantes con alta especificidad y afinidad por cada proteína marcadora y poca reactividad cruzada con otras proteínas. El kit ELISA también puede incluir anticuerpos específicos para una proteína de control. Otros kits ELISA incluyen reactivos capaces de detectar anticuerpos unidos, como anticuerpos secundarios marcados, cromóforos, enzimas (en forma conjugada con anticuerpos) y sus sustratos u otra sustancia capaz de unirse al anticuerpo. Además, el kit elimina el sustrato que se va a colorear con la enzima y la proteína no unida, y puede incluir una solución de lavado o una solución de elusión que sólo puede retener los marcadores proteicos unidos.
[0058] La muestra utilizada para el análisis incluye una muestra biológica capaz de identificar una proteína específica de la enfermedad inflamatoria infecciosa que puede distinguirse de un estado saludable, como la sangre, el suero, la orina, las pérdidas y la saliva. Preferentemente, puede medirse a partir de muestras biológicas líquidas, tales como sangre, suero y plasma. La muestra puede prepararse para aumentar la sensibilidad de detección del marcador proteico. Por ejemplo, la muestra de suero obtenida del paciente puede ser pretratada mediante métodos como la cromatografía de intercambio aniónico, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía líquida, la extracción secuencial o la electroforesis en gel.
[0059] La presente invención proporciona un método in vitro para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en una muestra que se ha proporcionado; y
(b) comparar el nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana en el sujeto humano con el nivel de un sujeto humano sano, y
(c) determinar que el sujeto humano que tiene un nivel de expresión aumentado de triptofanil-ARNt sintetasa humana en comparación con el sujeto sano ha sido infectado con la enfermedad infecciosa.
[0060] Los inventores descubrieron por primera vez que la WRS puede funcionar como un marcador de una nueva enfermedad infecciosa y proporcionaron un método para medir el nivel de expresión de la WRS para proporcionar la información necesaria para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa. A continuación, se describirá el método de la presente invención.
[0061] En el método de la presente invención se ha proporcionado una muestra de un objeto de ensayo.
[0062] La muestra puede usarse sin limitación siempre que se recoja de un sujeto al que se le va a diagnosticar una enfermedad infecciosa. Por ejemplo, la muestra puede ser una célula o un tejido, sangre, sangre completa, suero, plasma, saliva, líquido cefalorraquídeo, secreciones diversas, orina y heces obtenidas por biopsia. Preferentemente, sangre, plasma, suero, saliva, moco nasal, esputo, líquido capsular, líquido amniótico, ascitis, flujo del cuello del útero o vaginal, orina y líquido cefalorraquídeo. Preferiblemente sangre, plasma o suero.
[0063] En el paso (a) del método de la presente invención se mide el nivel de expresión de la WRS en la muestra proporcionada. El nivel de expresión de la WRS puede ser el nivel de expresión de la proteína WRS o del ARNm de la WRS.
[0064] El nivel de la proteína WRS puede detectarse o medirse utilizando un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de WRS. El anticuerpo específico de la proteína de WRS es como se describe en la composición de diagnóstico de la presente invención.
[0065] Los métodos conocidos en la técnica para medir el nivel de expresión de la proteína de WRS pueden utilizarse sin limitación, y los ejemplos de los mismos incluyen transferencia de Western, transferencia puntual, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), radioinmunodifusión, inmunodifusión de ouchterlony, inmunoelectroforesis de cohete, inmunohistografía, ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de fijación de complemento, FACS y chip de proteínas, pero no se limitan a ellos. Preferiblemente, puede utilizarse un método ELISA.
[0066] El nivel de ARNm de la WRS puede determinarse amplificando el ARNm o el ADNc de la WRS de una muestra del sujeto utilizando un conjunto de cebadores o una sonda que se une específicamente al ARNm de la WRS o utilizando la hibridación con una sonda para amplificar el ARNm de la WRS en una muestra del sujeto. Los cebadores y las sondas de la WRS son los mismos que se describen en la composición de diagnóstico. La medición del nivel de expresión del ARNm de WRS puede realizarse por métodos conocidos en la técnica sin ninguna limitación. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), la RT-PCR competitiva, la RT-PCR en tiempo real, el ensayo de protección de la RNasa (RPA), la transferencia de Northern, el chip de micromatrices de ADN, la secuenciación del ARN, la hibridación mediante Nanostring y la hibridación in situ de secciones de tejido, pero no se limitan a ello.
[0067] En el paso (b) del método de la presente invención, el nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana en el sujeto se compara con el nivel de un sujeto sano, y en el paso (c) se determina que el sujeto que tiene un nivel de expresión aumentado de triptofanil-ARNt sintetasa en comparación con el sujeto sano ha sido infectado con la enfermedad infecciosa.
[0068] El nivel de expresión de la WRS del sujeto medido en el paso (a) del método descrito anteriormente se compara con el nivel de la WRS de la persona sana medido por el mismo método. Si el nivel de expresión de la WRS está aumentado en comparación con una persona sana normal, se determina que el sujeto tiene una enfermedad infecciosa. Además, si la enfermedad infecciosa es la septicemia, cuanto más alto sea el nivel de expresión de la WRS, más grave puede ser la septicemia. En cuanto al grado de aumento del nivel de expresión de la WRS que es la base del diagnóstico, la correlación entre el nivel de expresión de la WRS y la gravedad de la septicemia se analiza según la técnica conocida en el arte para el método de medición del nivel de expresión de la WRS seleccionado, y se pueden proporcionar criterios de diagnóstico adecuados para indicar la gravedad de la septicemia en función del rango de los niveles de expresión de la WRS. En una realización de la presente invención, se ha demostrado que existe una estrecha correlación entre el mayor nivel de expresión de w Rs y el mayor grado de gravedad de la septicemia mediante el uso de diversos indicadores como la septicemia grave, el choque séptico, la puntuación SOFA y la supervivencia después de 28 días del diagnóstico de septicemia.
[0069] En una realización de la presente invención, la cantidad de WRS expresada en el suero de los pacientes fallecidos aumentó significativamente en el ensayo clínico del investigador en comparación con la de los pacientes supervivientes. Se confirmó que era indistinguible del marcador utilizado convencionalmente, la procalcitonina.
[0070] En consecuencia, una composición utilizada en un método para determinar el riesgo de mortalidad de una enfermedad infecciosa comprende un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintasa.
[0071] En la presente invención, el riesgo de mortalidad se refiere al riesgo de mortalidad por enfermedades infecciosas. La muerte debida a una infección muestra algunos o todos los síntomas de inflamación, fiebre alta, dolor, disnea, hipotermia e hipotensión, y significa que la muerte está causada por un shock, un fallo orgánico parcial o múltiple.
[0072] La presente invención proporciona un método in vitro para determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa en una muestra humana que se ha proporcionado; y
(b) determinar que el riesgo de mortalidad del sujeto humano aumenta de forma proporcional al incremento del nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana.
[0073] Las muestras en el método de discriminación de la presente invención son las descritas anteriormente.
[0074] La presente invención proporciona un uso in vitro de una composición que comprende un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano,
donde el agente se selecciona entre grupo que consiste en
- un anticuerpo que se une específicamente a la proteína triptofanil-ARNt sintetasa humana, y
- una sonda o un conjunto de cebadores que se unen específicamente al ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana.
[0075] El sujeto de la presente invención es un humano, y más preferentemente un humano o un paciente que necesita un diagnóstico.
[0076] En la presente invención, el método de diagnóstico de la enfermedad infecciosa consiste en comparar el nivel de la WRS de la muestra de prueba medido con el de una persona sana, y determinar que el sujeto que tiene un nivel de expresión de la WRS aumentado en comparación con una persona sana está infectado con la enfermedad. La comparación con dicha persona sana es la descrita anteriormente.
[0077] La expresión "que comprende" de la presente invención se utiliza como sinónimo de "que contiene" o "caracterizado" y no excluye los componentes adicionales o el método no mencionado en la composición o el método. La expresión "que consiste en" excluye los elementos, etapas o componentes adicionales no mencionados de otro modo. La expresión "que consiste esencialmente en" significa sustancias o etapas que no afectan sustancialmente sus propiedades básicas además de las sustancias o etapas mencionadas en el contexto de la composición o método. EFECTOS VENTAJOSOS
[0078] Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, la WRS se incrementa sólo en las enfermedades inflamatorias inducidas por la infección, diferenciando las enfermedades no infecciosas de las mismas, y se incrementa rápidamente en la etapa temprana de la infección. Además, el nivel de la WRS está estrechamente correlacionado con la gravedad y el pronóstico de las enfermedades o complicaciones inducidas por la infección. Por lo tanto, la WRS puede utilizarse como marcador para un diagnóstico más rápido y preciso, en comparación con un marcador convencional de enfermedades infecciosas o complicaciones de las mismas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0079]
La figura 1 muestra el cambio de WRS con el tiempo después de la infección medida por ELISA en el líquido de lavado peritoneal de ratones inyectados intraperitonealmente con 106, 107 o 108 UFC de S. typhimurium (ST). La abscisa representa el momento en el que se obtuvo el exudado abdominal tras la infección por ST (Tiempo tras la inoculación de ST (h))
La figura 2 muestra los resultados de la prueba ELISA para medir la forma de secreción de WRS tras la infección vírica.
La figura 2A muestra el curso temporal de los niveles de WRS presentes en el medio de cultivo de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) infectadas con el virus VRS (MOI = 2) o el PR8 (MOI = 2).
La figura 2B muestra los resultados de ELISA de la medición del nivel de la WRS presente en el suero de un paciente sano (HC, n = 20) y de un paciente con neumonía vírica (n = 5). La significación estadística utiliza la prueba de Mann Whitney, y el valor p indicado por * es de 0,04.
La figura 3A muestra los resultados de la prueba ELISA para medir el nivel de WRS presente en el suero de los pacientes de control sanos (H.C.), de septicemia grave y de choque séptico.
Las figuras 3B y 3C muestran los resultados de ELISA de la medición de los niveles de GRS o KRS presentes en el suero de los controles sanos (HC) y de los pacientes con septicemia, respectivamente (la significación estadística en la figura 3A se determinó mediante la prueba de comparación de Dunn tras el test de Kruskal Wallis. Las figuras 3B y 3C se determinaron mediante la prueba de Mann-Whitney de dos colas. *** indica p<0,001, * indica p<0,05, n.s indica estadísticamente no significativo).
La figura 4A muestra los resultados de ELISA de la medición del nivel de la WRS presente en el suero de los controles sanos (H.C.) y de los pacientes con septicemia infectados por hongos.
Las figuras 4B y 4C muestran los resultados del ELISA para medir los niveles de GRS o KRS presentes en el suero de los controles sanos (HC) y de los pacientes con septicemia, respectivamente (la significación estadística se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney de dos colas. *** indica p<0,001, * indica p<0,05, ns indica estadísticamente no significativo).
La figura 5A muestra los resultados del ELISA de la medición de los niveles de la WRS presentes en el suero de pacientes con infección bacteriana gram positiva y de pacientes con infección fúngica.
La figura 5B muestra los resultados de ELISA de la medición de los niveles de la WRS presentes en el suero de los pacientes infectados individualmente y de los infectados múltiples (la significación estadística se determinó mediante la prueba de comparación de Dunn después de la prueba de Kruskal Wallis. *** indica p<0,001, * indica p<0,05, ns indica estadísticamente no significativo).
La figura 6 es un gráfico que muestra los resultados del nivel de la WRS en pacientes con un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS, figura 6A), asma (ASA, figura 6B) como las enfermedades inflamatorias crónicas estériles, la artritis reumatoide (AR, figura 6C) y el síndrome de Sjogren (SS, figura 6C) en comparación con los controles sanos (HC).
La figura 7 muestra la curva ROC de la WRS.
La figura 8 muestra un gráfico con la correlación entre la WRS y la puntuación SOFA del CRP. r es un coeficiente de correlación de Pearson, y p es un valor de probabilidad.
La figura 9 muestra los niveles de WRS de los pacientes que sobrevivieron y murieron después de 28 días del diagnóstico de septicemia. El test de Mann Whitney se utiliza para la significación estadística, y el valor p indicado *** es de 0,0007.
La figura 10 confirmó los niveles de la WRS y la procalcitonina en suero mediante el ensayo de asociación de Spearman.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
[0080] En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle.
[0081] Sin embargo, los siguientes ejemplos son ilustrativos de la presente invención, y la presente invención no se limita a los siguientes ejemplos.
Experimento clínico
[0082] El método experimental se llevó a cabo con el permiso de la junta de revisión institucional de la Universidad Nacional de Seúl (Permiso N.° 1502-001-010). Las muestras de suero de los controles sanos se recogieron en el Centro de Salud de la Universidad Nacional de Seúl. Se obtuvieron muestras de suero de 99 pacientes con septicemia a través de la unidad de cuidados intensivos de septicemia grave o choque séptico. Los pacientes que proporcionaron el suero utilizado en el experimento eran los que estaban ingresados en la unidad de cuidados intensivos (UCI) del hospital afiliado a la universidad en Seúl. Sólo los pacientes que habían confirmado la infección bacteriana participaron en el experimento. El diagnóstico de septicemia grave o choque séptico se realizó según la conferencia de consenso ACCP/SCCM (1992). El experimento se llevó a cabo con el consentimiento informado de todos los pacientes que participaron en el experimento de acuerdo con la política del comité de revisión. El experimento también fue aprobado por el Comité de Revisión del Centro Médico Asan de Seúl. Entre enero de 2014 y julio de 2015, un total de 35 pacientes ingresados en la clínica de alergia-asma del Hospital Severance de Seúl participaron en el experimento. En el experimento participaron 26 controles sanos y 35 asmáticos estables diagnosticados de asma según los resultados de los síntomas y las pruebas de función pulmonar (aumento de más del 12 % del volumen espiratorio forzado durante 1 segundo (FEV1) tras el uso de un broncodilatador) por un alergólogo. El asma estable se definió como los pacientes asmáticos que mantuvieron la dosis habitual del fármaco sin aumentar la administración del mismo durante el último mes. Los ensayos clínicos fueron aprobados por el Hospital Severance y el Sistema de Salud de la Universidad de Yonsei (permiso n.° 4-2013-0397). Se recogió el suero de 42 pacientes con síndrome de Sjogren primario (SSp), 35 pacientes con artritis reumatoide (AR) y 20 controles sanos. El síndrome de Sjogren primario se diagnosticó según los criterios del Grupo de Consenso Americano-Europeo para el SSp o los criterios del Colegio Americano de Reumatología de 2012. La artritis reumatoide se diagnosticó según los criterios revisados de clasificación de la artritis reumatoide de 1987 o los criterios de clasificación de la artritis reumatoide de 2010. De acuerdo con el principio de la Declaración de Helsinki, todos los pacientes y controles sanos que participaron en el experimento recibieron el consentimiento informado del mismo. El experimento fue aprobado por el Comité de Revisión de1Hospital St. Mary de Seúl (KC13ONMI0646).
Experimento clín ico - Comparación con la procalcitonina
[0083] De acuerdo con la política del comité de revisión de cada institución, se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes que participaron en el experimento, incluyendo 120 personas sanas, 18 pacientes con SIRS (debido a causas distintas de las enfermedades infecciosas), 166 pacientes con septicemia y 160 pacientes con choque séptico. El síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), la septicemia y el choque séptico que se obtuvieron de los pacientes ingresados en la UCI del Hospital de la Universidad Nacional de Seúl se diagnosticaron según la conferencia de consenso ACCP/SCCM (1992).
[0084] Los niveles de procalcitonina (RayBiotech, USA, Cat N.°: ELH-PROCALC) y WRS (CUSABIO, China, Cat N.°: CSB-E11789h) en suero se midieron mediante kits ELISA.
Cultivo de células
[0085] Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se aislaron utilizando un tubo de preparación celular (CPTTM, Becton Dickinson) que contenía citrato de sodio.
Cepa bacteriana e infección
[0086] Se obtuvo Salmonella typhimurium (ATCC 14028) del Centro de Conservación Microbiana, Seúl, Corea. Las bacterias se cultivaron de forma rutinaria utilizando caldo nutritivo de BD bioscience. Las bacterias se incubaron durante la noche antes de la infección y se obtuvieron a una densidad de 1 x 108 UFC. La densidad bacteriana se estimó utilizando la absorbancia y la curva de calibración a 600 nm. Para los experimentos de infección de PBMC o de ratones, las bacterias se lavaron con PBS y se volvieron a dispersar en medio sin suero o en PBS.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, ELISA
[0087] Para el análisis cuantitativo de la WRS y KRS de ratón y humano, se midió la cantidad de proteína secretada en el medio de cultivo o en el suero mediante un kit ELISA. El kit ELISA de WRS se compró a Cusabio (Wuhan, China, número de catálogo CSB-E11789h) y el de KRS a USCN (Wuhan, China, número de catálogo SED002 Hu).
Estadísticas
[0088] La significación estadística se determinó cuando el valor de probabilidad (valor p) fue inferior a 0,05. Todos los cálculos estadísticos se realizaron con Graphpad prism 5.0 (Software GraphPad).
<Ejemplo 1>
Niveles de WRS aumentados debido a una infección bacteriana o vírica
<1-1> Secreción de WRS por infección de Salmonella
[0089] Se inyectó Salmonella typimurium en la cavidad abdominal del ratón para confirmar la cantidad de WRS presente en el exudado peritoneal.
[0090] Se inyectó Salmonella de 106, 107 o 108 UFC por vía intraperitoneal en hembras C57BL/6 de 9 a 10 semanas de edad, y se obtuvo exudado peritoneal de 5 a 11 ratones cada hora hasta cuatro horas después de la infección bacteriana para medir la cantidad de WRS presente en el exudado peritoneal mediante ELISA (figura 1). El WRS secretado por el exudado peritoneal fue secretado desde la fase más temprana tras la infección por salmonela y aumentó en función de la concentración de salmonela. La cantidad de WRS se alcanzó prácticamente 1 hora después de la infección.
<1-2> Secreción de WRS debida a infección vírica
[0091] Además de las bacterias, examinamos la secreción de WRS por infección vírica utilizando suero de células mononucleares de sangre periférica humana y neumonía vírica.
[0092] Cuando las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se infectan con el virus respiratorio sincitial (VRS) y el virus PR8, como el virus de la gripe, la WRS se incrementó significativamente en el medio de cultivo celular a partir de los 30 minutos después de la infección, y se confirmó que el nivel de WRS secretado se mantuvo a las 4 horas después de la infección en la que se realizó el experimento (A en la figura 2). Además, se confirmó que la cantidad de WRS estaba significativamente aumentada en el suero de los pacientes con neumonía vírica en comparación con los controles sanos (H.C) (B en la figura 2)
[0093] Estos resultados muestran que el nivel de WRS se incrementa por la infección vírica.
<Ejemplo 2>
Secreción específica de WRS en la enfermedad inflamatoria infecciosa
<2-1> Aumento de la WRS en pacientes con septicemia y choque séptico
[0094] El nivel de WRS en pacientes con septicemia y choque séptico debido a una infección se comparó con controles sanos.
[0095] Los pacientes con septicemia que participaron en este experimento fueron pacientes con septicemia y choque séptico grave que ingresaron en la UCI del Centro Médico Asan de Seúl. Las bacterias y los hongos detectados en los pacientes son los que se describen en la Tabla 1.
[0096] Los niveles de WRS aumentaron significativamente en los pacientes con septicemia grave y en los pacientes con choque séptico en comparación con los controles sanos (H.C) (figura 3A). Los valores de WRS medidos aumentaron unas 20 veces en 2,63±0,62 ng/ml (n=37) en pacientes sépticos, en comparación con 0,18±0,06 ng/ml (n=20) en los controles sanos. Además, el nivel de WRS en los pacientes con choque séptico era de 6,35±0,90 ng/ml (n=63), lo que era unas 50 veces superior al de los controles sanos. El nivel de WRS en los pacientes con choque séptico es mucho mayor que el de los pacientes con septicemia grave, lo que indica que el nivel de WRS está estrechamente relacionado con la gravedad de la septicemia.
[0097] En contraste con el aumento significativo de los niveles de WRS en los pacientes con septicemia en comparación con los controles sanos, la glicil-ARNt sintetasa (GRS) y la lisil-ARNt sintetasa (KRS), tal como la aminoacil-ARNt sintetasa (ARS) secretada en diferentes tipos no mostraron cambios significativos (figuras 3B y 3C).
[Tabla 1]
Figure imgf000014_0001
[0098] Mientras tanto, como se muestra en la figura 4, los niveles de WRS estaban aumentados (n = 8, 4,52 ± 1,83 ng / ml, prueba de Mann-Whitney) en el suero de pacientes con infecciones bacterianas así como con septicemia por hongos. Los niveles séricos de GRS y KRS no se modificaron significativamente. Entre los pacientes con septicemia anteriores, no se observaron diferencias significativas entre los pacientes con infección bacteriana Gram-negativa (n=62, 5,98±0,93 ng/ml), los pacientes con infección bacteriana Gram-positiva (n=25, 2,87±0,72 ng/ml) y los pacientes con infección fúngica (n=8, 4,52±1,83), y no se observaron diferencias significativas entre los pacientes con múltiples patógenos (n=11,3,53±1,22 ng/ml) y los que tenían un solo patógeno (n=94, 5,01±0,67 ng/ml) (figura 5).
<2-2> Nivel de WRS en la enfermedad inflamatoria no infecciosa
[0099] Los niveles de WRS en pacientes con síndrome de respuesta inflamatoria no infecciosa (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, SIRS), asma, tal como enfermedades inflamatorias crónicas estériles, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren se compararon con controles sanos.
[0100] Los niveles de WRS presentes en el suero de estos pacientes con enfermedades inflamatorias no infecciosas no fueron significativamente diferentes de los controles sanos (figura 6). El WRS detectado en el suero del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (figura 6A), pacientes asmáticos (figura 6B), pacientes con artritis reumatoide (figura 6C) y pacientes con síndrome de Sjogren (figura 6C) no hubo diferencias estadísticamente significativas. <Ejemplo 3>
Eficacia de la WRS como marcador d iagnóstico de enfermedades inflamatorias infecciosas
<3-1> Rendimiento de la WRS como marcador de enfermedad inflamatoria infecciosa
[0101] Para confirmar el rendimiento de WRS como marcador de enfermedad inflamatoria infecciosa, se preparó una curva de características operativas del receptor (curva ROC).
[0102] El AUC de la WRS en la curva ROC de 100 pacientes con septicemia infectada por bacterias fue de 0,90 (p<0,0001), el valor de corte fue de 0,28 ng/ml, la sensibilidad fue del 82 % y la especificidad del 80 % (figura 7). <3-2> Correlaciones entre el nivel de WRS, la gravedad de la enfermedad inflamatoria infecciosa y el pronóstico
[0103] Para confirmar aún más el rendimiento de WRS como marcador de enfermedad inflamatoria infecciosa, examinamos las correlaciones entre el nivel de WRS, la gravedad de la septicemia y el pronóstico de la septicemia.
[0104] La puntuación de evaluación de la insuficiencia orgánica secuencial (puntuación SOFA), que indica el pronóstico de los pacientes con septicemia, y el nivel de WRS o CRP detectado en el suero del paciente se mostraron en forma de gráfico, y se calcula el coeficiente de correlación de Pearson (figura 8).
[0105] El coeficiente de correlación de Pearson de WRS fue de 0,43, que fue significativamente mayor que el de CRP de 0,15, y se mostró una correlación estadísticamente significativa. En otras palabras, el nivel de WRS está más estrechamente correlacionado con la puntuación SOFA de los pacientes con septicemia que la CRP, que es un índice de inflamación existente.
[0106] Además, se midieron la supervivencia y el nivel de WRS después de 28 días del diagnóstico de septicemia como otros indicadores del pronóstico de los pacientes con septicemia, y se determinó la significación estadística mediante la prueba de Whitney (figura 9). Hubo una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de WRS entre los pacientes que murieron después de 28 días del diagnóstico de septicemia (muerte, n= 27, WRS 9,14+1,63 ng/ml, supervivencia, n=72, WRS 3,36+0,49 ng/ml). Así, cuanto mayor era el nivel de WRS, peor era el pronóstico de supervivencia de la septicemia.
<Ejemplo 4>
Comparación con procalcitonina
<4-1> Comparación de los contenidos en el suero
[0107] La cantidad de WRS (CUSABIO, China, Cat N.°: CSB-E11789h) y procalcitonina (RayBiotech, USA Cat N.°: ELH-PROCALC), conocidos como marcadores inflamatorios principales, en el suero de 120 sujetos sanos, 18 pacientes con SRIS (por causa no infecciosa), 166 pacientes con septicemia y 160 pacientes con choque séptico, se determinó cuantitativamente por el método ELISA según las instrucciones del fabricante.
[0108] Como resultado de la Tabla 2, la procalcitonina se distinguió del síntoma inflamatorio sistémico no infeccioso SlRS en comparación con las personas sanas y se detectó una mayor cantidad de la misma en la septicemia o choque séptico, que es una complicación de la enfermedad infecciosa. Sin embargo, la WRS resultó ser específico sólo para las complicaciones de las enfermedades infecciosas.
[Tabla 2]
Figure imgf000015_0001
<4-2> Comparación del contenido por supervivencia
[0109] Los pacientes con septicemia y choque séptico se dividieron en grupo de supervivencia y grupo de muerte

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, comprendiendo el método: (a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en una muestra humana que se ha proporcionado; y
(b) comparar el nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana en el sujeto humano con el nivel de un sujeto humano sano, y
(c) determinar que el sujeto humano que tiene un nivel de expresión aumentado de triptofanil-ARNt sintetasa humana en comparación con el sujeto sano ha sido infectado con la enfermedad infecciosa.
2. Un método in vitro para determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en una muestra humana que se ha proporcionado; y
(b) determinar que el riesgo de mortalidad del sujeto humano aumenta de forma proporcional al incremento del nivel de triptofanil-ARNt sintetasa humana.
3. Método, según la reivindicación 1 o 2, en el que la medición del nivel de expresión de la triptofanil-ARNt sintetasa humana en la muestra humana se realiza utilizando una composición que comprende un agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana, en el que el agente para medir el nivel de expresión de proteína o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana se selecciona del grupo que consiste en: - un anticuerpo que se une específicamente a la proteína triptofanil-ARNt sintetasa humana, y
- una sonda o un conjunto de cebadores que se unen específicamente al ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana.
4. Método, según la reivindicación 1 o 2, en el que la enfermedad infecciosa está provocada por una infección por uno o más seleccionados del grupo que consiste en virus, bacterias y hongos.
5. Método, según la reivindicación 4, en el que las bacterias son bacterias gram negativas o bacterias gram positivas.
6. Método, según la reivindicación 1 o 2, en el que la proteína triptofanil-ARNt sintetasa humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
7. Método, según la reivindicación 1 o 2, en el que el ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.
8. Método, según la reivindicación 3, en el que el conjunto de cebadores está representado por la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.
9. Método, según la reivindicación 1 o 2, en el que la enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en salmonelosis, intoxicación alimentaria, fiebre tifoidea, paratifoidea, neumonía, tuberculosis pulmonar, tuberculosis, septicemia, choque séptico, infección del tracto urinario, cistitis, pielonefritis, uretritis, prostatitis, infección del tracto respiratorio superior y otitis media.
10. Método, según la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma, suero, saliva, moco nasal, esputo, líquido capsular, líquido amniótico, ascitis, flujo del cuello del útero o vaginal, orina y líquido cefalorraquídeo.
11. Un uso in vitro de una composición que comprende un agente para medir el nivel de expresión de proteínas o ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana para diagnosticar una enfermedad infecciosa en un sujeto humano, o para determinar el riesgo de mortalidad de un sujeto humano afectado por una enfermedad infecciosa,
donde el agente se selecciona entre grupo que consiste en
- un anticuerpo que se une específicamente a la proteína triptofanil-ARNt sintetasa humana, y
- una sonda o un conjunto de cebadores que se unen específicamente al ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana.
12. Uso de un kit en el método según la reivindicación 1 o 2, comprendiendo dicho kit un agente para medir el nivel de expresión de la proteína o del ARNm de la triptófano sintetasa humana, en el que el agente se selecciona del grupo que consiste en
- un anticuerpo que se une específicamente a la proteína triptofanil-ARNt sintetasa humana, y
- una sonda o un conjunto de cebadores que se unen específicamente al ARNm de la triptofanil-ARNt sintetasa humana.
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